JP2019062792A - 微生物数の計測方法 - Google Patents

Abstract

【課題】透析液等の炭酸イオンや重炭酸イオンを含有する検体中の微生物数を、簡便かつ正確に計測する方法を提供する。【解決手段】（ａ）ポリアクリル酸及び／又はその塩、（ｂ）アルカリ土類金属の水酸化物、並びに（ｃ）栄養成分を含有する、微生物数計測用培地を調製するための組成物に、検体を加えて混和する工程、前記検体に含まれる微生物を培養する工程、及び前記微生物のコロニー数を計測する工程を含む、微生物数の計測方法。【選択図】なし

Description

本発明は、検体中の微生物数を簡便に計測する方法に関し、特に透析水等の炭酸イオン又は重炭酸イオンを含有する検体へ適用し得る方法に関する。

飲料水、清涼飲料水、工業用水、製薬用水、透析水等には、微生物による汚染度が小さいことが求められ、通常は存在する微生物数が非常に少ないことが知られている。特に、飲料水には生菌１００ＣＦＵ／ｍＬ以下、透析用水には生菌１０ＣＦＵ／ｍＬ以下の基準が設けられており、これらの基準を管理する上で、定期的に正確な微生物数を把握するためのモニタリングは重要である（非特許文献１）。

通常、食品等における微生物検出では、１ｍＬ程度の少量の検体懸濁液等を混釈培養する方法が採られる。しかしながら、存在する微生物数が非常に少ない飲料水等の検体に対しては、前記方法では微生物数を正確に計測できない場合がある。例えば、１００ｍＬ中に１０ＣＦＵ以下の菌が存在する場合に、検体として１ｍＬのみを供試すると、微生物を検出できないことがあり、汚染状況を正確に把握できない。

このような、液体検体中の微生物数を、特に大容量の液体検体中に存在する少量の微生物数を、簡便かつ正確に計測するために、本発明者らはこれまでに、ポリアクリル酸ナトリウム等のゲル化剤を用いる培地による方法を提案した（特願２０１６−１８９５４５）。すなわち、ゲル化剤に液体検体をそのまま培地を構成する溶媒として添加することによって操作を簡便にすること、そして該培地中で検体中の微生物を培養することによってコロニーを出現させて可視化する方法である（後述の参考例１）。

第１７改正 日本薬局方 参考情報Ｇ８水関連 人工腎臓用透析液粉末製剤 リンパック透析剤ＴＡ３ 添付文書（ニプロ株式会社）

しかしながら、透析液を検体とした場合に前記方法を適用すると、培地が白濁して微生物のコロニーの視認性が低下するという新たな課題が生じた。これは、透析液に通常多量に含まれる炭酸ナトリウムや重炭酸ナトリウム（非特許文献２）が、ポリアクリル酸ナトリウムと反応して炭酸ガスを発生させて、培地中に無数の気泡を生じさせることに起因することが分かった。
かかる状況において、本発明は、透析液等の炭酸イオンや重炭酸イオンを含有する検体中に存在する少量の微生物数を、透析液由来の炭酸ガスの発生を抑制し簡便かつ正確に計測する方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意研究の末、ポリアクリル酸ナトリウムを含む培地の成分として、水酸化カルシウム等のアルカリ土類金属の水酸化物を添加すると、炭酸ガスの発生を抑制でき、微生物数計測の際の視認性を確保できることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］（ａ）ポリアクリル酸及び／又はその塩、（ｂ）アルカリ土類金属の水酸化物、並びに（ｃ）栄養成分を含有する、微生物数計測用培地を調製するための組成物。
［２］さらに（ｄ）呈色試薬を含有する、［１］に記載の組成物。
［３］前記（ｂ）アルカリ土類金属の水酸化物が、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、水酸化バリウム、水酸化ストロンチウム、水酸化ラジウム、及び水酸化ベリリウムからなる群から選択される、［１］又は［２］に記載の組成物。
［４］［１］〜［３］のいずれかに記載の組成物と、培養容器とを含む、微生物数計測用培養器材。
［５］［１］〜［３］のいずれかに記載の組成物に検体を加えて混和する工程、前記検体に含まれる微生物を培養する工程、及び前記微生物のコロニー数を計測する工程を含む、微生物数の計測方法。
［６］前記検体が、０．００５ｍｏｌ／１００ｍＬ以上の炭酸イオン又は重炭酸塩イオンを含有する、［５］に記載の計測方法。
［７］前記検体中の微生物数が、０．１ＣＦＵ／ｍＬ以下である、［５］又は［６］に記載の計測方法。
［８］前記検体重量が、前記組成物中の前記（ａ）ポリアクリル酸及び／又はその塩の重量の１０〜１００００倍である、［５］〜［７］のいずれかに記載の計測方法。

本発明によれば、炭酸イオンや重炭酸イオンを含有する検体に対しても、炭酸ガスの発生を抑制し検体中の微生物数を、簡便かつ正確に計測することが可能になる。特に大容量の検体中に存在する少量の微生物数であっても、定量的な検出を実現することができる。

参考例１におけるゲル状培地１００ｍＬ中の赤色コロニーの写真。 比較例１のゲル状培地１００ｍＬの写真。 実施例１のゲル状培地１００ｍＬの写真。

本発明の組成物は、（ａ）ポリアクリル酸及び／又はその塩、（ｂ）アルカリ土類金属の水酸化物、並びに（ｃ）栄養成分を必須に含有する。
本発明の組成物は、微生物数計測用培地を調製するためのものである。前記調製は、通常、計測対象の微生物を含む液体検体をそのまま培地を構成するゲルの溶媒として添加し混和することにより行われる。かかる使用態様において、本発明の組成物及びこれを用いて調製された培地は、従来の微生物用の培地とは異なる。

（ａ）ポリアクリル酸及び／又はその塩は、対象微生物の培養及び計測のための培地を構成するゲル化剤の役割を担う。ポリアクリル酸及び／又はその塩は、液体検体と混和することにより、均一なゲルを形成する。かかるゲル形成において、通常は加熱による溶解や冷却を要しないため、操作を簡便が簡便であり、また対象微生物の生育が妨げられない。
形成されるゲルは通常は流動性がないため、微生物の存在数を正確に計測することができる。また、該ゲルからは通常は離水が生じないため、微生物のコロニーの存在数を正確に計測することができる。
また、ポリアクリル酸及び／又はその塩により形成されるゲルは通常は透明であるため、微生物のコロニーを目視で正確に検出することができる。

一般に、微生物用培地等には、寒天、カラギーナン、ローカストビーンガム等のゲル化剤が用いられるが、これらは液体溶媒を固化させる際に加熱が必要であるため、微生物を
含む液体検体をそのまま固化させるのには適さない。また、前記ゲル化剤を用いて固化させたゲルは透明性が低い点も適さない。
また、ポリビニルアルコールは、液体溶媒と均一に混和させるのが難しいうえ、離水しやすいという問題がある。また、キサンタンガムも、液体溶媒と均一に混和させるのが難しくダマになりやすいうえ、固化させたゲルが不透明になりやすい。
カルボキシメチルセルロースは、液体検体を固化することができず、流動性のあるゲルとなるため、微生物の定量的な検出に適さない。

（ａ）ポリアクリル酸及び／又はその塩として、ポリアクリル酸ナトリウムを用いる場合は、固化能の観点から、重合度１０，０００以上のものが好ましく、重合度２２，０００以上のものがより好ましい。また、架橋されていてもされていなくてもよい。

本発明におけるポリアクリル酸ナトリウムの使用時の濃度は、特に限定されないが、例えば０．０１〜１０ｇ／１００ｍＬが好ましく、０．５〜５ｇ／１００ｍＬがより好ましい。
また、他の（ａ）ポリアクリル酸及び／又はその塩を用いる場合は、本発明の効果を阻害しない限りにおいて、使用時の濃度は固形ゲルが形成される範囲とすればよい。

（ｂ）アルカリ土類金属の水酸化物は、前記ポリアクリル酸等と検体中の炭酸イオン又は重炭酸イオンとの反応による炭酸ガスの発生を抑制するためのものである。
アルカリ土類金属の水酸化物は、特に限定されないが、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、水酸化バリウム、水酸化ストロンチウム、水酸化ラジウム、及び水酸化ベリリウムが好ましく挙げられ、取り扱いや微生物の発育への影響の点で水酸化カルシウムが特に好ましい。
なお、これらを添加した場合でも、ポリアクリル酸等のゲルの透明性やゲル化は妨げられない。

本発明における（ｂ）アルカリ土類金属の水酸化物の使用時の濃度は、特に限定されないが、好ましくは、検体に含まれる炭酸イオン及び重炭酸イオンの等モル濃度以下である。例えば、一般的な透析液を検体とし、（ｂ）アルカリ土類金属の水酸化物として水酸化カルシウムを使用する場合は、使用時の濃度として０．０１〜１０ｇ／１００ｍＬが好ましく、０．１〜０．５ｇ／１００ｍＬがより好ましい。

（ｃ）栄養成分は、対象微生物を発育させるためものである。
栄養成分としては、特に限定されないが、ペプトン、獣肉エキス、酵母エキス、魚肉エキス等を好ましく挙げられる。
非特許文献１に記載されているように、上水試験では標準寒天培地、製薬用水や透析水の試験ではＲ２Ａ寒天培地を用いることが推奨されている。そのため、これら寒天培地の寒天を排除したブイヨン培地かそれと同等の成分を、本発明の組成物の含有成分とすることが好ましい。

本発明の組成物は、さらに（ｄ）呈色試薬を含有することが好ましい。これは、培養によって生じた微生物のコロニーを有色のものとしてより検出・計測しやすくするためである。
呈色試薬としては、例えば、２,３,５−トリフェニルテトラゾリウムクロライド（ＴＴＣ）やテトラゾリウムバイオレット等をはじめとする酸化還元指示薬が挙げられる。これは、検体中に存在する全ての種類の微生物を計測したい場合に好ましく用いることができる。ＴＴＣを用いる場合は使用時の濃度として１〜１００ｍｇ／Ｌが好ましく、１０〜５０ｍｇ／Ｌがより好ましい。

また、呈色試薬としては、特定の微生物種のみが保有する酵素に対する基質（以下、酵素基質という）であって、分解されることにより色素化合物を遊離し得る化合物を用いてもよい。これは、該特定の微生物を計測したい場合に好ましく用いることができる。
ここで色素化合物とは、可視光下で有色のもの及び蛍光発色するものの何れでもよい。可視光下で有色の化合物として遊離され得る官能基としては、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル基等が挙げられ、遊離した５−ブロモ−４−クロロ−３−インドールは酸化縮合して５，５’−ジブロモ−４，４’−ジクロロ−インディゴとなり、青色を呈する。蛍光発色する化合物として遊離され得る官能基としては、４−メチルウンベリフェリル基等が挙げられ、遊離した４−メチルウンベリフェロンは紫外線照射下で蛍光を発する。

酵素基質の例を挙げると、対象微生物が大腸菌群の場合は、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ＧＡＬ）や５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−グルクロン酸等を、黄色ブドウ球菌の場合は、リン酸５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル（Ｘ−ｐｈｏｓ）等を、腸球菌等の場合は、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−グルコピラノシド（Ｘ−ＧＬＵＣ）等を、真菌の場合は、Ｘ−ｐｈｏｓ、酢酸５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルや酪酸５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル等を、それぞれ好ましく用いることができる。さらに、全ての微生物種を検出したい場合には、これら全てを組み合わせて使用してもよい。
これらの酵素基質の使用時の濃度は、例えば、０．０１〜１．０ｇ／Ｌが好ましく、０．２〜１．０ｇ／Ｌがより好ましい。

本発明の組成物は、本発明の効果を妨げない限りにおいて、さらに、選択物質、抗菌性物質、無機塩類、糖類、増粘剤、ｐＨ調整剤、等を任意に含有してもよい。
選択物質としては、例えば、ポリミキシンＢやバンコマイシンなどの抗生物質や、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、Ｔｗｅｅｎ８０、コール酸ナトリウム等の胆汁酸塩等の界面活性剤が挙げられる。
抗菌性物質としては、例えば、ポリリジン、プロタミン硫酸塩、グリシン、ソルビン酸等が挙げられる。
無機塩類としては、例えば、塩化ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム等の無機酸金属塩、ピルビン酸ナトリウム、クエン酸鉄アンモニウム、クエン酸ナトリウム等の有機酸金属塩が挙げられる。
糖類としては、例えば、グルコース、ラクトース、スクロース、キシロース、セロビオース、マルトースが挙げられる。
増粘剤としては、例えば、デンプン及びその誘導体、ヒアルロン酸、アクリル酸誘導体、ポリエーテル、コラーゲン等が挙げられる。
ｐＨ調整剤としては、例えば、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、クエン酸等が挙げられる。なお、本発明の組成物は、対象微生物の生育の観点から、使用時のｐＨが好ましくは６．０〜８．０に、より好ましくは６．５〜７．５になるような組成である。

本発明の組成物は、培養容器と組み合わせて、微生物数計測用培養器材として提供されてもよい。
かかる培養容器は、液体検体を、通常は濃縮や希釈等の処理をすることなく、そのまま収容し、その中で本発明の組成物と混和して、前記組成物が含有する高分子化合物をゲル化させて培地を形成し、微生物を培養するためのものである。
培養容器の形態は特に限定されず、必要量の液体検体を十分に収容できるものであればよい。例えば、本発明の組成物と液体検体とを振とうにより混和させるのには、円筒形等の形状で、変形しにくい材料の容器が好ましい。また、例えば本発明の組成物と液体検体とを容器ごと揉んだり押圧したりして混和させるのには、変形しやすい、柔軟性のある材
料の容器が好ましい。例えば、ポリビニル系やポリエチレン系ポリマー等の袋状容器が好ましく挙げられ、蓋やジッパー等の封入具があればより好ましい。また、培養容器は透明であることが、微生物のコロニーを容器外から計測しやすいことから、好ましい。これらの収容可能用量としては、特に限定されないが、１００〜１０００ｍＬが好ましく挙げられ、少量の微生物を含む大容量の検体に適用するのに適する。
従来は予め形成されている培地を含む培養器材に検体を接触させて培養及び計測を行うものであったのに対し、本発明の微生物数計測用培養器材においては、培養容器内で液体検体そのものを溶媒として前記高分子化合物をゲル化させ、検体中の微生物がゲル内部で培養され計測に供されるという使用態様に好適である点で異なる。

また、培養容器を小型の平板（シート）状としてもよく、例えば１ｍＬ程度の少量の検体を用いて検出を行うのに適する。
例えば、一般的なシャーレや、凹型の皿状シートと平型又は凸型のシートとを重ねた収容容器の形態が挙げられる。平板状の形態とすることで、微生物のコロニーがより計測しやすくなる。また、小型化することにより、一度に複数の検体を並行して処理しやすくなる。
このような小型の平板状の培養容器の場合は、希釈した検体にも使用が可能となるため、検体中の微生物数が、例えば３００ＣＦＵ／ｍＬ以下である場合にも好適となる。

上記説明した本発明の微生物数計測用培地を調製するための組成物は、本発明の計測方法に好適に用いることができる。
本発明の計測方法は、本発明の組成物に検体を加えて混和する工程、前記検体に含まれる微生物を培養する工程、及び前記微生物のコロニー数を計測する工程を含む。
本発明の組成物と液体検体との混和は、任意の方法で行うことができ、例えば容器ごと振とうしたり揉んだり、又は滅菌した器具でかき混ぜればよい。
微生物の培養条件は、特に限定されないが、対象微生物の種類により適正に選ばれるが、例えば３５±２℃で２４〜４８時間が好ましい。
培養後の培地中には、対象微生物の生育コロニーが出現し、目視等で確認することができ、また、炭酸ガスの気泡が生じにくいため、正確に数を計測することができる。

本発明の計測方法は、微生物の存在量が少ない、すなわち清浄度の高い検体に好適に用いることができる。例えば、検体中の微生物数が、通常の１ｍＬの検査では検出できない０．１ＣＦＵ／ｍＬ以下である場合に好適である。
一般に、微生物の存在量が多い検体であれば、検出方法に適するように適当に希釈して計測することができるが、存在量が少ない場合は濃縮が繁雑であったり困難であったりする。本発明の計測方法は、そのような場合でも、簡便かつ正確に微生物数を検出できる点で有用である。

また、本発明の計測方法は、量の多い液体検体であっても、前処理することなくそのまま計測に供することができる点でも有用である。例えば、検体重量が、本発明の組成物中の前記（ａ）ポリアクリル酸ナトリウムの抱水能に応じた大量の、例えばその重量の１０〜１００００倍である場合に好適である。あるいは、大量の、例えば１００ｍＬ以上の検体の場合に好適である。

本発明の計測方法を適用しうる検体としては、特に限定されないが、通常は、炭酸イオン又は重炭酸塩イオンを０．００５ｍｏｌ／１００ｍＬ以上含有する液体検体である。かかる液体検体としては透析水が好ましく挙げられる。また、このような検体を予めトリプトソイブイヨン等で培養した培養液であってもよい。

次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

＜参考例１＞
（１）微生物計測用培地を調製するための組成物の作製
表１に示す組成の原料を、容積１５０ｍＬの円筒形の無色透明プラスチック容器内で混合して組成物を作製した。

（２）菌株の供試
供試菌株はBacillus subtilis NBRC3134を使用した。これをトリプトソイ寒天培地で２４時間前培養した後、マクファーランド比濁＃１相当（約３．０×１０⁸ＣＦＵ／ｍＬ）
になるように滅菌綿棒を用いて滅菌生理食塩水に懸濁し、菌原液とした。該菌原液を用いて、滅菌生理食塩水にて１０倍段階希釈を１０^-8まで繰り返し、数ＣＦＵ／１ｍＬの菌希釈液を作製した。該菌希釈液１ｍＬを９９ｍＬの滅菌水に加えて、数ＣＦＵ／１００ｍＬの、ごく少量しか微生物が存在しない試料液とした。該試料液を、上記（１）で作製した組成物に１００ｍＬ加え、数分間上下に振とうして混和し、室温にて固化させた。固化した培地を静置し、３５℃で２４時間培養した後、発育の有無を確認した。

（３）結果
図１にBacillus subtilisのコロニーを示す。
参考例１の組成物を用いることで、供試菌株の試料液は速やかに固化し、培養後は図１に示すように透明のゲルの中に赤色のコロニーが確認でき、容易にその数を計測することができた。

＜実施例１及び比較例１＞
（１）微生物計測用培地を調製するための組成物の作製
表２に示す組成の原料を、容積１００ｍＬの無色透明プラスチック製スパウトバッグ容器内で混合して、比較例１の組成物を作製した。
また、表２に示す組成の原料に、水酸化カルシウム０．３ｇ／１００ｍＬも加えて、容積１００ｍＬの無色透明プラスチック製スパウトバッグ容器内で混合して、実施例１の組成物を作製した。なお、実施例１の組成物における水酸化カルシウムの使用時の濃度は、後述の（２）で添加する透析液リンパック透析剤ＴＡ３（ニプロ株式会社製）の１００ｍ
Ｌ中の炭酸水素ナトリウム含有量の２５ｍｏｌ％に相当する。

（２）透析液の供試
リンパック透析剤ＴＡ３（ニプロ株式会社製）を添付文書に従って調製した透析液を、実施例１又は比較例１の組成物を収納する容器に１００ｍＬずつ加え、数分間容器を揉むことにより十分に混和したのち、室温にて固化させた。その後、３５℃、２４時間静置した後に培地の様子を観察した。

（３）結果
図２に示すように、比較例１の組成物を用いて作製した培地では、炭酸ガスと思われる無数の気泡が発生し、培地が白く濁ったように見えた。
一方、図３に示すように、実施例１の組成物を用いて作製した培地では、炭酸ガスと思われる気泡の発生が抑制され、微生物数計測の際の視認性が向上した。なお、実施例１の組成物を用いた場合であっても、比較例１とゲル化速度は変わらなかった。

本発明によれば、炭酸イオンや重炭酸イオンを含有する検体であっても、該検体中の微生物数を、簡便かつ正確に計測することが可能になる。特に大容量の検体中に存在する少量の微生物数であっても、定量的な検出を実現することができるため、透析液の高い検体に対しても、その中に存在する微量な微生物の数を漏らさずに高い視認性で計測することができるため有用である。

Claims (8)

1. （ａ）ポリアクリル酸及び／又はその塩、（ｂ）アルカリ土類金属の水酸化物、並びに（ｃ）栄養成分を含有する、微生物数計測用培地を調製するための組成物。
2. さらに（ｄ）呈色試薬を含有する、請求項１に記載の組成物。
3. 前記（ｂ）アルカリ土類金属の水酸化物が、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、水酸化バリウム、水酸化ストロンチウム、水酸化ラジウム、及び水酸化ベリリウムからなる群から選択される、請求項１又は２に記載の組成物。
4. 請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物と、培養容器とを含む、微生物数計測用培養器材。
5. 請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物に検体を加えて混和する工程、
   前記検体に含まれる微生物を培養する工程、及び
   前記微生物のコロニー数を計測する工程を含む、微生物数の計測方法。
6. 前記検体が、０．００５ｍｏｌ／１００ｍＬ以上の炭酸イオン又は重炭酸塩イオンを含有する、請求項５に記載の計測方法。
7. 前記検体中の微生物数が、０．１ＣＦＵ／ｍＬ以下である、請求項５又は６に記載の計測方法。
8. 前記検体重量が、前記組成物中の前記（ａ）ポリアクリル酸及び／又はその塩の重量の１０〜１００００倍である、請求項５〜７のいずれか一項に記載の計測方法。