ES2256048T5 - Prueba de un paso para detectar residuos anti-microbianos en huevos. - Google Patents
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Abstract
Un proceso para determinar la presencia o ausencia de un residuo anti-microbiano en una muestra de un huevo cuyo proceso comprende: (i) contactar la muestra con una prueba de inhibición microbiana apropiada para determinar la presencia o ausencia de un residuo anti-microbiano en la muestra; (ii) calentar la prueba y la muestra contactada por un intervalo de tiempo suficiente para inactivar un compuesto natural que causa inhibición, por ejemplo la lisozima, presente en la muestra; y (iii) incubar la prueba y la muestra contactada.
Description
Prueba de un paso para detectar residuos
anti-microbianos en huevos.
La presente invención se relaciona con un nuevo
método para la detección rápida de la presencia o ausencia de
residuos anti-microbianos en huevos.
La presencia de residuos
anti-microbianos en los alimentos y la alimentación
es una preocupación creciente en los consumidores debido a los
problemas relacionados con la salud y el incremento de bacterias
resistentes a los fármacos. Los antibióticos no son solamente
aplicados como medicamentos, sino que ciertamente en el caso de las
aves de corral también son ampliamente usados como sustancias
promotoras del crecimiento anti-microbiano. Es bien
conocido que las concentraciones de residuos
anti-microbianos en huevos pudieran ser altas. En la
mayoría de los países, tales como los países de la Unión Europea,
Canadá y los Estados Unidos, los Niveles Máximos de Residuos (MRL)
están regulados por la legislación.
Los métodos de prueba para detectar los residuos
anti-microbianos en líquidos del cuerpo tal como
leche u orina tal como la prueba de inhibición microbiana (por
ejemplo prueba de difusión en agar) o métodos que hacen uso de los
aglutinantes selectivos (por ejemplo anticuerpos o indicadores) son
bien conocidos. Ejemplos de métodos de prueba microbiológicos han
sido descritos en GB-A-1467439, EP
0005891, DE 3613794, CA 2056581, EP 0285792 y US 5494805. Todos
estos documentos tienen que ver con pruebas listas para usar que
hacen uso de un organismo de prueba. El organismo de prueba esta
mayoritariamente embebido en un medio agar, que puede contener un
indicador, una solución buffer, nutrientes y sustancias para
cambiar la sensibilidad para ciertos compuestos
anti-microbianos de una forma positiva o
negativa.
Ejemplos de organismos de prueba apropiados son
las cepas de Bacillus, Streptococcus o E. coli. En
general, el principio de estas pruebas es que cuando los compuestos
antibacterianos están presentes en una muestra a una concentración
suficiente para inhibir el crecimiento del organismo de prueba el
color de un ácido/base o indicador de redox se mantendrá el mismo.
Sin embargo cuando no ocurren inhibiciones, el crecimiento del
organismo de prueba está acompañado de la formación de metabolitos
reducidos o ácidos que conducen a un cambio en el color del
indicador.
Estos métodos de prueba son apropiados para la
detección de residuos anti-microbianos en líquidos
del cuerpo. Sin embargo hasta ahora la detección de residuos
anti-microbianos en huevos no fue posible debido a
la presencia de sustancias anti-microbianas, tal
como la lisozima, que están presentes de manera natural en
concentraciones altas en huevos. Estas sustancias de inhibición
muestran actividad inhibitoria contra los
micro-organismos de prueba conduciendo a resultados
positivos falsos.
En el caso de por ejemplo una muestra de leche u
orina las sustancias de inhibición tales como la lisozima o la
lactoferrina pueden ser inactivadas por el calentamiento de la
muestra, por ejemplo a 80ºC por 10 minutos (Vermunt y otros,
Netherlands Milk and Dairy Journal 47: (1) 31 - 40 (1993), o usando
métodos de diálisis bien conocidos (van Wall, Archiv für
Lebensmittelhygiene 29: (6) 235 (1978)). Después de este
pre-tratamiento la muestra líquida puede ser usada
para pruebas adicionales simplemente siguiendo los procedimientos
de la prueba. En el caso de un tipo de prueba Delvotest® (EP
0005891) la muestra líquida puede ser añadida directamente a la
prueba, después de lo cual la prueba es incubada.
Sin embargo calentar una muestra de huevo a
temperatura suficiente para inactivar las sustancias inhibidoras
del huevo, tales como la lisozima, siempre conduce a la coagulación
de la muestra. Se creía que tales muestras no eran apropiadas para
ningún procesamiento posterior.
Hasta ahora después de calentar a temperatura
suficiente para inactivar las sustancias
anti-microbianas diferentes a los residuos
anti-microbianos, los residuos
anti-microbianos que son detectados tienen que ser
extraídos de la muestra de huevo coagulada. Estos métodos de
extracción no solamente cuestan mucho tiempo y manipulación extra
sino incluso peor ya que siempre conducen a una pérdida de al menos
parte de los residuos anti-microbianos, si
estuvieran presentes en la muestra (Inglis y otros, Journal for the
Association of Official Analytical Chemists 61: (5) 1098 - 1102
(1978); Katz y otros, Journal of the Association of Official
Analytical Chemists 61: (5) 1103 - 1106 (1978); Janetschke y otros,
Monatshefe für Veterinaermedizin 34: (21) 824 - 826 (1979);
Steiner, Monatshefe für Veterinarmedizin 45: (11) 382 - 386
(1990)). Esto puede conducir a resultados negativos falsos y por lo
tanto a la presencia de antibióticos en los huevos para consumir,
lo que por supuesto es inaceptable desde el punto de vista de la
salud. Además los laboratorios que ejecutan estudios concernientes
a la presencia o ausencia de los residuos
anti-microbianos en los alimentos están limitados
por el tiempo disponible para ejecutar estos estudios. Con los
métodos actuales consumidores de tiempo solamente una cantidad muy
limitada de muestras de huevos puede ser examinada. Adicionalmente,
estos ensayos pueden solamente ser ejecutados en laboratorios bien
equipados y por personas bien preparadas, lo que es también un
factor limitante.
Puede concluirse de que hasta ahora no está
disponible ningún método de prueba apropiado para la detección de
residuos anti-microbianos en muestras de huevo. Los
métodos actuales no son confiables, son consumidores de tiempo y
pueden conducir a resultados positivos falsos y negativos falsos,
que a su vez conducen a una cantidad inaceptable de antibióticos en
la cadena alimenticia y a pérdidas económicas.
La presente invención proporciona una prueba de
un paso, confiable y simple de llevar a cabo para la detección de
residuos anti-microbianos en huevos.
Inesperadamente ha sido encontrado que cuando la
muestra de huevo es añadida a una prueba apropiada para detectar
residuos anti-microbianos y luego es incubada por
un tiempo suficiente a una temperatura suficiente para inactivar
los compuestos naturales que causan inhibición del huevo, la prueba
puede ser incubada directamente después del calentamiento para
determinar la presencia o ausencia de residuos
anti-microbianos.
Ha sido encontrado sorprendentemente que los
residuos anti-microbianos se difunden directamente
desde la muestra de huevo coagulada en el sistema de prueba. Así
los métodos de extracción adicionales para obtener los residuos
anti-microbianos de la muestra de huevo coagulada no
son requeridos.
De acuerdo a la invención se proporciona así un
proceso para determinar la presencia o ausencia de un residuo
anti-microbiano en una muestra de un huevo cuyo
proceso consiste en:
- (i)
- contactar la muestra con una prueba de inhibición microbiana apropiada para determinar la presencia o ausencia de un residuo anti-microbiano en la muestra, donde la prueba comprende un organismo de prueba, nutrientes y uno o más indicadores presentes en un medio agar;
- (ii)
- calentar la prueba y la muestra contactada a una temperatura desde 75ºC a 85ºC para desde 10 a 15 minutos para inactivar un compuesto natural que causa inhibición presente en la muestra;
- (iii)
- incubar la prueba y la muestra contactada; y
- (iv)
- donde se determina el grado de crecimiento o de la inhibición del crecimiento de un organismo de prueba indicando la ausencia o presencia del residuo anti-microbiano.
Compuestos naturales que causan inhibición
significa los compuestos que pueden obstaculizar la prueba y que
están presentes naturalmente en la muestra tal como compuestos que
causan inhibición de manera natural, por ejemplo la lisozima. Así
obstaculizar o inhibir significa el comportamiento del compuesto
sobre partes de la prueba, por ejemplo el microorganismo de
prueba.
Los requerimientos exactos de tiempo/temperatura
dependen de por ejemplo la condición de la muestra (por ejemplo la
temperatura inicial, el volumen de la muestra, el huevo en
completo, la clara del huevo o la yema del huevo); el tipo de
prueba; o el microorganismo usado en la prueba (por ejemplo especies
Streptomyces o Bacillus termofílicas). Por supuesto
debe tenerse cuidado de que el tratamiento con calor no inactive
los residuos anti-microbianos a ser detectados. El
tratamiento con calor puede ser ejecutado usando cualquier método
conocido en el arte, por ejemplo por calentamiento en un baño de
agua o usando una incubadora como es descrito a continuación.
Por ejemplo la prueba puede ser realizada de la
siguiente forma:
- 1.
- Una muestra del huevo es obtenida haciendo un agujero en el huevo de por ejemplo aproximadamente 1-2 cm cuadrados, pinchar la yema del huevo, colocar el huevo con el agujero hacia abajo sobre una botella, después que el huevo este vacío la botella se cierra y la muestra es homogenizada por agitación. Alternativamente por supuesto cualquier otro método conocido en el arte para obtener una muestra del huevo completo, la clara del huevo o la yema del huevo puede ser usado;
- 2.
- Añadir una cantidad suficiente de la muestra de huevo a ser probada a una prueba usando métodos bien conocidos;
- 3.
- Calentar la prueba, por ejemplo por aproximadamente 10 minutos a 80ºC, para inactivar las sustancias naturales que causan inhibición (por ejemplo la lisozima), para coagular la muestra de huevo;
- 4.
- Incubar la prueba siguiendo procedimientos estándares de la prueba y leer el resultado.
Cualquier prueba de inhibición microbiana
apropiada para determinar la presencia o ausencia de residuos
anti-microbianos pueden ser usada en un proceso de
kits de pruebas de la invención. Ejemplos son descritos en
GB-A-1467439,
EP-0005891, DE-3613794,
CA-2056581, EP-0285792 y US
5,494,805. Pruebas apropiadas son aquellas en las cuales son usados
microorganismos sensibles seleccionados.
Ejemplos de pruebas microbianas de difusión en
agar apropiadas son las pruebas en las cuales las especies de
Bacillus, Streptococcus o E. coli son usadas.
Preferiblemente especies termofílicas, por ejemplo Bacillus
stearothermophilus y Streptococcus thermophilus son
usadas. Ejemplos de cepas preferidas son Bacillus
stearothermophilus var. calidolactis C953 (depositada en el
Laboratory of Microbiology of the Technical University of Delft
bajo el número de acceso LMD 74.1 en 1974 y en el Centraal Bureau
voor Schimmelcultures (CBS), Baarn bajo el número de acceso CBS
760.83 en 1983 donde la cepa esta disponible al público) y
Streptococcus thermophilus T101 (DSM 4022, depositada en
Marzo 3, 1987). Ambas cepas son muy sensibles a los compuestos
antimicrobianos, especialmente quimioterapéuticos tales como
compuestos de sulfa y antibióticos tales como las penicilinas y las
tetraciclinas. Cepas de E. coli u otras bacterias
gram-negativas apropiadas pueden ser usadas para la
detección de por ejemplo quinolonas.
El Bacillus stearothermophilus var.
calidolactis C953 y Streptococcus thermophilus T101
crecen rápidamente y tienen la ventaja de que son termofílicos. Por
ejemplo la temperatura de crecimiento óptima de dicha cepa
Bacillus es de 50º a 70ºC. El organismo de prueba es por lo
tanto muy apropiado para una prueba de acuerdo a la invención si no
muere como resultado del calentamiento para inactivar los
compuestos naturales que causan inhibición que pueden estar
presentes en la muestra de huevo.
Cuando el organismo de prueba es una cepa
Bacillus, está es preferiblemente incorporada en el medio
agar en forma de una suspensión de espora que puede ser preparada e
incorporada al medio agar antes de la solidificación por métodos
conocidos (ver por ejemplo
GB-A-1467439). Cuando el organismo
de prueba es una cepa Streptococcus, la bacteria está
preferiblemente incorporada en el medio agar en forma de células
bacterianas que pueden ser preparadas de acuerdo a métodos
conocidos (ver por ejemplo EP 0285792). La concentración del
organismo de prueba en el medio agar está preferiblemente entre
10^{5} y 10^{10} de unidades que forman colonias por ml del
medio agar.
Nutrientes apropiados para permitir la
multiplicación del organismo de prueba en ausencia de residuos
anti-microbianos son por ejemplo fuentes de carbón
asimilables (por ejemplo lactosa, glucosa o dextrosa), fuentes de
nitrógeno asimilables (por ejemplo peptona) y fuentes de factores
de crecimiento, vitaminas y minerales (por ejemplo extracto de
levadura).
El crecimiento del microorganismo de prueba
puede ser detectado usando métodos bien conocidos, preferiblemente
por cambio de color del medio agar de la muestra de prueba.
Típicamente un indicador de color, preferiblemente un indicador
ácido-base o un indicador de redox, es usado.
Ejemplos de indicadores ácido-base apropiados
incluyen bromocresol púrpura y rojo fenol. Ejemplos de indicadores
de redox incluyen negro brillante, azul de metileno, azul de
toluidina y azul de nilo. También combinaciones de dos o más
indicadores pueden ser usadas.
Opcionalmente la sensibilidad de la prueba puede
ser alterada adicionando ciertas sustancias, cambiando las
condiciones de la prueba como el pH o la concentración de las
sustancias buffer o el agar o variando la proporción de los
volúmenes del agar y la muestra de huevo. Ejemplos de sustancias
que pueden ser añadidas al sistema de prueba para cambiar la
sensibilidad son los nucleósidos tales como la adenosina, o
antifolatos tales como el trimetoprim, ormetoprim o tetroxoprim,
los cuales mejoran la sensibilidad del organismo de prueba a los
compuestos de sulfa. Sales de ácido oxálico o ácido fluorhídrico
pueden ser añadidas para mejorar la sensibilidad a las
tetraciclinas. La cisteína puede ser añadida para disminuir la
sensibilidad a las penicilinas.
La cantidad de la muestra de huevo (huevo
completo, clara del huevo o yema del huevo de cualquier especie,
preferiblemente de aves de corral) a ser añadida a la prueba
depende del sistema de prueba. Para las pruebas de difusión
microbianas típicamente de 0.01 a 1.0 ml, preferiblemente de 0.05 a
0.5 ml son añadidos a la prueba usando métodos conocidos. Después
de la adición de la muestra de huevo la prueba es calentada para
inactivar los compuestos naturales anti-microbianos
presentes en la muestra, por ejemplo la lisozima, de la muestra de
huevo. La prueba es calentada por desde 10 a 15 minutos a desde
75ºC a 85ºC.
Después del tratamiento con calor la prueba es
incubada siguiendo las instrucciones del fabricante de la prueba.
El tiempo de incubación de la prueba es dependiente de las
circunstancias. En el caso de las pruebas de difusión en agar
usando Bacillus stearothermophilus la prueba es incubada en
un baño de agua o calentador de bloque a desde 60ºC a 70ºC,
preferiblemente a desde 62ºC a 65ºC. Típicamente, resultados pueden
ser obtenidos después de 1.5 a 4 horas, preferiblemente desde 2.5 a
3.5 horas.
Las pruebas de inhibición microbiana
convencionales apropiadas para el uso en la presente invención
incluyen los productos comerciales, Delvotest®, Premi®Test y
BR-test® (obtenibles de DSM N.V Holanda) el ADM
Copan®test (Copan, Italia) y la prueba Charm®AIM (Charm, EUA). La
inactivación de los compuestos naturales que causan inhibición
presentes el la muestra de huevo, por ejemplo la lisozima, es
lograda calentando por desde 10 a 15 minutos desde 75ºC a 85ºC.
Incubadoras apropiadas para ejecutar los
tratamientos de calor descritos en esta invención pueden ser
construidas de una manera tal que después de colocar las unidades
de prueba en la incubadora, tratamientos de incubación y de calor
como los descritos anteriormente puedan ser hechos. El primer
tratamiento de calor para inactivar los compuestos de inhibición y
opcionalmente para formar matrices sólidas y/o para activar las
esporas es realizado a una alta temperatura, después de lo cual la
incubación de la prueba puede continuar a una temperatura más baja.
Opcionalmente después de la incubación de la prueba la incubadora
puede enfriarse a una temperatura suficiente para detener la
prueba.
Un ejemplo de tal incubadora es un calentador de
bloque en el cual las unidades de prueba (por ejemplo ámpulas)
pueden ser colocadas. Por ejemplo en caso de una prueba de difusión
en agar microbiana convencional usando una cepa Bacillus
stearothermophilus el calentador de bloque/incubadora puede
contener un número de orificios apropiados para colocar allí las
ámpulas de prueba o las placas de prueba (por ejemplo la Premi®Test
o Delvotest®). Después de colocar las ámpulas o placas la
incubadora calienta la prueba a una temperatura de desde 75ºC a 85ºC
desde 10 a 15 minutos después de lo cual la incubadora cambia a una
temperatura más baja de desde 62ºC a 65ºC por desde 1.5 a 4 horas
(incubación de la prueba). Por supuesto los intervalos de
tiempo/temperatura exactos dependen de muchos factores y diferirá
por tipo de prueba. Esta invención incluye todas las incubadoras
capaces de realizar una pre-incubación a cierta
temperatura por un cierto periodo de tiempo seguida directamente
por una incubación a una temperatura más baja por un cierto periodo
de tiempo. Opcionalmente después de la incubación de la prueba la
incubadora puede enfriarse hasta una temperatura suficiente para
detener la prueba.
El proceso descrito en esta invención es muy
simple de llevarse a cabo, de manera que las personas que realicen
la prueba no tienen que estar especialmente preparadas o
entrenadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Para obtener una muestra de huevo para el examen
de la presencia o la ausencia de los residuos
anti-microbianos un agujero de aproximadamente
1-2 cm^{2} fue hecho en el huevo, la yema del
huevo fue pinchada y el huevo fue colocado con el agujero hacia
abajo sobre una botella permitiendo que la clara del huevo y la
yema del huevo goteen dentro de la botella. Después que el huevo se
vacío, la botella fue cerrada y la muestra fue homogenizada por
agitación.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Muestras de 5 huevos (duplicado), las cuales no
contenían residuos anti-microbianos, fueron
obtenidas de acuerdo al método descrito en el Ejemplo 1. Para
inactivar los compuestos naturales que causan inhibición presentes
en la muestra de huevo, 100 \mul de cada una de las 5 muestras
fueron añadidos a ámpulas Delvotest®. La prueba se produjo de
acuerdo a los métodos descritos en EP 0005891 con los nutrientes
presentes en el agar. Después de calentar por 10 minutos a 80ºC en
un baño de agua, las ámpulas fueron inmediatamente colocadas en un
baño de agua a 64ºC e incubadas siguiendo las instrucciones del
productor. Después de 140 minutos el color de todas las pruebas se
tornó de púrpura a amarillo, indicando que no estaban presentes
residuos anti-microbianos.
Las muestras de control no fueron calentadas a
80ºC por 10 minutos, sino directamente colocadas en el ámpula.
Estas pruebas se mantuvieron púrpuras por al menos 4 horas.
Estos resultados claramente demostraron que los
compuestos naturales que causan inhibición en la muestra de huevo
inhibieron la prueba conduciendo a resultados positivos falsos.
Cuando la muestra fue calentada como se describió anteriormente, la
actividad de los compuestos naturales que causan inhibición fue
eliminada y no fueron ya observados resultados positivos
falsos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Muestras de huevo fueron obtenidas de acuerdo al
método descrito en el Ejemplo 1. Las muestras fueron pinchadas
adicionando Penicilina G (0 a 4 ppb) o Sulfadiazina (0 a 100 ppb).
Las muestras de huevo fueron añadidas a ámpulas de Delvotest® (ver
Ejemplo 2) de acuerdo al método descrito en está invención:
calentada por 10 minutos a 80ºC, y luego colocadas inmediatamente
en un baño de agua a 64ºC e incubadas siguiendo las instrucciones
del fabricante. Los resultados fueron leídos tan pronto como el
color cambió a amarillo (después de 140 minutos). Las muestras que
no contenían Penicilina G (0 ppb) o Sulfadiazina (0 ppb) fueron
negativas, mientras que las muestras pinchadas con 4 ppb de
Penicilina G y 100 ppb de sulfadiasina se mantuvieron púrpuras
(positivo).
Estos resultados claramente demostraron que el
método descrito en esta invención es apropiado para detectar
residuos anti-microbianos en muestras de huevo.
Claims (1)
1. Un proceso para determinar la presencia o
ausencia de un residuo anti-microbiano en una
muestra de un huevo cuyo proceso consiste en:
- (i)
- contactar la muestra con una prueba de inhibición microbiana apropiada para determinar la presencia o ausencia de un residuo anti-microbiano en la muestra, donde la prueba comprende un organismo de prueba, nutrientes y uno o más indicadores presentes en un medio agar;
- (ii)
- calentar la prueba y la muestra contactada a una temperatura desde 75ºC a 85ºC para desde 10 a 15 minutos para inactivar un compuesto natural que causa inhibición presente en la muestra;
- (iii)
- incubar la prueba y la muestra contactada; y
- (iv)
- donde se determina el grado de crecimiento o de la inhibición del crecimiento de un organismo de prueba indicando la ausencia o presencia del residuo anti-microbiano.
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| EP99203264 | 1999-10-04 |
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