ES2318345T3 - Prueba de sangre y orina. - Google Patents
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Abstract
Un medio de prueba que comprende un microorganismo de prueba, un indicador y un metal en forma ionizada, caracterizado porque el metal es un metal alcalino térreo y la concentración del metal está entre 0.005 M y 1 M.
Description
Prueba de sangre y orina.
La presente invención se refiere a un novedoso
método para la rápida detección de la presencia o ausencia de
residuos de fármacos antimicrobianos en orina y sangre.
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Los fármacos antimicrobianos no solo son
aplicadas como medicamento, sino son también ampliamente empleadas
en medicina veterinaria como sustancias promotoras del crecimiento.
En la agricultura moderna el empleo legal de farmacéuticos
veterinarios como aditivo de alimentación es una práctica común.
Estos aditivos de alimentación previenen las enfermedades de los
animales, aumentan su crecimiento o aumentan la eficiencia de la
alimentación. Los compuestos pueden ser adicionados al alimento o
al agua de tomar de los animales. En algunos países la
administración por inyecciones de por ejemplo sustancias promotoras
del crecimiento es permitida, incrementando así la cantidad de
fármacos antimicrobianos en alimentos humanos. Por supuesto, que el
empleo ilegal de fármacos veterinarias puede también ocurrir.
La presencia de fármacos antimicrobianos en
alimentos es una preocupación creciente entre los consumidores. Las
reacciones alérgicas y los efectos en la flora intestinal humana
causados por los antibióticos son bien conocidos. Otra cuestión es
el desarrollo de bacterias resistentes. Es bien conocido que el uso
incorrecto de antibióticos (a saber la administración cada vez que
ésta no sea requerida por razones médicas, o tratamiento
incompletos) es la más importante causa del desarrollo de la
resistencia antibiótica. También, la presencia de compuestos
antimicrobianos en el alimento conduce al incremento de bacterias
resistentes a los fármacos. Una bacteria patogénica humana puede
así desarrollar resistencia a los antimicrobianos, que son empleados
tanto como aditivo en la alimentación como en la medicina humana.
Otro inconveniente del empleo de antibióticos en el alimento como
promotor del crecimiento es que los antibióticos influyen en el
proceso de producción de productos cárnicos fermentados como las
salchichas en un sentido negativo, debido a la inhibición de los
cultivos iniciadores.
La mayoría de los fármacos veterinarios entran a
la cadena alimenticia humana a través de carne de animales
sacrificados o a través de productos animales como leche y
huevos.
El control sobre la presencia de fármacos
antimicrobianos en animales sacrificados, productos animales o
productos alimenticios, es una cuestión importante en la industria
alimenticia. En la mayoría de los países los límites máximos de
residuos o niveles de tolerancia para residuos de fármacos en carne
fresca y productos cárnicos han sido establecidos. Para los
compuestos que no son permitidos existe una tolerancia cero, como
sustancias que nunca pueden estar presentes en productos animales.
Para la mayoría de los fármacos es determinado un período de
retiro. Este es el período mínimo entre el último tratamiento y el
tiempo de sacrificio. Durante este período los residuos de fármacos
disminuyen a niveles por debajo del límite máximo de residuo. Sin
embargo, en algunas ocasiones, incluso después del período de
retiro concentraciones de fármacos demasiado elevadas pueden aún
estar presentes en el animal. Esto puede ser causado por diferencias
naturales individuales en el metabolismo, o por interrupción del
proceso de excresión de la droga debido a enfermedad. Finalmente,
los procedimientos pueden no haber sido aplicados correctamente en
los períodos de retiro. En la mayoría de los países la legislación
que concierne a residuos de fármacos veterinarios en productos
alimenticios es mantenida empleando un programa oficial de control.
En general, las instituciones gubernamentales examinan un cierto
porcentaje de animales sacrificados para la presencia de residuos de
fármacos veterinarios. Además, los mataderos y supermercados pueden
también examinar la carne cruda, productos cárnicos y órganos como
riñón e hígado.
A pesar de que muchos de los fármacos
antimicrobianos más importantes son excretados a través de la orina,
hasta el momento la orina es apenas empleada como sustrato para
examinar la presencia o ausencia de residuos de fármacos
antimicrobianos en animales sacrificados. Ejemplos de los fármacos
antimicrobianos de animales, que son excretados a través de la
orina, están las \beta-lactamasas como
amoxicilina, ampicilina, penicilina G y penicilina V, tetraciclinas
como clortetraciclina y oxitetraciclina, aminoglucósidos como
gentamicina y estreptomicina, y sulfonamidas como sulfamidina.
La cantidad de compuestos antimicrobianos en la
orina es indicativo para los niveles de compuestos antimicrobianos
en la parte comestible del animal, por ejemplo el tejido muscular y
el hígado. Es fácil de entender que el examen de la orina ofrece
enormes ventajas. Para muchas especies de animales es muy sencillo
obtener muestras de orina ya que muchos animales tienen puntos
específicos de tiempo durante el cual la orina es excretada.
El empleo de la orina como una muestra para
probar la presencia de fármacos antimicrobianos en la carne, podría
permitir al animal ser probado antes del sacrificio. Esto ofrece al
agricultor la posibilidad de chequear si el período de retiro fue
terminado como esperado. Si no, el agricultor decidirá esperar unos
pocos días antes de transportar al animal al matadero. Las pérdidas
económicas en el caso de que un animal sea determinado positivo
para antibióticos después del sacrificio son elevadas. Es bastante
obvio que el sistema completo de control para detectar residuos de
fármacos antimicrobianos en la cadena alimenticia humana será más
eficiente si los animales son examinados antes de en vez de después
del sacrificio.
También como una alternativa muestras de sangre
de animales pueden ser empleadas para determinar la presencia o
ausencia de residuos de fármacos antimicrobianos en animales
sacrificados. Ambas muestras orina y sangre pueden por supuesto ser
obtenidas después del sacrificio del animal. En este caso las partes
cárnicas valiosas no tienen que ser dañadas para obtener la
muestra.
Los residuos antimicrobianos pueden ser
detectados empleando las pruebas de inhibición microbiana (por
ejemplo pruebas de difusión en agar). Tales métodos son
principalmente empleados para examinar el fluido de leche y carne y
son descritos en GB A 1467439, EP 0005891, DE 3673794, CA 2056581,
EP 0285792 y US 5,494,805. Todas estas descripciones tratan de
poner a punto el empleo de pruebas que hacen uso de un organismo de
prueba. El organismo de prueba es en su mayoría embebido en un
medio agar, que contiene un indicador, una solución buffer,
nutrientes y sustancias para cambiar la sensibilidad a ciertos
compuestos antimicrobianos en un sentido positivo o negativo.
Los organismos de prueba apropiados son cepas de
Bacillus, Streptococcus y/o Escherichia coli.
En general el principio de la prueba es que cuando los compuestos
antibacterianos están presentes en una muestra en una concentración
suficiente para inhibir el crecimiento del organismo de prueba, el
color de un ácido/base o indicador redox es retenido, mientras que
la ausencia de inhibición de crecimiento del organismo de prueba es
acompañada por la formación de metabolitos que podrán cambiar el
color del indicador. Los métodos de prueba actualmente disponibles
son apropiados para la detección de residuos antimicrobianos en
muchos tipos de muestras diferentes. Sin embargo el problema con
estos métodos de prueba es que la detección de residuos
antimicrobianos en orina y sangre no es posible debido a la
presencia de sustancias perturbadoras. Estas sustancias interfieren
con la prueba conduciendo a resultados falso positivos.
Algunos métodos de preparación de muestras de
orina y sangre son conocidos. El método más fácil es diluyendo la
muestra con agua (al menos en tres veces). Sin embargo es obvio que
la dilución de la muestra conduce a una pérdida de sensibilidad con
el mismo factor.
Ajustando el pH de cada muestra de orina o
sangre a un cierto valor elimina parcialmente las diferencias entre
las muestras. En el caso de la orina el pH puede diferir
considerablemente. Estas fluctuaciones son observadas entre
especies, entre animales de las mismas especies y de un día al otro
para cada uno de los animales. Por ejemplo, debido a las
diferencias en la alimentación y en el tiempo requerido para obtener
la muestra de orina el pH puede variar muy fuertemente entre
valores ácidos y básicos. Sin embargo, tales métodos no pueden ser
empleados en la práctica, ya que este podría ser el más conveniente
para examinar las muestras de orina en el lugar del agricultor. La
medición exacta del pH y titulación de la muestra para un cierto
valor de pH empleando soluciones ácidas o alcalinas es mucho más
compleja en esta situación. Al respecto Erasmuson y otros
(Analyst 123, 2497-2499 (1998)) han sugerido la
remoción del bicarbonato de las muestras de orina previo al análisis
por tratamiento acídico a pH 5.5. Las desventajas de este enfoque
están en que muchas de las operaciones necesitan ser ejecutadas
como la adición de varias alícuotas de ácido, midiendo el valor del
pH y permitiendo que el dióxido de carbono se desarrolle y que las
muestras sean diluidas disminuyendo así la sensibilidad. Además fue
también observado que ajustando el pH no se da una solución
satisfactoria para la mayoría de las muestras ya que resultados
falsos positivos aún ocurren. Finalmente también ajustando el pH,
otra vez la mayor desventaja es la dilución de la muestra.
Puede ser concluido que hasta ahora está
disponible un método de prueba que no es apropiado para la detección
de residuos antimicrobianos en muestras de orina y sangre. Los
métodos actuales son poco fiables, consumidores de tiempo y pueden
conducir a resultados falsos positivos.
Es un objetivo de la presente invención
proporcionar un medio de prueba mejorado y un método para la
determinación de antibióticos en fluidos, particularmente sangre y
orina. Sorprendentemente, nosotros hemos encontrado que hay una
mejoría sustancial alcanzada cuando aplicamos un metal alcalino
térreo al medio de prueba.
Para este fin, se proporciona un medio de prueba
que comprende un microorganismo de prueba, un indicador y un metal
en forma ionizada, donde el metal es un metal alcalino térreo y la
concentración de dicho metal es 0.005 M y 1 M.
Además, se proporciona un método para la
determinación de la presencia de antibiótico en un fluido que
comprende los pasos de:
- (a)
- contactar una muestra de dicho fluido con un medio de prueba que comprende un microorganismo de prueba y un indicador,
- (b)
- incubar el microorganismo de prueba por un período de tiempo para el crecimiento del microorganismo de prueba en el caso de que no esté presente el antibiótico en la muestra de fluido; y
- (c)
- detectar el crecimiento o la inhibición del crecimiento del microorganismo de prueba con un indicador,
caracterizado porque una sal de metal alcalino
térreo es adicionada al medio de prueba y/o a la muestra y la
concentración del metal en el medio de prueba y/o la muestra está
entre 0.005 M y 1 M.
También se proporciona un conjunto apropiado
para llevar a cabo el método de acuerdo con la invención, el
conjunto comprende:
- (a)
- al menos un contenedor al menos parcialmente lleno con el medio de prueba comprendiendo un microorganismo de prueba, nutrientes y al menos un indicador; y
- (b)
- una sal de metal alcalino térreo donde la sal metálica tiene una solubilidad en agua a 20ºC de al menos 0.02 M.
o comprendiendo el medio de prueba de acuerdo
con la reivindicación 1 ó 2.
También se proporciona el empleo de una sal de
metal alcalino térreo para tratar la muestra antes de determinar la
presencia o ausencia de un antibiótico en la muestra en una prueba
de inhibición microbiana.
\vskip1.000000\baselineskip
Los términos y abreviaturas dadas abajo son
empleadas en toda esta divulgación y son definidas como sigue.
El termino "antibiótico" se refiere a una o
más sustancias o constituyentes químicos de una muestra que
demuestra actividad contra las bacterias.
El término "fluido" se refiere a las
sustancias o composiciones que tienen partículas que mueven o
cambian fácilmente su posición relativa sin separación de la masa,
que ceden fácilmente por presión y que son capaces de fluir. Con
relación a la presente invención, el término "fluido" se
refiere a composiciones tales como soluciones acuosas, sangre,
guano, fluido de carne, leche, orina y similares.
El término "antibiótico
\beta-lactámico" se refiere a los antibióticos
que comprenden una sub-estructura
\beta-lactámica dentro su estructura química y
demuestran actividad contra las bacterias. Ejemplos de dichos
antibióticos \beta-lactámicos son amoxicilina,
ampicilina, cefaclor, cefadroxil, cefprozil, ceftiofur, cefalexina,
cefapirina, cefradina, cloxacilina, dicloxacilina, flucoxacilina,
oxacilina, penicilina G, penicilina V, y ticarcilina.
El término "indicador" se refiere a un
compuesto o sustancia que, con el cambio de un estado a otro,
proporciona una señal detectable como un cambio de color o
fluorescencia.
El término "prueba" se refiere a un método,
procedimiento, proceso o reacción empleada para identificar,
caracterizar o cuantificar uno o más antibióticos o clases de
antibióticos.
El término "dispositivo de prueba" se
refiere a los componentes o parte de los componentes adecuados para
la ejecución de las pruebas.
El término "medio de prueba" se refiere a
un líquido o suspensión solidificada de microorganismos de prueba,
además comprende al menos un indicador y opcionalmente comprende
nutrientes y sustancias amortiguadoras. Preferiblemente el medio de
prueba es solidificado en forma de gel o sol mediante un agente de
gelificación.
El término "microorganismo de prueba" se
refiere a un microorganismo que es sensible a antibióticos y que es
apropiado para monitorear la presencia o ausencia de su
crecimiento.
El término "umbral" se refiere al valor de
concentración por encima del cual un antibiótico dado es
considerado como presente y por debajo del cual dicho antibiótico
es considerado como ausente. Generalmente, un valor umbral es dado
para antibióticos particulares en muestras particulares por
autoridades locales, regionales o interregionales pero puede
también ser prefijado para ciertos propósitos investigativos.
El término "valencia" se refiere al grado
de potencia combinada de un elemento, tal como un metal, como es
mostrado por el número de pesos atómicos de un elemento univalente
(como hidrógeno) con el cual el peso atómico del elemento se
combinará o por el cual puede ser sustituido o con el cual puede ser
comparado.
En un primer aspecto de la invención se
proporciona un medio de prueba para la detección de compuestos
antimicrobianos en fluidos que comprenden uno o más tipos de
microorganismos de prueba como agentes detectores, un indicador y
un metal en forma ionizada. Inesperadamente ha sido encontrado que
cuando un metal en forma ionizada es empleado en un medio de
prueba, los problemas del arte previo mencionados anteriormente
podrían ser superados con la retención de la sensibilidad de la
prueba. Preferiblemente, la valencia de dicho metal es al menos 2.
El metal es un metal alcalino térreo. Ejemplos de tales metales son
el bario, berilio, calcio, magnesio, y estroncio. Más
preferiblemente, dicho metal es bario o calcio. La concentración de
dicho metal en dicho medio de prueba está entre 0.005 y 1 M,
preferiblemente entre 0.01 y 0.1 M. Los contraiones apropiados para
el ion metálico son iones que satisfacen el requisito de
solubilidad. Los contraiones preferidos son acetato, benzoato,
bromuro, cloruro, yoduro, nitrato, nitrito y en algunos casos
sulfato. Las sales metálicas deben tener una solubilidad en agua
que permita la fácil dilución de la sal metálica en la muestra de
prueba o el medio de prueba. En general dicha solubilidad en agua
debe ser igual a o mayor que 0.01 M, preferiblemente igual a o
mayor que 0.02 M, más preferiblemente igual a o mayor que 0.1 M, lo
más preferiblemente igual a o mayor que 1 M. Las sales metálicas
preferidas son bromuro de bario, cloruro de bario, yoduro de bario,
nitrato de bario, cloruro de berilio, sulfato de berilio, acetato
de calcio, bromuro de calcio, cloruro de calcio, yoduro de calcio,
nitrato de calcio, cloruro de magnesio, y sulfato de magnesio. Lo
más preferiblemente es la sal metálica de cloruro de calcio.
Opcionalmente, el medio de prueba puede también
contener nutrientes, estabilizadores y sustancias que cambian la
sensibilidad a ciertos compuestos antimicrobianos en un sentido
positivo o negativo, y/o sustancias que incrementan la viscosidad.
Ejemplos de sustancias que cambian la sensibilidad a ciertos
compuestos antimicrobianos son adenosina y antifolatos como
ormetoprim, tetroxoprim y trimetoprim que mejoran la sensibilidad
del organismo de prueba a compuestos sulfa o sales de ácido oxálico
o ácido fluorhídrico, que mejoran la sensibilidad a tetraciclina.
La cisteína puede ser adicionada para disminuir la sensibilidad a
las penicilinas, cuando sea requerido. Ejemplos de agentes que
incrementan la viscosidad son pectinato de ascorbil metilsilanol,
carbomero, carboximetil celulosa, alcohol cetearílico, alcohol
cetílico, esteres cetílicos, DEA cocamida, cera emulsionante,
glucosa, hidroxietil celulosa, hidroxipropilmetil celulosa, DEA
lauramida, DEA linoleamida, silicato de magnesio aluminio,
maltodextrinas, distearato PEG-8, poliacrilamida,
alcohol polivinilo, copolímero PVP/hexadeceno, cloruro de sodio,
sulfato de sodio, soyaamidopropil betaína, goma xantano y similares.
Alternativamente, ingredientes opcionales del medio de prueba
mencionados anteriormente pueden también ser adicionados de manera
exógena.
El medio de prueba comprende uno o más
indicadores, sin embargo, estos compuestos pueden también ser
adicionados durante el método de prueba. Al menos un indicador está
presente durante el crecimiento del microorganismo en presencia de
la muestra de fluido para indicar cualquiera de los cambios que
tienen lugar en el medio de reacción. El artesano experto apreciará
que muchos indicadores son apropiados para este propósito.
Particularmente útiles son los indicadores que con los cambios de
un estado a otro, proporcionan una señal visualmente detectable
como un cambio en el color o fluorescencia. Tales indicadores pueden
ser fácilmente seleccionados de manuales como "H.J. Conn's
Biological Stains", R.D. Lillie ed., Baltimore, 1969. Los
indicadores preferidos son los indicadores de pH y/o indicadores
redox. Ejemplos de indicadores apropiados son Azul Ácido 120,
Naranja Ácido 51, Amarillo Ácido 38, Ácido de Alizarina, Azul de
Alizarina, Azure A, Azure B, Azul Básico 3, Negro Brillante, Cresyl
de Azul Brillante, Croceina Brillante MOO, Amarillo Brillante,
Púrpura de Bromocresol, Azul de Bromofenol, Rojo de Bromofenol,
Azul de Bromotimol, Rojo Congo, Galocianina, Carmín Azul de Añil,
Verde Jano B, Tornasol, Azul de Metileno, Azul de Nilo A, Amarillo
de Nitrazol (también referido como Amarillo de Nitrazina).
o-Nitrofenol, p-Nitrofenol, 1-10
Fenantrolina, Fenolftaleína, Safranina O, Tionina, Azul de
Toluidina.
En una realización del primer aspecto de la
invención, el medio de prueba está preferiblemente en la forma de
una sol o un gel. Ejemplos apropiados de agentes solidificantes son
agar, ácido algínico y sales de los mismos, carragenina, gelatina,
hidroxipropilguar y derivados de los mismos, goma de algarroba (goma
de algarrobo), alga eucheuma procesada y similares. La cantidad de
agente solidificante en el medio de prueba está entre 2 y 100
g.l^{-1}, preferiblemente entre 5 y 50 g.l^{-1}, más
preferiblemente entre 10 y 20 g.l^{-1}, lo más preferiblemente
entre 12 y 15 g.l^{-1}. Sin embargo, la persona experta en el arte
entenderá que otros tipos de medios de prueba sólidos estar basados
en materiales portadores como cerámicas, algodón, vidrio,
partículas metálicas, papel, polímeros de cualquier tamaño y forma,
silicatos, esponjas, lana y similares. En caso de dispositivos de
prueba comerciales como Premi®Test o Delvotest® el medio de prueba
se presenta en tubos o placas. Ejemplos de los dispositivos útiles
para el propósito de la invención son los tubos transparentes
simples o en un grupo o combinado a un bloque de material
translúcido proporcionado con un número de huecos formados allí.
Los dispositivos de prueba preferiblemente tienen tamaños
determinados. Esto es debido a la fiabilidad de la prueba. En caso
de una prueba basada en la tecnología de difusión en agar
preferiblemente son empleados los tubos. El dispositivo de prueba
será preferiblemente lo suficientemente grande para contener una
cantidad de medio agar y muestra correspondiente a la altura de
3-30 mm, más preferiblemente 5-15
mm. La dimensión de la sección transversal interna de las unidades
de prueba es preferiblemente 1-30 mm, más
preferiblemente 5-15 mm. Los dispositivos de prueba
son preferiblemente herméticamente cerrados durante el
almacenamiento, bajo condiciones en las cuales puedan ser
almacenados al menos varios meses.
Por supuesto cualquier otro dispositivo
apropiado para la ejecución del método de la invención puede ser
empleado. El volumen del medio agar en el dispositivo de prueba es
determinado por la altura del dispositivo de prueba, la dimensión
de la sección transversal interna del dispositivo de prueba y el
porcentaje de volumen del dispositivo de prueba, el cual está lleno
con el medio agar. El volumen del medio agar es preferiblemente
0.01-5 ml, más preferiblemente
0.1-1 ml. En una realización alternativa, el
dispositivo de prueba es una placa que comprende uno o más pozos
conteniendo el medio de prueba. Una muestra del fluido a ser
analizada puede ser adicionada directamente a un pozo conteniendo
el medio de prueba y puede ser adicionada indirectamente a dicho
pozo, por ejemplo primero aplicando la muestra de fluido a ser
analizada a un material portador tal como un disco de papel y luego
poner el material portador encima del cual el fluido es adherido o
absorbido encima del medio de prueba.
En otra realización del primer aspecto de la
invención, el microorganismo es un microorganismo termoestable tal
como las especies Bacillus, preferiblemente Bacillus
stearothermophilus, o especies Streptococcus,
preferiblemente Streptococcus thermophilus. Estas especies
pueden ser introducidas en la prueba como unidades capaces de
producir colonias, o Unidades Formadoras de Colonias (CFU's). Dichas
CFU's pueden ser esporas, células vegetativas o una mezcla de
ambas. La concentración de dichas CFU's es expresada como Unidades
Formadoras de Colonias por ml de medio de prueba (CFU.ml^{-1}) y
es usualmente en el rango de 1 x 10^{5} a 1 x 10^{12}
CFU.ml^{-1}, preferiblemente 1 x 10^{6} a 1 x 10^{10}
CFU.ml^{-1}, más preferiblemente 2 x 10^{6} a 1 x 10^{9}
CFU.ml^{-1}, lo más preferiblemente 5 x 10^{6} a 1 x 10^{8}
CFU.ml^{-1},o aún máspreferiblemente 5 x 10^{6} a 2 x 10^{7}
CFU.ml^{-1}. Ejemplo de cepas preferidas son Bacillus
stearothermophilus var. calidolactis C953 (depositada en el
Laboratory of Microbiology of the Technical University of Delft bajo
el número de acceso LMD 74.1 y en el Centraal Bureau voor
Schimmellcultures (CBS), Baarn bajo el número de acceso CBS 760.83)
y Streptococcus thermophilus T101 (DSM 4022). Ambas cepas son
muy sensibles a los compuestos antimicrobianos, especialmente
quimioterapéuticos tal como los compuestos sulfa y antibióticos como
las penicilinas y tetraciclinas. Cepas de Escherichia coli u
otras bacterias Gram negativas apropiadas pueden ser empleadas para
la detección de, por ejemplo, quinolonas. Bacillus
stearothermophilus var. calidolactis C953 y Streptococcus
thermophilus T101 son de crecimiento rápido y tienen la ventaja
que son termofílicas. Por ejemplo, la temperatura de crecimiento
óptimo de dicha cepa de Bacillus está entre 50ºC y 70ºC. El
empleo de los microorganismos termofílicos previene el crecimiento
de los microorganismos durante el almacenamiento o transporte de la
prueba. Cuando el microorganismo de prueba es una cepa de
Bacillus, esta es preferiblemente incorporada dentro del
medio de agar en forma de una suspensión de espora, la cual puede
ser preparada o incorporada dentro del medio agar previo a la
solidificación por métodos conocidos (véase por ejemplo GB A
1467439). Cuando el organismo de prueba es una cepa de
Strepto-coccus, las bacterias son preferiblemente
incorporadas dentro del medio agar en forma de células bacterianas,
las cuales pueden ser preparadas de acuerdo con los métodos
conocidos (véase por ejemplo EP 0285792). La concentración del
organismo de prueba en el medio agar está preferiblemente entre
10^{5} y 10^{10} unidades formadoras de colonia por ml
(CFU.ml^{-1}) del medio agar.
En aún otra realización del primer aspecto de la
invención, los nutrientes son adicionados como una fuente separada,
por ejemplo como un granulado, polvo, tableta, disco o papel
de filtro. También otros compuestos como los indicador(es),
estabilizadores y/o antifolatos pueden ser adicionados como una
fuente separada, opcionalmente incorporada en el medio nuriente.
Nutrientes apropiados para facilitar la multiplicación del organismo
de prueba en ausencia de residuos antimicrobianos son por ejemplo
las fuentes asimilables de carbono (por ejemplo lactosa, glucosa, o
dextrosa), fuentes asimilables de nitrógeno (por ejemplo peptona) y
fuentes de factores de crecimiento, vitaminas y minerales (por
ejemplo extracto de levadura).
En un segundo aspecto de la invención se
proporciona un método fiable y sencillo para llevar a cabo la
detección de compuestos antimicrobianos en orina y sangre. De
acuerdo con la invención una sal de metal alcalino térreo es
adicionada a la muestra de fluido para ser analizada, por
ejemplo una muestra de orina o sangre, antes de adicionar la
muestra al sistema de prueba. Alternativamente el sistema de prueba
por sí mismo puede contener dicha sal metálica como se esbozó en el
primer aspecto de la invención. Inesperadamente ha sido encontrado
que cuando una sal metálica es empleada en el método de prueba, los
problemas del arte previo mencionados anteriormente podrían ser
superados con la retención de las sensibilidad de la prueba. Los
requisitos de las sales metálicas, el medio de prueba,
el(los) indicador(es), el microorganismo y los
componentes adicionales y las opciones preferidas son iguales a las
esbozadas en el primer aspecto de la invención. Dichas sales
metálicas son adicionadas al medio de prueba y/o a la muestra de
fluido a ser analizada.
En una realización del segundo aspecto, la sal
metálica es adicionada a la muestra de fluido para ser analizada
por medio de una solución, preferiblemente una solución acuosa.
En otra realización del segundo aspecto de la
invención, la sal metálica es adicionada a la muestra de fluido
para ser analizada en forma sólida. Opcionalmente la sal metálica en
forma sólida y la muestra de fluido a ser analizada son mezcladas
previo al análisis. Preferiblemente la sal metálica en forma sólida
es adicionada en forma de polvo, granulado, tableta, disco o papel
de filtro. Dicho granulado, polvo, tableta, disco o papel de filtro
puede también opcionalmente contener nutrientes y/o uno o más
indicadores y/o estabilizadores, y/o sustancias que cambian la
sensibilidad para ciertos compuestos antimicrobianos en un sentido
positivo o negativo, y/o agentes que incrementan la viscosidad,
como se esbozó anteriormente en el primer aspecto de la invención.
La concentración de dicho metal en dicha muestra de fluido a ser
analizada está entre 0.005 y 1 M, preferiblemente entre 0.01 y 0.1
M.
La cantidad de muestra de orina o sangre a ser
adicionada al medio de prueba depende del sistema de prueba. La
prueba es incubada siguiendo las instrucciones del fabricante. Para
las pruebas de difusión microbiana 0.01-1.0 ml,
preferiblemente 0.05-0.5 ml es adicionado al medio
de prueba empleando métodos bien conocidos. El tiempo de incubación
de la prueba es dependiente de las circunstancias. En caso de
pruebas de difusión en agar empleando Bacillus
stearothermophilus la prueba es incubada en un baño de agua o
bloque térmico a 60-70ºC, preferiblemente a
62-65ºC. Los resultados pueden ser obtenidos después
de 1.5-4 horas, preferiblemente de
2.5-3.5 horas.
Cualquier prueba apropiada para el método de la
invención es incluido en esta invención. Ejemplos son las pruebas
en que son empleados los microorganismos seleccionados como
sensibles, por ejemplo las pruebas de difusión microbiana en agar,
y pruebas basadas en la unión selectiva de compuestos a ser
detectados. La unión selectiva puede ser lograda empleando
tecnología de anticuerpo bien conocida o por empleo de marcadores
específicos. Cualquier muestra de fluido es apropiada para el
análisis por el método de la invención. Debe ser notado que el
método de la invención es también apropiado para el fluido de
sustancias sólidas de interés el cual puede ser retirado por
difusión, presión o pérdida natural de fluido. Ejemplos particulares
de este último caso son la carne y los materiales portadores que
han sido impregnados con el fluido a ser analizado.
En el tercer aspecto de la invención se
proporciona un conjunto para llevar a cabo el método del segundo
aspecto de la presente invención. Tal conjunto comprende un medio
de prueba como el descrito en el primer aspecto de la invención o
comprende:
- (a)
- al menos un contenedor parcialmente lleno con el medio de prueba comprendiendo un microorganismo de prueba, nutrientes y al menos un indicador; y
- (b)
- una sal de metal alcalino térreo donde la sal metálica tiene una solubilidad en agua a 20ºC de al menos 0.02 M.
Los contenedores pueden ser tubos de pruebas de
cualquier forma y tamaño y de cualquier material disponible,
proporcionando que sea posible la observación de los cambios en el
indicador. También, los contenedores pueden ser pozos como aquellos
incorporados en las placas de microtitulación.
Dicha sal metálica es una sal capaz de formar
iones metálicos como los esbozados en el primer aspecto de la
invención. La sal metálica puede ser presentada como una solución,
preferiblemente una solución acuosa, almacenada en un contenedor.
Preferiblemente dicha sal metálica está presente en forma sólida,
por ejemplo en forma de una tableta, en un disco o papel de filtro.
La ventaja del suministro de la sal metálica en el conjunto en
forma sólida es que cantidades predeterminadas pueden fácilmente ser
empacados, por ejemplo en tabletas, que facilitan la dosificación.
Otra ventaja más es que el empleo de una sal metálica en seco no
conduce a la dilución de la muestra y consecuentemente desciende la
sensibilidad de la prueba.
Opcionalmente, dicho conjunto comprende
instrumentos para el sellado de dichos contenedores llenos con el
medio de prueba durante la incubación y/o un inserto con
instrucciones para el empleo y/o instrumentos para el ajuste del
tiempo necesario para la incubación.
En una realización del tercer aspecto, dicho
conjunto comprende nutrientes. Preferiblemente dichos nutrientes
están contenidos dentro de un medio como una tableta, disco o un
papel de filtro. También otros compuestos como los
indicador(es), estabilizadores y/o antifolatos pueden ser
adicionados como una fuente separada, opcionalmente incorporada en
el medio nutriente.
En otra realización del tercer aspecto de la
presente invención, dicho conjunto comprende un dispositivo
termostático, con la ayuda del cual las muestras de prueba pueden
ser mantenidas a una temperatura preajustada. Preferiblemente,
dicho dispositivo termostático es diseñado en tal modo que este
puede sostener dichos contenedores llenos con el medio de prueba.
Opcionalmente el dispositivo termostático es acoplado a los
instrumentos para el ajuste del tiempo necesario de incubación de
manera que el calentamiento y/o enfriamiento es detenido después del
plazo de un periodo preajustado.
En otra realización más del tercer aspecto de la
invención, dicho conjunto comprende un portador de datos cargado
con una computadora, un programa apropiado para instruir una
computadora a analizar los datos digitales obtenidos del lector de
muestra. Dicho portador de datos puede ser cualquier portador
apropiado para almacenar información digital como
CD-ROM, un disquete, un DVD, una memoria portátil,
una cinta magnética o similares. En ventaja, dicho portador de
datos cargado con un programa computarizado que proporciona un fácil
acceso a los últimos programas computarizados disponibles
apropiados para el empleo en el método de la presente invención.
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Las muestras de orina fueron examinadas
empleando las ampolletas de prueba de inhibición microbiana
producidas de acuerdo a los métodos descritos en EP 0005891 con los
nutrientes presentes en el agar. Dicha prueba es también conocida
como Premi®Test (comercialmente disponible por DSM, Delft, Países
Bajos).
CaCl_{2}.2H_{2}O (0.81 mg, 0.0055 mmol) fue
disuelto en 100 \mul de orina obtenida de puerco (un total de 10
muestras fueron evaluadas) o terneros (un total de 35 muestras
fueron evaluadas), que no contienen residuos de fármacos. Para el
control de las muestras no fue adicionado CaCl_{2}. Las muestras
fueron adicionadas a las ampolletas de prueba. Después de una
pre-incubación durante 20 minutos a temperatura
ambiente la muestra fue extraída y la prueba fue incubada en un
baño de agua a 64\pm1ºC siguiendo las instrucciones del
fabricante. Los resultados fueron obtenidos después de
3-4 horas por lectura del cambio de color púrpura a
amarillo.
Los resultados como los resumidos abajo
demuestran claramente que un tratamiento de la orina con CaCl_{2}
es esencial para minimizar los resultados falso positivos de la
prueba en el Premi®Test.
Las muestras fueron examinadas como se describió
en el Ejemplo 1. CaCl_{2}.2H_{2}O fue disuelto en agua o fluido
de carne de pollo, en concentraciones de 0, 0.0078, 0.0156, 0.0312,
0.0625, 0.125, 0.25, 0.5 y 1 M. Las muestras fueron adicionadas a
las ampolletas de prueba. Después de una
pre-incubación durante 20 minutos a temperatura
ambiente la muestra fue extraída y la prueba fue incubada en un baño
de agua a 64\pm1ºC siguiendo las instrucciones del fabricante.
Los resultados fueron obtenidos después de 165 minutos para el
fluido de carne de pollo y de 185 minutos en el caso del agua, por
lectura del cambio de color púrpura a amarillo. Los resultados como
los resumidos abajo demuestran claramente que una concentración de
CaCl_{2} de hasta 0.25 M en agua no influyen en los resultados de
la prueba. En el fluido de carne de pollo no hay inhibición en el
caso de que la concentración de CaCl_{2} sea de hasta 1 M.
En este experimento es demostrado que la adición
del CaCl_{2} a la orina reduce los resultados falsos en la prueba
de inhibición microbiana.
Las muestras fueron examinadas empleando las
ampolletas de prueba de inhibición microbiana producidas de acuerdo
a los métodos descritos en EP 0005891 con los nutrientes presentes
en el agar. Dicha prueba es también conocida como Premi®Test
(comercialmente disponible desde DSM, Delft, Países Bajos).
CaCl_{2}.2H_{2}O (1 mg, 0.0068 mmol) fue
disuelto en 100 \mul de orina obtenida de bovinos (un total de 25
muestras fueron evaluadas) que no contienen residuos de fármacos.
Para el control de las muestras no fue adicionado CaCl_{2}. Las
muestras fueron adicionadas a las ampolletas de prueba. Después de
una pre-incubación durante 20 minutos a temperatura
ambiente la muestra fue extraída y la prueba fue incubada en un baño
de agua a 64\pm1ºC siguiendo las instrucciones del fabricante.
Los resultados fueron obtenidos después de 3-4 horas
por lectura del cambio de color púrpura a amarillo.
Los resultados como los resumidos en la Tabla 3
demuestran claramente que un tratamiento de la orina con CaCl_{2}
es esencial para minimizar los resultados falso positivos de la
prueba en el Premi®Test.
En este experimento es demostrado que la adición
de un metal alcalino térreo de calcio cualquiera CaCl_{2} o
Ca(CH_{3}COO)_{2} a la orina reduce los resultados
falsos en la prueba de inhibición microbiana.
Las muestras fueron examinadas empleando las
ampolletas de prueba de inhibición microbiana producidas de acuerdo
a los métodos descritos en EP 0005891 con los nutrientes presentes
en el agar. Dicha prueba es también conocida como Premi®Test
(comercialmente disponible desde DSM, Delft, Países Bajos).
CaCl_{2}.2H_{2}O (1.0 mg, 0.0068 mmol)
Ca(CH_{3}COO)_{2} (1.0 mg, 0.0041 mmol) y
Ca(CH_{3}COO)_{2} (2.0 mg, 0.0082 mmol) fueron
disueltos en 100 \mul de orina obtenida de bovinos (un total de 25
muestras fueron evaluadas) y cerdos (un total de 9 muestras fueron
evaluadas) que no contienen residuos de fármacos. A las muestras de
control no fue adicionado el metal alcalino térreo de calcio. Las
muestras fueron adicionadas a las ampolletas de prueba. Después de
una pre-incubación durante 20 minutos a temperatura
ambiente la muestra fue extraída y la prueba fue incubada en un
baño de agua a 64\pm1ºC siguiendo las instrucciones del
fabricante. Los resultados fueron obtenidos después de
3-4 horas por lectura del cambio de color púrpura a
amarillo.
Los resultados como los resumidos en la Tabla 4
demuestran claramente que un tratamiento de la orina con el metal
alcalino térreo de calcio es esencial para minimizar los resultados
falso positivos de la prueba en el Premi®Test.
Claims (15)
1. Un medio de prueba que comprende un
microorganismo de prueba, un indicador y un metal en forma ionizada,
caracterizado porue el metal es un metal alcalino térreo y
la concentración del metal está entre 0.005 M y 1 M.
2. Un medio de prueba de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado porque el metal alcalino
térreo es seleccionado a partir del grupo compuesto por bario,
calcio y magnesio.
3. Un método para la determinación de la
presencia de un antibiótico en un fluido que comprende los pasos
de:
- (a)
- contactar una muestra de dicho fluido con un medio de prueba que comprende un microorganismo de prueba y un indicador,
- (b)
- incubar el microorganismo de prueba por un período de tiempo para el crecimiento del microorganismo de prueba en el caso de que no esté presente el antibiótico en la muestra; y
- (c)
- detectar el crecimiento o la inhibición del crecimiento del microorganismo de prueba con un indicador,
caracterizado porque una sal de metal
alcalino térreo es adicionada a dicho medio de prueba y/o a dicha
muestra y la concentración del metal en el medio de prueba y/o
muestra está entre 0.005 M y 1 M.
4. Un método de acuerdo con la reivindicación 3,
caracterizado porque el indicador es al menos un indicador de
pH y/o al menos un indicador redox.
5. Un método de acuerdo con la reivindicación 3
ó 4, caracterizado porque el fluido en que los antibióticos
están siendo determinados es sangre u orina.
6. Un método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 3 a 5, caracterizado porque el metal
alcalino térreo es seleccionado a partir del grupo compuesto por
bario, calcio y magnesio.
7. Un método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 3 a 6, caracterizado porque la concentración
de la sal del metal en el medio de prueba y/o la muestra no debe
excederse de 1 M.
8. Un método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 3 a 7, caracterizado porque la sal del metal
es adicionada a la muestra.
9. Un método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 3 a 8, caracterizado porque la sal del metal
es adicionada a la muestra antes de que la muestra sea adicionada
al medio de prueba.
10. Un método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 3 a 9, caracterizado porque la sal del metal
es adicionada a la muestra por medio de una solución.
11. Un conjunto apropiado para llevar a cabo el
método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 10, el
conjunto comprende:
- (a)
- al menos de un recipiente parcialmente lleno con el medio de prueba comprendiendo un microorganismo de prueba, nutrientes y al menos un indicador; y
- (b)
- una sal de un metal alcalino térreo donde la sal del metal tiene una solubilidad en agua a 20ºC de al menos 0.02 M.
o comprendiendo el medio de prueba de acuerdo
con la reivindicación 1 ó 2.
12. Un conjunto de acuerdo con la reivindicación
11, comprendiendo además un dispositivo termostático apropiado para
mantener las muestras de prueba a la temperatura preajustada.
13. Un conjunto de acuerdo con la reivindicación
11 ó 12, comprendiendo además un portador de datos cargado con un
programa computarizado para instruir una computadora a analizar los
datos digitales obtenidos del lector de muestra.
14. Un conjunto de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 13, caracterizado porque la sal del
metal se presenta en una tableta, un disco o papel de filtro o una
solución acuosa.
15. El empleo de una sal de metal alcalino
térreo para tratar una muestra antes de la determinación en la
muestra de la presencia o ausencia de un antibiótico en una prueba
de inhibición microbiana.
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