DE69832901T2

DE69832901T2 - Reglungsprozess für die desinfizierung von flüssigkeiten

Info

Publication number: DE69832901T2
Application number: DE69832901T
Authority: DE
Inventors: Yves Levi; Danièle TOUATI; Sam Dukan
Original assignee: Suez Lyonnaise des Eaux
Current assignee: Suez Lyonnaise des Eaux
Priority date: 1997-09-29
Filing date: 1998-09-23
Publication date: 2006-08-24
Anticipated expiration: 2018-09-24
Also published as: ES2148125T3; FR2769092A1; DE69832901D1; EP1025259B1; FR2769092B1; EP1025259A1; AU740366B2; US6387648B1; WO1999016896A1; CA2304577A1; ES2148125T1; AU9270998A; DE1025259T1; JP2001518308A

Description

Die Erfindung betrifft ganz allgemein Mittel zur Regelung der Desinfektion von Flüssigkeiten. Sie ist insbesondere auf Regelungsmittel gerichtet, bei welchen die Messung von Enzymaktivitäten angewendet wird.
Die Gewährleistung von Qualität und Unschädlichkeit von Flüssigkeiten, die dazu bestimmt sind, mit einem Menschen oder Tier in Berührung zu kommen, wie ein für die Konsumtion bestimmtes Wasser, ein flüssiges Lebensmittel, ein Badewasser oder ein Wasser, das für pharmazeutische oder biotechnologische Zubereitungen vorgesehen ist, hängt direkt von der Zuverlässigkeit und Empfindlichkeit der Verfahren ab, die zum Messen der Anzahl der in dieser Flüssigkeit überlebenden Mikroorganismen angewendet werden.
In den Verfahren, die gegenwärtig zur Regelung der Desinfektion einer Flüssigkeit angewendet werden, werden Kultivierungstechniken auf Gelose und/oder mikroskopische Techniken eingesetzt.
Die Kultivierungstechniken auf Gelose bestehen darin, die Anzahl von Bakterienkolonien auszuzählen, die sich in verschiedenen standardisierten Gelosenährmedien vermehrt haben (beispielsweise norme française NF T 90-414, Essais des Eaux, Recherche et dénombrement des coliformes et des coliformes thermotolérants (Französische Norm NF T 90-414, Wasseruntersuchungen, Nachweis und Auszählung von coliformen und wärmetoleranten coliformen Keimen)). Diese Techniken haben mehrere Nachteile.
An erster Stelle ist zu erwähnen, dass sie ihre Ergebnisse erst nach im Mittel 24 Stunden liefern, um welche eine mögliche Anpassung des Desinfektionsverfahrens abweicht.
Die Kultivierungstechniken auf Gelose sind außerdem auf die Herstellung von mikrobiologischen Kulturbatterien für die Analyse einer jeden Flüssigkeitsprobe beschränkt. Nicht alle Mikroben- und insbesondere Bakterienfamilien vermehren sich auf ein und demselben Nährmedium; deshalb ist es möglich, dass kein coliformer Keim nach Kultivierung auf dem für den Nachweis coliformer Keime standardisierten Nährmedium nachgewiesen werden kann, aber eine hohe Anzahl von anderen Bakterien nach Kultivierung auf anderen Nährmedien gefunden wird. Die Qualität der Analyse wird daher von der Auswahl der Gelosenährmedien bestimmt. Dabei ist diese Auswahl umso schwieriger, als mitunter eine größere Anzahl von Kolonien nach Kultivierung auf einem anderen Medium als dem für den Nachweis derselben Kolonien standardisierten Nährmedium beobachtet worden ist. So ist beispielsweise gezeigt worden, dass die Auszählungen der wiederbelebbaren aeroben Bakterienflora in dem Gelosemedium R2A größer als in dem entsprechenden standardisierten Nährmedium waren (siehe beispielsweise "A new rapid medium for enumeration and subculture of bacteria from potable water", von Reasoner, D. J. und Godreich, E. F., App. Environm. Microbiol., 49, 1–7 (1985)). Um eine zuverlässige negative Diagnostik zu etablieren, wird in den Kultivierungstechniken auf Gelose daher eine Vielzahl von Analysen angewendet. Die Kultivierungstechniken auf Gelose erlauben es außerdem nicht leicht, die Regelung des Desinfektionsverfahrens zu automatisieren.
Bakterien sind außerdem insbesondere nach einem Umweltstress wie der Durchführung eines Desinfektionsverfahrens in der Lage, eine resistente Form anzunehmen, in welcher sie sich nicht mehr vermehren, aber einen minimalen Stoffwechsel sicherstellen, wobei nach Wiederherstellung von günstigeren Umweltbedingungen diese Bakterien ihre Vermehrung wieder aufnehmen können. Solche Bakterien werden als "nicht kultivierbar, aber lebensfähig" bezeichnet, sind durch die herkömmlichen Kultivierungstechniken auf Gelose nicht nachweisbar und können für den Verbraucher eine biologische Gefahr bedeuten.
In einem Verfahren, das gegenwärtig zur fast sicheren Kontrolle des Wirkungsgrades der Desinfektion einer Flüssigkeit zur Verfügung steht, werden mit spezifischen Anfärbungen verbundene mikroskopische Techniken angewendet. Dieses Verfahren erlaubt die Unterscheidung zwischen kultivierbaren Bakterien, Bakterien, die nicht kultivierbar, aber lebensfähig sind, und toten Bakterien. Es erfordert jedoch die Durchführung mehrerer Anfärbungstests für jede Probe und lässt sich technisch schwierig automatisieren.
Insbesondere in den Patenten US-A-5 223 401, US-A-5 366 872 und der Patentanmeldung FR-A-2 638 170 sind Sterilitätsindikatoren beschrieben. Jedoch stellt die Sterilisation einen Sonderfall der Desinfektion dar. Die in jenen Dokumenten offenbarten Indikatoren erlauben allerdings nur, qualitative Endergebnisse zu erhalten.
Weiterhin betrifft das Patent US-A-5 158 973 die Optimierung der Konzentration von zwei bakteriziden Mitteln in Abhängigkeit von dem in die Bakterienzellen eingebauten ¹⁴C-Anteil für eine gegebene Probe.
Deshalb liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, die Nachteile der Verfahren des Standes der Technik zu beheben und ein Verfahren zur Regelung der Desinfektion einer Flüssigkeit vorzuschlagen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es

a) in einer nachfolgend als Stufe 2 bezeichneten Stufe der Desinfektion die Messung der Aktivität mindestens eines Enzyms, indem gegebenenfalls in der Flüssigkeit vorhandene Mikroorganismen mit einem Substrat in Berührung gebracht werden, das so ausgewählt ist, dass es in der Lage ist, die Aktivität dieses/dieser Enzyme/s, insbesondere durch Umwandlung des Substrats in eine gefärbte, fluoreszierende bzw. lumineszierende Verbindung oder durch das Verschwinden dieses Substrats, nachzuweisen, wobei diese Enzymaktivität anschließend als wahre Aktivität bezeichnet wird,
b) in einer nachfolgend als Stufe 1 bezeichneten Stufe, die der Stufe 2 vorangeht, die Messung der Aktivität desselben/derselben Enzyme/s wie in a), wobei diese Aktivität anschließend als Anfangsaktivität bezeichnet wird,
c) das Ausdrücken von wahrer und Anfangsaktivität für das jeweilige Enzym als Anteil an Mikroorganismen, die in der Flüssigkeit in Stufe 2 der Desinfektion überlebt haben, über ein Referenzsystem, das vorher mittels einer Probe dieser Flüssigkeit hergestellt worden ist, die in Stufe 1 entnommen und anschließend steigenden Dosen an Desinfektionsmittel/n ausgesetzt wurde, und
d) die Anpassung des Charakters und/oder der Dosen des/der chemischen bzw. physikalischen Mittel/s, das/die zur Desinfektion angewendet wird/werden, abhängig vom Anteil an überlebenden Mikroorganismen,

Dabei sind in der vorliegenden Patentanmeldung unter überlebenden Mikroorganismen Mikroorganismen, die kultivierbar und/oder nicht kultivierbar, aber lebensfähig sind, zu verstehen.
Unter dem Anteil an überlebenden Mikroorganismen ist in der vorliegenden Patentanmeldung das Verhältnis von Konzentration der überlebenden Mikroorganismen in der Flüssigkeit in der Desinfektionsstufe 2 zu Konzentration der in derselben Flüssigkeit in der Stufe 1 überlebenden Mikroorganismen zu verstehen. Dieser Anteil an überlebenden Mikroorganismen wird vorzugsweise als Abtötungswert in Form einer negativen Potenz von 10 oder als logAbtötung, der –log₁₀ (Abtötung) entspricht, angegeben.
Die Stufe 1 kann beispielsweise einer "der Desinfektion der Flüssigkeit vorausgehenden Stufe" und die Stufe 2 einer beliebigen Stufe des Desinfektionsverfahrens (wobei "Stufen nach der Desinfektion der Flüssigkeit" eingeschlossen sind) entsprechen.
Das erfindungsgemäße Verfahren richtet sich auf Flüssigkeiten, in welchen die gegebenenfalls vorhandenen Mikroorganismen ganz speziellen Bedingungen unterworfen werden, nämlich Desinfektionsbedingungen, welche die Zellen einem beträchtlichen Stress aussetzen.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Regelung der Desinfektion einer Flüssigkeit ist insbesondere auf eine Flüssigkeit gerichtet, die vorgesehen ist, mit einem Menschen oder Tier in Berührung zu kommen, d.h. entweder durch einfache Berührung, Absorption, Verdauung, Infusion oder Injektion. Dabei wird es insbesondere auf Flüssigkeiten angewendet, die vorgesehen sind, mit einem Menschen oder Tier in Berührung zu kommen, wie ein Badewasser, ein für die Konsumtion bestimmtes Wasser, ein für pharmazeutische bzw. biotechnologische Zubereitungen bestimmtes Wasser oder ein flüssiges Lebensmittel.
Das In-Berührung-Bringen der gegebenenfalls in der Flüssigkeit vorhandenen Mikroorganismen mit dem Substrat kann durch direktes In-Berührung-Bringen der Flüssigkeit oder einer Probe dieser Flüssigkeit mit dem Substrat oder durch In-Berührung-Bringen eines Konzentrats der gegebenenfalls vorhandenen Mikroorganismen wie eines Filter- oder eines Zentrifugenrückstandes der Flüssigkeit oder der Flüssigkeitsprobe mit dem Substrat durchgeführt werden.
Vor der Messung der Aktivität bestimmter Enzyme wie Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase oder Glutathionreduktase umfasst das erfindungsgemäße Verfahren vorteilhafterweise eine Stufe, in welcher die Flüssigkeit, die Flüssigkeitsprobe oder das Konzentrat einer Lyse, insbesondere durch Ultraschall, unterworfen wird.
Vor der Messung der Aktivität anderer Enzyme wie Katalase oder Superoxiddismutase kann die vorhergehende Lysestufe weggelassen werden, da die Aktivität dieser Enzyme mittels eines in die Mikroorganismen diffundierenden Substrats wie Lucigenin und Wasserstoffperoxid gemessen werden kann.
Entsprechend einem vorteilhaften erfindungsgemäßen Merkmal weist/weisen das/die Enzym/e, dessen/deren Aktivität gemessen wird/werden, in der Flüssigkeit, der Flüssigkeitsprobe oder dem Konzentrat ein Verhältnis von wahrer zu Anfangsaktivität in affiner Relation und mit einem Anstieg, der sich deutlich von Null unterscheidet und vorzugsweise kleiner als –0,2 ist, zu dem Anteil an überlebenden Mikroorganismen über mindestens einen Wertebereich des Anteils an überlebenden Mikroorganismen auf. Dies ist beispielsweise der Fall bei Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase für eine logAbtötung von etwa 0 bis 3, Glutathionreduktase für eine logAbtötung von etwas 4 bis 7 und Superoxiddismutase für eine logAbtötung von etwa 3 bis 6.
Weitere interessierende Enzyme können insbesondere zur Familie der Dehydrogenasen oder zur Familie der Enzyme, die an der Reaktion auf oxidativen Stress beteiligt sind, gehören.
Um zu bestimmen, ob ein oder mehrere Enzyme für die Durchführung des erfindungsgemäßen Regelungsverfahrens mit einer gegebenen Flüssigkeit geeignet sind, kann wie folgt verfahren werden:

– Entnehmen mindestens einer Probe der Flüssigkeit und Messung der Konzentration der überlebenden Mikroorganismen (kultivierbare und/oder nicht kultivierbare, aber lebensfähige Mikroorganismen), insbesondere durch Kultivierung auf Gelose und/oder durch Anfärbung und Betrachtung im Mikroskop,
– Messen der Aktivität eines jeden Enzymkandidaten in dieser/diesen Flüssigkeitsprobe/n,
– Aussetzen der Flüssigkeitsprobe/n verschiedenen Dosen von Desinfektionsmittel/n unter Bedingungen, die sonst äquivalent sind (beispielsweise Dauer der Exposition und Temperatur),
– Messen der Aktivität eines jeden Enzymkandidaten nach Exposition mit den verschiedenen Dosen an Desinfektionsmittel/n,
– Aufstellen einer Kurve, die die prozentuale Aktivität (nach Exposition mit den verschiedenen Dosen an Desinfektionsmittel/n gemessene Enzymaktivität, bezogen auf die entsprechende Enzymaktivität vor Exposition) in Abhängigkeit von den gemessenen logAbtötungen (wie zuvor definiert) darstellt, für jeden Enzymkandidaten,
– Bestimmen des Bereichs des logAbtötung, für welchen der Anstieg der Kurve sich deutlich von Null, vorzugsweise kleiner als –0,2, unterscheidet, wobei dieser Bereich den Reaktionsbereich des in dieser Flüssigkeit betrachteten Enzymkandidaten bildet, für jeden Enzymkandidaten und
– ein Enzymkandidat ist für die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens auf diese Flüssigkeit geeignet, wenn sein Reaktionsbereich die Werte von logAbtötung umfasst, die den für die betrachtete Flüssigkeit gewünschten Desinfektionszielen entsprechen.

Entsprechend einem besonders vorteilhaften erfindungsgemäßen Merkmal ist das Enzym oder mindestens eines der Enzyme, dessen/deren Aktivität gemessen wird/werden, eine Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase, Malatdehydrogenase, Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase, Katalase, Superoxiddismutase oder Glutathionreduktase. Die (oder mindestens eine der) Enzymaktivität/en wird/werden dann durch die Umwandlung eines Substrats und gegebenenfalls in Anwesenheit eines Cofaktors wie Glucose-6-phosphat und Cofaktor NADP, L-Malat und Cofaktor NAD, Glyceraldehyd-3-phosphat und Cofaktor NAD bzw. Lucigenin, Wasserstoffperoxid und oxidiertes Glutathion und Cofaktor NADPH gemessen.
Entsprechend einer vorteilhaften erfindungsgemäßen Ausführungsform werden die Messungen der wahren und der Anfangsaktivität mittels eines Geräts zur Messung der Lichtstärke wie eines Spektralphotometers, Spektralfluorometers oder Luminometers, die gegebenenfalls mehrere Analysekanäle besitzen, durchgeführt.
Entsprechend einer weiteren vorteilhaften erfindungsgemäßen Ausführungsform umfasst die Angabe als Anteil an überlebenden Mikroorganismen mithilfe des zuvor aufgestellten Referenzsystems die Berechnung des gegebenenfalls in Prozent angegebenen Verhältnisses von wahrer zu Anfangsaktivität des jeweiligen Enzyms.
Entsprechend einer anderen vorteilhaften erfindungsgemäßen Ausführungsform liegt das Referenzsystem in Form eines Diagramms wie einer oder mehrerer Kurven vor, die für das jeweilige Enzym das Verhältnis von wahrer zu Anfangsaktivität in Relation zu den Werten des Anteils an überlebenden Mikroorganismen wie logAbtötung bringen. Dieses Verhältnis von wahrer zu Anfangsaktivität wird auch als "relative Aktivität" in der vorliegenden Patentanmeldung bezeichnet.
Entsprechend einem Merkmal dieser anderen vorteilhaften erfindungsgemäßen Ausführungsform können diese spektrometrischen Messungen insbesondere für jede gemessene Enzymaktivität bei einer konstanten Temperatur von insbesondere 25°C und einer konstanten Wellenlänge, speziell einer Wellenlänge von 240 bis 550 nm, beispielsweise 340 nm, durchgeführt werden. Diese Messungen können kontinuierlich oder diskontinuierlich über einen Zeitraum von etwa 30 Minuten aufgezeichnet werden. Wenn eine höhere Messempfindlichkeit gewünscht wird, wird vorzugsweise die Luminometrie angewendet.
Die Anpassung der Desinfektionsstufe des erfindungsgemäßen Verfahrens kann durch regelmäßiges Verfolgen der Veränderung des Anteils an überlebenden Mikroorganismen (beispielsweise angegeben als Abtötung, logAbtötung oder Kennwert D) mit den weiter oben beschriebenen enzymatischen Indikatoren bis zum Erreichen des gestellten Desinfektionsziels erfolgen.
Die Stufe der Einstellung der Desinfektion des erfindungsgemäßen Verfahrens kann auch durch die Zugabe des Äquivalents "Dosis an Desinfektionsmittel/n" erfolgen, das der Differenz zwischen dem gewünschten Anteil an überlebenden Mikroorganismen (Sollwert) und dem Anteil an Mikroorganismen, der tatsächlich in der Flüssigkeit, der Flüssigkeitsprobe oder dem Konzentrat in einer Desinfektionsstufe oder danach gemessen worden ist, entspricht.
Vorteilhafterweise ist das Dosisäquivalent an Desinfektionsmittel/n, wie es von einer Referenzkurve abgelesen wird, die den Anteil an kultivierbaren Mikroorganismen in Abhängigkeit von der Dosis an Desinfektionsmittel/n, der die Flüssigkeit ausgesetzt ist, darstellt.
Die Erfindung liefert besonders vorteilhafte Ergebnisse bei Flüssigkeiten, die Mikroorganismen enthalten, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die insbesondere besteht aus den Gattungen Escherichia, Alcaligenes, Bacillus, Flavobacterium, Methylobacterium, Pseudomonas, Klebsiella, Enterobacterium, Agrobacterium, Streptococcus, Micrococcus und Salmonella.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Regelung der Desinfektion einer Flüssigkeit kann besonders vorteilhaft leicht in einem Verfahren zur Desinfektion einer Flüssigkeit automatisiert werden. Im Gegensatz zu den Verfahren des Standes der Technik erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren eine mikrobiologische Kontrolle, die sicher, schnell und leicht durchführbar ist.
Vorzugsweise wird der Anteil an überlebenden Mikroorganismen als Abtötungswert angegeben (Konzentration der überlebenden Mikroorganismen, bezogen auf die Anfangskonzentration an überlebenden Mikroorganismen, wie sie in der Stufe 1 gemessen wird, von logAbtötung (–log₁₀ (Abtötung)) oder log Kennwert D (logAbtötung). Der Kennwert D stellt ebenfalls ein Maß für die mikrobiologische Qualität der betrachteten Flüssigkeit dar.
Im erfindungsgemäßen Verfahren zur Regelung der Desinfektion einer Flüssigkeit werden als überlebende Mikroorganismen diejenigen der vorhandenen Mikroorganismen, die kultivierbar und/oder diejenigen der vorhandenen Mikroorganismen, die nicht kultivierbar, aber lebensfähig sind, betrachtet. Wenn es gewünscht wird, gleichzeitig die kultivierbaren Mikroorganismen und die nicht kultivierbaren, aber lebensfähigen Mikroorganismen zu berücksichtigen, wird von dem Referenzsystem dann vorteilhafterweise für jedes Enzym das Verhältnis von wahrer Aktivität zu Anfangsaktivität zu den Werten des Anteils an überlebenden Mikroorganismen, die aus der Addition der Werte des Anteils an kultivierbaren Mikroorganismen und der Werte des Anteils an nicht kultivierbaren, aber lebensfähigen Mikroorganismen, wie sie mit herkömmlichen Techniken gemessen werden, resultieren, in Relation gebracht.
Von den chemischen oder physikalischen Mitteln, die vorteilhafterweise für diese Desinfektion angewendet werden, sind Chlor und seine Derivate, UV, Ozon, H₂O₂, Filtermembranen, Temperatur, Ultraschall und ionisierende Strahlung zu nennen.
Weitere erfindungsgemäße Merkmale und Vorteile werden anhand der folgenden Ausführungsbeispiele, durch welche die Erfindung nicht beschränkt werden soll, näher erläutert.
Die Beispiele nehmen Bezug auf die 1, 2 und 3, wobei
1 den Anteil an kultivierbaren Bakterien Escherichia coli (angegeben als Abtötungswert in Bezug auf die Anfangspopulation) in Abhängigkeit von der Konzentration des verwendeten freien Chlors (mg/l),
2 die Aktivität der Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase (ZWF), angegeben in % der gemessenen maximalen Aktivität, in Abhängigkeit vom Anteil an kultivierbaren Bakterien (angegeben in Abtötungswerten in Bezug auf die anfängliche Mikrobenpopulation) und
3 die Glutathionreduktase-Aktivität, angegeben in % der gemessenen (maximalen) Anfangsaktivität in Abhängigkeit vom Anteil an kultivierbaren Bakte rien (angegeben als Abtötungswerte in Bezug auf die maximale Mikrobenpopulation) zeigt.
Beispiel 1: Mikrobiologische Kontrolle eines einer Desinfektion unterworfenen Wassers, das für die Konsumtion durch den Menschen bestimmt ist
Es wurde versucht zu bestimmen, ob Enzymaktivitäten einen zuverlässigen Indikator für den Anteil an überlebenden Mikroorganismen in einer Flüssigkeit, die einer Desinfektion unterworfen wird, wie einem für die Konsumtion durch den Menschen bestimmten Wasser, bilden können.
Verfahren und Ergebnisse
Dazu wurde eine Impfkultur mit einer reinen Kultur von Escherichia coli (Stamm MG1655, erhältlich von Institut Pasteur) auf einem Nährmedium (Medium LB, umfasst 10 g/l Trypton Bacto, 5 g/l Bacto-Hefeextrakt und 10 g/l NaCl, pH 7 eingestellt) bei 25°C hergestellt. Die Bakterien wurden in der exponentiellen Vermehrungsphase durch Zentrifugieren geerntet und anschließend mit einem Phosphatpuffer (pH 7, 0,05 M) gewaschen. Die Zentrifugenrückstände wurden resuspendiert (etwa 5·10⁷ Zellen/ml) in Phosphatpufferlösungen (pH 7, 0,05 M), die freies Chlor mit unterschiedlichen Konzentrationen (0,0 bis 2,0 mg/l) enthielten. Die verschiedenen Bakteriensuspensionen wurden anschließend bei 25°C gerührt. Nach den 20 min wurden zur Analyse Proben von diesen Bakteriensuspensionen (Volumen 100 bis 1000 ml pro zu messende Enzymaktivität) entnommen.
Für jede Probe wurden parallel der Anteil an überlebenden Mikroorganismen und verschiedene Enzymaktivitäten entsprechend folgenden Verfahren gemessen.
Auszählung der überlebenden Mikroorganismen
Es wurde für jede Bakteriensuspensionsprobe die Anzahl der Mikroorganismen, die überlebt hatten, d.h. die Anzahl an kultivierbaren und/oder nicht kultivierbaren, aber lebensfähigen Bakterien, ausgezählt.
Die Auszählung der überlebenden Mikroorganismen kann entsprechend dem Fachmann bekannten herkömmlichen Verfahren erfolgen: beispielsweise durch Ausbreiten auf einem Gelosemedium wie einem TSA-Medium (Tryptic Soy Agar, Difco) zur Auszählung der kultivierbaren Bakterien und durch das CTC-Verfahren zur Auszählung der nicht kultivierbaren, aber lebensfähigen Bakterien (Schaule, G., Flemming, H. C. und Ridgway, H. F., "Use of 5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride for quantifying planktonic and sessile bacteria in drinking water", Appl. Environ. Microbiol., 59, 3850–3857 (1993)).
Aus der gemessenen mittleren Anzahl n_i wurde dann die mittlere Konzentration (C_i) der überlebenden Mikroorganismen bei der jeweiligen untersuchten Dosis i an freiem Chlor berechnet. Jede mittlere Konzentration C_i der überlebenden Mikroorganismen wurde dann relativ zu der maximalen Konzentration der überlebenden Mikroorganismen, wie sie vor der Desinfektion gemessen worden war (maximale Konzentration C_max) angegeben. Im Fall der erfindungsgemäßen Darstellung entspricht C_max der mittleren Konzentration der überlebenden Mikroorganismen, wie sie ohne freies Chlor gemessen worden war. Jede C_i wird so angegeben als Abtötungswert (oder Vernichtungswert) mittels der Formel: Abtötung = Ci/Cmax.
Dieser Anteil an überlebenden Mikroorganismen C_i/C_max ist auch ein Maß für die Qualität der Desinfektion.
Die Ergebnisse der Auszählung der kultivierbaren Mikroorganismen sind in 1 veranschaulicht, worin der Anteil an kultivierbaren Bakterien E. coli in Abhängigkeit von der angewendeten Dosis an freiem Chlor mitgeteilt wird. Auf der Ordinate in 1 sind die Abtötungswerte (oder Vernichtungswerte) aufgetragen, die den Konzentrationen der kultivierbaren Mikroorganismen entsprechen, die durch Auszählung erhalten wurden, und auf die vor der Desinfektion gemessene maximale Konzentration bezogen: 10⁰ zeigt eine Konzentration der kultivierbaren Mikroorganismen an, die gleich der gemessenen maximalen Konzentration ist; 10^–1 zeigt an, dass die Konzentration an kultivierbaren Mikroorganismen sich um den Faktor 10 verringert hat, 10^–2 zeigt an, dass sich die Konzentration an kultivierbaren Mikroorganismen um den Faktor 10² verringert hat, usw. Auf der Abszisse in 1 ist die Anfangskonzentration des freien Chlors der entsprechenden Bakteriensuspension mitgeteilt. Mit den Ergebnissen der Auszählung der nicht kultivierbaren, aber lebensfähigen Mikroorganismen, wurde genauso verfahren, die, falls gewünscht, zu den Ergebnissen der Auszählung der kultivierbaren Mikroorganismen addiert werden können.
Enzymaktivität
Parallel zur zuvor beschriebenen Auszählung der überlebenden Mikroorganismen wurden verschiedene Enzymaktivitäten gemessen.
Es werden insbesondere die zwei Enzyme betreffende Versuche mitgeteilt: Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase (anschließend als ZWF bezeichnet) und Glutathionreduktase. Diese Enzyme sind üblicherweise in zahlreichen Mikroorganismen vorhanden, sie sind daher in der Lage, die Gesamtheit der Mikrobenpopulationen, die in den Suspensionen vorhanden sind, repräsentieren zu können und somit das aus der durchgeführten Desinfektion resultierende Bild zu ergeben.
In den hier beschriebenen Versuchen war die Konzentration der suspendierten Bakterien zu niedrig, als dass ihre Enzymaktivitäten korrekt direkt mit der entnommenen Flüssigkeitsprobe ohne vorhergehende Aufkonzentrierung hätten gemessen werden können. Die Suspensionsproben wurden daher derart filtriert (Membran mit 0,22 μm), dass die Mikroorganismen geerntet werden konnten. Die Mikroorganismen können auch durch ein 10 min langes Zentrifugieren bei 3000 g und 4°C geerntet werden.
Die durchgeführten Vergleichsstudien zeigen, dass es bevorzugt ist, die Mikroorganismen vor der Messung der Aktivität von ZWF oder Glutathionreduktase zu lysieren. Die Filterrückstände (oder Zentrifugenrückstände) wurden deshalb in einem System angeordnet, das die Lyse der geernteten Mikroorganismen erlaubt: Vor einer Aktivitätsmessung von ZWF oder Glutathionreduktase erfolgte die Lyse der Mikroorganismen vorzugsweise durch eine Ultraschallsonde (2 Zyklen à 30 s unter Ultraschall und 30 s ohne Ultraschall). Dazu ist festzustellen, dass, um die Aktivität eines Enzyms zu messen, das nicht ZWF oder Glutathionreduktase ist, wie beispielsweise Katalase oder Superoxiddismutase, die vorhergehende Lyse der Mikroorganismen weggelassen werden kann, indem ein diffundierendes Substrat wie Lucigenin und Wasserstoffperoxid verwendet wird.
Die verschiedenen Enzymaktivitäten können gemäß dem Fachmann bekannten Verfahren gemessen werden. Zusammengefasst werden bei jeder zu messenden Enzymaktivität die Mikroorganismen einer jeden Probe in Berührung mit einem Substrat gebracht, das derart ausgewählt ist, dass das Targetenzym dessen Umwandlung katalysieren kann, und dass diese enzymatische Umwandlung leicht durch herkömmliche Analyseverfahren wie Spektralkolorimetrie, Spektralfluorometrie oder Luminometrie, bei welchen eine Automatisierung realisierbar ist, verfolgt werden kann.
Um die Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase-Aktivität zu messen, wurden die Mikroorganismen der Probe in Berührung mit einem Substrat, das aus 0,6 mM Glucose-6-phosphat und Nicotinamidadenindinucleotidphosphat in oxidierter Form (NADP 0,2 mM) bestand, in Gegenwart einer den pH-Wert stabilisierenden Lösung (Zugabe des Puffers Tris pH 7,6 MgCl₂ 10 mM) gebracht. Dieses Substrat führt in Gegenwart der Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase zur Bildung von Nicotinamidadenindinucleotidphosphat in reduzierter Form (NADPH), das durch spektralkolori metrische Verfolgung einer bei 340 nm auftretenden Wellenlänge verfolgt werden kann (Fraenkel, D. G. und Levisohn, S. R., "Glucose and gluconate metabolism in an Escherichia coli mutant lacking phosphoglucose isomerase", J. Bact., 93, 1571–1578 (1967)).
Zur Messung der Glutathionreduktase-Aktivität werden die Mikroorganismen der Probe in Berührung mit einem Substrat, das aus Nicotinamidadenindinucleotidphosphat in reduzierter Form (NADPH 0,2 mM) und oxidiertem Glutathion (Glutathiondisulfid GS-SG 2,5 mM) besteht, in Gegenwart einer den pH-Wert stabilisierenden Lösung (Phosphatpuffer 100 mM, pH 7) gebracht. Durch die katalytische Wirkung der Glutathionreduktase wird das Substrat in Nicotinamidadenindinucleotidphosphat in oxidierter Form (NADP) und zu Glutathion in reduzierter Form (GSH) umgewandelt. Das Verschwinden des NADPH wird dann spektralkolorimetrisch bei einer Wellenlänge von 340 nm verfolgt (Lopez-Barea, J. und Lee, C. Y., "Mouse liver glutathione reductase: purification, kinetics and regulation", Eur. J. Biochem., 98, 487–499 (1979)).
Die Messungen der Enzymaktivität wurden hier bei derselben konstanten Temperatur (25°C) mit einem Spektralphotometer PERKIN-ELMER, Modell Lambda 1, durchgeführt.
Der Wert der optischen Dichte, der vor der Auslösung der jeweiligen Enzymreaktion gemessen wurde, diente als "Blindwert". Die Werte der optischen Dichte eines jeden Reaktionsmediums wurden dann im Laufe der Zeit aufgezeichnet.
Die wahre Enzymaktivität der Probe wurde dann in dem linearen Teil der Kurve, welche die wahre optische Dichte darstellt, die nach dem In-Berührung-Bringen des Substrats mit dem Targetenzym (beispielsweise zwischen 5 und 35 min) beobachtet wurde, berechnet. Die Berechnung des Anstiegs der Kurve "wahre optische Dichte der Probe in Abhängigkeit von der Zeit" in dem betrachteten Zeitraum von 5 bis 35 min ergibt einen Wert für diese Veränderung der wahren optischen Dichte.
Für jedes Enzym wurden die wahren Enzymaktivitäten, die bei verschiedenen Dosen von Desinfektionsmitteln gemessen (Menge des verbrauchten oder erzeugten Substrats pro Zeiteinheit) wurden, jeweils in Prozent des Anfangswerts der für dieses Enzym aufgezeichneten Aktivität angegeben, d.h. in Prozent des Wertes der für dieses Enzym bei der niedrigsten Desinfektionsmitteldosis gemessenen Aktivität: Im vorliegenden Fall wurde die wahre Aktivität der Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase (ZWF) und die wahre Aktivität der Glutathionreduktase der Proben in Prozent der wahren Aktivität von Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase (ZWF) bzw. Glutathionreduktase angegeben, wie sie bei Bakteriensuspension gemessen wurden, die kein freies Chlor enthielten (d.h. vor der Desinfektion). Dieses Verhältnis von wahrer Enzymaktivität der Flüssigkeit in einer Stufe des Desinfektionsverfahrens (d.h. im Laufe oder nach der Desinfektion) zu wahrer Enzymaktivität dieser Flüssigkeit vor der Desinfektion wird hier als relative Enzymaktivität der Flüssigkeit in dieser Desinfektionsstufe bezeichnet.
Die erhaltenen relativen Enzymaktivitäten wurden dann mit den mikrobiologischen Auszählungen verglichen. Die Ergebnisse der Auszählungen der kultivierbaren Mikroorganismen werden in den 2 und 3 veranschaulicht.
In 2 ist auf der Ordinate die gemessene Aktivität der Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase (ZWF), angegeben in Prozent des Maximums (Anfangsaktivität) der aufgezeichneten Aktivität, und auf der Abszisse die entsprechende Anzahl der kultivierbaren E. coli, die durch Auszählung erhalten wurde, aufgetragen.
In 3 ist auf der Ordinate die gemessene Aktivität der Glutathionreduktase, angegeben in Prozent des Maximums der aufgezeichneten Aktivität (Anfangsaktivität), und auf der Abszisse die entsprechende Anzahl der durch Auszählung erhaltenen kultivierbaren E. coli aufgetragen.
In 2 ist wie in 3 die Anzahl der überlebenden Mikroorganismen als Funktion des logAbtötung entsprechend der Formel: logAbtötung = –log10(Ci/Cmax),worin C_i und C_max wie weiter oben definiert sind, angegeben.
Erforderlichenfalls können dieselben Arten von Figuren erhalten werden, indem die Ergebnisse der Auszählung der nicht kultivierbaren oder lebensfähigen Mikroorganismen berücksichtigt werden.
In 2 sind wie in 3 die Werte von logAbtötung auf der Abszisse auf folgende Weise aufgetragen: 1E + 00 bedeutet die Anzahl kultivierbarer Mikroorganismen, die gleich der gemessenen maximalen Anzahl ist (die Suspension enthält kein freies Chlor), 1E – 01 bedeutet die Anzahl der kultivierbaren Mikroorganismen, die gleich der gemessenen maximalen Anzahl minus der Anzahl Mikroorganismen ist, die einem Wert von logAbtötung von 1 entspricht, 1E – 02 bedeutet die Anzahl kultivierbarer Mikroorganismen, die gleich der gemessenen maximalen Anzahl minus der Anzahl Mikroorganismen ist, die einem Wert des logAbtötung von 2 entspricht, usw., bis 1E – 07, der die Anzahl kultivierbarer Mikroorganismen bedeutet, die gleich der gemessenen maximalen Anzahl minus der Anzahl Mikroorganismen ist, die einem Wert des logAbtötung von 7 entspricht.
Dazu ist festzustellen, dass dieser Wert von logAbtötung auch ein Kennwert für die mikrobiologische Qualität der jeweiligen Flüssigkeit darstellt, der als D bezeichnet wird.
Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass die Verfolgung der Aktivität der Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase (relative Aktivität) ein repräsentativer Indikator für die Anzahl der überlebenden Mikroorganismen innerhalb eines Probenbereichs ist, der von Flüssigkeitsproben, die keine entfernende Behandlung der Mikroorganismen erfahren haben, bis zu Flüssigkeitsproben, die einen logAbtötung (oder Vernichtung) von unter oder gleich etwa 3 (siehe 2) aufweisen, reicht.
Die erhaltenen Ergebnisse zeigen auch, dass die Glutathionreduktase-Aktivität (relative Aktivität) ein repräsentativer Indikator für die Anzahl der überlebenden Mikroorganismen innerhalb eines Flüssigkeitsprobenbereichs ist, der einen log Abtötung (oder Vernichtung) von etwa 4 bis 7 aufweist (siehe 3). Die Glutathionreduktase-Aktivität wird nicht signifikant beeinflusst, bevor logAbtötung von 4 nicht erreicht ist. Eine signifikante Proportionalität zwischen relativer Aktivität und log Abtötung wurde bei diesem Enzym erst in dem Bereich von log Abtötung von etwa 4 bis 7 beobachtet.
Auf ähnliche Weise konnten wir zeigen, dass die (relative) Aktivität der Superoxiddismutase (gemessen durch Luminometrie mit Lucigenin) ein repräsentativer Indikator für die Anzahl der überlebenden Mikroorganismen in einem Flüssigkeitsprobenbereich ist, der einen logAbtötung (oder Vernichtung) von etwa 3 bis 6 aufweist. Superoxiddismutasen und Katalasen haben außerdem den Vorteil, dass sie keine Lyse erfordern: Die Messung ihrer Aktivität kann mit einem diffundierenden Substrat wie Lucigenin bzw. bei Wasserstoffperoxid durch Luminometrie durchgeführt werden.
Die untersuchten verschiedenen Enzyme überdecken deshalb nicht dieselben Empfindlichkeitsbereiche: Die relative Aktivität der Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase (ZWF) ist ein repräsentativer Indikator für die Anzahl der überlebenden Mikroorganismen (log Abtötung) in Flüssigkeitsproben, die nur kleine relative Verminderungen von Mikrobenpopulationen erfahren haben, und die relative Aktivität von Superoxiddismutase und Glutathionreduktase ist ein repräsentativer Indikator für die Anzahl der überlebenden Mikroorganismen (log Abtötung) in Flüssigkeitsproben, die mittlere bis starke relative Verminderungen von Mikrobenpopulationen erfahren haben.
Dieselben Arten von Empfindlichkeitsbereichen (Proportionalität von relativer Aktivität und logAbtötung in bestimmten Wertebereichen von log Abtötung konnten beobachtet werden, indem die relative Aktivität von Malatdehydrogenase, Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase und Katalasen (entweder durch Messung des Verbrauchs von Wasserstoffperoxid bei 240 nm in einer gepufferten Lösung mit pH 7 oder durch Chemolumineszenz) gemessen wurde. Der Fachmann wird weitere Enzymbeispiele und Messvorschriften für Enzymaktivitäten in verschiedenen Bezugnahmen wie Oxidative stress and the molecular biology of antioxidant defenses, 1997, Cold Spring Harbor Laboratory Press 0-87969-502-1/97, Lehninger, 1977, Biochimie, Flammarion ISBN 2-257-25009-5, und Methods in Enzymology, Academic Press Inc., beispielsweise Bände I-XLI-XLII-89-105 und 234, finden können.
Jedes Enzym, für welches eine signifikante Proportionalität (signifikanter Anstieg, beispielsweise von unter –0,2) von relativer Aktivität zu logAbtötung nachgewiesen werden kann, beispielsweise indem die weiter oben beschriebene Vorschrift befolgt wird, stellt einen erfindungsgemäßen zuverlässigen Indikator dar.
Dieselben Typen von Enzymempfindlichkeitsbereichen können erhalten werden, indem auf E.-coli-Suspensionen keine zunehmenden Chlordosen, sondern zunehmende Ozon- oder UV-Dosen angewendet werden.
Diskussion
Es hat sich somit gezeigt, dass es die Messung der Enzymaktivität erlaubt, die Veränderung der Mikrobenpopulationen in einer Flüssigkeit, die desinfiziert wird, zu verfolgen. Diese verschiedenen enzymatischen Indikatoren für das Überleben von Mikroben erlauben es, alle Mikrobenpopulationen: kultivierbare und nicht kultivierbare, aber lebensfähige Mikroorganismen, zu berücksichtigen.
Beispielsweise kann die relative Aktivität von ZWF bei log Abtötung von unter 3 und die relative Aktivität der Glutathionreduktase bei log Abtötung von über 4 verfolgt werden. Wenn die genaue Messung eines log Abtötung von 3 bis 4 erforderlich ist, kann dann beispielsweise die relative Aktivität der Superoxiddismutase gemessen werden.
Wenn die Desinfektion nicht zu einem logAbtötung von über 6 geführt hat, kann dann entweder einfach die relative Aktivität der Superoxiddismutase, die erst ab logAbtötung von über 3 beginnt, zu reagieren, oder die relative ZWF-Aktivität bis zu log Abtötung von 3 und anschließend ab da die relative Superoxiddismutaseaktivität verfolgt werden.
Die zuvor beschriebenen verschiedenen Typen enzymatischer Indikatoren für das Überleben von Mikroorganismen erlauben es deshalb, den Wert von log Abtötung der Kontrollflüssigkeit und damit seinen Kennwert D der mikrobiologischen Qualität, seinen Abtötungswert und die Anzahl der darin überlebenden Mikroorganismen zu kennen. Sie geben somit eine genaue Messung von Geschwindigkeit und Wirkungsgrad des angewendeten Desinfektionsverfahrens.
Wenn die Anzahl der überlebenden Mikroorganismen in der Kontrollflüssigkeit (beispielsweise angegeben in Form von logAbtötung oder einem Kennwert der Desinfektion) nicht dem gewünschten Ziel der Desinfektion entspricht (beispielsweise dem Sollwert des logAbtötung oder der Qualität der Desinfektion), kann die Dosis an Desinfektionsmittel/n, die auf die Flüssigkeit angewendet wird (beispielsweise Konzentration an freiem Chlor oder an Ozon und Dosis von UV, Temperatur, Ultraschall und ionisierender Strahlung) demgemäß angepasst werden.
Diese Erhöhung oder Senkung der Dosis an Desinfektionsmittel/n kann erfolgen, indem die Veränderung der Anzahl der überlebenden Mikroorganismen (log Abtötung) mittels der zuvor mitgeteilten enzymatischen Indikatoren bis zum Erreichen des Desinfektionsziels regelmäßig verfolgt wird.
Die Anpassung der Dosis an Desinfektionsmittel/n kann auch mittels Referenzkurven erfolgen, die zuvor mit einer Probe der Flüssigkeit aufgestellt worden sind, die den Anteil der überlebenden Mikroorganismen darstellen, beispielsweise angegeben als Werte des log Abtötung in Abhängigkeit von der Dosis an angewendetem/angewendeten Desinfektionsmittel/n (beispielsweise zunehmende Dosen an freiem Chlor, Ozon, UV, Temperatur, Ultraschall und ionisierender Strahlung).
Solche Referenzkurven erlauben es, die Werte der äquivalenten Dosen an Desinfektionsmittel/n für den gemessenen bzw. gewünschten Anteil an überlebenden Mikroorganismen abzulesen, wie sie mit den zuvor beschriebenen enzymatischen Indikatoren erhalten worden sind. Dabei genügt es dann, die Dosis an Desinfektionsmittel/n, die auf die Kontrollflüssigkeit angewendet worden ist, um die Differenz, die zwischen diesen Äquivalenten Dosen an Desinfektionsmittel/n abgelesen worden ist, zu erhöhen oder zu senken.
Solche Referenzkurven können beispielsweise erhalten werden, indem die überlebenden Mikroorganismen in einer Probe dieser Flüssigkeit ausgezählt werden, die zunehmenden desinfizierenden Dosen ausgesetzt worden ist (beispielsweise zunehmenden Konzentrationen an freiem Chlor oder Ozon und zunehmenden Dosen an UV, ionisierender Strahlung, Ultraschall und steigenden Temperaturen).
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Regelung der Desinfektion einer Flüssigkeit erlaubt es somit, durch die Messung von Enzymaktivitäten die Desinfektion der Flüssigkeit vollständig, einfach und schnell (weniger als eine Stunde) zu kontrollieren, und dies unabhängig von dem physiologischen Zustand oder der Identität der Mikroorganismen, die darin überlebt haben. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Regelung der Desinfektion einer Flüssigkeit hat außerdem den besonderen Vorteil, dass es sich leicht automatisieren lässt, im Gegensatz zu den Verfahren, in welchen mikroskopische Techniken oder mikrobiologische Kultivierungstechniken angewendet werden.
Es ist jedoch selbstverständlich, dass die vorliegende Erfindung nicht auf die Ausführungsbeispiele beschränkt ist, die zuvor beschrieben und veranschaulicht worden sind, sondern dass sie alle Abwandlungen umfasst. So können insbesondere die Messungen der Enzymaktivität durch andere Analyseverfahren als die zuvor beschriebenen durchgeführt werden.

Claims

Verfahren zur Regelung der Desinfektion einer Flüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, dass es a) in einer nachfolgend als Stufe 2 bezeichneten Stufe der Desinfektion die Messung der Aktivität mindestens eines Enzyms, indem gegebenenfalls in der Flüssigkeit vorhandene Mikroorganismen mit einem Substrat in Berührung gebracht werden, das in der Lage ist, die Aktivität des/der Enzyme/s nachzuweisen, wobei diese Enzymaktivität anschließend als wahre Aktivität bezeichnet wird, b) in einer nachfolgend als Stufe 1 bezeichneten Stufe, die der Stufe 2 vorangeht, die Messung der Aktivität desselben/derselben Enzyme/s wie in a), wobei diese Aktivität anschließend als Anfangsaktivität bezeichnet wird, c) das Ausdrücken von wahrer und Anfangsaktivität für das jeweilige Enzym als Anteil an Mikroorganismen, die in der Flüssigkeit in Stufe 2 der Desinfektion überlebt haben, über ein Referenzsystem, das vorher mittels einer Probe dieser Flüssigkeit hergestellt worden ist, die in Stufe 1 entnommen und anschließend steigenden Dosen an Desinfektionsmittel/n ausgesetzt wurde, und d) die Anpassung des Charakters und/oder der Dosen des/der chemischen bzw. physikalischen Mittel/s, das/die zur Desinfektion angewendet wird/werden, abhängig vom Anteil an überlebenden Mikroorganismen, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Stufe 1 einer Stufe vor der Desinfektion der Flüssigkeit entspricht, und dass die Stufe 2 einer beliebigen Stufe der Desinfektion entspricht.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Flüssigkeit eine solche, die vorgesehen ist, mit Mensch oder Tier in Berührung gebracht zu werden, wie Badewasser, zur Konsumtion bestimmtes Wasser, für pharmazeutische oder biotechnologische Zubereitungen bestimmtes Wasser oder eine als Lebensmittel geeignete Flüssigkeit ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das In-Berührung-Bringen der gegebenenfalls in der Flüssigkeit vorhandenen Mikroorganismen mit dem Substrat durch In-Berührung-Bringen der Flüssigkeit bzw. einer Probe dieser Flüssigkeit mit dem Substrat realisiert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das In-Berührung-Bringen der gegebenenfalls in der Flüssigkeit bzw. einer Probe der Flüssigkeit vorhandenen Mikroorganismen mit dem Substrat durch In-Berührung-Bringen eines Filtrats oder Zentrifugenrückstands der Flüssigkeit oder einer Probe dieser Flüssigkeit mit dem Substrat realisiert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Flüssigkeit, die Flüssigkeitsprobe, oder das Konzentrat vor der Messung der Aktivität mindestens eines Enzyms einer aufschließenden Behandlung, insbesondere durch Beschallung, unterworfen wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das/die Enzym/e, dessen/deren Aktivität gemessen wird/werden, in der Flüssigkeit, der Flüssigkeitsprobe oder dem Konzentrat ein Verhältnis von wahrer zu Anfangsaktivität in affiner Relation und mit einem Anstieg, der sich deutlich von Null unterscheidet und vorzugsweise kleiner als –0,2 ist, zu dem An teil an überlebenden Mikroorganismen über mindestens einen Wertebereich des Anteils an überlebenden Mikroorganismen aufweist/aufweisen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym oder mindestens eines der Enzyme, dessen/deren Aktivität gemessen wird, eine Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase, Malat-Dehydrogenase, Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase, Katalase, Superoxid-Dismutase oder Glutathion-Reduktase ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Messungen der wahren und der Anfangsaktivität mittels eines Spektralphotometers, Spektralfluorometers oder Luminometers durchgeführt werden, die gegebenenfalls mehrere Analysekanäle besitzen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Ausdrücken als Anteil an überlebenden Mikroorganismen mit Hilfe des Referenzsystems die Berechnung des gegebenenfalls in Prozent angegebenen Verhältnisses von wahrer zu Anfangsaktivität für das jeweilige Enzym umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Referenzsystem in Form eines Diagramms wie einer oder mehrerer Kurven vorliegt, die für das jeweilige Enzym das Verhältnis von wahrer zu Anfangsaktivität in Relation zu den Werten des Anteils an überlebenden Mikroorganismen bringen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die spektroskopischen Messungen für jede gemessene Enzymaktivität bei konstanter Temperatur, insbesondere 25°C, und bei konstanter Wellenlänge, insbesondere einer Wellenlänge von 240 bis 550 nm, beispielsweise 340 nm, durchgeführt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die spektroskopischen Messungen über einen Zeitabschnitt von etwa 30 min kontinuierlich oder diskontinuierlich durchgeführt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Anpassung der Dosen des/der chemischen bzw. physikalischen Mittels durch Zugabe des "Desinfektionsmitteldosisäquivalents" erfolgt, das der Differenz zwischen dem gewünschten Anteil an überlebenden Mikroorganismen und dem in der Flüssigkeit, der Probe oder dem Konzentrat gemessenen Anteil an Mikroorganismen entspricht.
Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Desinfektionsmitteldosisäquivalent derart ist, dass es von einer Referenzkurve abgelesen wird, die den Anteil an überlebenden Mikroorganismen in Abhängigkeit von der Desinfektionsmitteldosis, der die Flüssigkeit ausgesetzt ist, darstellt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Flüssigkeit Mikroorganismen enthält, welche aus der Gruppe ausgewählt sind, die von den Gattungen Escherichia, Alcaligenes, Bacillus, Flavobacterium, Methylobacterium, Pseudomonas, Klebsiella, Enterobacterium, Agrobacterium, Streptococcus, Micrococcus und Salmonella gebildet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass es ein automatisiertes Verfahren zur Desinfektion einer Flüssigkeit ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass der Anteil an überlebenden Mikroorganismen als Schwächungswert (Konzentration der überlebenden Mikroorganismen, bezogen auf die Anfangskonzentration der überlebenden Mikroorganismen, wie sie in Stufe 1 gemessen wird, als Logarithmus der Schwächung (–log₁₀(Schwächung))) oder Kennzahl D (= logSchwächung) ausgedrückt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die überlebenden Mikroorganismen kultivierbare und/oder nicht kultivierbare, aber lebensfähige Mikroorganismen sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die chemischen bzw. physikalischen Mittel, die zur Desinfektion angewendet werden, aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Chlor und seinen Verbindungen, UV-Strahlung, Ozon, H₂O₂, Filtermembranen, Temperatur, Ultraschall und ionisierender Strahlung besteht.