DE2417508A1 - Superoxiddismutasen und deren verwendung als oxidationsverhinderer - Google Patents

Description

Dr. Hans-Heinrich Willrath _D _ _{62 WIESB}aden ₄.₄.₁₉₇₄

Dr. Dieter Weber postfaAiszr _τ'_/&^

Τ\· 1 ΠΙ T/H C -nr _*. Gustav-Freytag-Stra6e25

Dipl.-Phys. Klaus beirrert * »««>»»»

Telegrammadresse: WILLPATENT

PATENTANWÄLTE

323/74

Agence Nationale de Valorisation de la Recherche

(ANVAR)

13, Rue Madeleine Michelis, 92200 Nuellly S/Seine

Frankreich

Superoxiddismutasen und deren Verwendung als Oxidationsverhinderer

Prioritäten: v. 16.April 1973 in Frankreich Anm.No.: 73 13.670

v. 10.August 1973 in Frankreich Anm.No.: 73 29.328

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Superoxiddismutaseenzymen als Oxidationsverhinderer, insbesondere zur Verhinderung der Oxidation von Nahrungsmitteln und anderen oxidierbaren Verbindungen oder oxidierbaren Umgebungen. Ferner ist Gegenstand der.Erfindung eine neue Klasse von Superoxiddismutasen und ein Verfahren zu deren Gewinnung sowie ihre

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Postsdiedc: Frankfurt/Main 67 65-60Ϊ Bank: Dresdner Bank AG. Wiesbaden. Konto-Nr. 276807

Verwendung zum Schütze gegen Autooxidantien bei Lipiden und Verbindungen, die als Antioxidatien in der Nahrungsmittelindustrie verwendet werden.

Superoxiddismutasen, die aus Rindererythrocyten (Markovitz, J.Biol.Chem. 234, Seite 40, 1959) und aus Escherichia coli (Keele und Fridovich, J.Biol.Chem. 245, Seite 6176, 1970, extrahiert wurden, sind bereits beschrieben worden.

Die Superoxiddismutasen sind Enzyme, die in der Lage sind, die Dismutation von Superoxidionen nach der folgenden Gleitchung hervorzurufen:

2 O₂ " + 2 H⁺-^H₂O₂ + O₂

Sie dienen also dazu, ein Selbstschutzsystem für Gegenstände oder Organismen zu erstellen, in denen sie sich finden, denn die Superoxidionen, die im Verlauf der Oxidationsreaktionen unter dem Einfluß von molekularem Sauerstoff erzeugt werden, sind sehr aktiv und greifen unter anderem die Proteine durch Oxidation des Tryptophans neben anderen Aminosäuren und den Nucleinsäuren an.

Es wurde nun gefunden, daß die Superoxxddismutaseenzyme jeglichen Ursprunges bemerkenswert als Oxidationsverhinderer bei oxidierbaren Substanzen, insbesondere als Oxidationsverhinderer bei lipidischen, proteinischen oder lipoproteinischen Nahrungsmitteln sowie anderen oxidierbaren Substanzen und Umgebungen, wirken. Die Erfindung hat die Verwendung von Super-

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oxiddismutaseenzymen als Oxidationsverhinderer für oxidierbare Substanzen, insbesondere Nahrungsmittel, als Antioxidantien, wie in der Nahrungsmittelindustrie und bei Bakterien und anderen oxidierbaren Umgebungen,zum Gegenstande.

In anderer Hinsicht betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Bekämpfung der Oxidation von oxidierbaren Substanzen und ist dadurch gekennzeichnet, daß man mit den genannten Substanzen eine wirksame Menge mindestens eines Superoxiddismutaseenzyms vereinigt. Im Sinne der Erfindung ist unter einer "oxidierbaren Substanz" jede Substanz zu verstehen, die für einen Abbau durch eine Oxidation anfällig ist, die unter Vermittlung von Superoxidionen verläuft.

Die Superoxiddismutasen, die sich als wirksam erwiesen haben, werden beispielsweise aus Seebakterienstämmen, wie zum Beispiel Stämmen von Photobacterium phosphoreum, Photobacterium leiognathi oder Photobacterium sepia hergestellt. Es kommen aber auch alle anderen Superoxiddismutasen, wie beispielshalber ohne Beschränkung solche in Betracht, die aus Escherichia coli, aus Pilzen, wie Pleurotus olearius, oder aus Blut extrahiert sind, insbesondere die Erythrocupreine. Unter diesen Verschiedenen Stämmen sind zu nennen die Stämme vom Photobacterium phosphoreum Nr.ATCC 11040, Photobacterium leiognathi Nr.ATCC 25521, Photobacterium sepia Nr. ATCC 15709, Escheri-,chia Coli Nr. ATCC 15224 und Pleurotus olearius Gillet (Laboratoire de Cryptogamie de Paris).

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Man konnte die bemerkenswerte Antioxidationswirkung feststellen, die von diesen Superoxiddismutasen gegenüber Pilzen, Äpfeln und Kartoffeln neben anderen Nahrungsmitteln gewonnen wird.. über diese Versuche wird in gewissen Beispielen berichtet, die sich nachstehend finden.

Man kann jedoch bisher keine Beurteilungsmethoden für die Qualität von Nahrungsmitteln aufstellen, die polyvalent und wirklich objektiv sind. Auch hat man gewählt, gleichfalls Versuche an besonderen Modellen durchführen zu lassen, die den Vorteil bieten, Modelltypen einer großen Anzahl von Nahrungsmitteln und Nahrungsmittelzusammensetzungen darzustellen, und die hinsichtlich ihrer Unangreifbarkeit- objektiv analysiert werden können. So hat man als Modell für die Aut— Oxidationsverhinderung von Lipoproteinen die Verhinderungsaktivität für die Autoxidation geprüft, die gemäß der Erfindung durch die Superoxiddismutasen gegenüber ARN-t-Hefeligase erreicht wird, wobei das Modell alle Klassen von Lipo-

proteinen repräsentiert. Ebenso hat man als Modell für Nucleoproteine in ihrer Allgemeinhat das Bacteriophag R 17 benutzt, das ein Ribonucleoprotein ist. Andererseits hat man auch gemäß der Erfindung die Wirksamkeit von Superoxiddismutasen für den Schutz gegen die Oxidation von Bakterien festgestellt, die gegen Ultraviolettstrahlungen exponiert werden, sowie für den Schutz eines sogenannten "Jeffries-Milieu", das Natriumtetrathionat enthält und für die Anreicherung von Salmonellen aktiv ist. _₅_

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Wie oben dargelegt wurde, kann das nach der Erfindung benutzte Superoxiddismutaseenzym aus jeder geeigneten Quelle, wie Erybhrocuprein, Escherichia coli, Pilzen, wie Pleurotus olearius und aus Quellen, wie Photobacterium phosphoreum, Photobacterium leiognathi und Photobacterium sepia sowie anderen extrahiert werden. Unabhängig von der Enzymquelle ist die Beurteilung des Wirkungsgrades letzterer bei der in Betracht kommenden Verwendung dieselbe, weil in absoluten Werten gemessen wird: man mißt nämlich die Enzymaktivität durch Verhinderung der ^ehemolumineszenzreaktion von Luminol; diese Reaktion wird durch das enzymatische System Hypoxanthin/ Xanthinoxidase/Sauerstoff erzeugt; um diese Reaktion zu verwirklichen, wurde jedesmal eine Injektion von 1 ml Hypoxanthin von 0,33 χ 10 Mol in ein Gemisch von 0,3 ml Luminol von 10 Mol, 0,3 ml Glycin-NaOH-Puffer von 1 Mol und pH 9, O,3 ml EDTA von 10~ Mol, 1,8 ml Wasser und O,OO5 ml einer Xanthinoxidaselösung von 1 mg/ml durchgeführt. Die experimentelle Einrichtung, die für die Messung der Leuchtintensitäten erstens ohne und zweitens nach Verhinderung mittels Superoxiddismutase benutzt wurde, bestand aus einer versilberten Küvette zur Aufnahme der zu prüfenden Mischung, die vor einen Photomultiplikator gesetzt wurde. Die Reaktion wurde ausgelöst, indem das Substrat in die Küvette eingegeben wurde und sich dann eine Emission eines Bhotonen-Flusses bildete, die unter der Wirkung des Photomultiplikators einen Strom entstehen ließ, dessen Intensität mittels eines Picoamperemeters gemessen und aufgezeichnet wurde. Wenn man in die Reaktionsmischung eine

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geeignete Menge der zu bewertenden Superoxiddismutase vor Auslösung der Reaktion einführte, erreichte man eine Verhinderung dieser Lichtemission. Die gewählte Aktivitätseinheit entspricht willkürlich der Enzymmenge, die eine 50 %-ige Reduktion der maximalen Leuchtintensität bei Abwesenheit der enzymatischen Verhinderung hervorruft. Diese Einheit ist also unabhängig von der Enzymquelle und dem Superoxiddismutaseenzym, die benutzt wurden.

In gewissen Fällen kann es zur Beurteilung des Wirkungsgrades der Superoxiddismutasen bei der betreffenden Anwendung über eine vernünftige Zeitspanne vorteilhaft sein, die Oxidation der Stoffe zu aktivieren. Zu diesem Zweck arbeitet man praktisch entweder mit Hilfe von durdiBestrahlung bei 365 m,u reduzierten Flavinen oder mittels eines enzymatischen Systems, beispielsweise des Systems Xanthinoxydase/Hypoxanthin/ Sauerstoff.

Wenn man die Oxidation durch reduzierte Flavine beschleunigt, bestrahlt man eine Lösung von Flavinmononucleotid (FMN) Von 1O~⁴ Mol, lo"⁴ Mol EDTA und 1O~² Mol Phosphatpuffer von pH 7,0 in einer Quarzküvette_f die in ein Zeiss-Spektibfluorimeter,ausgerüstet mit einem Filter M 365, eingesetzt ist; man verfolgt die Photoreduktion/ .die sich rasch einstellt, indem man die Verminderung der bei 530 m.vt. ausgesandten Fluoreszenzintensität verfolgt. Nach geänderter Reduktion nimmt man die Lösungen wieder auf, um sie in Gegenwart von Luft heftig zu bewegen, und erreicht so ihre vollständige Rückoxidation,

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die Superoxidionen. O_ · erzeugt. Es ist zu bemerken, daß der Reduktion—Reoxidationszyklus der Flavine mehrmals wiederholt werden kann, ohne daß die Struktur des Flavinmononucieotides verändert würde. Als Abwandlung kann man mit Bestrahlungen von 365 m,u mittels einer B 100 A-Larape, geliefert von der Ultraviolet—Products Inc., an solchen Lösungen arbeiten, die oben beschrieben wurden und kontinuierlich gerührt werden.

Wenn"man wünscht, die Oxidation durch das enzymatische System Hypoxanthin/Xanthinoxydase/Sauerstoff zu beschleunigen, ist es vorteilhaft eine Lösung zu benutzen, die 0,3 ml 10 Mol

Hypoxanthin, 0,3 ml 1 Mol Phosphatpuffer von pH 7,8,0,3 ml 10~³ EDTA, 2,1 ml Wasser ι
lösung von 1 mg/ml enthält.

10~ EDTA, 2,1 ml Wasser und 0,05 ml einer Xanthinoxydase-

In anderer Hinsicht betrifft die Erfindung die Erzeugung von Superoxiddismutase und insbesondere ein Verfahren zur Erzeugung eines neuen eisenhaltigen Superoxiddismutaseenzyms.

Die Erfindung hat ein Verfahren zur Herstellung von Superoxiddismutase ,extrahiert aus Seebakterienstämmen, und die so erhaltenen Superoxiddismutasen zum Gegenstande. Sie betrifft insbesondere ein Verfahren zur Extraktion von Superoxiddismutase aus Stämmen von Photobacterium phosphoreum, Photobacterium leiognathi oder Photobacterium sepia und anderen.

Das Verfahren gemäß der Erfindung besteht darin, daß man eine Seebakterienkultur in Wasser dispergiert und bei ungefähr 4 C hält, dann das Milieu auf pH 6,5 bis 8, vorzugsweise etwa 7, einstellt, die Mischung einige Minuten auf 50 bis 6O°C bringt, sie wieder auf ungefähr 4°C abkühlt und bei dieser Temperatur zentrifugiert, an der überstehenden Fraktion eine erste fraktionierte Fällung mittels neutralen Salzen vornimmt, nochmals zentrifugiert und an der überstehenden Fraktion eine: zweite fraktionierte Fällung mit Neutralsalzen durchführt und zentrifugiert.

Als Abwandlung kann man das Verfahren nach der Erfindung durch eine Reinigungsstufe vervollständigen, die vorteilhafterweise in einer Auflösung des bei der letzten Zentrifugierung gesammelten Niederschlages in einen Phosphatpuffer von pH 7,8 und einer Dialyse der so erhaltenen Lösung gegen denselben Phosphasepuffer von pH 7,8 besteht.

Gemäß einer anderen Abwandlung des Verfahrens nach der Erfindung reinigt man das aus der Seebakterienkultur extrahierte Enzym nach Wiederaufnahme des Produktes der letzten Zentrifugierung mit Phosphatpuffer von pH 7,8 und Dialyse gegen denselben Puffer durch eine Chromatographie, vorzugsweise eine Kolonnenchromatographie, insbesondere eine solche an drei aufeinanderfolgenden Kolonnen; sie bestehen aus einer ersten

Kolonne aus Sephadexgel G 200, einer Kolonne aus Sephadexdiäthylaminoäthyl (DEAE-Sephadex A-50) und einer zweiten Kolonne aus Sephadexgel G 200. - 9 -

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Die bei dem Verfahren der Erfindung als Enzymquelle dienende Bakterienkultur ist beispielsweise eine Kultur von Stämmen von Photobacterium phosphoreum, Photobacterium leiognathi oder Photobacterium sepia. um den pH-Wert der Bakteriendispersion in Wasser auf 6,5 bis 8 einzustellen, worin die erste Stufe des Verfahrens besteht, benutzt man beispielsweise 2 η Ammoniak und.setzt anschließend Kaliumchlorid, vorzugsweise 3 Mol KCl, zu. Dann bringt man die so gebildete Mischung nur einige Minuten, vorzugsweise während 3 bis 4 Minuten, auf eine Temperatur von 50 bis 60°C, kühlt sie wieder auf etwa 4 C ab,und bei dieser Temperatur vollzieht man alle folgenden Verfahrensstufen gemäß der Erfindung. Jede der zu diesen Verfahrensstufen gehörenden fraktionierten Fällungen erfolgt, wie oben angegeben, mittels Neutralsalzen in wässriger Lösung, vorzugsweise mittels Ammoniumsulfat (NH₄)₂ ^SO4■

Bei einer vorteilhaften Ausführungsweise des Verfahrens nach der Erfindung vollzieht man die erste fraktionierte" Fällung mittels Ammoniumsulfat (NH₄)₂ ^SO4» ^{das in einer} solchen Menge zugesetzt wird, daß die behandelte Mischung beziehungsweise der Enzymextrakt so auf eine Endkonzentration von etwa 3O bis 35 % der Sättigung bei 4°C gebracht wird. Man muß jedoch beachten, daß man das Ammoniumsulfat ganz oder teilweise durch ein oder mehrere andere geeignete Salze ersetzen kann und die Gesamtmenge dieser Salze dann eine äquivalente und geeignete Menge, daß sie die Mischung auf eine Endkonzentration von ungefähr 30 bis 35 % der Sättigung bei 4°C bringt, i_st.

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Als Abwandlung kann man"ein ültrafiltrationssystem, z.B. ein System benutzen, bei dem eine poröse Einrichtung, wie poröse Rohre, eingesetzt wird. Insbesondere kann das System ein erstesporöses Rohr, das die Moleküle eines höheren Molekulargewichtes als 40 000 unter deren Konzentration zurückhält, und ein zweites poröses Rohr benutzen, das die gewünschten Enzymmoleküle durchtreten läßt, aber die verbliebenen Bakterien zurückhält, so daß man einen sterilen Enzymextrakt erhält. Ebenso erfolgt zweckmäßig die zweite fraktionierte Fällung mittels Ammoniumsulfat (NH.)₂S0., das in solcher Menge zugesetzt wird, daß die Mischung oder der Enzymextrakt so auf eine Endkonzentration von etwa 70 bis 75 % der Sättigung bei 4°C gebracht wird.

Die aus verschiedenen Seebakterlenstämme»idurch das Verfahren nach der Erfindung erhaltenen Superoxiddismutasen enthalten alle nichthämatinisches Eisen, während die früher beschriebenen eine Superoxiddismutaseaktivität aufweisenden Enzyme, nämlich das Erythrocuprein, und der Enzymextrakt von Escherichia coil zweiwertige Kationen aufweisen, die im ersten Fall aus Kupfer und Zink und im zweiten Fall aus Mangan bestehen. Die Untersuchung auf das Vorhandensein eines Metalles in den betreffenden Superoxiddismutasen kann durch eine Analyse am Atomadsorptionsspektrographen erfolgen.

Man kann auch eine colorimetrische Prüfung durchführen, die im vorliegenden Fall darin besteht, daß man ein elektrophoretisches Wanderungsgel eines Enzympräparates mittels

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eines für Ferro-Eisen Fe spezifischen Farbstoffes/ das Bathophenanthrolin, gegebenenfalls in Gegenwart eines Reduktionsmittels, wie Hydrazin, einfärbt. Für diese.Prüfung schneidet man das Gel in Längsrichtung entzwei und legt einen der beiden Teile in Coomassie-'-Blau und den anderen Teil in das Bathophenanthrolin. Die Prüfung ist positiv, wenn man in letzterem Fall auf der Höhe des Proteinbandes einen rosa Ring erhält. Bekanntlich kann ein solches Auftreten eines rosa Ringes als Nachweis für das Vorhandensein von Ferro-Eisen hier in dem Superoxiddismutaseprotein angesehen werden.

Man kann auch radioaktives Eisen zur Markierung des Proteins benutzen und so die Stöchiometrie bezüglich des vorhandenen zweiwertigen Metallkations bestimmen.

In anderer Hinsicht hat also die Erfindung eine aus Seebakterienkulturen extrahierte Superoxiddismutase zum Gegenstande und ist dadurch gekennzeichnet, daß sie nichthämatinisches Eisen aufweist, ein Molekulargewicht von etwa 40 000 - 2500*und einen pHi-Wert oder isoelektrischen Punkt von etwa 4 bis 7 besitzt und eine enzymatische Höchstaktivität bei etwa pH 8,5 bis 10 mit einem Optimum bei etwa pH 9,5 aufweist. Man kann das Enzym über lange Zeiträume aktiv halten, indem man es in einer Lösung von 70 bis 80 % neutralem Ammoniumsulfat (NH₄)₂ ^SO4 ^{bei 4}°^c aufbewahrt.

Um die Aktivität der Superoxiddismutasen gemäß der Erfindung zu messen, kann man die Verhinderungswirkung der letzteren auf

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die Chemcr.lumineszenzreaktion bewerten, die durch das enzymatische System Sauerstoff-Hypoxanthin-Xanthin-Oxydase-Luminol hervorgerufen wird, wie später dargelegt werden soll. Dieses reagierende Enzymsystera ruft die Freisetzung von Superoxidionen hervor, die fähig sind, eine Chemolumineszenzreaktion mit dem Luminol zu liefern. Der Zusatz von Superoxiddismutase zu diesem System spaltet nämlich Superoxidionen ab und ruft so eine Verminderung der Intensität des bei dieser Reaktion ausgestrahlten Lichtes hervor. Die Superoxiddismutasen katalysieren die Reaktion

2 O₂ " + 2 H⁺ -fr H₂O₂ + O₂

Wenn man dann als Substrate in dieser Reaktion die durch die Enzymreaktion erzeugten Superoxidionen benutzt, indem man Xanthin.-Oxydase und Xanthin oder Hypoxanthin einsetzt, werden die so erzeugten Superoxidionen sehr instabil und strahlen spontan Licht aus. Letzteres ist indessen zu schwach, und die Maßnahmen können keine genügende Reproduzierbarkeit

» haben. Aus diesem Grunde vervollständigt man in der Praxis die analytische Vorrichtung, indem man zum Nachweis der gebildeten Superoxidionenmenge eine Chemolumineszenzsubstanz, nämlich Luminol oder 5-Amino-2,3-dihydro-l,4-phthalazindion, einsetzt.

Luminol +O₂ · -^h 0 + Oxidationsprodukt.

Man hat andererseits auch superoxidionenliefernde Systeme, katalytische Systeme mit der Fähigkeit zur Förderung der

2+ 2+ Oxidation von Luminol, bestehend aus den Ionen Fe , Ni

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oder Co , in wässrigen Lösungen molekularen Sauerstoffs in Gegenwart gewisser Liganden eingesetzt. Die in das System eingeführte Superoxiddismutase vermindert die Menge an Superoxidionen und infolgedessen die Lichterzeugung.

Die Analyse wird wie folgt durchgeführt:

Man benutzt die folgende Reaktionsmischung:

Luminol 1O~³ Mol 0,3 ml

Phosphatpuffer 1(T³MoI pH 7,8 0,3 ml

EDTA KT³MoI 0,3 ml

Wasser gsp 2 ml

+ 50 .ul Xanthinoxydase (1,05 Mol einer Lösung von 1 mg/ml Xanthinoxydase).

Die Mischung gibt man in eine versilberte Küvette vor einem Photomultiplikator. Man leitet die Reaktion ein, indem man in die Küvette das Substrat einführt: 1 ml einer Lösung von 0,3 .η Mol Hypoxanthin.

Dann stellt sich eine Emission, ein Photonenfluß ein, der unter der Wirkung des Photomultiplikators zur Entstehung eines Stromes Anlaß gibt, dessen Intensität durch ein Picoamperemeter gemessen und aufgezeichnet wird. Wen man in die Reaktionsmischung 5 ,ul der zu bewertenden Superoxiddismutase vor der Auslösung der Reaktion einführt, stellt man eine Verhinderung dieser Lichtemission fest.

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Man definiert dann willkürlich die Einheit des Superoxiddismutaseenzyms als diejenige Menge derselben, die eine Verhinderung von 50 % Lichtemission hervorruft. Es ist jedoch zu bemerken, daß man auch die Aktivität von Superoxiddismutasen nach der Erfindung^/erten kann, indem man die Verhinderung derselben Reaktion hervorruft, wie sie oben erwähnt wurde, indem man unmittelbar 1 ml einer Lösung von Superoxidionen, hergestellt durch elektrochemische Reduktion (J.M.Cord, I.Fridoviteh,- J-B.C, Band 244, 25 (1969), Seiten 6049 bis 6055) in 2 ml einer Lösung, enthaltend 0,5 ,uMol Luminol und 0,17 mMol Phosphatpuffer von pH 7,8; einführt.

Als Abwandlung kann man die Aktivität von Superoxiddismutasen nach der Erfindung wie folgt bewerten. In die oben erwähnte Küvette führt man O,3 ml 1 Mol Glycin-NaOH-Puffer von pH 9, O,3 ml neutralisiertes 1O~ Mol EDTA, 1,1 ml 10 Mol Flavin-mononucleotid und 0,3 ml Luminol (2p mg/70 ml)

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ein. Man setzt 1 ml 10 Mol NaBH₄ zu. Unter diesen Bedin-

* —7 —8 gungen erhält man ein Auswertungssignal bei 10 bis 10 A bei einer Spannung von 15OO Volt. Es sei bemerkt, daß die NaBH.-Lösung unmittelbar vorher hergestellt werden soll, während das Luminol unter Lichtabschluß bei O⁰C aufbewahrt und getrennt der Reaktionsmischung zugesetzt werden soll. Die Zugabe von Superoxiddismutase zu diesem System ruft eine gewisse Verhinderung des Lichtsignales hervor, die linear mit der Enzymmenge bis zu einem Ausmaß von 75 % schwankt.

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Nach noch einer anderen Abwandlung kann man die Aktivität der Superoxiddismutäsen bewerten, indem man eine Reaktionsmischung benutzt, die aus 0,3 ml 1 Mol Glycin-NaOH-Puffer von pH 9, 0,3 ml 10 Mol EDTA 1,1 ml Wasser und 0,3 ml

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10 Mol Luminol besteht. Man versetzt die Mischung mit 5 ,ul Xanthin-Oxydase (1 mg/ml) und einer aliquoten Menge Superoxiddismutase. Man setzt 1 ml Hypoxanthin zu (0,3 ml 10 Mol Hypoxanthin,im letzten Augenblick mit Wasser bis auf 10 ml verdünnt). Es sei betont, daß das Luminol, das bei O⁰C unter Lichtabschluß aufbewahrt werden muß, dem Reaktionsgemisch getrennt zuzusetzen ist.

Das für die Untersuchung der Vergleichsprobe (ohne Super-

—8 oxiddismutase) erhaltene Signal ist etwa 10 A bei einer Spannung von 1500 Volt, und die Verhinderung des Lichtsignals ist linear und proportional der Superoxiddismutasemenge bis zu 50 ■%.

Nimmt man an, daß unter geeigneten Bedingungen die ^fMetallionen Fe , Ni und Co zur Entstehung von Superoxidradikalen führen können, so kann man sich dem Problem der Oxidation von Lipiden, insbesondere solche: enthaltenden Nahrungsmitteln, zuneigen, und man hat sich so dem Reaktionsmechanismus unter Bildung von Superoxidionen durch ein System mit den genannten Metallionen und einer^ geeigneten Ligandei)genähert. Dann konnte man feststellen, daß die üblicherweise in der Nahrungsmittelindustrie benutzten Antioxidantien , wie die Kettenunterbrecher mit freien Radikalen

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vom Typ des Pyrogallols/beispielsweise Propylgallat oder die Verhinderer zur Erzeugung von freien Radikalen, wie EDTA und Ascorbinsäure/ gegen jede Erwartung gewisse Oxidationen effektiv begünstigen können, die, sei es auf enzymatischem Wege, sei es unter dem Einfluß von Metallionen, katalysiert werden, statt als Antioxidantien zu wirken, wie man es hierbei erwartete.

Es wurde nun festgestellt, daß unter geeigneten pH-Bedingungen die Superoxiddismutasen nach der Erfindung oxidierende Systeme inhibieren, wie solche, die aus., elektroche-

— 2+

misch erzeugten Ionen O- · / FMNH₂/O₂ oder den Ionen Fe ,

2+ 2+

Ni oder Co in wässrigen Lösungen molekularen Sauerstoffes in Gegenwart geeigneter Liganden bestehen. So hat sich gezeigt, daß sieben Einheiten aus Photobacterium leiognathi extrahierte Superoxiddismutase zu 16,5 % die

2+

Lichtemission infolge der Wirkung des Systems Co /O₂/ Tetraglycin auf das Luminol 2 pH 9,7 und zu etwa 40 %

2+ * diejenige auf Grund der Wirkung des Systems Ni /O₂/ Cyanid auf Luminol bei pH 9 verhindern.

Es konnte gezeigt werden/ daß die Superoxiddismutasen wirksam die Lipide und die Antioxidantien sowie andere üblicherweise in der Nahrungsmittelindustrie benutzte Konservierungsmittel schützen, indem sie sehr stark die mit der Produktion des Superoxidions O₂" verbundenen Reaktionen verhindern. Insbesondere wurde festgestellt, daß die Aut-oxidation der aus

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Anchoveta stammenden ungesättigten Lipide durch Superoxiddismutasen sehr stark behindert wird. Außerdem haben andere Versuche ergeben, daß Superoxiddismutasen eine Schutzwirkung gegen Autoxidation gewisser Antioxidantien, insbesondere solcher, wie sie zur Konservierung von Nahrungsmitteln benutzt werden, z.B. Pyrogallol oder Ascorbinsäure, ausüben.

Unter einem anderen Gesichtspunkt betrifft infolgedessen . die Erfindung Nahrungsmittelzusammensetzungen oder Zusammensetzungen, die aus Bakterien- oder Virusstämmen oder Kulturmilieus erhalten sind und in Vereinigung mit diesen Nahrungsmitteln Bakterien oder Viren oder anderen Milieuprinzipien vorliegen, die eine wirksame Menge eines Superoxiddismutaseenzyms enthalten.

Es ist klar, daß die mit den zu schützenden Substanzen zu vereinigenden Superoxiddismutaseenzyinmengen nicht kritisch sind und die Ermittlung der für jeden Fall geeignetsten

»■

Mengen dem Fachmann überlassen bleibt. Routineversuche gestatten, den Wirkungsgrad des durch das Enzym angestrebten Schutzes zu ermitteln und anzupassen oder gegebenenfalls die Menge des letzteren entsprechend zu modifizieren, wobei man sich ähnlicher Aktivitätsprüfungen bedient, wie sie oben beschrieben wurden. Beispielsweise kann man jedoch präzisieren, daß Superoxiddismutaseenzyinmengen von 1 bis 100 Einheiten je ml oder Gramm für den Schutz von autoxidierbaren Substanzen, wie sie oben definiert wurden, besonders

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geeignet sind.

Wie vorstehend nachgewiesen wurde, schützen die Superoxiddismutaserjwirksam die Lipide und Antioxidantien sowie andere Konservierungsmittel, die gewöhnlich in der Nahrungsmittelindustrie verwendet werden, indem sie sehr stark die mit der Erzeugung von Superoxidion O₂* verbundenen Reaktionen verhindern. Insbesondere wurde festgestellt, daß die Autoxidation der aus Fischen stammenden ungesättigten Lipide stark durch Superoxiddismutasen eingeschränkt wird. Außerdem haben andere Versuche gezeigt, daß Superoxiddismutasen eine Schutzwirkung gegen Selbstoxidation gewisser Antioxidantien, insbesondere solcher, wie sie für die Konservierung von Lebensmitteln benutzt werden, z.B. Pyrogallol oder As-

corbinsäure, ausüben.

Nachstehend wird die Erfindung an Hand von Beispielen ohne Beschränkung näher beschrieben.

Beispiel 1

Bakterien von Photobacterium leiognathi des Stammes Nr.ATCC 25 521 wurden auf einem künstlichen Nährboden gezüchtet, der in g/l enthielt:

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NaCl 30

D ' 18,7

KH₂PO₄ 2

MgSO₄, 7H₂O 0,2

(NH₄J₂HPO₄ 0,5

Glukose 1,5

Glycerin ' ' 1,5

Trypticase 5

Hefeextrakt - 5

Mit Natronlauge stellt man dieses Milieu auf pH 7,2 ein und sterilisiert es 1 Stunde bei 110°C.

Man bedient sich einer über Nacht gewachsenen Vorkultur von 1 Liter und verteilt auf vier Erlenmeyer-Kolben mit je 250 ml Nährboden, um einen Gärbehälter von 12 Liter Nährboden zu impfen.

Die Kultur wird 12 Stunden lang bei 20⁰C unter starker Belüftung gehalten, und man erhält so 100 g Bakterien, ausgedrückt als Gewicht des befeuchteten Produktes.

135 g befeuchtete Bakterien von Photobacterium leiögnathi aus mehreren Züchtungen werden in 650 ml Wasser dispergiert und über Nacht bei 4°C ruhen-gelassen. Man versetzt mit 2 η Ammoniak,bis das Milieu pH 7 bis 8 erreicht hat,und setzt anschließend 18 ml 3 Mol KCl zu. Die Mischung wird auf

58 C gebracht und vier Minuten bei dieser Temperatur gehalten, worauf man bis auf 4 C abkühlt und 10 Minuten bei einer

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Geschwindigkeit von 10 000 U/min zentrifugiert. Während man immer bei 4 C arbeitet, stellt man die überstehenden Flüssigkeiten auf 35 % Sättigung mit festem Ammoniumsulfat bei pH 8 ein, schleudert ab und bringt die Überstandsflüssigkeit auf 75 % Sättigung an Ammoniumsulfat und läßt über Nacht bei 4°C stehen. Durch Abschleudern gewinnt man das ausgefällte Protein und bewahrt es in einer 75 %-igen Ammoniumsulfatlösung auf.

Die Aktivität einer Lösung von 9 mg Protein/ml (Biuret) war 40 Einheiten/mg, während sie zum Vergleich für die Katalase in Lösung von 9 mg Protein/ml bei 0 Einheiten/mg lag.

Nach einer neuen fraktionierten Ausfällung mittels Ammoniumsulfat mit einem Konzentrationsgradienten von 35 bis 75 % Sättigung erhält man eine Superoxiddismutase, die in Lösung von 14,8 mg Protein/ml (Biuret) eine Aktivität von 134 Einheiten/mg bis 500 Einheiten/mg besitzt. Den Pröteinniederschlag löst man in Phosphatpuffer von pH 7,8 und dialysiert 48 Stunden bei 4°C. Das Superoxiddismutaseenzym bewahrt man bei -20°C auf.

um dessen Aktivität zu bestimmen, benutzt man eine vor einen Photomultiplikator gesetzte Küvette, die nachstehende Reaktionsmischung enthält:

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Luminol 1O~³ Mol 0,3 ml

Phosphatpuffer 10~³ Mol pH 7,8 0,3 ml

EDTA 1O~³ Mol - 0,3 ml

Wasser 1,0 ml

Xanthinoxydase (1 mg/ml) 0,050 ml

Man initiiert die Reaktion, indem man in die Küvette' 1 ml

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Hypoxanthin von 3 χ 10 Mol gibt. Dann wird ein Photonenfluß emittiert, der unter der Wirkung des Photomultiplikators einen Strom entstehen läßt, dessen Intensität sowie Intensitätsschwankungen am Picoamperemeter gemessen und aufgezeichnet werden.

Wenn man in die Reaktionsmischung vor der Auslösung der Reaktion 5 ,ul einer Superoxiddismutaselösung einführt, die in vorstehender Weise hergestellt wurde, erhält man eine Beeinträchtigung der Lichtemission, und es wird willkürlich angenommen, daß eine Einheit Suparoxiddismutaseenzym die Enzymmenge sein würde, die eine Verhinderung von 50 % der Lichtemission hervorruft. Bai der UV-Spektroskopie*liefert die extrahierte Superoxiddismutase das bekannte Spektrum von nichthämatinischen Proteinen mit einer Tryptophanschulter bei 290 m,u.

Zur Bestimmung ihres Molekulargewichtes benutzt man zwei bekannte Methoden: die eine besteht in der Bestimmung eines Zentrifugiergradienten an Saccharose_;und im anderen Fall setzt man ein Sephadexgel G 200 ein. um dies zu bewirken, benutzt man folgende Markierungsmittel von bekannten Molekulargewichten: - 22 -

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Hefe-ADH Molgewicht

Rinderalbumin 150 000

Peroxydase 66 000

Es wird auf ein Molekulargewicht von 40 000 - 2500 geschlossen.

Um die Bausteine der Proteinstruktur des Enzyms zu bestimmen, wird eine Elektrophorese in Polyacrylamidgel, versetzt mit SDS (Natriumdedecylsulfat) von 10 %,durchgeführt. Man beobachtet eine einzige Bausteinart vom Molekulargewicht etwa 21 000. Das Molekulargewicht der erhaltenen Superoxiddismutase kann also zu 21 000 χ 2, d.h. 42 000, geschätzt werden, ebenfalls auf dem Polyacrylamidgel erhält man ein rotes Band in Gegenwar t von Bathophenantrolin und Hydrazin genau auf dem Niveau des durch Coomassieblau entwickelten Superoxiddismutasebandes.

Bei einer colorimetrischen Analyse einer Proteinlösung erhält man für das Eisen einen Wert, der bei Schätzung des Molekulargewichtes des Enzyms zu 42 000 etwa 2 Atome Eisen je Molekül ergibt. Eine Atomabsorptionsspektrometrie einer Proteinlösung von 0,2 mg/ml bestätigt diesen Wert. Man kann also verhältnismäßig auf 2 die Atomanzahl Eisen je Mol Superoxiddismutase schätzen. Andererseits hat das gemäß diesem Beispiel extrahierte Enzym gezeigt, daß es keinem merklichen Aktivitätsverlust nach 5 Minuten bei einer Temperatur von 70 C unterliegt. Eine Elektrofocalisation der Super-

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oxiddismutase gestattet, den pHi-Wert oder isoelektrischen Punkt dieses Enzyms zu 4,4 zu bewerten. Das Enzym besitzt eine Höchstaktivität bei pH etwa 9,5.

Man erhält ein identisches Enzym mit ähnlichen Eigenschaften aus einem Bakteriumstamm von Photobacterium leiognathi Wr.ATCG 25 587.

Beispiel 2

Eine Bakterienkultur von Photobacterium sepia des Stammes Nr.ATCC 15 709 wird einer Lysierung unterzogen, indem man sie im Verhältnis von 1 g Bakterienfeuchtgewicht auf 4 ml Wasser in kaltem Wasser rührt. Anschließend wird 20 Minuten bei 4°C und 16 000 U/min zentrifugiert. Der gelben, klaren überstandslauge fügt man 3 Mol KCl bis zu einer Endkonzentration von 0,1 Mol zu. Die Lösung erhitzt man 3 bis 4 Minuten in einem auf 60 C gehaltenen Wasserbad, kühlt anschließend auf 4°C und klärt durch Abschleudern. Die Überstandsflüssigkeit unterzieht man einer fraktionierten Fällung durch Zugabe von festem Ammoniumsulfat. Die aktive Fraktion fällt zwischen 45 und 75 % Sättigung an Ammoniumsulfat aus und wird durch Abschleudern abgetrennt. Man löst sie wieder im Mindestvolumen von 5 X 10 Mol K₃HPO₄ bei pH 7,8 und dialysiert über Nacht gegen denselben Phosphatpuffer. Das Produkt dieser Dialyse wird dann auf eine Kolonne aus Sepahadexgel G 100 oder G 200 geleitet, die mit 5 χ ίο" Mol Phosphatpuffer von pH 7,8 äquilibriert. ^D:i-^e eluierte aktive

• - 24 -

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Fraktion wird mittels einer Ultrazentrifugiermembran Diaflo PM--10 konzentriert und anschließend über Nacht gegen 5 χ 10 Mol K₃HPO₄ von pH 7,8 dialysiert.

Man absorbiert das Superoxiddismutaseenzym auf einer Kolonne aus DEAE-Sephadex A-50, abgepuffert mit 5 χ 1O~ Mol K₃HPO₄ von pH 7,8. Das Protein wird aus der Kolonne mit einem linearen K₃HPO₄-Gradienten bei pH 7,8 (von 5 χ 10 Mol auf 3 χ lo" Mol) eluiert. Die Superoxiddismutase wird so bei einer Konzentration an Phosphat von 1,4 χ 10 Mol eluiert und anschließend konzentriert. Eine nochmalige Filtration erfolgt unter denselben Bedingungen wie vorstehend auf einer Kolonne aus DEAE-Sephadex A-50. Das Enzym wird so bei einer Konzentration an Phosphat von 1,6 χ 10 Mol eluiert und konzentriert.

Das so extrahierte und gereinigte Protein gibt eineeinzige. Bandöbei der Elektrophorese an Acrylamidgel (100 »ug Protein je 1 Gel). Man erhält so 3 mg reine Superoxiddismutase aus 20 g erstarrten Zellen von Photobacterium sepia (mit einer Superoxiddismutaseaktivität von 250 bis 5000 Einheiten/mg). Das aktive Enzym hält sich über einen langen Zeitraum, wenn man es in einer 70 bis 80 %-igen (NH₄)₂SO₄~Lösung bei 4°C konserviert.

Das Molekulargewicht des mittels einer Ultrazentrifugierung bei 45 000 U/min während 16 Stunden bei 4 C gereinigten Enzyms wird bestimmt. Man mißt die Absetzgeschwindigkeit

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nach der Methode von Martin und Ames mit' einem linearen Gradienten an Sucrose von 5 bis 20 (als Gewicht/Volumen) und unter Benutzung eines Bekmah-Spinco-Gerätes Modell L-2-65 B mit einem Rotor SW 65 K. Es findet sich ein Absetzkoeffizient von 3,2 für diese Dismutase gegenüber einem Koeffizienten von 4,82 bzw. 7,4 für Alkoholdeshydrogenase aus Pferdeleber und Hefe. Aus dieser Sedimentationskonstante wird dann das Molekulargewicht der extrahierten Superoxiddismutase zu etwa 42 500 berechnet. Andererseits wurde festgestellt, daß das Molekül dieses Proteins 2 Atome Eisen enthält. "

Die Elektrophorese an Acrylamidgelen ergibt für die Dismutase eineeinzige Bandfy entsprechend einem Molekulargewicht von 20 000 bis 20 500, wonach das proteinische Molekül aus zwei identischen Bausteinen zusammengesetzt ist.

Die Superoxiddismutase erweist sich im übrigen als sehr beständig gegen die proteolytische Wirkung des Trypsins, weil eine 60-minütige Behandlung von 150 .ug dieser Superoxiddismutase mit 10 ,ug Trypsin bei 20°C zu keinerlei Veränderung in der enzymatisehen Aktivität und auch nicht in der elektrophoretischen Beweglichkeit des nichtdissoziierten Proteins führt. Das erhaltene Enzym ist sehr beständig gegenüber Wärme: keinerlei Verlust an enzymatischer Aktivität tritt nach 30 Minuten bei 20°C, 30°C und selbst- 40°C auf; nach 15 Minuten bei 50°C erscheint eine Aktivitätsminderung von 28 %; nach 30 Minuten bei 50°C ist der Aktivitätsverlust

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immer noch nur 50 %,und er ist -nur 10 % und 50 % nach 3 Minuten beziehungsweise 10 Minuten bei SO⁰C.

Eine Elektrofocalisation der Superoxiddismutasa gestattet, den pHi-Wert oder isoelektrischen Punkt dieses Enzyms zu 4,1 zu bewerten. Mittels einer Lösung von Superoxidionen O₂" , hergestellt auf elektrolytischem Wege, stellt man fest, daß das Enzym ein Aktivitätsmaximum bei pH 8,5 bis 10 mit einem Optimum bei pH 9,5 bietet.

Beispiel 3

Ein Stamm Nr.ATCC 11 040 von Photobacerium phosphoreum-Bakterien, die Seebakterien sind und infolgedessen eine starke innere Salzkonzentration aufweisen, wird behandelt.

-3 Die Lysierung der Bakterien erfolgt spontan in einer 10 Mol EDTA-Lösung bei pH 7,8.

Die Zelltrümmer werden mittels 20 minutenlanger Zentrifugierung bei 16 000 U/min und O⁰C entfernt. Voruntersuchungen haben gezeigt, daß das Superoxiddismutaseenzym bei 50⁰C beständig war, und daher werden die anderen Proteine, die selbst thermolabil sind, beseitigt, indem man das Lysat 3 Minuten auf 50⁰C nach Zugabe von KCl bis zur Molarität von 0,1 hält und die denaturierten Proteine durch bekannte Abschleuderung abtrennt. Anschließend wird bei 0⁰C gearbeitet. Bei dieser Temperatur führt man eine fraktionierte Fällung mittels Ammoniumsulfat (NK₄)₂ ^SO4 durch, das in solcher Menge zugesetzt wird, daß die Mischung oder der behandelte Enzymextrakt auf

- 27 -

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einen Konzentrationsgradienten von O auf etwa 30 der Sättigung bei 4°C gebracht wird. Die ausgefällte Fraktion wird entfernt, indem man 45 Minuten bei 16 000 U/min und O⁰C zentrifugiert. Der überstehenden Flüssigkeit setzt man die erforderliche Menge neutrales Ammoniumsulfat zu, um sie auf 75 % der Sättigung bei 4°C zu bringen. Man vereinigt die ausgefällte Fraktion durch eine Zentrifugierung analog der vorstehenden.

Zwecks Reinigung der so extrahierten Superoxiddismutase löst man den gesammelten Niederschlag in ein wenig 5 χ 10 Mol Phosphatpuffer von pH 7,8 und dialysiert gegen denselben Puffer 48 Stunden lang bei 4°C, um einen Extrakt (A) zu erhalten. Dann trennt man die noch vorhandenen Proteine in Funktion ihrer Molekularabstufung mittels eines Sephadexgels G 100, dessen Körner eine solche Netzstruktur haben, daß die Proteine mit höherem Molekulargewicht als 100 0OO ausgeschlossen werden, die daher sehr rasch zur Außenseite des Gels austreten. Die Moleküle von kleinerem Molekulargewicht dringen in das Gel ein und werden daraus mehr oder weniger rasch nach· ihrer Struktur eluiert. Zu diesem Zweck läßt man das Sephadexharz 3 Stunden in Wasser quellen, entgast es und filtriert über einem Büchner-Trichter, um das Wasser zu entfernen. Man legt es in den Filtrationspuffer und gibt es in eine Kolonne,von 50 cm Länge bei 3 cm Innendurchmesser. Die Kolonne wird durch Leitung von 2 Liter Pufferlösung ins Gleichgewicht gebracht. Zuvor wurde der

- 28 -

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Enzymextrakt (A), der aus der Dialyse stammte, aufgenommen/ um ihn auf einer Diaflo-Millipormembran (P.M.-10) unter Stickstoffdruck bis auf 1 Volumen von 5 ml zu konzentrieren. Dieses Konzentrat wird auf die wie vorstehend vorbereitete Kolonne gegeben und mittels Durchleitung von 500 ml 5 χ 10 Mol Phosphatpuffer von 7,8 eluiert. Der Durchsatz beträgt je 1 Tropfen alle 6 Sekunden, und man fängt Fraktionen von 2,5 ml auf. Diese mit merklicher Aktivität werden vereinigt und auf einer Diaflo-Membran konzentriert. Man erhält so einen konzentrierten Extrakt (B).

Man führt eine neue Reinigungsstufe durch Chromatographie auf einem Ionenaustauschharz auf Grundlage von DEAE-Sephadex durch. Auf diesem Harz werden die Proteine nach ihrer Ladung durch Puffer von zunehmender Ionenstärke eluiert. Zur Vorbereitung der Kolonne wird sie in Wasser quellengelassen, dann entgast und mit folgenden Lösungen gewaschen:.

NaOH 0,5 Mol ^%

KH₂PO₄ 0,5 Mol

Dabei sorgt man dafür, daß das Harz nach jeder Stufe mit destilliertem Wasser bis zu einem pH-Wert nahe der Neutralität gespült wird. Nach Filtration auf dem Büchner-Trichter wird das Harz in 0,1 Mol Phosphatpuffer von pH 7,8 suspendiert und in eine Kolonne von 30 cm Länge bei 3 cm Innendurchmesser gegeben. Die Kolonne wird ins Gleichgewicht gebracht, indem man 300 ml 0,1 Mol Puffer durchfließen läßt.

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Auf die so vorbereitete Kolonne wird der konzentrierte Extrakt (B) gegeben. Wenn dieser Extrakt vollständig absorbiert ist, eluiert man mit 500 ml Phosphatpuffer von 7,8, bestehend aus 250 ml 0,1 Mol Phosphatpuffer, dem nach und nach 250 ml 0,5 Mol Phosphatpuffer zugesetzt werden. Der Durchfluß beträgt je 1 Tropfen alle 5 Sekunden, und das Volumen der aufgefangenen Fraktionen ist 2,5 ml. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt, mit Ammoniumsulfat ausgefällt und dann in dieser Form bei -18 bis -20⁰C aufbewahrt.

Die Reinheit des Superoxiddismutaseenzyms kann durch Elektrophorese auf Polyacrylamidgel kontrolliert werden. Eine Bestimmung des Molekulargewichtes des Enzyms mittels einer Untersuchung der Eluierung während einer Filtration über Sephadex G 200 gestattet, mittels der Relation Log(PM)=f (Eluiervolumen) und bekannter Markierungen dem Superoxiddismutaseextrakt eil. Molekulargewicht von etwa 40 000 zuzuschreiben. Dieses Molekulargewicht wurde auch durch· eine Sucrose-Stufenzentrifugierung ermittelt: Man gießt ⁴SuCrOSeabstufungen von 5 bis 20 % in 5 χ 10 Mol Phosphatpuffer von 7,8,indem man progressiv 2,60 ml der 20 %-igen Lösung 225 ml der 5 %-igen Lösung in einer geeigneten Vorrichtung zumischt. Auf diese Sucroseabstufungen gibt man verschiedene Markierungsproteine von bekanntem Molekulargewicht und Superoxiddismutase. Das Gleichgewicht stellt man durch eine Zentrifugierung bei 45 000 U/min und 5°C während 22 Stunden her. Dann werden die Rohre am Boden durchlocht und Fraktionen von je 10 Tropfen aufgefangen, an denen die enzymatischen

- 3o -

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- 3ο -

Aktivitäten gemessen werden/ welche die verschiedenen benutzten Markierungsproteine bieten. Nachdem man die Gerade aufgezeichnet hat, welche die Molekulargewichtsänderung als Funktion der Nummer der Elutionsfraktion wiedergibt, wertet man das Molekulargewicht der extrahierten Superoxiddismutase von Photobacterium phosphoreum zu etwa 40 OOÖ, was das vorstehende Ergebnis bestätigt.

um das Molekulargewicht der Bausteine des Proteins zu ermitteln, unterzieht man letzteres sowie die Markierungsproteine, deren Bausteine bekanntes Molekulargewicht haben, einer elektrophoretischen Wanderung auf Polyacrylamidgel in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat. Die graphische Auflösung der gefundenen Werte gestattet, dem Molekulargewicht jedes Bausteines des Superoxiddismutasemoleküls den Wert von 20 000 zuzuschreiben.

Das Superoxiddismutasemolekül erweist sich noch bei 50 C als sehr beständig und besitzt ein enzymatisches Aktivitätsmaximura bei pH etwa 9,5. Eine Elektrofocalisierung der Superoxiddismutase führt zur Bewertung des pHi-Wertes oder isoelektrischen Punktes dieses Enzyms zu 4,2. Eine colorimetrische Prüfung, wie vorstehend beschrieben, gestattet, das Vorhandensein von Ferro-Eisen im Protein aufzuzeigen. Auf dem Niveau des Proteinbandes in einem elektrischen Wanderungsgel, dem zuvor Bathophenanthrolin zugegeben ist, erscheint ein rosa Ring. Die Atomanzahl Ferro-Eisen je Molekül wurde als praktisch = 2 ermittelt. Andererseits

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wurde die Verhinderung der Autoxydase gewisser Verbindungen unter der Wirkung der Superoxiddismutäsen (SOD) durch folgende Methode bestimmt: · ·

Beispiel 4

Man stellt eine Lösung von 2,5 χ ίο" Mol Pyrogallol in Phosphatpuffer von 2,0 χ 10 Mol K₂HPO₄ von 7,7 her. Diese* Lösung (A) hat ein Volumen von 3 ml. Für verschiedene Systeme wird das Anwachsen der optischen Dichte (DO) bei 440 m .u/min gemessen und daraus die prozentuale Verhinderung für jedes der folgenden Systeme abgeleitet:

Anwachsen von DO

bei 440 m ,u/min Inhibierung

(A) 0,031

(A) + 25 Einheiten SOD
von Photobacterium
leiognathi (roh) O,O29 6,5

(A) + 250 Einheiten SOD
von Photobacterium
leiognathi (roh) 0,004 87

(A) + 4 ,ug Katalase 0,046

Man sieht also, daß diese Superoxiddismutase einen außergewöhnlichen Verhinderungseffekt gegen die Autoxydation von Pyrogallol hat.

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Beispiel 5

Man arbeitet wie in Beispiel 4 mit dem Unterschied/ daß

das in Lösung in dem Phosphatpuffer eingesetzte Pyrogallol

-4 ■ —4 -4

5,0 χ 10 Mol, 2 χ 10 ,beziehungsweise 10 Mol, betrug.

Die erhaltenen Lösungen sind mit (B), (C) und (D) bezeichnet. Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten:

Anwachsen von DO Inhibierung bei 440 m.u/min (xlO) %

5 χ lo"⁴ Mol Pyrogallol (in 2,0 χ ΙΟ*"² Mol Phosphatpuffer von pH 7,7)

(B) 0,175

(BX + 5 Einheiten SOD
von Photobacterium
leiognathi (roh) 0,070 60

(B) + 10 Einheiten "^II" 0,043 75

(B) + 50 Einheiten """ 0,004 98

(B) +200 Einheiten ^ni>" 0,001 99,5

(B) + 4 ,ug Katalase 0,135

Pyrogallol 2 χ 10~⁴ Mol (id.)

(C) 0,054

(C) + 25 Einheiten SOD
von Photobacterium
leiognathi (roh) 0,026 52

(C) + 5 Einheiten """ 0,012 78

(C) + 10 Einheiten """ 0,005 91

Pyrogallol lo"⁴ Mol (id.)

(D) 0,030

(D) + 1 Einheit SOD

von Photobacterium

leiognathi (roh) 0,013 57

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Beispiel 6

-4
10 Mol Pyrogallollösungen werden in Phosphatpuffer

5 χ 10~ Mol beziehungsweise 2 χ 1O~*² Mol K₃HPO₄ bei pH 7,7, gesättigt mit molekularem Sauerstoff, zubereitet. Diese Lösungen (E) und (F) haben ein Volumen von 2,5 ml. Das Anwachsen der optischen Dichte bei 440 m .u/min wird gemessen und daraus die prozentuale Verhinderung abgeleitet.

Anwachsen von DO - Inhibierung bei 440 m.u/min (x 10) %

K2HPO4 5 xl0~2 MOl	χ 1 Einheit SOD von Photobacterium leiognathi	0,365
(E)	+ 5 Einheiten "^1"	0,275
(E)	+10 Einheiten """	0,183
(E)	+20 Einheiten """	0,063
(E)	K2HPO4 2 χ 10"2 Mol	0,018
(E)

25 50 83 95

(F) O,O62

(F) χ 10 Einheiten SOD
Photobacterium
leiognathi 0,016 74

Es ist zu bemerken, daß die Enzymeinheit in 2,5 ml einem

—Q

Enzym von 2 χ 10 Mol entspricht.

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Beispiel 7

Es wird eine 1O~⁴ Mol Äscorbinsäurelösung in 2 χ 1O~² Mol

Phosphatpuffer von pH 7,7 hergestellt. Die Veränderung der

optischen Dichte (DO) bei 265 m,u/miri wird für jedes der folgenden Systeme gemessen:

Veränderung von DO Inhibierung

bei 265 m.u/min %

Vergleich 0,016

ⁿ + 7,5 Einheiten SOD
von Photobacterium

leiognathi (roh) 0,005 69

" + 10 Einheiten "*" 0 1OO

" + 15 :Einheiten "^w" 0 100

" + 20 Einheiten """ 0 100

Beispiel 8

Man arbeitet wie im Beispiel 7 mit dem Unterschied, daß die

-4 -2

10 Mol Ascorbinsäure in einem 5 χ 10 Mol Phosphatpuffer

von pH 8,8 in Lösung gebracht wird.

Veränderung von DO Inhibierung bei 265 m,u/min %

Vergleich 0,031

" +7,5 Einheiten SOD
von Photobacterium
leiognathi (roh) 0,011 . 65

" + IO Einheiten """ 0,004 87

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Beispiel 9

Die Wirkung von Superoxiddismutasen auf die Oxidation von Luminol,katalysiert durch Metallionen, wurde wie folgt bestimmt: ·

I max (χ 10 Inhibierung quanta/s/ml) %

oxydierendes katalytisches System: CO /Oj/NI^OAc/ Dihydroxy-

f umar* säure *

pH 9,0 Vergleich 16 2

" + 140 Einheiten SOD von Photobacterium sepia 7,3 55

pH 9,8 Vergleich 16,5

" + 140 Einheiten

11,0 33

oxydierendes katalytisches System: Ni²⁺/O₂/NH.0Ac/ Dihydroxy-

fumai> säure

pH 9,0 Vergleich 4,7

" + 140 Einheiten SOD von Photobacterium sepia 0,88 81

pH 9,8 Vergleich 240 * -

" + 140 Einheiten

" " 80 67

Beispiel 10

Eine Suspension von 10 % Gewicht je Volumen von Anchovetalipid in einem 0,1 Mol Phosphatpuffer von pH 8 wird hergestellt. Hierzu wird Superoxxddismutase von Photobacterium leiognathi roh im Verhältnis von 0,01 Gew.-% Enzym je Ver-

-

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hältnis an Lipid, d.h. 0,1 iug Rohenzym je Gramm Lipid, gegeben.

In einem Warburg-Gerät wird der Sauerstoffverbrauch durch dieses System gemessen, indem man jedesmal ihn auf den mit dem Vergleichslipid derselben Zusammensetzung erhaltenen Wert, jedoch ohne Berücksichtigung des Superoxiddismutasezusatzes, vergleicht- Die Messungen werden in aufeinanderfolgenden Zeitabständen durchgeführt, und die erhaltenen Ergebnisse werden in Form einer prozentualen Verhinderung der Oxidation gegenüber der Vergleichssubstanz ohne Berücksichtigung der Zugabe der Superoxiddismutase ausgedrückt.

Zeit in Stunden 0-24 24-40 40-42 42-44 % Inhibierung 61 74 72 78

Beispiel 11

Man verwendet 5 g frische Pilze "Champignons de Paris¹¹, die in feine Scheiben geschnitten und von ihren farbigen Lamellen befreit sind, denn diese könnten die Färbung des Milieus stören und die Auswertung des Ergebnisses erschweren. Die so vorbereiteten Pilze werden in mehrere Becher von lOOml verteilt und in jeden führte man anschließend 50 ml einer auf pH 7,8 abgepufferten Lösung (0,01 Mol Phosphatpuffer) ein, die 0,02 % Ascorbinsäure enthält. In einen der Becher gibt man 50 Einheiten Superoxiddismutase von Photobacterium leiognathi des Stammes Nr.ATCC 25 521. Jeden Becher bedeckt

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man mit einem doppelten Papierblatt und läßt bei Laboratoriumstemperatur stehen. Nach 40 Stunden wird die optische Dichte bei 600 m.u der überstehenden Flüssigkeit jeden Bechers untersucht: die gefundene optische Dichte gestattet, ein Anwachsen der optischen Dichte von 0,173 im Mittel für die Vergleichsmuster abzuleiten, während das Anwachsen der optischen Dichte nur 0,002 für die Überstandsflüssigkeit beträgt, welche Superoxiddismutase enthält. Die Oxidation in dem so behandelten Becher ist also 47 % niedriger als diejenige in den Vergleichsbechern. *

Beispiel 12

Apfelscheiben werden in eine Lösung von drei Einheiten Superoxiddismutase von Photobacterium leiognathi des Stammes Nr. ATCC 25 521 je ml in einem Phosphatpuffer bei pH 7,8 eingelegt. Nach einigen Minuten werden die Apfelscheiben aus der Lösung genommen und in Petri-Sehalen gelegt, wo sie belassen werden; nach einigen Tagen vergleicht man die so aufbewahrten Scheiben mit ebenso zubereiteten Scheiben, die aber ohne Behandlung mit einer Superoxiddismutase aufbewahrt wurden. Letztere sehen brauner aus als diejenigen, die nach der Erfindung erhalten wurden.

Beispiel 13

Kartoffelrundscheiben werden in Becher eingelegt, deren jeder drei Einheiten Superoxiddismutase von Photobacterium leiognathi des Stammes Nr. ATCC 25 521 je ml in Phosphatpuffer von pH

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7,8 erhält. Einige Minuten-darauf nimmt man sie heraus und legt sie dann in Petri-Schalen, wo man sie beläßt. Nach vier Tagen sehen die so behandelten Scheiben beträchtlich weniger oxidiert aus als identische Rundscheiben, die derselben Behandlung unterzogen wurden, jedoch ohne Zugabe von Superoxiddi smutas e.

Beispiel 14

Bekanntlich sind gewisse ÄRN-t-Hefeligasen Lipoproteine, in denen die enzymatische Aktivität eine Funktion der Unbeschädigtheit des Lipidteiles ist. Man verfügt hier also über ein Material, an dem man objektiv den Abbau .durch eine einfache Beurteilung der enzymatischen Aktivität feststellen kann und das infolge seiner im wesentlichen lipoproteinischen Konstitution als Modell für alle lipoproteinischen Nahrungsmittel genommen werden kann.

Die verwendeten Ligasen waren aus Hefezellen (Saccharomycetes cerevisiae) extrahiert. Zu Ihrer Gewinnung arbeitet man wie folgt; man züchtet Saccharomycetes cerevisiae-Stämme Nr. ATCC 9841 in einem Nährboden, der 30 g Glucose und 5 g Hefeextrakt enthält und läßt die Kultur sich bis zum Milieu der logarithmischen Wachstumsphase entwickeln. Anschließend wird zentrifugiert, dann wäscht man die Zellen und zerreibt sie in einerVorrichtung, die unter dem Namen "French Press" bekannt ist. So werden 67 g Hefe mit 67 ml Puffer (bestehend aus 0,01 Mol Tris von pH 8, O,01 Mol

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MgCl₂> 1 mMol EDTA, 10 % Glycerin und 2 mMol Phenylmethylsulfonimnfluorid) behandelt. Nach dreimaliger Wiederholung der Zerreibung in der als "French Pr.ess" bezeichneten Vorrichtung wird 3O Minuten bei 15 OOO U/min zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird wieder aufgenommen und nochmals 2 Stunden bei 50 OOO U/min zentrifugiert. Die Öberstandsflüssigkeit dieser letzten Zentrifugierung wird auf einer Kolonne aus DEAE-Cellulose DE-52 von 2 χ 36 cm gewaschen, die 80 g Cellulose enthält. Diese Kolonne war vorher durch 0,02 Mol Kaliumphosphatpuffer, O,O2 Mol Mercaptoäthanol, 1 mMol MgCl₂ und 10 % Glycerin ins Gleichgewicht gebracht. Nachdem diese Oberstandsflüssigkeit auf die Kolonne gegeben ist, wird mit 370 ml desselben Puffers gewaschen. Anschließend werden die Ligasen mit einem O,25 Mol Kaliumphosphatpuffer, 0,02 Mol Mercaptoäthanol, 1 mMol MgCl₂ und 10 % Glycerin eluiert.

Die optische Dichte der am Boden der Kolonne aufgefangenen Fraktionen wird bestimmt und daran die Aktivität mit*Lysin sowie mit den anderen Aminosäuren geprüft (die Aktivitätswerte sind in der folgenden Tabelle I zusammengestellt). Anschließend wird jeder Extrakt durch Ultrafiltration bis auf eine Proteinkonzentration von 10 mg/ml konzentriert und analysiert, indem man die Beladung an ARN-t mißt. Das benutzte Brütmilieu von 100 ,ul enthält 50 mMol ΝΉ orpholino-3-propan-schwefelsäure (pH 6,5) , 10 mMol MgCl₂, 2 mMol ATP (Adenosintriphosphorsäure), 400 pMol (Picomol) Lysin, markiert am Kohlenstoff 14, 10 Einheiten optischer Dichte

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bei 260 m.u Gesamthefe ARN-t.

Nach Babrütung während einer festgelegten Zeit werden 50 »ul Reaktionsmischung auf Whatmann-Papier DE-81 gegeben und 1 1/2 Stunde mit 8,7 %-iger Essigsäure und 2,5 %-iger Ameisensäure gewaschen- Anschließend wird das so gewaschene Papier getrocknet und auf den gebildeten Flecken eine Zählung mit Hilfe einer Szintillationskristallmischung auf Toluolbasis durchgeführt.

Um die Schutzleistung gegen Oxidation der ARN-t-Lysin-Hefeligase zu beurteilen, die von einer Superoxiddismutase geliefert wird, stellt man eine Lösung von 0,37 mg Lipoproteinen in 1 ml Phosphatpuffer (0,5 Mol) von pH 7,5 her und versetzt entweder mit 0,1 % Ascorbinsäure oder 90 Einheiten Superoxiddismutase von Photobacterium leiognathi des Stammes Nr.ATCC 25 521; in jedem Fall läßt man die Lösungen bei 4 C stehen, entnimmt zu verschiedenen Zeiten gleiche Anteile (siehe Tabelle I) und ermittelt die enzymatische Aktivität ,wie vorstehend angegeben.

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- 41 Tabelle I

Tage	ohne Schutz mittel	% Aktivität	mit 90 Einheiten Superoxiddi s- mutase von Photo- bacterium leiognathi
O	100	mit 0,1 % - Ascorbinsäure	100
2	81	100	97
4	€2	31	96
7	35	19	72
9	27	2,8	67
	1,2

Man erhält ähnliche Ergebnisse unter Benutzung derselben Anzahl von Einheiten Superoxiddismutasen aus Pleurotus olearius Gillet, Eschirichia coli des Stammes Nr.ATCC 15 224 oder Erythrocuprein.

Beispiel 15

Zwecks Bestimmung des Schutzes von Bakterien gegen Oxidation durch eine Superoxiddismutase benutzt man Leuchtbakterien von Photobacterium leiognathi des Stammes Nr.ATCC 25 521, deren Oxidation man künstlich durch Photoreduktion des PMN beschleunigt, um die Schutzerscheinung innerhalb eines kürzeren Zeitabstandes erkennbar zu machen. Die'Bakterien werden bei 28°c auf einem Nährboden, enthaltend 8 g Nährbrühe, 10 g NaCl, 14 g Na₃HPO₄, .2 g KH₃PO₄, mit Wasser aufgefüllt

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auf lOOO ml und eingestellt auf "pH 7, gezüchtet. Die Zählung der Zellen erfolgt durch Ausbreitung von 0,1 ml einer Bakterienlösung, verdünnt mit physiologischer Kochsalzlösung, auf Petri-Schalen, die auf 25°C gehalten sind und einen Nährboden enthalten, der aus 8 g Nährbrühe, 10 .g NaCl, 15 g Agar-Agar,aufgefüllt mit Wasser bis auf 1000 ml, besteht, und dessen pH-Wert auf 7 eingestellt ist.

Man zentrifugiert eine Kultur von 100 ml Photobacterium leiognathi mit exponentieller Zunahme (ihre optische Dichte bei 600 m.u ist 0,3) bei einer Geschwindigkeit von IO 000 ü/min 10 Minuten lang bei 3°C. Der Bodensatz von der Zentrifugierung wird in 100 ml physiologischem Serum dispergiert. Diese Bakteriensuspension wird auf das 10-fache in 5 χ 10 Mol FMN und 3 %-igem NaCl (entsprechende Anteile} auf ein Endvolumen von IO ml verdünnt. Die Bakterien bestrahlt man bei 25°C mit 365 m,u unter einer Lampe B 1OO A unter stündigem Rühren. Nach festgelegten Expositionsspannen unter der Lampe entnimmt man gleiche Anteile und zählt die Zellen, nachdem sie vorher noch in physiologischem Serum verdünnt worden sind. Während man vor der Bestrahlung 1 χ IO Zellen/ml hatte, zählt man nach festgelegten Bestrahlungszeiten die Zellenanzahl/ml, die in der nachstehenden Tabelle angegeben sind.

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Tabelle II

Expositionsdauer in Minuten	Vergleich	Bakterien, versetzt mit 13,5 Einheiten/ml Superoxiddis- mutase (in 10"2 Mol Phosphat puffer von pH 7)
30 60 120	4 χ 106 5 χ 105 8 χ 1O3	7 χ 106 3,9 χ 106 6 χ 104

Beispiel 16

Man arbeitet wie in Beispiel 15, indem man Bakterien von Photobacterium leiognathi des Stammes Nr.ATCC-25 521 in einer physiologischen Kochsalzlösung bis zu einem Endvolumen von IO ml suspendiert und diese Suspension 16.Stunden unter

ο
Energie 0,55 mW/cm ). Anschließend gibt man die Suspension in Petri-Schalen, um das Überlebensverhältnis der Bakterien zu ermitteln. ·

/U mittels einer Lampe B 100 Ά bestrahlt (einfallende

Obgleich eine sehr langdauernde Strahlung, nämlich 16 Stunden, benutzt wird, kann man feststellen, daß es 3,3 mal mehr überlebende Bakterien gibt, im Verhältnis zu einem Vergleichsversuche ohne Superoxiddismutase in Petri-Schalen, worin sich eine Suspension befindet, welche vor der Bestrahlung 53 Einheiten/ml Superoxiddismutase (SOD) von Pleurotus olearius Gillet zugesetzt ist; die erhaltenen Ergebnisse sind folgende:

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nichtbestrahlte Bakterien 9,7 χ ΙΟ⁴ Zellen/ml

bestrahlte Bakterien

(Vergleich) 1,5 _{x i0} ² Zellen/ml

bestrahlte Bakterien

(versetzt mit 53 Einheiten/ml

SOD von Pleurotus olearius 5,0 χ 10 Zellen/ml

Beispiel 17

Es wurde ein Versuch zur Präservierung eines Bacteriophags durchgeführt, der ein Nucleoproteine ist und im folgenden als Bacteriophag R 17 bezeichnet wird. Dieser Bacteriophag wird in einer Lösung, enthaltend 6 g Na₂HPO₄, 3 g KH₂PO., 0,5 g NaCl, 1 g NH-Cl, 100 ml Wasser und 10 ml CaCl₂ von 0,Ol Mol aufbewahrt und verdünnt. 0,1 ml dieser Bacteriophaglösung läßt man 10 Minuten bei 38°C mit 0,2 ml einer Lösung von Escherichia coli des Stammes Nr. ATCC 15 224, 10 g Typticase, 5 g Hefeextrakt, 10 g NaCl und 1000 ml Wasser brüten, und zwar bei einer optischen Dichte von 0,5 bei 650 m/U und mit 3 ml weicher Gelosesuspension (bestehend aus 8 g Agar, 10 g Trypticase, 1 g Hefeextrakt, 8 g NaCl, 1000 ml Wasser, 2 ml 1 Mol CaCl₂ und 5 ml 20 %-iger Glukose), die man auf 45°C hält. Das ganze gießt man in Petri-Schalen, die 20 ml harter Gelose (bestehend aus 12 g Agar, 10 g Trypticase, 1 g Hefeextrakt, 8 g NaCl, 1000 ml Wasser, 2 ml 1 Mol CaCl₂ und 5 ml 20 %-ige Glukose) enthalten ; man hält die Petri-Schalen auf einer Temperatur von 37 C.

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Zwecks Beschleunigung der natürlichen Oxidation des Bacteriophags R 17 greift man zur Photoreduktion von Flavinen: Man verdünnt die Bacteriophaglösung auf das 10-fache Volumen mit einer Lösung von lo"⁴ Mol FMN, lo"³ Mol EDTA und lo"² Mol Phosphatpuffer von pH 7; die- Photoreduktion führt man am Fluorimeter durch, wobei das Endvolumen der Lösung 0,8 ml beträgt.

Mit einer Lösung, enthaltend anfänglich 4,1 χ 10 Teile/ml im Augenblick t—0, erhält man die in der nachstehenden Tabelle angegebenen Resultate:

Tabelle III

Teilchen/ml

Anzahl der	Vergleichs	mit 13,5	Schutz (M (Verhältnis-Hrf)	V
aufeinander	versuch (ent	Einheiten/ml	(A)	1,53
folgenden	haltend 0,05 mg	Dismutase		3,00
Photoreduk	bei pH 3 inakti	(B)		4,00
tionsvor	vierte Dismutase)
gänge	(A)
0	4,1 χ 108	4,1 χ 108
3	4,9 χ 107	7,5 χ 107
6	5 χ 106	1,5 χ 107
9	5 χ 1O5	2 χ 106

Beispiel 18

Man arbeitet wie im vorstehenden Beispiel mit dem Unterschied, daß man zur Beschleunigung der Oxidation de.s Bacteriophags R 17 0,3 ml des letzteren mit einem enzymatischen

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System Hypoxanthin/Xanthinoxiclase/Sauer stoff bebrütet, wobei das Volumen des Brütsystems 3 ml beträgt. Nach 15 Minuten behandelt man das System nochmals durch Zugabe von 0,05 ml Xanthinoxidase und 0,3 ml 10~ Mol Hypoxanthin.

Mit 0,5 χ 10 Teilchen/ml im Zeitpunkt t erhält man die" Ergebnisse der nachstehenden Tabelle IV in Abwesenheit und in Gegenwart von 200 Einheiten/ml Superoddismutase aus Photobacterium sepia des Stammes Nr.ATCC 15 709. Die erhaltenen Ergebnisse sind vergleichbar mit den Superoxiddismutasen von Pleurotus olearius Gillet oder Erithrocuprein.

Tabelle IV

	Teilchen/ml	ohne	mit	Sterb	Sterb	O
Anzahl der	D.ismutase	Dismutas«	lich	lich	4O
aufeinander	(Vergleich)	(200 Ein	keit	keit
folgenden		heiten)	in %	In %
enzymatischen			(Ver	(niit Dis-
Vorgänge			gleich)	mutase)
	5,OxIO8	5,OxIO8	-	•
0	3,5xlO8	5 XlO8	30
1	2 xlO8	3 xlO8	60
2

Beispiel 19

Man prüft die Schutzwirkung durch die Superoxiddismutasen

gegen Oxydase der pancreatischen Ribonuclease mittels einer Oxidation, indem man eine Photoreduktion von FMN einsetzt, um die Erscheinung während einer geeigneteren Periode erkennbar zu machen. Zu diesem Zweck verdünnt man eine pancre-

- 47 -

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-2

atlsche Ribonucleaselösung (0,1 mg/ml in 10 Mol Phos-

-3
phatpuffer von pH 7 und 10 Mol EDTA) in 10-fachem Volumen

-4 -3

einer Lösung, bestehend aus 10 Mol FMN, 10 * Mol EDTA

_2

und 10 Mol Phosphatpuffer von pH 7, wobei das Endvolumen 0,8 ml beträgt. Man unterzieht so das pancreatische Ribonucleaseprotein mehreren Photoreduktionszyklen in Abwesenheit und in Gegenwart von 67,5 Einheiten/ml Superoxiddismutase aus Pleurotus olearius Gillet oder in Gegenwart derselben bei pH 3 denaturierten und inaktiven Dismutase.

Man bestimmt die Aktivität des Rebonucleaseenzyms mittels eines Spektrophotometers, indem man die Zunahme der optischen Dichte bei 280 m,u einer Ribonucleinsäurelösung,
wie sie vorstehend beschrieben wurde, verfolgt. Die erhaltenen Ergebnisse finden sich in der nachstehenden Tabelle:

Tabelle V

Anzahl der Zyklen	% Restaktivität ■	Vergleich (ohne Dis mutase)	Vergleich mit bei pH 3 inak tivierter Dis mutase (0,05mg)	Dismutase 67,5 Einheiten/ml
0 3 6 9	1OO 67 45 22	100 56 45 22	100 89 89 67

Beispiel 20

Man verwendet ein Superoxiddismutaseenzym vom Stamme Photobacterium leiognathi Nr. ATCC 25 521, um die Konservierung

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des unter dem Namen des Jeffries-Milieu bekannten Natriumtetrathionat enthaltenden Milieus zu verbessern. Hierbei handelt es sich um eine Anreicherungsmilieu der Salmonella, das in bekannter Weise wie folgt verwendet wird: In ein soches Milieu mit Natriumtetrathionat führt man eine Abstichprobe ein, die Salmonellen in geringer Menge und Bakterien von Escherichia coli in erheblicher Menge enthält. Nach einer Verweilzeit von 24 Stunden im Brutschrank bei 37°C impft man einen Tropfen dieser Kultur auf ein Nährbodenmilieu in einer Petri-Schale. Nach einer Bebrütung von 24 Stunden bei 37°C beobachtet man in dieser Kultur eine sehr große Zahl von Salmonellenkolonien, aber man stellt völlige Abwesenheit von Escherichia coli fest.

Auf diese Weise wird bestätigt, daß das genannte Milieu mit Natriumtetrathionat die Escherichia coli-Bakterien behindert, aber die Entwicklung der Salmonellen begünstigt. Es wird jedoch gleichfalls bestätigt, daß dieses Milieu tatsächlich nur bis zu einem Maximum von 3 Wochen,* gerechnet von seiner Zubereitung, und praktisch sogar nur bis zu einem Maximum von 2 Wochen brauchbar ist. Infolgedessen kann man bisher nur eine Fabrikation eines solchen Milieus in kleinen Quanten vorsehen, was die Führung eines Vorrates schwierig macht und damit den Gestehungspreis belastet.

Um einen Versuch über den Schutz gegen Oxidation des Jeffries-Milieus durchzuführen, entnimmt man 100 Röhrchen

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ein und desselben Quantums dieses Milieus mit Natriumtetrathionat. In elf dieser Röhrchen, die jedes 20 ml
Milieu enthalten, gibt man 2 ml einer Superoxiddismutaselösung von Photobacterium leiognathi im Verhältnis von 15 Einheiten/ml. Alle diese Röhrchen werden als Vergleichsmuster angesehen. Die Gesamtheit der ICX) Röhrchen wird bei einer Temperatur von +40⁰C aufbewahrt.

Zwecks Ermittlung der Konservierung von Milieu wird 7 Wochen lang eine Analyse durchgeführt und anschließend nur alle 2 Wochen eine Analyse. Bei jeder dieser Analysen erfolgt ein Vergleich eines Rohres, enthaltend Enzym mit

1 Vergleichsohr für die drei ersten Versuche,

2 Vergleichsrohre für den vierten und fünften Versuch,

3 Vergleichsrohre für die fünf letzten Versuche.

Für die Analyse verfolgt man die oben am Anfang dieses Beispiels beschriebene Arbeitsweise.

Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt:

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- 5ο Tabelle VI

Wochen	Natrium- tetra-	Vergleiche (Natriumtetrathionafc)	zweiter	dritter
	thionat + Enzym	erster	///////////	///////////
1	+		///////////	///////////
2	+	+	///////////	///////////
3	+	+	-	///////////
4	+	+	—	///////////
5	+	+	+	-
6	+	+	-	-
7	+	-	+	+
9	+	+	0
11	+	+	+ - mittelmäßig	0
13	+

+ = Ergebnis befriedigend: reine Salmonellenkultur

- = schlechtes Ergebnis: Kultur E.Coil

O = schlechtes Ergebnis ι überhaupt keine Kultur

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Aus dieser Tabelle ist unmittelbar ersichtlich, daß die Inhalte der Rohre, in denen Superoxiddismutaseenzyme eingeführt sind, alle ihre Eigenschaften bewahrt haben. Was das Vergleichsröhrchen selbst betrifft, so war es nur während der drei ersten Versuche befriedigend, was der bisher als normal angesehenen Gültigkeitsdauer für die handelsüblichen Quanten von Milieus mit Natriumtetrathionat entspricht. Auf Grund der folgenden Versuche wurde festgestellt, daß die Ergebnisse für die Vergleichsröhrchen sehr unregelmäßig sind, was es ausschließt, das Produkt als händelsfähig anzusehen. Man stellt also fest, daß dieser Zusatz von 2 ml einer Lösung von Superoxiddismutaseenzym des Stammes Photobacteriura leiognathi Nr. ATCC 25 521 je Röhrchen von 20 ml Natriumtetrathionat die Widerstandsfähigkeit des letzteren gegei Oxidation um mindestens 10 Wochen und sogar noch mehr verlängert.

Beispiel 21

Konservierung von Kartoffeln

A. 250 g geschälte Kartoffeln werden 30 Mimten in Wasser bei 100⁰C gekocht. Man gibt 60 ml Wasser hinzu und passiert durch einen Mischer bis zur Erzielung einer homogenen Masse. Drei Teilmengen von 50 g werden in Becher gegeben, und in jeden Becher werden 20 ml Wasser zugefügt und mit dem Brei gut vermischt.

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- .52 -

Becher P 1 Vergleich

P 2 500 Einheiten Superoxiddismutase (10 Einheiten/g (P.leiognathi) werden zugesetzt und vermischt.

P 3 Vergleich plus 0,5 ml 2,0 % Ascorbinsäure {Endkonzentration 0,02 % Ascorbinsäure).

P 4 wie P 3 aber es sind auch 500 Einheiten Superoxiddismutase zugefügt.

Alle Muster werden dann durch Gefrieren getrocknet (lyophilisiert) und bei Umgebungstemperatur belassen.

B. Man verwendet Kartoffelflocken, die 25 mg/kg BHT (Ditertiärbutyl-paracresol) und BHA (Butyl-hydroxyanisol) und Glycerinmonostearat (1 %) enthalten.

In250 ml siedendes Wasser gibt man 45 g dieser Flocken, beläßt sie 2 Minuten und rührt mit einem Glasstab. Zwei Teilmengen von 50 g dieses Kartoffelbreies werden aufgenommen und mit 50 ml Wasser vermischt.

Ml Vergleich

M2 5OO Einheiten Superoxiddismutase (10 Einheiten/g Brei) werden zugesetzt und gut durchgemischt.

Die beiden Muster werden anschließend durch Gefrieren getrocknet und das Pulver bei Umgebungstemperatur belassen.

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Nach zwei Monaten wird der Geruch der Muster A) und B) von sechs Personen verglichen. Bei Gegenwart von Superoxiddismutase ist der Geruch unterschiedlich von dem der Vergleichsmuster, und zwar weniger sauer und angenehmer.

Beispiel 22

Konservierung von Karotten

Es wird genau dieselbe Arbeitsweise wie vorstehend für Kartoffeln beschrieben angewandt, aber für mit Wasser gekochte Karotten und mit derselben Menge Superoxiddismutase/g, Nach zwei Monaten wird der Geruch der Muster von sechs Personen verglichen. Bei Vorhandensein von Superoxiddismutase ist der Geruch anders als der der Vergleichsmuster, er ist weniger sauer und angenehmer.

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Claims (1)

1. Patentansprüc he

   1.) Verfahren zur Behinderung der Autoxidation von durch Oxidation einem Abbau ausgesetzten Substanzen unter Einsatz von Superoxidionen, dadurch gekennzeichnet , daß man mit den Substanzen eine wirksame Menge mindestens eines Superoxid- '" dismutaseenzyms vereinigt.

   2.) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die behandelten Substanzen aus Nahrungsmitteln, insbesondere lipidischen, proteinischen oder lipoproteinischen Nahrungsmitteln, bestehen.

   3.) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die behandelten Substanzen Bakterien oder Viren sind.

   4.) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die behandelten Substanzen Kulturmedien sind, die für das Wachstum von Zellen benutzt werden.

   5.) Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Superoxxddismutase in die betreffende Substanz im Verhältnis von 1 bis 100 Einheiten Superoxiddismutaseenzym je ml oder Gramm Substanz eingebracht wird.

   6.) Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Superoxxddxsitiutaseenzym aus Extrakten von

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   Seebakterienstämmen, Escherichia coli. Pilzen oder Blutextrakten, insbesondere Erythrocupreinen, ausgewählt wird.

   7.) Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Seebakterienstämme aus Stämmen von Photobacterium leiognathi, Photobacterium phosphoreum oder Photobacterium sepia, insbesondere einem Stamm von Photobacterium leiognathi Nr.ÄTCC 25 521 r einem Stamm von Photobacterium phosphoreum Nr .ATCC 11 040 oder einem Stamm von Photobacterium sepia Nr.ATCC 15 7Ο9 bestehen.

   8.) Stoffzusammensetzung, deren Substanzen für den Abbau durch " Oxidation unter Vermittlung von Superoxidionen anfällig sind, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine für den Schutz dieser Substanzen gegen Oxidation oder Verminderung ihrer Oxidation wirksame Menge mindestens eines Superoxiddismutaseenzyms enthält.

   » 9.) Masse nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine proteinische Masse und in Vereinigung mit dem für Selbstoxidation anfälligen Protein eine wirksame Menge mindestens eines Superoxiddismutaseenzyms enthält.

   10.) Masse nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die behandelten Substanzen und/oder Superoxiddismutasen einem der Ansprüche 1 bis 7 entsprechen.

   - 56 4098A5/1068

   11.) Verfahren zur Herstellung von Superoxiddismutase durch Extraktion von Kulturen von Seebakterienstämmen, insbesondere Kulturen von Stämmen von Photobacterium phosphoreum_f Photobacterium leiognathi.oder Photobacterium sepia, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Seebakterienkultur in Wasser dispergiert und auf etwa 4°C hält, anschließend den pH-Wert des Milieus auf 6,5bis 8, vorzugsweise etwa 7, einstellt, die Mischung einige Minuten auf 50 bis 60⁰C bringt, sie auf etwa 4°C abkühlt und bei dieser Temperatur zentrifugiert, an der überstehenden Fraktion eine erste fraktionierte Fällung mittels Neutralsalzen durchführt, nochmals zentrifugiert und an der überstehenden Fraktion eine zweite fraktionierte Fällung mittels Neutralsalzen vornimmt und zentrifugiert.

   12.) Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Auflösung des gesammelten Niederschlages von der ersten Zentrifugierung in einem Phosphatpuffer von pH 7,8 erfolgt und die so erhaltene Lösung gegen denselben Phosphatpuffer von pH 7,8 dialysiert wird.

   13.) Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man das Produkt der letzten Zentrifugierung mit Phosphatpuffer von pH 7,8 wieder aufnimmt und eine Chromatographie der erhaltenen Lösung durchführt.

   14.) Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man eine erste Chromatographie auf einer Säule von Sephatex-Gel G 200, eine Chromatographie auf einer Säule von Sephatex—

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   Diathylaminoäthyl (DEAE-S) und eine nochmalige Chromatographie auf einer Säule von Sephadex-Gel 200 durchführt.

   15.) Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mischung 3 bis 4 Minuten lang auf 50 bis 60⁰C bringt.

   16.) Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß

   als Neutralsalz neutrales Ammoniumsulfat (NH₄)₂S0. verwendet -wird.

   17.) Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß man die erste fraktionierte Fällung mittels Zusatzes einer solchen(NH-)₂S0.-Menge durchführt, daß die Mischung oder der behandelte Enzymextrakt auf eine Endkonzentration von etwa 30 bis 35 % der Sättigung bei 4°C gebracht wird.

   18.) Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß

   » die zweite fraktionierte Fällung mittels Zusatzes einer solchen Menge(NH.)₂SO₄ durchgeführt wird, daß die Mischung oder der behandelte Enzymextrakt so auf eine Endkonzentration von etwa 70 bis 75 % der Sättigung bei 4°C gebracht wird.

   19.) Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß eine ültrafiltrationsvorrichtung benutzt wird.

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   2O.) Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Ultrafiltrationsvorrichtung ein erstes poröses Rohr aufweist, das die Moleküle eines höheren Molekulargewicht* . als 40 000 unter deren Konzentrierung zurückhält, während ein zweites poröses Rohr die gewünschten Enzymmoleküle durchläßt, aber durch Zurückhaltung der restlichen Bakterien einen sterilen enzymatischen Extrakt liefert.

   (21Ϊ) Superoxiddismutase, dadurch gekennzeichnet, daß sie nichthämatinisches Eisen enthält, ein Molekulargewicht von 40 000 - etwa 2500 und einen pHi-Wert oder isoelektrischen Punkt von etwa 4 bis 7 sowie ein enzymatisches Aktivitätsmaximum bei pH etwa 8,5 bis 10 mit einem Optimum bei etwa 9,5 besitzt.

   22.) Superoxiddismutase nach Anspruch 21, erhalten aus Kulturen der Stämme von Photobacterium leiognathi Nr. ATCC 25 521 oder ATCC 25 587, dadurch gekennzeichnet, daß sie zwei Atome Eisen je Molekül aufweist, ein Molekulargewicht von etwa 42 000 und ein pHi von 4,4 besitzt und ein enzymatisches Aktivitätsmaximum bei einem pH von 9,5 zeigt.

   23.) Superoxiddismutase nach Anspruch 21 aus Kulturen von Stämmen von Photobacterium sepia Nr.ATCC 15 709, dadurch gekennzeichnet, daß sie zwei Atome Eisen je Molekül enthält, ein Molekulargewicht von etwa 42 500 und einen pHi-Wert von 4,1 sowie ein enzymatisches Aktivitätsmaximum bei pH 8,5 bis 10 mit einem Optimum bei pH 9,5 besitzt.

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   ~⁵⁹~ 2A17508

   24.) Superoxiddismutase nach Anspruch 21 aus Kulturen von Stämmen von Photobacterium phosphoreum Nr.ATCC 11 040, dadurch gekennzeichnet, daß sie zwei Atome Eisen je Molekül enthält, ein Molekulargewicht von etwa 40 000 und einen ρΗ£·τ Wert von 4,2 besitzt und ein enzymatisches Aktivitätsroaxiaaaia bei pH 9,5 zeigt.

   25.) Verwendung von Superoxiddismutase nach einem der Ansprüche 21 bis 24 zum Schutz gegen Autoxidation von Lipiden und/oder Verbindungen, die als Antioxidantien, insbesondere in der Lebensmittelindustrie, verwendet werden.

   26.) Verwendung nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß die Antioxidantien aus Pyrogallol oder Ascorbinsäure bestehen .

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