DE3007579A1 - Selektives medium zur isolierung von choleravibrionen - Google Patents
Selektives medium zur isolierung von choleravibrionenInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues selektives Medium zur Isolierung von Choleravibrionen.
Choleravibrionen oder -bakterien gehören der Gattung Vibrio an. Bei einer Infektion mit Cholera tritt eine von
Diarrhöe, Nausea und Exsikkose begleitete Erkrankung ein. Wegen des epidemieartigen Verlaufs der Krankheit kommt es
häufig vor, daß die Ermittlung von Choleravibrionen bei Patienten oder in der Umwelt, z.B. im Wasser, in den
Nahrungsmitteln oder dergl., nötig wird. Die Ermittlung von Choleravibrionen oder -bakterien wurde bisher in verschiedenen selektiven Isolierungsmedien, wie TCBS (Thiosulfat-citrat-gallensäuresalze)-Agarmedium, Vibrio-Agarmedium und dergl., durchgeführt.
Es ist jedoch eine große Anzahl nicht-agglutinierbarer
Vibrionen (NAG-Vibrionen) bekannt. Diese der Gattung
Vibrio angehörenden Bakterien ähneln einander hinsichtlich ihrer physiologischen und biochemischen Eigenschaften. Das Isolierungsmedium sollte daher von der Art sein,
daß allein ein selektives Wachstum der Choleravibrionen ermöglicht wird, d.h. eine sog. Selektivität aufweisen.
Das Medium sollte außerdem von der Art sein, daß es die Ausbildung charakteristischer Kolonien der Choleravibrionen ermöglicht, d.h. es sollte eine sog. Differenzierfähigkeit (Unterscheidungsfähigkeit) aufweisen.
Die oben erwähnten, bekannten Medien sind so zusammengesetzt, daß Bakterien, die der Gattung Vibrio angehören,
aus klinischen Materialien, z.B. dem Stuhl von Patienten, isoliert und unterschieden werden können. Bei den bekannten Medien werden als Komponenten, welche dem Medium die
Differenzierfähigkeit verleihen, Saccharose und ein pH-Indikator verwendet. Als Komponenten, welche dem Medium
Selektivität verleihen, werden Gallensäuresalze eingesetzt.
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Bei der Ermittlung von Choleravibrionen mittels dieser Medien
werden jedoch folgende Nachteile beobachtet:
(1) Es wird zugelassen, daß außer den Choleravibrionen
auch andere NAG-Vibrionen aufwachsen und die Selektivität daher gering ist;
(2) eine Vielzahl von NAG-Vibrionen besitzt die Fähigkeit, ähnlich wie Choleravibrionen Saccharose abzu-.
bauen.,und folglich wird die Differenzierfähigkeit schlecht;
(3) die Medien führen dazu, daß das Wachstum der Cholerabakterien mehr oder weniger inhibiert wird, und
es treten daher bei der Ermittlung von Cholerabakterien Schwierigkeiten auf, falls zur Ermittlung Materialien aus
der Umwelt zur Verfügung stehen oder Material, das von Patienten gewonnen wurde, die sich auf dem Weg der Besserung
befinden, d.h. Materialien, die nur eine geringe Zahl von Cholerabakterien enthalten. Außerdem treten Schwierigkeiten
bei der Ermittlung von Cholerabakterien auf, deren Wachstumsfähigkeit geschwächt wird; und
(4) wegen der Anwesenheit der Gallensäuresalze wird die gewachsene Kolonie hart, was bei einer anschließend
durchgeführten Serumagglutination zu fehlerhaften Ergebnissen führen kann.
Die Untersuchung von Cholerabakterien mittels bekannter Medien hat sich daher als kompliziert und ungenau erwiesen,
und es wurde oft eine Verseuchung mit Choleravibrionen übersehen, insbesondere bei Umweltuntersuchungen.
Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein selektives Medium zur Isolierung von Choleravibrionen zu
schaffen, das sowohl eine ausgezeichnete Unterscheidungsfähigkeit als auch ausgezeichnete Selektivität aufweist.
Weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein selektives Medium zur Isolierung von Choleravibrionen zu
schaffen, welches effektiv zur Ermittlung von Cholera-
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bakterien aus Materialien eingesetzt werden kann, welche aus Umweltmaterialien gewonnen wurden oder aus klinischen
Untersuchungsmaterialien bei Patienten erhalten wurden,die sich auf dem Weg der Besserung befinden,
d.h. Materialien, in denen die Zahl der Cholerabakterien klein ist.
Diese Aufgaben werden erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß man Mannose und einen Sulfonphthalein-Farbstoff als Unterscheidungsfähigkeit
verleihende Komponenten sowie Polymyxin B, ein oberflächenaktives Mittel und Kaliumtellurit
als Selektivität verleihende Komponenten zusammenmischt. Das heißt, die vorliegende Erfindung besteht darin, ein
selektives Medium zur Isolierung von Choleravibrionen zu schaffen, welches Mannose, einen Sulfonphthalein-Farbstoff,
Polymyxin B, ein oberflächenaktives Mittel und Kaliumtellurit umfaßt.
Unter den oberflächenaktiven Mitteln, welche eine der Komponenten des erfindungsgemäßen Mediums ausmachen, sind
ampholytische Tenside, wie z.B. Natriumlaurylsulfat,
Natriumheptadecylsulfat und dergl.. Das oberflächenaktive
Mittel wird dem Medium in erster Linie zu dem Zweck einverleibt, um das Wachstum von gram-positiven Bakterien
vollkommen zu inhibieren. Polymyxin B dient dazu, das Wachstum anderer Vibriobakterien als Cholerabakterien und
gram-negative Bakterien zu inhibieren. Andererseits wirkt Kaliumtellurit in der Weise, daß das Wachstum von Bakterien
inhibiert wird, welche den oben erwähnten Wachstumsinhibitoren widerstehen.
Die Konzentrationen dieser Bestandteile des Mediums werden vorzugsweise folgendermaßen eingestellt: Polymyxin B
im Bereich von 100 000 bis 200 000 Einheiten/l, das oberflächenaktive Mittel im Bereich vom 0,009 bis 0,25 Gew./
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-D-
VoI.-% und Kaliumtellurit im Bereich von 0,00008 bis
0,00015 Gew./Vol.-%. Das Medium, welches Polymyxin B, das oberflächenaktive Mittel und Kaliumtellurit in solchen
Konzentrationen umfaßt, wie sie oben definiert sind, hat keinen nachteiligen Einfluß auf das Wachstum von Cholerabakterien,
inhibiert jedoch das Wachstum von im wesentlichen allen anderen Bakterien und weist daher eine ausgezeichnete
Selektivität auf.
In dem die oben erwähnten Bestandteile enthaltenden Medium können nur wenige Bakterientypen wachsen. Unter diesen
Bakterien befinden sich außer den Cholerabakterien fast keine Bakterien, welche Mannose zu einer Säure abbauen .
können. Das Vorliegen von Cholerabakterien kann folglich durch den Farbwechsel des Mediums einfach beobachtet werden,
falls dem Medium der Sulfonphthalein-Farbstoff einverleibt
ist, welcher bei ©iner Änderung des pH-Wertes die Farbe ändert. Die Konzentrationen dieser Bestandteile in
dem Medium werden vorzugsweise so eingestellt, daß Mannose
in dem Bereich von über 1,5 Gew./Vol.-%, insbesondere
1,5 bis 2,5 Gew./Vol-5i, und der Sulfonphthalein-Farbstoff
in dem Bereich von 0,002 bis 0,008 Gew./Vol.-% liegt.
Brauchbare Sulfonphthalein-Farbstoffe für das erfindungsgemäße Medium sind u.a. Bromthymolblau, Thymolblau, Cresolrot,
Phenolrot und dergl..
Das erfindungsgemäße Medium umfaßt weiterhin neben den obengenannten Bestandteilen herkömmlicherweise eingesetzte
Nährstoffquellen, wie Pepton, Fleischextrakt,
Natriumchlorid und dergl., und Agarpulver.
Das erfindungsgemäße Medium wird folgendermaßen hergestellt.
Die obengenannten Bestandteile werden in Wasser unter Erhitzen aufgelöst, die auf diese Weise hergestellte
Lösung wird in ein Gefäß gegeben und abgekühlt, bis man
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einen Feststoff erhält. Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden die Bestandteile mit Ausnahme von Kaliumtellurit
vermischt und getrocknet, um ein trockenes Pulver zu erhalten, und Kaliumtellurit in einem anderen Gefäß
vorgesehen. Beim Gebrauch wird das trockene Pulver in gereinigtem Wasser unter Erhitzen aufgelöst. Dazu wird eine
verdünnte, wäßrige Lösung von Kaliumtellurit (vorzugsweise in einer Konzentration von etwa 0,1%) gegeben und
nachfolgend wird alles in ein geeignetes Gefäß gefüllt und bis zur Verfestigung abgekühlt.
Bei der Bestimmung von Cholerabakterien unter Verwendung des erfindungsgemäßen Mediums wird folgendermaßen vorgegangen.
Die zu untersuchende Probe wird auf die Oberfläche des Mediums appliziert, über Nacht bei 370C kultiviert
und visuell untersucht. Dabei werden Cholerabakterien, falls solche vorhanden sind, in Form gelber Kolonien
beobachtet.
Die vorliegende Erfindung wird im folgenden anhand von Beispielen und Vergleichsbeispielen näher erläutert.
Tabelle 1 Zusammensetzung des erfindungsgemäßen Iso lierungamediums
Fleis chextraktpulver Polypepton Natriumchlorid D-Mannose
Agarpulver Polymyxin B Natriumheptadecylsulfat Cresolrot
gereinigtes Wasser
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| 5,0 | g | g |
| 10,0 | g | g |
| 10,0 | g | g |
| 20,0 | g | mg |
| 15,0 | g | ml |
| 180 000 Einheiten | ||
| 0,1 | ||
| 0,04 | ||
| 0,04 | ||
| 1,0 | ||
| 1000 |
Die obigen Bestandteile werden in dem gereinigten Wasser unter Erhitzen aufgelöst. Jeweils 20 ml der auf diese
Weise hergestellten Lösung werden in eine Petrischale gegeben und abgekühlt und verfestigt, um ein Medium
herzustellen.
Jedem der in Beispiel 1 hergestellten Medien sowie einem TCBSCThiosulfat-citrat-gallensäuresalzeJ-Agarmedium und
einem Vibrio-Agarmedium wird ein Kloakenwasser appliziert,
dem Cholerabakterien einverleibt sind (enthaltend einige bis 1000 Cholerabakterien/ml Kloakenwasser). Die Medien
werden über Nacht bei 370C kultiviert und anschließend visuell untersucht. Die Zusammensetzungen des TCBS-Agarmediums
und des Vibrio-Agarmediums sind in Tabelle 2 bzw. 3 angegeben. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 aufgeführt.
Tabelle 2 Zusammensetzung von TCBS-Agarmedium Pro Liter wäßriges Medium: g
Hefeextrakt 5,0
Pepton 10,0
Natriumeitrat 10,0
Natriumthio sulfat 10,0
Ochsengalle 5 , 0
Natriumcholat 3»0
Saccharose 20,0
Natriumchlorid 10,0
Eisen(IIl)-citrat 1,0
Bromthymolblau 0,04
Thymolblau 0,04
Agar 15,0 pH: etwa 8,6
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Tabelle 3 Zusammensetzung von Vibrio-Agarmedium
Pro Liter wäßriges Medium: g
Hefeextrakt 5,ο
Pepton 5,0
Saccharose 12,5
Natriumtaurocholat 5,0
Natriumlaury!sulfat 0,2
Natriumeitrat 8,0
Natriumthio sulfat 8,5
Dinatriumphosphat 7,5
Eisen(lII)-citrat 3,0
Natriumchlorid 10,0
Cresolrot 0,02
Wasserblau 0,2
Agar 15,0 pH: 8,5 + 0,1
Tabelle 4 Testergebnisse Probe Zahl der Cholera- Erfindungs-
Nr. bakterien/ml Abwasser
gemäßes Medium
TCBS- Vibrio-Agar- Agarmedium medium
1 einige
2 etwas über
3 100
4 1000
Bemerkungen:
-: nicht beobachtet
+: 1 bis 10 Kolonien werden beobachtet
++: 11 bis 99 «·» «
+++: 100 oder mehr « " «
Das in Klammern gesetzte Zeichen bezeichnet Kolonien anderer Bakterien als Cholerabakterien.
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10 ml Monsur*s Peptonwasser (ein Anreicherungsmedium für
Cholerabakterien), dessen Zusammensetzung in Tabelle angegeben ist, wird mit 1 ml der Probe Nr. 2, die in Beispiel
2 verwendet wurde, okuliert. Nachfolgend wird 8 h
bei 37°C kultiviert. Dieses Medium wird auf das 102-,
•χ λ κ β
10^-, 10 -, 10 - und 10 -fache Volumen verdünnt. Mit einer
vorbestimmten Menge jeder der Lösungen werden das erfindungsgemäße Medium sowie das TCBS-Agarmedium und das
Vibrio-Agarmedium, deren Zusammensetzungen jeweils in den Tabellen 1, 2 und 3 angegeben sinds okuliert. Die Bakterien
werden über Nacht bei 37°C kultiviert, um auf ähnliche Weise wie in Beispiel 2 ihr Wachstumsstadium abzuschätzen.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 zusammengestellt.
Tabelle 5 Zusammensetzung von Monsur's Peptonwasser
Pepton 10,0 g
Natriumchlorid 10,0 g Natriumtaurocholat 5,0g
Natriumcarbonat 1,0 g
gereinigtes Wasser 1000 ml pH: 9,0 bis 9,2
Tabelle 6 Testergebnisse
Verdünnung Erfindungsgem. TCBS-Agar- Vibrio-Agar-Medium medium medium
Die Zeichen +++ (+) haben die in Beispiel 2 definierte Bedeutung.
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Claims (6)
1. Selektives Medium zur Isolierung von Choleravibrionen,
dadurch gekennzeichnet, daß es Mannose, einen Sulfonphthalein-Farbstoff, Polymyxin B, ein oberflächenaktives
Mittel und Kaliumtellurit umfaßt.
2. Selektives Medium nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß es, bezogen auf die Gesamtmenge des Mediums, 1,5 bis 2,5 Gew./Vol.-% Mannose, 0,002 bis 0,008 Gew./VoI.-
% des SuIfonphthalein-Parbstoffs, 100 000 bis 200 000 Einheiten/l
Polymyxin B, 0,009 bis 0,25 Gew./Vol.-% des oberflächenaktiven
Mittels und 0,00008 bis 0,00015 Gew./Vol.-% Kaliumtellurit umfaßt.
3. Selektives Medium nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Sulfonphthalein-
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Farbstoff Bromthymolblau, Thymolblau, Cresolrot oder
Phenolrot ist.
4. Selektives Medium nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das oberflächenaktive
Mittel ein ampholytisches Tensid ist.
5· Selektives Medium nach einem der Ansprüche 1 oder Zt dadurch gekennzeichnet, daß das oberflächenaktive
Mittel Natriumlaurylsulfat oder Natnumheptadecylsulfat
ist.
6. Selektives Medium nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es die in Beispiel 1
der nachstehenden Beschreibung angegebene Zusammensetzung aufweist.
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