ES2148125T3 - Procedimiento de regulacion de la desinfeccion de liquidos. - Google Patents
Procedimiento de regulacion de la desinfeccion de liquidos.Info
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Abstract
Procedimiento de regulación de la desinfección de un líquido, caracterizado porque comprende: A. en una etapa de dicha desinfección, designada a continuación etapa 2, la medición de la actividad de por lo menos una enzima mediante puesta en contacto de los microorganismos, eventualmente presentes en dicho líquido, con un substrato seleccionado por ser capaz de revelar la actividad de esta o estas enzima(s), siendo denominada esta actividad enzimática, a continuación, actividad propia, B. en una etapa designada a continuación etapa 1, anterior a dicha etapa 2, la medición de la actividad de la o las misma(s) enzima(s) que en A, siendo designada esta actividad a continuación actividad inicial, C. la traducción, para cada enzima, de la actividad propia y de la actividad inicial señaladas, a porcentajes de microorganismos supervivientes en dicho líquido en la etapa 2 de dicha desinfección, y ello por intermedio de un sistema de referencia, preestablecido con la ayuda de una muestra de dicho líquido que se ha tomado en dicha etapa 1 y luego se ha expuesto a unas dosis crecientes de desinfectante(s), así como D. el ajuste, en función de dicho porcentaje de microorganismos supervivientes, de la naturaleza y/o de las dosis del (de los) agente(s) químico(s) o físico(s) utilizados para dicha desinfección.
Description
Procedimiento de regulación de la desinfección de
líquidos.
El presente invento se refiere, de una manera
general, a unos medios para la regulación de la desinfección de
líquidos. Concierne, más particularmente, a unos medios de
regulación que ponen en práctica la medición de actividades
enzimáticas.
La garantía de calidad y de inocuidad de los
líquidos destinados a estar en contacto con un ser humano o un
animal, tales como un agua destinada al consumo, un líquido
alimentario, un agua de baño, un agua destinada a formulaciones
farmacéuticas o biotecnológicas, depende directamente de la
fiabilidad y de la sensibilidad de las técnicas empleadas para medir
el número de microorganismos supervivientes en dicho líquido.
Los métodos actualmente empleados para la
regulación de la desinfección de un líquido utilizan las técnicas de
cultivación en gelosa y/o las técnicas de microscopías.
Las técnicas de cultivación en gelosa consisten
en recontar el número de colonias bacterianas que se desarrollan en
diferentes medios nutritivos gelosados normalizados (p.ej. según la
norma francesa NF T 90-414, Ensayos de aguas,
Investigación y recuento de los coliformes y de los coliformes
termotolerantes). Estas técnicas presentan varios
inconvenientes.
En primer lugar, se puede citar el hecho de que
éstas no dan sus resultados más que al cabo de 24 horas en promedio,
lo cual retrasa en igual medida el ajuste eventual del procedimiento
de desinfección.
Las técnicas de cultivación en gelosa se
restringen, además, a la realización de baterías de cultivos
microbiológicos para el análisis de cada muestra de líquido. En
efecto, todas las familias de microbios, y de bacterias en
particular, no se desarrollan en el mismo medio nutritivo; así, no
puede detectarse ningún coliforme después de cultivar en el medio
nutritivo normalizado para la detección de los coliformes, sino
encontrarse un buen número de otras bacterias después de cultivar en
otros medios nutritivos. La elección de los medios nutritivos
gelosados determina por lo tanto la calidad del análisis. Esta
elección es tanto más delicada por cuanto que a veces se ha
observado un número más importante de colonias después de cultivar
en un medio distinto del medio nutritivo normalizado para la
detección de estas mismas colonias. Se ha demostrado por ejemplo que
los recuentos de la flora bacteriana aerobia revivificable eran
mayores en el medio gelosado R2A que en el medio nutritivo
normalizado correspondiente (véase por ejemplo "A new rapid medium
for enumeration and subculture of bacteria from potable water"
[Un nuevo método rápido para la enumeración y la subcultivación de
bacterias procedentes de un agua potable] de Reasoner D. J. y
Godreich E. F., App. Environm. Microbiol. (1985)
49-páginas 1-7). Para establecer un
diagnóstico negativo fiable, las técnicas de cultivación en gelosa
recurren por lo tanto a una multiplicación de los análisis. Las
técnicas de cultivación en gelosa no permiten además automatizar con
facilidad la regulación del proceso de desinfección.
Las bacterias son además capaces, y en particular
como continuación de un estrés ambiental, tal como la aplicación de
un proceso de desinfección, de adoptar una forma de resistencia, con
la cual ellas no se multiplican mientras que se asegure un
metabolismo mínimo; a partir de la restauración de las condiciones
ambientales más favorables, estas bacterias podrían reanudar su
multiplicación. Tales bacterias son denominadas "no cultivables
pero viables": no son detectables por las clásicas técnicas de
cultivación en gelosa y pueden representar un riesgo biológico para
el consumidor.
Un método actual, disponible para controlar de
una manera casi segura la eficacia de la desinfección de un líquido,
utiliza unas técnicas de microscopías asociadas con coloraciones
específicas. Este método permite una discriminación entre bacterias
cultivables, bacterias no cultivables pero viables, y bacterias
muertas. Necesita, no obstante, la realización de varias ensayos de
coloraciones para cada muestra, y desde un punto de vista técnico es
difícilmente automatizable.
Más particularmente, los documentos de patentes
de los EE.UU. US-A-5.223.401,
US-A-5.366.872 y el documento de
solicitud de patente francesa
FR-A-2.638.170 describen unos
indicadores de esterilidad. Ahora bien, la esterilización representa
un caso particular de la desinfección. No obstante, los indicadores
divulgados en estos documentos no permiten obtener más que unos
resultados finales cualitativos.
Por lo demás, el documento
US-A-5.158.973 se refiere a la
optimización, para una muestra dada, de la concentración de dos
agentes bactericidas en función del porcentaje de incorporación de
^{14}C en células bacterianas.
El presente invento pretende paliar los
inconvenientes de las técnicas de la tecnología anterior y propone
un procedimiento de regulación de la desinfección de un líquido,
caracterizado porque comprende:
A. en una etapa de dicha desinfección, designada
a continuación etapa 2, la medición de la actividad de por lo menos
una enzima mediante puesta en contacto de los microorganismos,
eventualmente presentes en dicho líquido, con un substrato
seleccionado por ser capaz de revelar la actividad de esta o estas
enzima(s), particularmente por transformación de dicho
substrato en compuestos coloreados, fluorescentes o luminiscentes, o
por desaparición de dicho substrato, siendo denominada esta
actividad enzimática, a continuación, actividad propia,
B. en una etapa designada a continuación etapa
1, anterior a dicha etapa 2, la medición de la actividad de la o las
misma(s) enzima(s) que en A, siendo designada esta
actividad a continuación actividad inicial,
C. la traducción, para cada enzima, de la
actividad propia y de la actividad inicial señaladas, a porcentajes
de microorganismos supervivientes en dicho líquido en la etapa 2 de
dicha desinfección, y ello por intermedio de un sistema de
referencia, preestablecido con la ayuda de una muestra de dicho
líquido que se ha tomado en dicha etapa 1 y luego se ha expuesto a
unas dosis crecientes de desinfectante(s), así como
D. el ajuste, en función de dicho porcentaje de
microorganismos supervivientes, de la naturaleza y/o de las dosis
del (de los) agente(s) químico(s) o físico(s)
utilizados para dicha desinfección.
Por microorganismos supervivientes, los autores
entendemos, en la presente solicitud, microorganismos cultivables
y/o microorganismos no cultivables pero viables.
Por porcentajes de microorganismos
supervivientes, los autores entendemos, en la presente solicitud, la
relación entre la concentración de microorganismos supervivientes en
dicho líquido en dicha etapa 2 de desinfección y la concentración de
microorganismos supervivientes en el mismo líquido en dicha etapa 1.
Este porcentaje de microorganismos supervivientes es expresado
preferentemente en valores de aniquilamiento en la forma de
potencias negativas de 10 o en el logaritmo de aniquilamiento que
corresponde a - log_{10} (de aniquilamiento).
Dicha etapa 1 puede corresponder, por ejemplo, a
una etapa "antes de la desinfección" de dicho líquido y dicha
etapa 2 puede corresponder a una etapa cualquiera del procedimiento
de desinfección (etapas "después de la desinfección" de dicho
líquido comprendido allí).
El procedimiento según el invento se refiere a
unos líquidos en los cuales los microorganismos eventualmente
presentes están sometidos a unas condiciones absolutamente
particulares, a saber a unas condiciones de desinfección que inducen
un estrés notable de las células.
El procedimiento de la regulación de la
desinfección de un líquido según el invento se refiere
particularmente a los líquidos destinados a ser puestos en contacto
con un ser humano o un animal, independientemente de que esto se
realice por simple contacto, o por absorción, ingestión, instilación
o inyección. Este procedimiento se aplica particularmente a unos
líquidos destinados a estar en contacto con un ser humano o un
animal, tal como un agua de baño, un agua destinada al consumo, un
agua destinada a formulaciones farmacéuticas o biotecnológicas, o un
líquido alimentario.
Dicha puesta en contacto de los microorganismos,
eventualmente presentes en dicho líquido, con dicho substrato, se
puede realizar por puesta en contacto directo de dicho líquido, o de
una muestra de dicho líquido, con dicho substrato, o bien por puesta
en contacto de un concentrado de dichos microorganismos
eventualmente presentes, tal como un material filtrado, o un residuo
de centrifugación, de dicho líquido o de dicha muestra de líquido,
con dicho substrato.
Con anterioridad a la medición de la actividad de
ciertas enzimas, tales como la
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa o
la glutatión reductasa, el procedimiento según el invento comprende,
de una manera ventajosa, la etapa de someter a dicho líquido, a
dicha muestra de líquido o a dicho concentrado, a un tratamiento de
lisis, particularmente por sonicación (tratamiento con
ultrasonidos).
Con anterioridad a la medición de la actividad de
otras enzimas, tales como una catalasa o superóxido dismutasa, la
etapa de lisis previa se puede evitar: la actividad de estas enzimas
se puede medir con la ayuda de un substrato que se difunde en el
interior de los microorganismos, tal como la lucigenina y el
peróxido de hidrógeno.
De acuerdo con un aspecto ventajoso del invento,
la o las enzima(s) cuya(s) actividad(es) se
mide(n), presenta(n), en dicho líquido, en dicha
muestra de líquido o en dicho concentrado una relación entre la
actividad propia y la actividad inicial en una correspondencia afín
y con una pendiente significativa diferente de cero, preferentemente
menor que -0,2, con el porcentaje de microorganismos supervivientes
en al menos un intervalo de valores de dichos porcentajes de
microorganismos supervivientes. Éste se da el caso, por ejemplo, con
la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa
para unos logaritmos de aniquilamiento comprendidos entre
aproximadamente 0 y 3, con la glutatión reductasa para unos
logaritmos de aniquilamiento comprendidos entre aproximadamente 4 y
7, y con la superóxido dismutasa para unos logaritmos de
aniquilamiento comprendidos entre aproximadamente 3 y 6.
Otras enzimas que tienen interés pueden
especialmente formar parte de la familia de las deshidrogenasas o de
la familia de las enzimas implicadas en la respuestas al estrés
oxidante.
Para determinar si una (o varias)
enzima(s) es (o son) apropiada(s) para la puesta en
práctica del método de regulación según el invento en un líquido
dado, se podrá proceder de la siguiente manera:
- toma de por lo menos una muestra de dicho
líquido y medición de la concentración de microorganismos
supervivientes (microorganismos cultivables y/o microorganismos no
cultivables pero viables), en particular por cultivación en gelosa
y/o por coloraciones y observaciones en un microscopio,
- valoración de la actividad de cada enzima
candidata, en esta o estas muestra(s) de líquido,
- exposición de dicha o dichas muestra(s)
de líquido a diferentes dosis de desinfectante(s) en unas
condiciones por lo demás equivalentes (p.ej. condiciones de duración
de la exposición y de temperatura),
- medición de la actividad de cada enzima
candidata después de exposición a las diferentes dosis de
desinfectante(s),
- producción, para cada enzima candidata, de una
curva que presenta los porcentajes de actividad (actividad
enzimática medida, después de una exposición a las diferentes dosis
de desinfectante(s), referida a la actividad enzimática
correspondiente antes de la exposición) en función de los logaritmos
de aniquilamiento medidos (tales como antes se definen),
- determinación, para cada enzima candidata, del
intervalo de logaritmos de aniquilamiento para el que la pendiente
de dicha curva es significativamente diferente de cero,
preferentemente menor que -0,2, constituyendo este intervalo la gama
de respuesta de la enzima candidata considerada en dicho
líquido,
- una enzima candidata es apropiada para la
puesta en práctica del método según el invento en dicho líquido, si
su gama de respuesta comprende los valores del logaritmo de
aniquilamiento que corresponden a los objetivos de desinfección,
pretendidos para el líquido considerado.
Según un aspecto particularmente ventajoso del
invento, la o por lo menos una de las enzima(s)
cuya(s) activi-
dad(es) se mide(n) es una glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, una malato deshidrogenasa, una gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, una catalasa, una superóxido dismutasa o una glutatión reductasa. Dicha (o por lo menos una de dichas) actividad(es) enzimática(s) se miden entonces, por transformación de un substrato, y llegado el caso, en presencia de un co-factor, tal como respectivamente glucosa-6-fosfato y el co-factor NADP, L-malato y el co-factor-NAD, el gliceraldehído-3-fosfato y el co-factor NAD, lucigenina, peróxido de hidrógeno, glutatión oxidado y el co-factor NADPH.
dad(es) se mide(n) es una glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, una malato deshidrogenasa, una gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, una catalasa, una superóxido dismutasa o una glutatión reductasa. Dicha (o por lo menos una de dichas) actividad(es) enzimática(s) se miden entonces, por transformación de un substrato, y llegado el caso, en presencia de un co-factor, tal como respectivamente glucosa-6-fosfato y el co-factor NADP, L-malato y el co-factor-NAD, el gliceraldehído-3-fosfato y el co-factor NAD, lucigenina, peróxido de hidrógeno, glutatión oxidado y el co-factor NADPH.
Según un modo ventajoso de realización del
invento, dichas mediciones de la actividad propia y de la actividad
inicial se efectúan con ayuda de un aparato para detección de la
intensidad luminosa, tal como un espectrofotómetro, un
espectrofluorómetro o un luminómetro, que presenta eventualmente
varios canales de análisis.
Según otro modo ventajoso de realización del
invento, dicha traducción a porcentajes de microorganismos
supervivientes con ayuda de dicho sistema de referencia
preestablecido, comprende, para cada enzima, el cálculo de la
relación entre la actividad propia y la actividad inicial,
eventualmente expresada en porcentaje.
Según todavía otro modo ventajoso de realización
del invento, dicho sistema de referencia se presenta en una forma
gráfica tal como la de una o varias curva(s), que
pone(n), para cada enzima, a dicha relación entre la
actividad propia y la actividad inicial en correspondencia con unos
valores de las porcentajes de microorganismos supervivientes, tales
como los logaritmos de aniquilamiento. Dicha relación entre la
actividad propia y la actividad inicial se designa igualmente como
"actividad relativa" en la presente solicitud de patente.
Según un aspecto de este otro modo ventajoso de
realización del invento, dichas mediciones espectrofotométricas se
pueden realizar particularmente, para cada actividad enzimática
medida, a una temperatura constante, en particular a 25ºC y a una
longitud de onda constante, particularmente a una longitud de onda
comprendida entre 240 y 550 nm, por ejemplo a 340 nm. Dichas
mediciones se pueden registrar de una manera continua o discreta en
un intervalo de tiempo de aproximadamente 30 min. En el caso de que
se busquen unas sensibilidades de medición más elevadas, se utiliza
preferentemente la luminometría.
La etapa de ajuste de la desinfección del
procedimiento conforme al invento, puede efectuarse por seguimiento
regular de la evolución del porcentaje de microorganismos
supervivientes (p.ej. expresado como aniquilamiento, logaritmo de
aniquilamiento o índice D) con la ayuda de los indicadores
enzimáticos presentados con anterioridad en esta memoria, y ello
hasta la obtención del objetivo de desinfección que se ha
establecido.
La etapa de ajuste de la desinfección del
procedimiento según el invento puede efectuarse igualmente por suma
de la equivalente "dosis de desinfectante(s)" que
corresponde a la diferencia entre el porcentaje pretendido de
microorganismos supervivientes (valor de consigna) y el porcentaje
de microorganismos medido realmente en dicho líquido, en dicha
muestra de líquido o en dicho concentrado, en una etapa de la
desinfección, o después de la desinfección.
Ventajosamente, dicha equivalente dosis de
desinfectante(s) es tal como se lee en una curva de
referencia, que representa el porcentaje de microorganismos
cultivables en función de la dosis de desinfectante(s) a la
que es expuesto dicho líquido.
El invento da unos resultados particularmente
ventajosos para líquidos que comprenden microorganismos
seleccionados entre el conjunto constituido particularmente por los
géneros Escherichia, Alcaligenes, Bacillus, Flavobacterium,
Methylobacterium, Pseudomonas, Klebsiella, Enterobacterium,
Agrobacterium, Streptococcus, Micrococcus y
Salmonella.
El procedimiento de regulación de la desinfección
de un líquido según el invento puede, de una manera particularmente
ventajosa, ser automatizado fácilmente en un procedimiento de
desinfección de un líquido. Al contrario que en las técnicas de la
tecnología anterior, el procedimiento según el invento permite un
control microbiológico seguro, rápido y fácil de poner en
práctica.
De manera preferente, dicho porcentaje de
microorganismos supervivientes se expresa como valor del
aniquilamiento (concentración de microorganismos supervivientes,
referida a la concentración inicial de microorganismos
supervivientes, tal como se mide en dicha etapa 1, del logaritmo de
aniquilamiento (= -log_{10} (aniquilamiento)) o del índice D (=
logaritmo de aniquilamiento). Dicho índice D constituye igualmente
un índice de la calidad microbiológica del líquido considerado.
Dicho procedimiento de regulación de la
desinfección de un líquido según el invento considera, como
organismos supervivientes, aquellos de los microorganismos presentes
que son cultivables y/o aquellos de estos microorganismos presentes
que no son cultivables pero son viables. En el caso en el que se
desee tener en cuenta a la vez los microorganismos cultivables y los
microorganismos no cultivables pero viables, dicho sistema de
referencia establece entonces ventajosamente, para cada enzima,
dicha relación entre la actividad propia y la actividad inicial en
correspondencia con unos valores de los porcentajes de
microorganismos supervivientes que resultan de la suma de los
valores de los porcentajes de microorganismos cultivables y de los
valores de los porcentajes de microorganismos no cultivables pero
viables, tales como los que se miden con ayuda de las técnicas
clásicas.
Entre dichos agentes químicos o físicos,
ventajosamente utilizados para dicha desinfección, se pueden citar
el cloro y sus derivados, los rayos UV (ultravioletas), el ozono,
H_{2}O_{2}, las membranas filtrantes, la temperatura, los
ultrasonidos y las radiaciones ionizantes.
Otras características y ventajas del presente
invento se pondrán de manifiesto todavía a través de los ejemplos de
realización siguientes, dados a título indicativo y no
limitativo.
Dichos ejemplos hacen referencia a las figuras 1,
2 y 3:
La figura 1 representa el porcentaje de bacterias
Escherichia coli cultivables (expresado como valor de
aniquilamiento con relación a la población inicial) en función de la
concentración de cloro libre aplicado (mg/l),
La figura 2 representa la actividad de
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa
(ZWF), expresada como % de la actividad máxima medida, en función
del porcentaje de bacterias cultivables (expresado como valores de
aniquilamiento con relación a la población inicial de
microbios),
La figura 3 representa la actividad de glutatión
reductasa, expresada como % de la actividad inicial (máxima) medida,
en función del porcentaje de bacterias cultivables (expresado como
valores de aniquilamiento con relación a la población máxima de
microbios).
Se busca determinar si las actividades
enzimáticas pueden constituir un indicador fiable del porcentaje de
microorganismos supervivientes en un líquido para desinfección, tal
como un agua destinada al consumo humano.
Con este objetivo, se produce un inóculo por pura
cultivación de Escherichia coli (cepa MG1655 disponible en el
Institut Pasteur) en un medio nutritivo a 25ºC (medio LB, que
comprende 10 g/l de tripsina Bacto, 5 g/l de un extracto de levadura
Bacto, 10 g/l de NaCl, con un pH ajustado a 7). Las bacterias se
cosechan en una fase exponencial de crecimiento por centrifugación,
y luego se lavan con la ayuda de un tampón de fosfato (de pH 7; 0,05
M). Los residuos se vuelven a poner en suspensión (aproximadamente 5
\cdot 10^{7} células/ml) en unas soluciones de un tampón de
fosfato (de pH 7; 0,05 M) que comprenden cloro libre en diferentes
concentraciones (de 0,0 a 2,0 mg/l). Las diferentes suspensiones de
bacterias se disponen seguidamente en agitación a 25ºC. Al cabo de
20 min, se toman entonces, para sus análisis, unas muestras de estas
suspensiones bacterianas (volumen de 100 a 1.000 ml por cada
actividad enzimática que se ha de medir).
Para cada muestra, se miden de modo paralelo el
porcentaje de microorganismos supervivientes y diferentes
actividades enzimáticas de acuerdo con los métodos siguientes.
Se recuenta, para cada muestra de suspensión
bacteriana, el número de microorganismos que han sobrevivido, es
decir el número de bacterias cultivables y/o el número de bacterias
no cultivables pero viables.
\newpage
El recuento de los microorganismos supervivientes
puede hacerse de acuerdo con unas técnicas clásicas, que son
conocidas para un experto en la especialidad: por ejemplo, por
calibración en un medio gelosado, tal como un medio de TSA (de
Tryptic Soy Agar = agar de soja tríptica, de Difco) para el recuento
de las bacterias cultivables, y por la técnica del C.T.C. para el
recuento de las bacterias no cultivables pero viables (Schaule G.,
Flemming H. C. et Ridgway H. F. 1993, Use of
5-cyano-2,3-ditolyl
tetrazolium chloride for quantifying planktonic and sessile bacteria
in drinking water [Uso de cloruro de
5-ciano-2,4-ditolil-tetrazolio
para cuantificar bacterias plantónicas y sésiles en un agua
potable], Appl. Environ. Microbiol. 59: 3.850-3.
A partir del número medio n_{i} medido, se
calcula entonces la concentración media (C_{i}) de microorganismos
supervivientes para cada una de las dosis i de cloro libre ensayado.
Cada concentración media C_{i} de microorganismos supervivientes
se expresa entonces relativamente a la concentración máxima de
microorganismos supervivientes, tal como se mide antes de la
desinfección (concentración máxima C_{max}). En el caso de la
presente ilustración, C_{max} corresponde a la concentración media
de microorganismos supervivientes, tal como se mide en ausencia de
cloro libre. Cada C_{i} se traduce de esta manera a un valor de
aniquilamiento (o de eliminación) con ayuda de la fórmula:
aniquilamiento
= C_{1} /
C_{max}.
Este porcentaje de microorganismos supervivientes
\frac{C_{i}}{C_{max}} representa igualmente una medida de la
calidad de desinfección.
Los resultados de los recuentos de
microorganismos cultivables se ilustran por la figura 1, en donde se
hace referencia al porcentaje de bacterias de E. coli
cultivables en función de la dosis de cloro libre a la que se ha
sometido. En las ordenadas de la figura 1 se hace referencia a los
valores de aniquilamiento (o de eliminación) que corresponden a las
concentraciones de microorganismos cultivables, tal como se obtienen
por recuento, y referidas a la concentración máxima medida antes de
la desinfección: 10^{0} indica una concentración de
microorganismos cultivables que es igual a la concentración máxima
medida; 10^{-1} indica que la concentración de microorganismos
cultivables ha disminuido en un factor de 10, 10^{-2} indica que
la concentración de microorganismos cultivables ha disminuido en un
factor de 10^{-2}. En las abscisas de la figura 1, se hace
referencia a la concentración inicial de cloro libre de la
suspensión correspondiente de bacterias. Se procede de un modo
idéntico con los resultados de los recuentos de microorganismos no
cultivables pero viables que, si se desea, se pueden sumar a los
resultados del recuento de los microorganismos cultivables.
Paralelamente al recuento de los microorganismos
supervivientes que antes se ha descrito, se miden diferentes
actividades enzimáticas.
Se informa aquí más particularmente acerca de los
experimentos referidos a dos enzimas: la
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa
(seguidamente denominada ZWF) y la glutatión reductasa. Estas
enzimas están corrientemente presentes en numerosos microorganismos;
ellas son por lo tanto susceptibles de poder representar el conjunto
de las poblaciones de microbios presentes en las suspensiones, y de
esta manera dar la imagen que resulta de la desinfección
realizada.
En los experimentos aquí descritos, las bacterias
en suspensión están en unas concentraciones demasiado pequeñas como
para que sus actividades enzimáticas se puedan medir correctamente
de una manera directa en la muestra líquida tomada, sin ninguna
operación previa de concentración. Las muestras de suspensiones son,
por lo tanto, aquí filtradas (a través de una membrana de 0,22
\mum) de manera tal que se cosechen desde ellas los
microorganismos. Los microorganismos se pueden igualmente cosechar
por centrifugación a 3.000 xg durante 10 min a 4ºC.
Los estudios comparativos realizados muestran que
es preferible lisar los microorganismos con anterioridad a la
medición de las actividades de la ZWF o de la glutatión reductasa.
Los materiales filtrados (o residuos) se disponen por lo tanto en un
sistema que permite la lisis de los microorganismos cosechados: con
anterioridad a una medición de la actividad de ZWF o de glutatión
reductasa, la lisis de los microorganismos se efectúa, de manera
preferente, mediante una sonda de ultrasonidos (2 ciclos de 30 s
bajo ultrasonidos y de 30 s en reposo). Se puede señalar que, para
medir la actividad de enzimas distintas de la ZWF o la glutatión
reductasa, tales como p.ej. una catalasa o una superóxido dismutasa,
la lisis previa de los microorganismos se puede evitar utilizando un
substrato que se difunde, tal como la lucigenina y el peróxido de
hidrógeno.
Las diferentes actividades enzimáticas se pueden
medir de acuerdo con técnicas conocidas por un experto en la
especialidad. Dicho brevemente, para cada actividad enzimática que
se ha de medir, los microorganismos de cada muestra se disponen en
contacto con un substrato seleccionado de manera tal que la enzima
establecida como diana pueda catalizar su transformación, y que esta
transformación enzimática se pueda seguir con facilidad mediante las
técnicas analíticas clásicas tales como espectrocolorimetría,
espectrofluorometría o luminometría, para las que es realizable una
automatización.
Para medir una actividad de
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa,
los microorganismos de la muestra se ponen en contacto con un
substrato que se compone de
glucosa-6-fosfato 0,6 mM y de
nicotinamida adenina dinucleótido fosfato en forma oxidada (NADP 0,2
mM), en presencia de una solución que estabiliza el pH (adición de
un tampón Tris de pH 7,6 y MgCl_{2} 10 mM). Este substrato
conduce, en presencia de una
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, a
la formación de nicotinamida adenina dinucleótido fosfato en forma
reducida (NADPH) cuya aparición se puede seguir por
espectrocolorimetría a la longitud de onda de 340 nm (Frankel D.G.
et Levisohn S.R. 1967, Glucose and gluconate metabolism in an
Escherichia coli mutant lacking phosphoglucose isomerase
[Metabolismo de glucosa y gluconato en un mutante de Escherichia
coli que carece de fosfoglucosa isomerasa] J. Bact 93:
1.571-1.578).
Para medir una actividad de glutatión reductasa,
los microorganismos de la muestra se ponen en contacto con un
substrato que se compone de nicotinamida adenina dinucleótido
fosfato en forma reducida (NADPH 0,2 mM) y de glutatión oxidado
(disulfuro de glutatión GS - SG 2,5 mM) en presencia de una solución
que estabiliza el pH (tampón de fosfato 100 mM de pH 7). Bajo la
acción catalítica de la glutatión reductasa, este substrato se
transforma en nicotinamida adenina dinucleótido fosfato en forma
oxidada (NADP) y en glutatión en forma reducida (GSH). La
desaparición de NADPH es entonces seguida por una
espectrocolorimetría a la longitud de onda de 340 nm
(Lopez-Barea J. y Lee C. Y. 1979, Mouse liver
glutathione reductase: purification, kinetics and regulation
[Glutatión reductasa de hígado de ratón: purificación, cinética y
regulación], Eur. J. Biochem. 98: 487-499).
Las mediciones de las actividades enzimáticas se
realizan aquí a una temperatura constante idéntica (25ºC) con la
ayuda de un espectrofotómetro de PERKIN-ELMER modelo
lambda 1.
El valor de la densidad óptica medida antes del
comienzo de la reacción enzimática considerada, sirve como "blanco
objetivo de la medición". Los valores de las densidades ópticas
propias de cada medio de reacción se registran entonces en el curso
del tiempo.
La actividad enzimática propia de la muestra se
calcula seguidamente en la parte lineal de la curva que representa
la densidad óptica propia, observada después de la puesta en
contacto con la enzima establecida como diana (por ejemplo entre 5
min y 35 min). El cálculo de la pendiente de la curva de "densidad
óptica propia de la muestra en función del tiempo" en el
intervalo de tiempo de 5-35 min considerado,
proporciona un valor de esta variación de la densidad óptica
propia.
Para cada enzima, las actividades enzimáticas
propias, medidas con las diferentes dosis de desinfectantes
(cantidad de substrato consumido o producido por unidad de tiempo)
se expresan, cada una de ellas, en % del valor inicial de la
actividad registrada para la misma enzima, es decir en % del valor
de la actividad medida, para la misma enzima, con la más pequeña
dosis de desinfectante: en la presente ilustración, la actividad
propia de glucosa-6-fosfato
deshidrogenasa (ZWF) y la actividad propia de glutatión reductasa de
las muestras se expresan en % de la actividad propia de
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa
(ZWF) y, respectivamente, de glutatión reductasa, tal como se mide
para las suspensiones de bacterias que no comprenden cloro libre (es
decir, antes de la desinfección). Esta relación entre la actividad
enzimática propia del líquido en una etapa del procedimiento de
desinfección (es decir en curso de desinfección o después de ella) y
la actividad enzimática propia de este mismo líquido antes de la
desinfección, se designa aquí como actividad enzimática relativa del
líquido en dicha etapa de desinfección.
Las actividades enzimáticas obtenidas se comparan
entonces con las mediciones de recuentos microbiológicos. Los
resultados de los recuentos de microorganismos cultivables son
ilustrados por las figuras 2 y 3.
La figura 2 representa, en las ordenadas, la
actividad de glucosa-6-fosfato
deshidrogenasa (ZWF) medida, expresada en % del máximo (actividad
inicial) de actividad registrado y, en las abscisas, el número
correspondiente de E. coli cultivables, que se ha obtenido
por recuento.
La figura 3 representa, en las ordenadas, la
actividad de glutatión reductasa, expresada como % del máximo de
actividad registrada (actividad inicial) y, en las abscisas, el
número correspondiente de E. coli cultivables, que se ha
obtenido por recuento.
En la figura 2, igual que en la figura 3, el
número de microorganismos supervivientes se expresa en función del
logaritmo de aniquilamiento experimentado según la fórmula
siguiente:
log de
aniquilamiento = -log_{10} (C_{i} /
C_{max})
donde C_{1} y C_{max} son tal
como se han definido con anterioridad en esta
memoria.
Si es necesario, los mismos tipos de figuras se
pueden establecer teniendo en cuenta los resultados de los recuentos
de microorganismos no cultivables pero viables.
En la figura 2, igual que en la figura 3, los
valores del logaritmo de aniquilamiento son referidos en el eje de
las abscisas de la manera siguiente: 1E+00 representa un número de
microorganismos cultivables igual al número máximo registrado
(suspensión que no tiene cloro libre); 1E-01
representa un número de microorganismos cultivables que es igual al
número máximo registrado del que se ha restado un número de
microorganismos que corresponde a un valor del logaritmo de
aniquilamiento de 1; 1E-02 representa un número de
microorganismos cultivables que es igual al número máximo registrado
del que se ha restado un número de microorganismos que corresponde a
un valor del logaritmo de aniquilamiento de 2, y así sucesivamente
hasta 1E-07, que representa un número de
microorganismos cultivables que es igual al número máximo registrado
del que se ha restado un número de microorganismos que corresponde a
un valor del logaritmo de aniquilamiento de 7.
Se puede señalar que este valor del logaritmo de
aniquilamiento constituye igualmente un índice de la calidad
microbiológica del líquido considerado, índice que nosotros
denominamos D.
Los resultados obtenidos muestran que el
seguimiento de la actividad de
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa
(actividad relativa) es un indicador representativo del número de
microorganismos supervivientes para una gama de muestras que va
desde las muestras de un líquido que no ha sido sometido a ningún
tratamiento de eliminación de los microorganismos hasta las muestras
de un líquido que presenta un logaritmo de aniquilamiento (o de
eliminación) menor o igual que aproximadamente 3 (compárese la
figura 2).
Los resultados obtenidos muestran igualmente que
la actividad de la glutatión reductasa (actividad relativa) es un
indicador representativo del número de microorganismos
supervivientes para una gama de muestras de líquidos que presentan
un logaritmo de aniquilamiento (o de eliminación) comprendido entre
aproximadamente 4 y 7 (compárese la figura 3). En efecto, la
actividad de la glutatión reductasa no es afectada de una manera
significativa antes de que se alcance el logaritmo de
aniquilamiento 4. Una proporcionalidad significativa entre la
actividad relativa y el logaritmo de aniquilamiento no se observa,
para esta enzima, más que en el intervalo de los logaritmos de
aniquilamiento comprendidos entre aproximadamente 4 y 7.
De una manera similar, hemos podido demostrar que
la actividad (relativa) de superóxido dismutasa (mediciones por
luminometría con la ayuda de lucigenina) es un indicador
representativo del número de microorganismos supervivientes para una
gama de muestras de líquidos que presentan un logaritmo de
aniquilamiento (o de eliminación) que está comprendido entre
aproximadamente 3 y 6. Las superóxido dismutasas y las catalasas
presentan además la ventaja de no necesitar ningún tratamiento de
lisis: la medición de su actividad se puede realizar en un substrato
que se difunde tal como la lucigenina, o respectivamente el peróxido
de hidrógeno, por luminometría.
Las diferentes enzimas ensayadas no cubren por lo
tanto los mismos dominios de sensibilidad: la actividad relativa de
la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa
(ZWF) es un indicador representativo del número de microorganismos
supervivientes (logaritmo de aniquilamiento) en unas muestras de
líquido que no han experimentado más que unas pequeñas disminuciones
relativas de las poblaciones de microbios, las actividades relativas
de la superóxido dismutasa y de la glutatión reductasa son
indicadores representativos del número de microorganismos
supervivientes (logaritmo de aniquilamiento) en unas muestras de
líquido que han experimentado unas disminuciones relativas de las
poblaciones de microbios desde medianas a grandes.
Los mismos tipos de gamas de sensibilidad
(proporcionalidad entre la actividad relativa y el logaritmo de
aniquilamiento para ciertos intervalos de valores del logaritmo de
aniquilamiento) se han podido observar midiendo la actividad
relativa de la malato deshidrogenasa, de la
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa, y de las catalasas (ya sea por medición del consumo
de peróxido de hidrógeno a 240 nm en una solución tamponada a un pH
de 7, ya sea por quimioluminiscencia). Un experto en la especialidad
podrá encontrar otros ejemplos de enzimas y de protocolos de
medición de actividades enzimáticas, en diferentes obras de
referencia tales como: Oxidative stress and the molecular biology
of antioxidant defenses [Estrés oxidativo y la biología
molecular de defensas antioxidantes] 1997, Cold Spring Harbor
Laboratory Press
O-87969-502-1/97:
Lehninger 1977, Biochemie [bioquímica], Flammarion ISBN
2-257-25009-5;
Methods in Enzymology [Métodos en enzimología], Academic Press Inc.;
p.ej. los volúmenes I-XLI-XLII
89-105 y 234.
Cualquier enzima para la que se pueda poner en
evidencia una proporcionalidad significativa (pendiente
significativa, por ejemplo menor que -0,2) entre la actividad
relativa y el logaritmo de aniquilamiento, por ejemplo siguiendo el
protocolo antes descrito, constituye un indicador fiable de acuerdo
con el invento.
Los mismos tipos de gamas de sensibilidad
enzimática se pueden obtener aplicando a las suspensiones de E.
coli no unas dosis crecientes de cloro, sino unas dosis
crecientes de ozono o unas dosis crecientes de UV.
Se pone por lo tanto de manifiesto que la
medición de las actividades enzimáticas permite seguir la evolución
de las poblaciones de microbios en un líquido en desinfección. Estos
diferentes indicadores enzimáticos de la supervivencia de microbios
permiten dar cuenta de la totalidad de las poblaciones de microbios:
microorganismos cultivables y microorganismos no cultivables pero
viables.
Se puede seguir, por ejemplo, la actividad
relativa de ZWF para unos logaritmos de aniquilamiento menores que
3, y la actividad relativa de glutatión reductasa para unos
logaritmos de aniquilamiento mayores que 4. En el caso de que se
requiera una medición exacta de un logaritmo de aniquilamiento
comprendido entre 3 y 4, se puede entonces, por ejemplo, medir una
actividad relativa de superóxido dismutasa.
En el caso de que la desinfección efectuada no se
tenga que realizar a unos logaritmos de aniquilamiento mayores que
6, se puede entonces simplemente seguir la actividad relativa de
superóxido dismutasa, que no comenzará a responder más que a partir
de unos logaritmos de aniquilamiento mayores que 3, o bien seguir la
actividad relativa de ZWF hasta unos logaritmos de aniquilamiento de
3, y luego la actividad relativa de superóxido dismutasa más allá de
este valor.
Los diferentes tipos de indicadores enzimáticos
de supervivencia de microbios antes presentados permiten por lo
tanto conocer el valor del logaritmo de aniquilamiento del líquido
controlado, y por esta misma razón, su índice D de calidad
microbiológica, su valor de aniquilamiento y el número de
microorganismos que allí sobreviven. Ellos dan por lo tanto in
fine (al final) una medición de la viscosidad y de la eficacia
del procedimiento de desinfección aplicado.
Si el número de microorganismos supervivientes en
el líquido controlado (p.ej. expresado en la forma de un logaritmo
de aniquilamiento o un índice de la calidad de desinfección) no
corresponde al objetivo de desinfección establecido (p.ej. el valor
de consigna del logaritmo de aniquilamiento o de la calidad de
desinfección), la dosis de desinfectan-
te(s) que se ha aplicado a dicho líquido (p.ej. la concentración de cloro libre, de ozono, la dosis de UV, de temperatura, de ultrasonidos y de radiaciones ionizantes) se puede ajustar en consecuencia.
te(s) que se ha aplicado a dicho líquido (p.ej. la concentración de cloro libre, de ozono, la dosis de UV, de temperatura, de ultrasonidos y de radiaciones ionizantes) se puede ajustar en consecuencia.
Este aumento o esta disminución de la dosis de
desinfectante(s) se puede hacer siguiendo de manera regular
la evolución del número de microorganismos supervivientes (logaritmo
de aniquilamiento) con la ayuda de los indicadores enzimáticos
presentados aquí anteriormente, y ello hasta la obtención del
objetivo de desinfección que se ha establecido.
El ajuste de la dosis de desinfectante(s)
se puede hacer igualmente con la ayuda de curvas de referencia
preestablecidas en una muestra de dicho líquido, que representan el
porcentaje de microorganismos supervivientes, p.ej. expresado como
valores del logaritmo de aniquilamiento, en función de la dosis de
desinfectante(s) que se ha aplicado (p.ej. dosis crecientes
de cloro libre, de ozono, de UV, de temperatura, ultrasonidos o
radiaciones ionizantes).
Tales curvas de referencia permiten leer los
valores de las dosis de desinfectante(s) que equivalen
respectivamente al porcentaje medido y al porcentaje deseado de
microorganismos supervivientes, tales como los que se obtienen con
la ayuda de los indicadores enzimáticos antes presentados. Es
suficiente entonces aumentar o disminuir la dosis de
desinfectante(s) que se ha aplicado al líquido controlado,
por la diferencia leída entre estos equivalentes de dosis de
desinfectante(s).
Tales curvas de referencia se pueden obtener por
ejemplo recontando los microorganismos supervivientes en una muestra
de dicho líquido expuesto a unas dosis crecientes de desinfección
(p.ej. concentraciones crecientes de cloro libre, de ozono, dosis
crecientes de UV, de radiaciones ionizantes, de ultrasonidos o
valores crecientes de la temperatura).
El procedimiento de regulación de la desinfección
de un líquido, según el invento, permite por lo tanto, con la ayuda
de mediciones de actividades enzimáticas, controlar de una manera
completa, simple y rápida (en menos de una hora) la desinfección de
un líquido, y ello cualquiera que sea el estado fisiológico o la
identidad de los microorganismos que allí sobreviven. El
procedimiento de regulación de la desinfección de un líquido según
el invento presenta además la ventaja particular de ser
automatizable con facilidad, al contrario que los procedimientos que
ponen en práctica las técnicas de microscopías de cultivos
microbiológicos.
Queda bien entendido que el presente invento no
está limitado a los ejemplos de realización descritos y
representados con anterioridad en esta memoria, sino que engloba
todas sus variantes. Así es como particularmente las mediciones de
actividades enzimáticas se pueden realizar por una técnicas
analíticas distintas de las mencionadas con anterioridad en esta
memoria descriptiva.
Claims (20)
1. Procedimiento de regulación de la
desinfección de un líquido, caracterizado porque
comprende:
A. en una etapa de dicha desinfección, designada
a continuación etapa 2, la medición de la actividad de por lo menos
una enzima mediante puesta en contacto de los microorganismos,
eventualmente presentes en dicho líquido, con un substrato
seleccionado por ser capaz de revelar la actividad de esta o estas
enzima(s), siendo denominada esta actividad enzimática, a
continuación, actividad propia,
B. en una etapa designada a continuación etapa
1, anterior a dicha etapa 2, la medición de la actividad de la o las
misma(s) enzima(s) que en A, siendo designada esta
actividad a continuación actividad inicial,
C. la traducción, para cada enzima, de la
actividad propia y de la actividad inicial señaladas, a porcentajes
de microorganismos supervivientes en dicho líquido en la etapa 2 de
dicha desinfección, y ello por intermedio de un sistema de
referencia, preestablecido con la ayuda de una muestra de dicho
líquido que se ha tomado en dicha etapa 1 y luego se ha expuesto a
unas dosis crecientes de desinfectante(s), así como
D. el ajuste, en función de dicho porcentaje de
microorganismos supervivientes, de la naturaleza y/o de las dosis
del (de los) agente(s) químico(s) o físico(s)
utilizados para dicha desinfección.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque dicha etapa 1 corresponde a una etapa
anterior a la desinfección de dicho líquido y porque dicha etapa 2
corresponde a una etapa cualquiera de dicha desinfección.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2,
caracterizado porque dicho líquido es un líquido destinado
para estar en contacto con un ser humano o un animal, tal como un
agua de baño, un agua destinada al consumo, un agua destinada a
formulaciones farmacéuticas o biotecnológicas, o un líquido
alimentario.
4. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque dicha puesta en
contacto de los microorganismos, eventualmente presentes en dicho
líquido, con dicho substrato, se realiza por puesta en contacto de
dicho líquido, o de una muestra de dicho líquido, con dicho
substrato.
5. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque dicha puesta en
contacto de los microorganismos eventualmente presentes en dicho
líquido, o en dicha muestra de líquido, con dicho substrato, se
realiza por puesta en contacto de un material filtrado, o de un
residuo de centrifugación, de dicho líquido o de dicha muestra de
líquido, con dicho substrato.
6. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque dicho líquido,
dicha muestra de líquido, o dicho concentrado, se someten, con
anterioridad a dichas mediciones de la actividad de al menos una
enzima, a un tratamiento de lisis, particularmente por
sonicación.
7. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la o las
enzima(s), cu-
ya(s) actividad(es) se mide(n), presenta(n), en dicho líquido, en dicha muestra de líquido o en dicho concentrado, una relación entre la actividad propia y la actividad inicial en correspondencia afín, y con una pendiente significativamente diferente de cero, preferentemente menor que -0,2, con el porcentaje de microorganismos supervivientes en al menos un intervalo de valores de dichos porcentajes de microorganismos supervivientes.
ya(s) actividad(es) se mide(n), presenta(n), en dicho líquido, en dicha muestra de líquido o en dicho concentrado, una relación entre la actividad propia y la actividad inicial en correspondencia afín, y con una pendiente significativamente diferente de cero, preferentemente menor que -0,2, con el porcentaje de microorganismos supervivientes en al menos un intervalo de valores de dichos porcentajes de microorganismos supervivientes.
8. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la o al menos
una de las enzima(s), cuya(s) actividad(es) se
mide(n), es una
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa,
una malato deshidrogenasa, una
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa, una catalasa, una superóxido dismutasa, o una
glutatión reductasa.
9. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque dichas
mediciones de la actividad propia y de la actividad inicial se
realizan con la ayuda de un espectrofotómetro, de un
espectrofluorómetro, o de un luminómetro, que presentan
eventualmente varios canales de análisis.
10. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque dicha traducción
a porcentajes de microorganismos supervivientes con la ayuda de
dicho sistema de referencia comprende, para cada enzima, el cálculo
de la relación entre la actividad propia y la actividad inicial,
eventualmente expresada en porcentaje.
11. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque dicho sistema
de referencia se presenta en una forma gráfica, tal como la de una o
varias curva(s) que ponen, para cada enzima, a dicha relación
entre la actividad propia y la actividad inicial en correspondencia
con valores de porcentajes de microorganismos supervivientes.
12. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 11, caracterizado porque dichas
mediciones espectrométricas se realizan para cada actividad
enzimática medida, a una temperatura constante, particularmente a
25ºC, y a una longitud de onda constante particularmente a una
longitud de onda comprendida entre 240 y 550 nm, por ejemplo a 340
nm.
13. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 12, caracterizado porque dichas
mediciones espectrométricas se realizan de manera continua o
discreta en un intervalo de tiempo de aproximadamente 30
minutos.
14. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque dicho ajuste de
las dosis del (de los) agente(s) químico(s) o
físico(s) se realiza por suma de la equivalente "dosis de
desinfectante(s)" correspondiente a la diferencia entre el
porcentaje de microorganismos supervivientes considerado y el
porcentaje de microorganismos medido en dicho líquido, en dicha
muestra de líquido, o en dicho concentrado.
15. Procedimiento según la reivindicación 14,
caracterizado porque dicha equivalente dosis de
desinfectante(s) es tal como se lee en una curva de
referencia que representa el porcentaje de microorganismos
supervivientes en función de la dosis de desinfectante(s) a
la que es expuesto dicho líquido.
16. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque dicho líquido
comprende microorganismos seleccionados entre el conjunto
constituido por los géneros Escherichia, Alcaligenes, Bacillus,
Flavobacterium, Methylobacterium, Pseudomonas, Klebsiella,
Enterobacterium, Agrobacterium, Streptococcus, Micrococcus y
Salmonella.
17. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque es automatizado
en un procedimiento de desinfección de un líquido.
18. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 17, caracterizado porque dicho
porcentaje de microorganismos supervivientes se expresa como valor
de aniquilamiento (concentración de microorganismos supervivientes,
referida a la concentración inicial de microorganismos
supervivientes, tal como se ha medido en dicha etapa 1, del
logaritmo de aniquilamiento (-log_{10} (aniquilamiento)) o del
índice D (= logaritmo. de aniquilamiento).
19. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 18, caracterizado porque dichos
microorganismos supervivientes son microorganismos cultivables y/o
microorganismos no cultivables pero viables.
20. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 19, caracterizado porque dichos agentes
químicos o físicos, utilizados para la desinfección, se seleccionan
entre el conjunto constituido por el cloro y sus derivados, los
rayos UV, el ozono, H_{2}O_{2}, las membranas filtrantes, la
temperatura, los ultrasonidos y las radiaciones ionizantes.
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