JP2019062787A - 微生物数の計測方法 - Google Patents

Abstract

【課題】培地中の微生物のコロニーの視認性を向上させ、該微生物数の定量的な計測を簡便かつ正確にできる方法を提供する。【解決手段】（ａ）加熱による溶解を経ずに、かつ冷却によらず、流動性のない透明なゲルを形成しうる高分子化合物、（ｂ）グアーガム、及び（ｃ）栄養成分を含有する、微生物数計測用培地を調製するための組成物に、検体を加えて混和する工程、前記検体に含まれる微生物を培養する工程、及び前記微生物のコロニー数を計測する工程を含む、微生物数の計測方法。【選択図】なし

Description

本発明は、検体中の微生物数を簡便に計測する方法に関する。

微生物数を計測する方法としては、混釈培養法や寒天平板塗抹法等が知られている。（非特許文献１）これらの方法において微生物を培養するのに用いる寒天培地は、栄養成分や選択成分と寒天を共に溶解し、固化させたものであり、培養・計測に先立って予め調製しておく必要がある。また、寒天平板塗抹法においては、検体を平板培地に適用するに際して、培地に検体を完全に吸収させながら塗布させるため、操作に時間を要するという問題もあった。

近年、微生物の検出・計測をより簡便かつ効率的に行うため、培地を予め調製しておくことが不要な乾燥簡易培養器材が種々開発されている。かかる培養器材では、使用時に添加した液体検体の水分により培地を形成させて、そのまま培養に供することができる。
本発明者らもこれまでに、ポリアクリル酸ナトリウム等のゲル化剤を用いる培地による方法を提案した（特願２０１６−１８９５４５、特願２０１６−２２９７５３）。すなわち、ゲル化剤に液体検体をそのまま培地を構成する溶媒として添加することによって操作を簡便にすること、そして該培地中で検体中の微生物を培養することによってコロニーを出現させて可視化する方法である。これらの方法は、存在する微生物数が非常に少ない検体に対しても簡便かつ正確な計測を可能にしたり、小型化した培養容器により操作性と簡便さを向上させるものである。

第２版 微生物学実習提要 ５９ページ ４．３菌量の測定と培養法 東京大学医科学研究所学友会編 丸善株式会社

しかしながら、前記方法において、ポリアクリル酸ナトリウム等のゲル化剤が水分で膨潤して形成されたゲルの内部には、自由水が生じ、微生物のコロニーがゲル全体に拡散してしまうために定量的な計測が困難になる場合がある。
かかる状況において、本発明は、培地中の微生物のコロニーの視認性を向上させ、該微生物数の定量的な計測を簡便かつ正確にできる方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意研究の末、ポリアクリル酸ナトリウム等のゲル化剤を含む培地の成分として、グアーガムを併用すると、培地中の微生物のコロニーの視認性が向上し、微生物数計測における定量性が確保できることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］（ａ）加熱による溶解を経ずに、かつ冷却によらず、流動性のない透明なゲルを形成しうる高分子化合物、（ｂ）グアーガム、及び（ｃ）栄養成分を含有する、微生物数計測用培地を調製するための組成物。
［２］前記（ａ）高分子化合物が、自重の１０倍以上抱水できるものである、［１］に記載の組成物。
［３］前記高分子化合物が、アクリル酸をモノマー単位として有するものである、［１］又は［２］に記載の組成物。
［４］前記高分子化合物が、ポリアクリル酸及び／又はその塩である、［３］に記載の組成物。
［５］さらに（ｄ）呈色試薬を含有する、［１］〜［４］のいずれかに記載の組成物。
［６］［１］〜［５］のいずれかに記載の組成物と、培養容器とを含む、微生物数計測用培養器材。
［７］前記培養容器が、上部材と、凹部を有する下部材とを含む、［６］に記載の培養器材。
［８］前記上部材が、前記下部材の凹部と、前記組成物を介して互いに嵌合しうる形状である凸部を有する、［７］に記載の培養器材。
［９］前記組成物が、前記上部材の凸部及び／又は前記下部材の凹部の少なくとも一部に塗着している、［８］に記載の培養器材。
［１０］前記上部材及び／又は前記下部材が透明である、［７］〜［９］のいずれか一項に記載の培養器材。
［１１］［１］〜［５］のいずれかに記載の組成物に検体を加える工程、前記検体に含まれる微生物を培養する工程、及び前記微生物のコロニー数を計測する工程を含む、微生物数の計測方法。
［１２］前記検体中の微生物数が、０．１ＣＦＵ／ｍＬ以下である、［１１］に記載の方法。
［１３］前記検体重量が、前記組成物中の前記高分子化合物の重量の１０〜１００００倍である、［１１］又は［１２］に記載の方法。

本発明によれば、検体中の微生物数を、簡便かつ正確に計測することが可能になる。特に大容量の検体中に存在する少量の微生物数であっても、定量的な検出を実現することができる。また、特定の培養容器を用いる態様とすれば、小容量の検体を用いて、高い操作性と正確性で計測することができる。

本発明に係る培養器材の一態様を表す図。（イ）は上部材と下部材とが重っていない状態の培養器材の正投影図を、（ロ）は（イ）の線ＡＡ’での断面図の一例を、（ロ’）は（イ）の線ＡＡ’での断面図の別の一例を、（ハ）は（イ）の線ＢＢ’での断面図の一例を、（ハ’）は（イ）の線ＢＢ’での断面図の別の一例をそれぞれ表す。 本発明に係る培養容器の一態様を表す図。（イ）は上部材と下部材とが嵌合していない状態の培養容器の正投影図を、（ロ）は（イ）の線ＡＡ’での断面図の一例を、（ロ’）は（イ）の線ＡＡ’での断面図の別の一例を、（ハ）は（イ）の線ＢＢ’での断面図の一例を、（ハ’）は（イ）の線ＢＢ’での断面図の別の一例をそれぞれ表す。 本発明に係る培養容器の一態様を表す図。（イ）は上部材と下部材とが嵌合した状態の培養容器の正投影図を、（ロ）は（イ）の線ＣＣ’での断面図の一例を、（ハ）は（イ）の線ＣＣ’での断面図の別の一例をそれぞれ表す。 本発明に係る培養容器の使用態様例を示す斜投影図。 比較例１のゲル状培地１００ｍＬ中のコロニーの写真。 実施例１のゲル状培地１００ｍＬ中のコロニーの写真。

本発明の組成物は、（ａ）加熱による溶解を経ずに、かつ冷却によらず、流動性のない透明なゲルを形成しうる高分子化合物、（ｂ）グアーガム、及び（ｃ）栄養成分を必須に含有する。
本発明の組成物は、微生物数計測用培地を調製するためのものである。前記調製は、通
常、計測対象の微生物を含む液体検体をそのまま培地を構成するゲルの溶媒として添加することにより行われる。

ここで、（ａ）加熱による溶解を経ずに、かつ冷却によらず、流動性のない透明なゲルを形成しうる高分子化合物は、固化培地を構成するゲル化剤の役割を担う。
（ａ）高分子化合物としては、自重の好ましくは１０倍以上、より好ましくは２０倍以上、さらに好ましくは３０倍以上、抱水できるものが適する。かかる抱水により、培地の調製に適したゲルが形成され得る。

形成されるゲルに流動性がないことにより、微生物の存在数を正確に計測することができる。また、該ゲルからは離水が生じないことが好ましい。離水が生じると、微生物のコロニーの存在を定性的には検出することはできるが、その存在数を正確に計測することが難しくなる場合がある。ここで、離水とはゲルが抱えていた水が該ゲルから分離することをいう。また、「離水が生じない」とは、具体的には例えば、室温で６０分間静置した後に、ゲルから分離する水が当初抱水量の好ましくは０．５重量％以下、より好ましくは０．１重量％以下であることをいう。

また、形成されるゲルが透明であることにより、微生物のコロニーを培養器材を分解することなく外部から正確に検出することができる。なお、ここで透明とは、形成されるゲルが流動しない濃度で蒸留水に高分子化合物を添加した場合に、分光光度計測定（光路長１ｃｍ）した可視光透過率が、７０％以上（蒸留水の同透過率を１００％とする）であることが好ましいが、これに限定されない。

また、前記高分子化合物は、加熱による溶解を経ずに、また冷却によらず、ゲルを形成しうるものであるため、操作を簡便にし、また対象微生物の生育を妨げない。なお、本明細書において加熱とは、室温から上昇させることをいい、具体的には微生物が生存不能となる例えば６０℃を超える温度にまで上昇させることをいう。また、冷却とは、高分子化合物を液体検体に溶解した時の温度から降下させることをいう。また、本明細書において室温とは、通常は１〜４０℃、好ましくは１〜３０℃、さらに好ましくは２０〜３０℃をいう。

そのような高分子化合物としては、アクリル酸をモノマー単位として有するものが好ましく挙げられ、アクリル酸をモノマー単位として有していればホモポリマーに限らずコポリマーでもよく、また架橋ポリマーであってもよい。
具体的には、ポリアクリル酸及び／又はその塩、並びにそれらの誘導体（以下、「ポリアクリル酸類」とも記す）から選択される一以上が好ましい。

ポリアクリル酸類により形成されるゲルは流動性がなく、また離水が生じにくいため、微生物の存在数を定量的に正確に計測することができる。
また、形成されるゲルが透明であることにより、微生物のコロニーを、培養器材を分解することなく外部から正確に検出することができる。
また、ポリアクリル酸類は、加熱による溶解を経ずに、また冷却によらず、ゲルを形成させることができるため、培地形成操作が簡便であり、また対象微生物の生育を妨げない。
ポリアクリル酸類としては、廉価で入手しやすい点及びゲル形成の簡便さから、特にポリアクリル酸ナトリウムが好適である。

一般に、微生物用培地等に主成分として用いるゲル化剤としては、寒天、カラギーナン、ローカストビーンガム等が用いられるが、これらは液体検体を固化させる際に加熱が必要であるため、微生物を含む液体検体をそのまま固化させるのには適さない。また、前記
ゲル化剤を用いて固化させたゲルは透明性が低い点も適さない。
また、ポリビニルアルコールは、液体検体と均一に混和させるのが難しいうえ、離水しやすいという問題がある。また、キサンタンガムも、液体検体と均一に混和させるのが難しくダマになりやすいうえ、固化させたゲルが不透明になりやすい。
カルボキシメチルセルロースは、液体検体を固化することができず、流動性のあるゲルとなるため、微生物の定量的な検出に適さない。

（ａ）高分子化合物として、ポリアクリル酸ナトリウムを用いる場合は、固化能の観点から、重合度１０，０００以上のものが好ましく、重合度２２，０００以上のものがより好ましい。また、架橋されていてもされていなくてもよい。

本発明におけるポリアクリル酸ナトリウムの使用時の濃度は、特に限定されないが、例えば０．０１〜１０ｇ／１００ｍＬが好ましく、０．５〜５ｇ／１００ｍＬがより好ましい。
また、他の（ａ）高分子化合物を用いる場合は、本発明の効果を阻害しない限りにおいて、使用時の濃度は固形ゲルが形成される範囲とすればよい。

（ｂ）グアーガムは水溶性であり水を含むことにより粘度が高くなることから、前記（ａ）高分子化合物により形成されたゲル内の自由水の移動を抑制することができる。
なお、これを添加した場合でも、ポリアクリル酸等のゲルの透明性やゲル化、微生物の生育、あるいは呈色試薬による反応は妨げられない。

本発明における（ｂ）グアーガムの使用時の濃度は、特に限定されないが、好ましくは、質量比として（ａ）高分子化合物の１／２００〜１倍量であることが好ましく、１／４０〜１／２倍量であることがより好ましい。例えば、（ａ）高分子化合物として、ポリアクリル酸ナトリウムを使用時濃度として１〜２ｇ／１００ｍＬ用いる場合は、（ｂ）グアーガムの使用時の濃度は０．０１〜１．０ｇ／１００ｍＬが好ましく、０．０５〜０．５ｇ／１００ｍＬがより好ましい。このような量とすることで、培地のゲル化を妨げず、またグアーガムの不溶塊（いわゆるダマ）が生じることもなく、計測に好適な培地が形成される。

（ｃ）栄養成分は、対象微生物を発育させるためものである。
栄養成分としては、特に限定されないが、ペプトン、獣肉エキス、酵母エキス、魚肉エキス等を好ましく挙げられる。
水道水等における微生物検出に関する上水試験では標準寒天培地、製薬用水や透析水の試験ではＲ２Ａ寒天培地を用いることが推奨されている（第１７改正 日本薬局方 参考資料Ｇ８水関連）。そのため、これら寒天培地の寒天を排除したブイヨン培地かそれと同等の成分を、本発明の組成物の含有成分とすることが好ましい。

本発明の組成物は、さらに（ｄ）呈色試薬を含有することが好ましい。これは、培養によって生じた微生物のコロニーを有色のものとしてより検出・計測しやすくするためである。
呈色試薬としては、例えば、２,３,５−トリフェニルテトラゾリウムクロライド（ＴＴＣ）やテトラゾリウムバイオレット等をはじめとする酸化還元指示薬が挙げられる。これは、検体中に存在する全ての種類の微生物を計測したい場合に好ましく用いることができる。ＴＴＣを用いる場合は使用時の濃度として１ｍｇ〜１００ｍｇ／Ｌが好ましく、１０〜５０ｍｇ／Ｌがより好ましい。

また、呈色試薬としては、特定の微生物種のみが保有する酵素に対する基質（以下、酵素基質という）であって、分解されることにより色素化合物を遊離し得る化合物を用いて
もよい。これは、該特定の微生物を計測したい場合に好ましく用いることができる。
ここで色素化合物とは、可視光下で有色のもの及び蛍光発色するものの何れでもよい。可視光下で有色の化合物として遊離され得る官能基としては、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル基等が挙げられ、遊離した５−ブロモ−４−クロロ−３−インドールは酸化縮合して５，５’−ジブロモ−４，４’−ジクロロ−インディゴとなり、青色を呈する。蛍光発色する化合物として遊離され得る官能基としては、４−メチルウンベリフェリル基等が挙げられ、遊離した４−メチルウンベリフェロンは紫外線照射下で蛍光を発する。

酵素基質の例を挙げると、対象微生物が大腸菌群の場合は、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ＧＡＬ）や５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−グルクロン酸等を、黄色ブドウ球菌の場合は、リン酸５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル（Ｘ−ｐｈｏｓ）等を、腸球菌等の場合は、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−グルコピラノシド（Ｘ−ＧＬＵＣ）等を、真菌の場合は、Ｘ−ｐｈｏｓ、酢酸５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルや酪酸５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル等を、それぞれ好ましく用いることができる。さらに、全ての微生物種を検出したい場合には、これら全てを組み合わせて使用してもよい。
これらの酵素基質の使用時の濃度は、例えば、０．０１〜１．０ｇ／Ｌが好ましく、０．２〜１．０ｇ／Ｌがより好ましい。

本発明の組成物は、本発明の効果を妨げない限りにおいて、さらに、選択物質、抗菌性物質、無機塩類、糖類、増粘剤、ｐＨ調整剤、等を任意に含有してもよい。
選択物質としては、例えば、ポリミキシンＢやバンコマイシンなどの抗生物質や、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、Ｔｗｅｅｎ８０、コール酸ナトリウム等の胆汁酸塩等の界面活性剤が挙げられる。
抗菌性物質としては、例えば、ポリリジン、プロタミン硫酸塩、グリシン、ソルビン酸等が挙げられる。
無機塩類としては、例えば、塩化ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム等の無機酸金属塩、ピルビン酸ナトリウム、クエン酸鉄アンモニウム、クエン酸ナトリウム等の有機酸金属塩が挙げられる。
糖類としては、例えば、グルコース、ラクトース、スクロース、キシロース、セロビオース、マルトースが挙げられる。
増粘剤としては、例えば、デンプン及びその誘導体、ヒアルロン酸、アクリル酸誘導体、ポリエーテル、コラーゲン等が挙げられる。
ｐＨ調整剤としては、例えば、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、クエン酸等が挙げられる。なお、本発明の組成物は、対象微生物の生育の観点から、使用時のｐＨが好ましくは６．０〜８．０に、より好ましくは６．５〜７．５になるような組成である。

本発明の組成物は、培養容器と組み合わせて、微生物数計測用培養器材として提供されてもよい。
かかる培養器材に含まれる培養容器は、液体検体を、通常は濃縮や希釈等の処理をすることなく、そのまま収容し、その中で本発明の組成物と混和して、前記組成物が含有する高分子化合物をゲル化させて培地を形成し、微生物を培養するためのものである。

培養容器の形態は特に限定されず、必要量の液体検体を十分に収容できるものであればよい。例えば、本発明の組成物と液体検体とを振とうにより混和させるのには、円筒形等の形状で、変形しにくい材料の容器が好ましい。また、例えば本発明の組成物と液体検体とを容器ごと揉んだり押圧したりして混和させるのには、変形しやすい、柔軟性のある材料の容器が好ましい。例えば、ポリビニル系やポリエチレン系ポリマー等の袋状容器が好
ましく挙げられ、蓋やジッパー等の封入具があればより好ましい。また、培養容器は透明であることが、微生物のコロニーを容器外から計測しやすいことから、好ましい。なお、ここで透明とは、目視により容器の反対側を透視できる程度でよく、より具体的には可視光透過率が７０％以上であることが好ましいが、これに限定されない。
これらの収容可能用量としては、特に限定されないが、１００〜１０００ｍＬが好ましく挙げられ、少量の微生物を含む大容量の検体に適用するのに適する。

従来の培養器材では予め形成されている培地に検体を接触させて培養及び計測を行うものであったのに対し、本発明の微生物数計測用培養器材においては、培養容器内で液体検体そのものを溶媒として前記高分子化合物をゲル化させ、検体中の微生物がゲル内部で培養され計測に供されるという使用態様に好適である点で異なる。

また、培養容器を平板（シート）状としてもよく、かかる態様において好ましくは培養容器は小型である。
例えば、一般的なシャーレや、凹型の皿状シートと平型又は凸型のシートとを重ねた収容容器の形態が挙げられる。平板状の形態とすることで、微生物のコロニーがより計測しやすくなる。また、小型化することにより、例えば１ｍＬ程度の少量の検体を用いて検出を行うのに適し、一度に複数の検体を並行して処理しやすくなる。
このような小型の平板状の培養容器の場合は、希釈した検体にも使用が可能となるため、検体中の微生物数が、例えば３００ＣＦＵ／ｍＬ以下である場合にも好適となる。

平板状の培養容器の一態様について、図面を参照して説明する。
かかる培養容器は、上部材（３０）、及び凹部を有する下部材（１０）、を含む（図１）。通常、上部材（３０）を下部材（１０）の凹部を覆うように被せて使用される。被せた状態において、上部材と下部材の凹部との間に適当な空間が存し、ここに本発明の培地調製用の組成物（２０）が含まれた態様が本発明の培養器材（１）になる。かかる状態において、上部材と下部材の凹部の底面及び側面とで囲まれる空間が、該組成物及び検体とで形成される培地が存在する空間（以下、「培地領域」とも記す）となる。

好ましい態様では、上部材（３０）は、下部材（１０）の凹部と、培地調製用の組成物（２０）を介して互いに嵌合しうる形状である凸部を有する（図２）。この態様においては、例えば図３に示すように、円柱状の上部材の凸部が、それよりやや大きい直径の円柱状の下部材の凹部に嵌合する。嵌合した状態において、上部材の凸部の上面と下部材の凹部の底面とは、完全に密着する必要はなく、上部材の凸部と下部材の凹部との間に適当な空間が存し、ここに本発明の培地調製用の組成物が含まれた態様が本発明の培養器材（１）になる。嵌合した状態において、上部材の凸部の上面と下部材の凹部の底面及び側面とで囲まれる空間が、培地領域となる。

培地領域の容積は、計測対象とする検体の種類や検査の規模によって任意に設計することができるが、例えば、１ｍＬ程度の容積として、培養容器を小型化することが好ましい。また、上部材を下部材に被せたときに、押圧等により検体を培地領域全体に広げることができるように、検体量に比して培地領域が大きくなりすぎないよう（下部材の凹部の深さが大きくなりすぎないよう）に設計することが好ましい。また、上部材が凸部を有する場合は、凸部が、嵌合により検体を培地領域全体に押し広げることができるように、検体量に比して培地領域が大きくなりすぎないよう（上部材の凸部の高さが小さくなりすぎないよう）に設計することが好ましい。
一方で、コロニーが上下方向に重なると正確な観察・計測がしづらくなるため、検体量に比して培地領域が小さくなりすぎないよう（培地領域の厚さが大きくなりすぎないような凹部の底面積）に設計することが好ましい。
培地領域の厚さは、例えば０．１〜１．０ｍｍとすることが好ましいが、これに限定さ
れない。
上部材の凸部及び下部材の凹部は、嵌合しうる形状であれば任意の形状でよい。また、上部材の凸部の上面及び下部材の凹部の底面は、平面でも曲面でもよいが、操作性の観点から平面が好ましい。

本発明に係る培地調製用の組成物は、上部材の、下部材に被せたときに下部材の凹部と向かい合う部分、すなわち培地領域を形成する部分及び／又は下部材の凹部の少なくとも一部に塗着していることが好ましい。上部材が凸部を有する態様においては、培地調製用の組成物は、上部材の凸部及び／又は下部材の凹部の少なくとも一部に塗着していることが好ましい。該塗着部位は、通常、上部材と下部材とが嵌合したときに培地領域に面する部分であり、上部材の凸部の上面及び／又は下部材の凹部の底面の少なくとも一部が好ましく、全部がより好ましい。本発明の好ましい態様において、培地調製用の組成物は、下部材の凹部の底面全体に塗着している。

本態様において、上部材及び／又は下部材の材料は特に限定されず、ポリアクリル系、ポリビニル系、ポリエチレン系、ポリエステル系のポリマー等を採用できる。また、材料の剛性は特に問わないが、上部材が凸部を有しない場合は液体試料添加後の押圧が容易になるように、適度に変形可能な剛性であることが好ましい。

本態様において、上部材及び／又は下部材は透明であることが好ましく、上部材及び下部材が透明であることがより好ましい。これにより、計測対象の微生物のコロニーを、培養容器を分解することなく、外部から容易に観察・計測することができる。
なお、ここで透明とは、目視により部材の反対側を透視できる程度でよく、より具体的には可視光透過率が７０％以上であることが好ましいが、これに限定されない。

本態様の培養容器において、上部材と下部材とは、別個に分離していてもよいし、一体となっていてもよい。
例えば、上部材の一部と下部材の一部とが、図４に示すように一辺を共有する等して、連続していてもよい。このような態様の場合、培養容器を折り曲げて、上部材と下部材とを重ね合わせて、上部材を下部材に被せることにより、好ましくは上部材の凸部と下部材の凹部とを嵌合させることにより、使用することが可能となる。
また、本態様の培養容器において、上部材及び下部材は、それぞれ複数の凸部及び凹部を有していてもよい。すなわち、使用時に複数の培地領域が形成される態様であってもよく、一度に複数の検体を並行して処理するのに適する。

本態様の培養器材は、任意の方法で製造することができるが、一例を説明する。
適当な大きさのアクリル板等用いて、上部材及び下部材とする。上部材の凸部及び下部材の凹部は、アクリル板の接着やくり抜き、又は金型等を用いた押圧や射出による成型などにより、作製すればよい。
本発明の培地調製用の組成物は、非水系溶媒に溶解又は懸濁させたものを、上部材の凸部及び／又は下部材の凹部の一部又は全体に塗布した後、乾燥することにより、培養器材に塗着させることができる。
ここで、非水系溶媒は、常温常圧下で揮発し得るものがよく、例えば、エタノール、メタノール、プロパノール、ブタノール等の低級アルコールを好ましく挙げられる。これらの非水系溶媒を用いれば、製造時に（ａ）高分子化合物をゲル化させることなく培地調製用の組成物を塗着させることができるので、容易に培養器材を製造することができる。

本発明の微生物数計測用培地を調製するための組成物及びこれを含む培養器材は、本発明の計測方法に好適に用いることができる。
本発明の計測方法は、本発明の組成物に検体を加える工程、前記検体に含まれる微生物
を培養する工程、及び前記微生物のコロニー数を計測する工程を含む。
本発明の組成物とこれに加えた液体検体とは、通常は混和させる。混和は、任意の方法で行うことができ、例えば容器ごと振とうしたり揉んだり、又は滅菌した器具でかき混ぜればよい。
微生物の培養条件は、特に限定されないが、対象微生物の種類により適正に選ばれるが、例えば３５±２℃で２４〜４８時間が好ましい。
培養後の培地中には、対象微生物の生育コロニーが出現し、目視等で確認することができ、正確に数を計測することができる。

本発明の計測方法は、微生物の存在量が少ない、すなわち清浄度の高い検体に好適に用いることができる。例えば、検体中の微生物数が、通常の１ｍＬの検査では検出できない０．１ＣＦＵ／ｍＬ以下である場合に好適である。
一般に、微生物の存在量が多い検体であれば、検出方法に適するように適当に希釈して計測することができるが、存在量が少ない場合は濃縮が繁雑であったり困難であったりする。本発明の計測方法は、そのような場合でも、簡便かつ正確に微生物数を検出できる点で有用である。

また、本発明の計測方法は、量の多い液体検体であっても、前処理することなくそのまま計測に供することができる点でも有用である。例えば、検体重量が、本発明の組成物中の前記（ａ）高分子化合物の抱水能に応じた大量の、例えばポリアクリル酸ナトリウムである場合はその重量の１０〜１００００倍である場合に好適である。あるいは、大量の、例えば１００ｍＬ以上の検体の場合に好適である。

また、本発明の組成物を、上記説明した平板状の培養容器に含まれた態様で微生物数の計測に用いる場合は、以下のように行えばよい。
すなわち、下部材の凹部に検体を添加する工程、上部材を下部材の凹部に被せる工程、前記検体に含まれる微生物を培養する工程、及び前記微生物のコロニー数を計測する工程により実施できる。上部材を下部材に被せる工程において、より好ましくは凹部を器材外から押圧する。これにより、下部材の凹部に添加された検体を培地領域全体に均一に押し広げられる。また、検体の水分により、培地調製用の組成物中の（ａ）高分子化合物がより速やかにゲル化して、培地が容易に形成される。
また、上部材が、下部材の凹部と培地調製用の組成物を介して互いに嵌合しうる形状である凸部を有する培養器材を用いる場合は、培養器材の下部材の凹部に検体を添加する工程、上部材の凸部を下部材の凹部に嵌合する工程、前記検体に含まれる微生物を培養する工程、及び前記微生物のコロニー数を計測する工程を含むことが好ましい。
上部材の凸部を下部材の凹部に嵌合することにより、下部材の凹部に添加された検体が培地領域全体に均一に押し広げられる。また、検体の水分により、培地調製用の組成物中の（ａ）高分子化合物がより速やかにゲル化して、培地が容易に形成される。

本発明の計測方法を適用しうる検体としては、特に限定されないが、飲料水、清涼飲料水、工業用水、製薬用水、透析水、尿等の液体検体等が好ましく挙げられる。また、これらの検体を予めトリプトソイブイヨン等で培養した培養液であってもよい。

次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

（１）微生物計測用培地を調製するための組成物の作製
表１に示す組成の原料を、容積１００ｍＬの無色透明プラスチック製スパウトバッグ容器内で混合して、比較例１の組成物を作製した。
また、表１に示す組成の原料に、グアーガム０．２ｇ／１００ｍＬも加えて同様に実施例１の組成物を作製した。
また、表１に示す組成の原料に、キサンタンガム０．２ｇ／１００ｍＬも加えて同様に比較例２の組成物を作製した。

（２）菌株の供試
Escherichia coli NBRC102203を供試菌株として使用した。該菌株をトリプトソイ寒天培地で２４時間、前培養し、滅菌綿棒を用いて、マクファーランド比濁＃１相当（約３．０×１０^８ＣＦＵ／ｍＬ）になるように滅菌生理食塩水に懸濁し、菌原液とした。菌原液は１０^−８まで、滅菌生理食塩水にて１０倍段階希釈を繰り返し、数ＣＦＵ／ｍＬの菌希釈液を作製し、該菌希釈液１ｍＬを９９ｍＬの滅菌水に加え１００ｍＬ中に数ＣＦＵしか微生物が存在しない試料液を作製した。該試料液を実施例１及び比較例１〜２の組成物が格納されたバッグにそれぞれ１００ｍＬずつ加え、数分間容器ごと揉んでよく混和し固化させた。ゲル化後に３５℃、２４時間培養し、発育の有無を確認した。

（３）結果
比較例１の組成物を用いた場合は、溶解性もゲル化速度も良好で、透明性を有するゲルが形成されたが、ポリアクリル酸ナトリウムゲル中の自由水の存在により培養２４時間後にはコロニーが培地全体に拡散して、計測が不可能であった（図５参照）。
一方、実施例１の組成物を用いた場合は、溶解性もゲル化速度も良好で、透明性を有するゲルが形成され、またポリアクリル酸ナトリウムゲル中の自由水が固定されることから、培養２４時間後であってもコロニーは培地全体に拡散せず、正確な計測が可能であった（図６参照）。
また、比較例２の組成物を用いた場合は、液体検体を添加した際に組成物が完全に溶解せず、ダマが発生して濁ったゲルとなった。さらに、培養２４時間後にコロニーが培地全体に拡散して、計測が不可能であった。

本発明によれば、該検体中の微生物数を、高い視認性で簡便かつ正確に計測することが可能になるため有用である。

１：培養器材
１０：下部材
２０：微生物数計測用培地を調製するための組成物
３０：上部材

Claims (13)

1. （ａ）加熱による溶解を経ずに、かつ冷却によらず、流動性のない透明なゲルを形成しうる高分子化合物、（ｂ）グアーガム、及び（ｃ）栄養成分を含有する、微生物数計測用培地を調製するための組成物。
2. 前記（ａ）高分子化合物が、自重の１０倍以上抱水できるものである、請求項１に記載の組成物。
3. 前記高分子化合物が、アクリル酸をモノマー単位として有するものである、請求項１又は２に記載の組成物。
4. 前記高分子化合物が、ポリアクリル酸及び／又はその塩である、請求項３に記載の組成物。
5. さらに（ｄ）呈色試薬を含有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
6. 請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物と、培養容器とを含む、微生物数計測用培養器材。
7. 前記培養容器が、上部材と、凹部を有する下部材とを含む、請求項６に記載の培養器材。
8. 前記上部材が、前記下部材の凹部と、前記組成物を介して互いに嵌合しうる形状である凸部を有する、請求項７に記載の培養器材。
9. 前記組成物が、前記上部材の凸部及び／又は前記下部材の凹部の少なくとも一部に塗着している、請求項８に記載の培養器材。
10. 前記上部材及び／又は前記下部材が透明である、請求項７〜９のいずれか一項に記載の培養器材。
11. 請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物に検体を加える工程、
    前記検体に含まれる微生物を培養する工程、及び
    前記微生物のコロニー数を計測する工程を含む、微生物数の計測方法。
12. 前記検体中の微生物数が、０．１ＣＦＵ／ｍＬ以下である、請求項１１に記載の方法。
13. 前記検体重量が、前記組成物中の前記高分子化合物の重量の１０〜１００００倍である、請求項１１又は１２に記載の方法。