JP2019519214A - 微生物の培養器材およびそれを用いる微生物数の計測方法 - Google Patents

Abstract

操作性が高くかつ簡単に製造することができ、さらに、検体中の微生物数を容易に計測することができる培養器材を提供する。（ａ）上部材、（ｂ）凹部を有する下部材、及び（ｃ）培地成分を有し、（ｃ）培地成分は、（ｃ１）ポリアクリル酸及び／又はその塩、並びにそれらの誘導体から選択される一以上と、（ｃ２）栄養成分とを含有する、微生物の培養器材。好ましくは、（ａ）上部材が、（ｂ）下部材の凹部と（ｃ）培地成分を介して互いに嵌合しうる形状である凸部を有する。

Description

本発明は、検体中の微生物数を簡便に計測するための培養器材に関する。

微生物数を計測する方法としては、混釈培養法や寒天平板塗抹法等が知られている（非特許文献１）。
これらの方法において微生物を培養するのに用いる寒天培地は、栄養成分や選択成分を寒天と共に溶解した培地を固化させたものであり、培養・計測に先立って予め調製しておく必要がある。また、寒天平板塗抹法においては、検体を平板培地に適用するに際して、培地に検体を完全に吸収させながら塗布させるため、操作に時間を要するという問題もある。

近年、微生物の検出・計測をより簡便かつ効率的に行うため、培地を予め調製しておくことが不要な乾燥簡易培養器材が種々開発されている。かかる培養器材では、使用時に液体検体を添加すると、その水分により培地を形成させてそのまま培養に供することができる。
例えば、特許文献１には、防水性基体の上面部に、接着剤層、栄養成分を含む冷水可溶性ゲル化剤粉末層、およびカバーシートを備えるシート状培養装置が開示されている。特許文献２には、防水性基材の上面に水溶性ゲル化剤とメッシュを有する繊維質吸水性シートとを具備する簡易培地が開示されている。特許文献３には、防水性基材の上面に、吸水性ポリマー層、多孔質マトリックス層を順次積層した、シート状培養器材が開示されている。特許文献４には、基材シート上に検体が広がる枠を設け、その枠内に接着成分、ゲル化剤を含む培地液をパターン形成した、シート状培養器材が開示されている。かかる枠は、接触角を特定の値に設定した疎水性樹脂からなり、試料液は枠内にだけ広がる。

特公平２−４９７０５号公報 特開２０００−３２５０７２号公報 ＷＯ９７／２４４３２パンフレット 特開２０１５−２０４８４５号公報

第２版 微生物学実習提要 ５９ページ ４．３菌量の測定と培養法 東京大学医科学研究所学友会編 丸善株式会社

特許文献１記載の培養器材では、防水性基体と上面フィルムの間に検体を適用し、上面フィルムの上からスプレッダーという器具で押さえつけて試料液を所定の面積に広げる操作を行うものである。この操作は平らな面を必要とし、かつ慎重に行わないと、試料が均一に広がるどころか、周囲へ流出する恐れがあり、操作性に難がある。
特許文献２および３記載の培養器材には、不織布をはじめとする多孔質マトリックスが用いられているため、添加された液体検体は毛細管現象により拡散し、均一に器材全体に広がるため、操作性は高い。しかし、多孔質マトリックスを用いる都合上、その製造の際に、溶媒の乾燥状態を制御する困難さがあったり（特許文献２）、多孔質マトリックス層と培地層とを積層する手順が繁雑であったり（特許文献３）する。また、多孔質マトリッ
クスの表面の凹凸により培地表面に生じる乱反射や、多孔質マトリックス自体の不透明さによって、培養後のコロニーが見にくくなる難点もある。
特許文献４記載の培養器材は多孔質マトリックスを用いていないが、液体検体が広がる際の土手となる枠から検体がこぼれないように、操作の際に平らな場所を要したり慎重性が求められたりする。また、該枠は、特定の接触角に設定した材料で形成されているが、検体の種類によっては、例えば油分やタンパク質等を含む飲食品等を検体とする場合には、枠の撥水性が変わることが想定され、培養器材としての汎用性に問題があるともいえる。

このような状況を鑑みて、操作性が高く、かつ簡単に製造することができ、さらに、検体中の微生物数を容易に計測することができる、微生物の培養器材を提供することを目的とする。

本発明者は、上記課題を解決するべく鋭意研究の末、凹部を有する皿状部材と凸部を有する蓋部材とを嵌合した際に囲まれる空間に、培地成分を設ければ、検体の適用時に器具や毛細管現象等を利用せずとも均一に拡散させることができ、かつごく短時間で培地形成が可能となるため、簡便な操作で微生物の培養及び計測を実現できることに想到した。そして、培地を形成するゲル化剤として、ポリアクリル酸及び／又はその塩が、操作の簡便性や外部からの視認性の高さの観点から好適であることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］（ａ）上部材、（ｂ）凹部を有する下部材、及び（ｃ）培地成分を有し、
（ｃ）培地成分は、（ｃ１）加熱による溶解を経ずに、かつ冷却によらず、流動性のない透明なゲルを形成しうる高分子化合物と、（ｃ２）栄養成分とを含有する、微生物の培養器材。
［２］前記（ｃ１）高分子化合物が、自重の１０倍以上抱水できるものである、［１］に記載の培養器材。
［３］前記ゲルが離水を生じない、［１］又は［２］に記載の培養器材。
［４］前記（ｃ１）高分子化合物が、アクリル酸をモノマー単位として有するものである、［１］〜［３］のいずれかに記載の培養器材。
［５］前記（ｃ１）高分子化合物が、ポリアクリル酸及び／又はその塩、並びにそれらの誘導体から選択される一以上である、［４］に記載の培養器材。
［６］（ａ）上部材が、（ｂ）下部材の凹部と（ｃ）培地成分を介して互いに嵌合しうる形状である凸部を有する、［１］〜［５］のいずれかに記載の培養器材。
［７］（ｃ）培地成分は、（ａ）上部材の凸部及び／又は（ｂ）下部材の凹部の少なくとも一部に塗着している、［６］に記載の培養器材。
［８］（ａ）上部材及び／又は（ｂ）下部材が透明である、［１］〜［７］のいずれかに記載の培養器材。
［９］［１］〜［８］のいずれかに記載の培養器材を用いて、検体中の微生物を培養し、微生物数を計測する方法。
［１０］（ｂ）下部材の凹部に検体を添加する工程、
（ａ）上部材の凸部を（ｂ）下部材の凹部に嵌合する工程、
前記検体に含まれる微生物を培養する工程、及び
前記微生物のコロニー数を計測する工程を含む、［９］に記載の方法。
［１１］培養器材の（ａ）上部材が、（ｂ）下部材の凹部と（ｃ）培地成分を介して互いに嵌合しうる形状である凸部を有し、
（ｂ）下部材の凹部に検体を添加する工程、
（ａ）上部材の凸部を（ｂ）下部材の凹部に嵌合する工程、
前記検体に含まれる微生物を培養する工程、及び
前記微生物のコロニー数を計測する工程を含む、［９］に記載の方法。

なお、本明細書において検体とは、特に限定されないが、通常は、液体検体であり、具体的には飲料水、清涼飲料水、工業用水、製薬用水、透析水、尿等の水性の液体検体等である。
また、本明細書において微生物とは、通常は、大腸菌群、ブドウ球菌、ビブリオ属細菌、腸球菌、真菌、枯草菌などをいう。

本発明によれば、検体中の微生物を、簡便な操作で培養し、その数を容易に計測することができる。また、本発明の培養器材は、複雑な構成ではないため、製造も簡単である。

本発明の培養器材の一態様を表す図。（Ａ）は上部材と下部材とが重っていない状態の培養器材の正投影図を、（Ｂ）は（Ａ）の線ＡＡ’での断面図の一例を、（Ｂ’）は（Ａ）の線ＡＡ’での断面図の別の一例を、（Ｃ）は（Ａ）の線ＢＢ’での断面図の一例を、（Ｃ’）は（Ａ）の線ＢＢ’での断面図の別の一例をそれぞれ表す。 本発明の培養器材の一態様を表す図。（Ａ）は上部材と下部材とが嵌合していない状態の培養器材の正投影図を、（Ｂ）は（Ａ）の線ＡＡ’での断面図の一例を、（Ｂ’）は（Ａ）の線ＡＡ’での断面図の別の一例を、（Ｃ）は（Ａ）の線ＢＢ’での断面図の一例を、（Ｃ’）は（Ａ）の線ＢＢ’での断面図の別の一例をそれぞれ表す。 本発明の培養器材の一態様を表す図。（Ａ）は上部材と下部材とが嵌合した状態の培養器材の正投影図を、（Ｂ）は（Ａ）の線ＣＣ’での断面図の一例を、（Ｃ）は（Ａ）の線ＣＣ’での断面図の別の一例をそれぞれ表す。 本発明の培養器材の使用態様例を示す斜投影図。 実施例の培養器材で検出された赤色コロニーの写真。

本発明の培養器材を、図面を参照して説明する。
本発明の培養器材は、（ａ）上部材（３０）、（ｂ）凹部を有する下部材（１０）、及び（ｃ）培地成分（２０）を有する（図１）。通常、上部材（３０）を下部材（１０）の凹部を覆うように被せて使用される。被せた状態において、上部材と下部材の凹部との間に適当な空間が存し、培地成分が存在する。かかる状態において、上部材と下部材の凹部の底面及び側面とで囲まれる空間が、培地成分及び検体とで形成される培地が存在する空間（以下、「培地領域」とも記す）となる。

好ましい態様では、上部材（３０）は、下部材（１０）の凹部と、培地成分（２０）を介して互いに嵌合しうる形状である凸部を有する（図２）。この態様においては、例えば図３に示すように、円柱状の上部材の凸部が、それよりやや大きい直径の円柱状の下部材の凹部に嵌合する。嵌合した状態において、上部材の凸部の上面と下部材の凹部の底面とは、完全に密着する必要はなく、上部材の凸部と下部材の凹部との間に適当な空間が存し、培地成分が存在する。嵌合した状態において、上部材の凸部の上面と下部材の凹部の底面及び側面とで囲まれる空間が、培地領域となる。

培地領域の容積は、計測対象とする検体の種類や検査の規模によって任意に設計することができるが、例えば、１ｍＬ程度の容積として、培養器材を小型化することが好ましい。また、上部材を下部材に被せたときに、押圧等により検体を培地領域全体に広げることができるように、検体量に比して培地領域が大きくなりすぎないよう（下部材の凹部の深さが大きくなりすぎないよう）に設計することが好ましい。また、上部材が凸部を有する場合は、凸部が、嵌合により検体を培地領域全体に押し広げることができるように、検体
量に比して培地領域が大きくなりすぎないよう（上部材の凸部の高さが小さくなりすぎないよう）に設計することが好ましい。
一方で、コロニーが上下方向に重なると正確な観察・計測がしづらくなるため、検体量に比して培地領域が小さくなりすぎないよう（培地領域の厚さが大きくなりすぎないような凹部の底面積）に設計することが好ましい。
培地領域の厚さは、例えば０．１〜１．０ｍｍとすることが好ましいが、これに限定されない。
上部材の凸部及び下部材の凹部は、嵌合しうる形状であれば任意の形状でよい。また、上部材の凸部の上面及び下部材の凹部の底面は、平面でも曲面でもよいが、操作性の観点から平面が好ましい。

（ｃ）培地成分は、上部材の、下部材に被せたときに下部材の凹部と向かい合う部分、即ち培地領域を形成する部分及び／又は下部材の凹部の少なくとも一部に塗着していることが好ましい。上部材が凸部を有する態様においては、（ｃ）培地成分は、上部材の凸部及び／又は下部材の凹部の少なくとも一部に塗着していることが好ましい。該塗着部位は、通常、上部材と下部材とが嵌合したときに培地領域に面する部分であり、上部材の凸部の上面及び／又は下部材の凹部の底面の少なくとも一部が好ましく、全部がより好ましい。本発明の好ましい態様において、培地成分は、下部材の凹部の底面全体に塗着している。

本発明において、上部材及び／又は下部材の材料は特に限定されず、ポリアクリル系、ポリビニル系、ポリエチレン系、ポリエステル系のポリマー等を採用できる。また、材料の剛性は特に問わないが、上部材が凸部を有しない場合は液体試料添加後の押圧が容易になるように、適度に変形可能な剛性であることが好ましい。

本発明において、上部材及び／又は下部材は透明であることが好ましく、上部材及び下部材が透明であることがより好ましい。これにより、計測対象の微生物のコロニーを、培養器材を分解することなく、外部から容易に観察・計測することができる。
なお、ここで透明とは、目視により部材の反対側を透視できる程度でよく、より具体的には可視光透過率が７０％以上であることが好ましいが、これに限定されない。

本発明の培養器材において、上部材と下部材とは、別個に分離していてもよいし、一体となっていてもよい。
例えば、上部材の一部と下部材の一部とが、図４に示すように一辺を共有する等して、連続していてもよい。このような態様の場合、培養器材を折り曲げて、上部材と下部材とを重ね合わせて、上部材を下部材に被せることにより、好ましくは上部材の凸部と下部材の凹部とを嵌合させることにより、使用することが可能となる。
また、本発明の培養器材において、上部材及び下部材は、それぞれ複数の凸部及び凹部を有していてもよい。すなわち、使用時に複数の培地領域が形成される態様であってもよく、一度に複数の検体を並行して処理するのに適する。

本発明の培養器材における（ｃ）培地成分は、（ｃ１）加熱による溶解を経ずに、かつ冷却によらず、流動性のない透明なゲルを形成しうる高分子化合物と、（ｃ２）栄養成分とを含有する。
本発明において、（ｃ）培地成分は、微生物を培養するための培地を調製するためのものである。前記調製は、通常、計測対象の微生物を含む液体検体をそのまま培地を構成するゲルの溶媒として、培地成分に添加・浸透させることにより行われる。

ここで、（ｃ１）加熱による溶解を経ずに、かつ冷却によらず、流動性のない透明なゲルを形成しうる高分子化合物は、培地を構成するゲル化剤の役割を担う。
（ｃ１）高分子化合物としては、自重の好ましくは１０倍以上、より好ましくは２０倍以上、さらに好ましくは３０倍以上、抱水できるものが適する。かかる抱水により、培地の調製に適したゲルが形成され得る。

形成されるゲルに流動性がないことにより、微生物の存在数を正確に計測することができる。また、該ゲルからは離水が生じないことが好ましい。離水が生じると、微生物のコロニーの存在を定性的には検出することはできるが、その存在数を正確に計測することが難しくなる場合がある。ここで、離水とはゲルが抱えていた水が該ゲルから分離することをいう。また、「離水が生じない」とは、具体的には例えば、室温で６０分間静置した後に、ゲルから分離する水が当初抱水量の好ましくは０．５％以下、より好ましくは０．１％以下であることをいう。

また、形成されるゲルが透明であることにより、微生物のコロニーを培養器材を分解することなく外部から正確に検出することができる。なお、ここで透明とは、形成されるゲルが流動しない濃度で蒸留水に高分子化合物を添加した場合に、分光光度計測定（光路長１ｃｍ）した可視光透過率が、７０％以上（蒸留水の同透過率を１００％とする）であることが好ましいが、これに限定されない。

また、前記高分子化合物は、加熱による溶解を経ずに、また冷却によらず、ゲルを形成しうるものであるため、操作を簡便にし、また対象微生物の生育を妨げない。なお、本明細書において加熱とは、室温から上昇させることをいい、具体的には微生物が生存不能となる例えば６０℃を超える温度にまで上昇させることをいう。また、冷却とは、高分子化合物を液体検体に溶解した時の温度から降下させることをいう。また、本明細書において室温とは、通常は１〜４０℃、好ましくは１〜３０℃、さらに好ましくは２０〜３０℃をいう。

そのような高分子化合物としては、アクリル酸をモノマー単位として有するものが好ましく挙げられ、アクリル酸をモノマー単位として有していればホモポリマーに限らずコポリマーでもよく、また架橋ポリマーであってもよい。
具体的には、ポリアクリル酸及び／又はその塩、並びにそれらの誘導体（以下、「ポリアクリル酸類」とも記す）から選択される一以上が好ましい。

ポリアクリル酸類により形成されるゲルは流動性がなく、また離水が生じにくいため、微生物の存在数を定量的に正確に計測することができる。
また、形成されるゲルが透明であることにより、微生物のコロニーを、培養器材を分解することなく外部から正確に検出することができる。
また、ポリアクリル酸類は、加熱による溶解を経ずに、また冷却によらず、ゲルを形成させることができるため、培地形成操作が簡便であり、また対象微生物の生育を妨げない。
ポリアクリル酸類としては、廉価で入手しやすい点及びゲル形成の簡便さから、特にポリアクリル酸ナトリウムが好適である。

一般に、微生物用培地等には、寒天、カラギーナン、ローカストビーンガム等のゲル化剤が用いられるが、これらは液体検体を均一に固化させる際に加熱が必要であるため、微生物を含む液体検体をそのまま固化させることや、簡易培養器材の形態には適さない。また、前記ゲル化剤を用いて固化させたゲルは透明性が低い点も適さない。
また、ポリビニルアルコールは、液体検体と均一に混和させるのが難しいうえ、離水しやすいという問題がある。また、キサンタンガムも、液体検体と均一に混和させるのが難しくダマになりやすいうえ、固化させたゲルが不透明になりやすい。
カルボキシメチルセルロースは、液体検体を固化することができず、流動性のあるゲル
となるため、微生物の定量的な検出に適さない。

本発明におけるポリアクリル酸類としては、固化能の観点から、重合度１０，０００以上のものが好ましく、重合度２２，０００以上のものがより好ましい。また、架橋されていてもされていなくてもよい。

本発明におけるポリアクリル酸類の使用時の濃度は、特に限定されないが、固化能の観点から、０．００１ｇ〜０．１ｇ／１ｍＬが好ましく、０．００５ｇ〜０．０５ｇ／１ｍＬがより好ましい。そのため、培養器材が対象とする検体容量に応じて、使用時の濃度が上記範囲になるように、培地成分を塗着させることが好ましい。

（ｃ）培地成分に含まれる（ｃ２）栄養成分は、対象微生物を発育させるためものである。
栄養成分としては、特に限定されないが、ペプトン、獣肉エキス、酵母エキス、魚肉エキス等を好ましく挙げられる。
微生物数を計測する方法のひとつである上水試験法では、標準寒天培地、製薬用水や透析水の試験ではＲ２Ａ寒天培地を用いることが推奨されている。そのため、このような用途に用いる場合にはこれら寒天培地の寒天を排除したブイヨン培地かそれと同等の成分を、本発明における培地成分に含有させることが好ましい。

（ｃ）培地成分は、さらに（ｃ３）呈色試薬を含有することが好ましい。これは、培養によって生じた微生物のコロニーを有色のものとしてより検出・計測しやすくするためである。
呈色試薬としては、例えば、２,３,５−トリフェニルテトラゾリウムクロライド（ＴＴＣ）やテトラゾリウムバイオレット等をはじめとする酸化還元指示薬が挙げられる。これは、検体中に存在する全ての種類の微生物を計測したい場合に好ましく用いることができる。ＴＴＣを用いる場合は使用時の濃度として１００ｍｇ〜１ｍｇ／Ｌが好ましく、５０〜１０ｍｇ／Ｌがより好ましい。

また、呈色試薬としては、特定の微生物種のみが保有する酵素に対する基質（以下、酵素基質という）であって、分解されることにより色素化合物を遊離し得る化合物を用いてもよい。これは、該特定の微生物を計測したい場合に好ましく用いることができる。
ここで色素化合物とは、可視光下で有色のもの及び蛍光発色するものの何れでもよい。可視光下で有色の化合物として遊離され得る官能基としては、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル基等が挙げられ、遊離した５−ブロモ−４−クロロ−３−インドールは酸化縮合して５，５’−ジブロモ−４，４’−ジクロロ−インディゴとなり、青色を呈する。蛍光発色する化合物として遊離され得る官能基としては、４−メチルウンベリフェリル基等が挙げられ、遊離した４−メチルウンベリフェロンは紫外線照射下で蛍光を発する。

酵素基質の例を挙げると、対象微生物が大腸菌群の場合は、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ＧＡＬ）や５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−グルクロン酸等を、黄色ブドウ球菌の場合は、リン酸５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル（Ｘ−ｐｈｏｓ）等を、腸球菌等の場合は、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−グルコピラノシド（Ｘ−ＧＬＵＣ）等を、真菌の場合は、Ｘ−ｐｈｏｓ、酢酸５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルや酪酸５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル等を、それぞれ好ましく用いることができる。さらに、全ての微生物種を検出したい場合には、これら全てを組み合わせて使用してもよい。
これらの酵素基質の使用時の濃度は、例えば、０．０１〜１．０ｇ／Ｌが好ましく、０
．２〜１．０ｇ／Ｌがより好ましい。

（ｃ）培地成分は、さらに（ｃ４）増粘剤を含有することが好ましい。これは、培地成分を上部材及び／又は下部材に安定に塗着させるための接着剤の役割を果たす。
かかる増粘剤としては、微生物の生育に影響を与えないものであれば特に限定されないが、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース、又はキサンタンガム、グアーガム、メチルセルロース、デンプン及びその誘導体、ポリエーテル、ヒアルロン酸、コラーゲン等が挙げられる。

（ｃ）培地成分は、本発明の効果を妨げない限りにおいて、さらに、選択物質、抗菌性物質、無機塩類、糖類、増粘剤、ｐＨ調整剤等を任意に含有してもよい。
選択物質としては、例えば、ポリミキシンＢやバンコマイシンなどの抗生物質や、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、Ｔｗｅｅｎ８０、コール酸ナトリウム等の胆汁酸塩等の界面活性剤が挙げられる。
抗菌性物質としては、例えば、ポリリジン、プロタミン硫酸塩、グリシン、ソルビン酸等が挙げられる。
無機塩類としては、例えば、塩化ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム等の無機酸金属塩、ピルビン酸ナトリウム、クエン酸鉄アンモニウム、クエン酸ナトリウム等の有機酸金属塩が挙げられる。
糖類としては、例えば、グルコース、ラクトース、スクロース、キシロース、セロビオース、マルトースが挙げられる。
ｐＨ調整剤としては、例えば、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウムが挙げられる。なお、本発明の組成物は、対象微生物の生育の観点から、使用時のｐＨが好ましくは６．０〜８．０に、より好ましくは６．５〜７．５になるような組成である。

本発明の培養器材は、任意の方法で製造することができるが、一例を説明する。
適当な大きさのアクリル板等用いて、上部材及び下部材とする。上部材の凸部及び下部材の凹部は、アクリル板の接着やくり抜き、又は金型等を用いた押圧や射出による成型などにより、作製すればよい。
（ｃ）培地成分は、非水系溶媒に溶解又は懸濁させたものを、上部材の凸部及び／又は下部材の凹部の一部又は全体に塗布した後、乾燥することにより、培養器材に塗着させることができる。
ここで、非水系溶媒は、常温常圧下で揮発し得るものがよく、例えば、エタノール、メタノール、プロパノール、ブタノール等の低級アルコールを好ましく挙げられる。これらの非水系溶媒を用いれば、製造時にポリアクリル酸類等の（ｃ１）高分子化合物をゲル化させることなく培地成分を塗着させることができるので、容易に培養器材を製造することができる。

上記説明した本発明の培養器材は、検体中の微生物を培養し、該微生物数を計測する方法に好適に用いることができる。
該計測方法は、具体的には、（ｂ）下部材の凹部に検体を添加する工程、（ａ）上部材を（ｂ）下部材の凹部に被せる工程、前記検体に含まれる微生物を培養する工程、及び前記微生物のコロニー数を計測する工程を含むことが好ましい。上部材を下部材に被せる工程において、より好ましくは凹部を器材外から押圧する。これにより、下部材の凹部に添加された検体を培地領域全体に均一に押し広げられる。また、検体の水分により、培地成分中のポリアクリル酸類等の（ｃ１）高分子化合物がより速やかにゲル化して、培地が容易に形成される。
また、上部材が、（ｂ）下部材の凹部と（ｃ）培地成分を介して互いに嵌合しうる形状である凸部を有する培養器材を用いる場合は、培養器材の（ｂ）下部材の凹部に検体を添
加する工程、（ａ）上部材の凸部を（ｂ）下部材の凹部に嵌合する工程、前記検体に含まれる微生物を培養する工程、及び前記微生物のコロニー数を計測する工程を含むことが好ましい。
上部材の凸部を下部材の凹部に嵌合することにより、下部材の凹部に添加された検体が培地領域全体に均一に押し広げられる。また、検体の水分により、培地成分中のポリアクリル酸類等の（ｃ１）高分子化合物がより速やかにゲル化して、培地が容易に形成される。

微生物の培養条件は、特に限定されないが、対象微生物の種類により適正に選ばれるが、例えば３５±２℃で２４〜４８時間が好ましい。
培養後の培地中には、対象微生物の生育コロニーが出現するので、これを計測する。微生物のコロニー数の計測は、培養器材を分解することなく行うことができ、外部から目視によって確認したり、カメラ等で撮像したものを画像解析ソフトで解析したりすることによって、計測すればよい。本発明の計測方法によれば、正確にコロニー数を計測することができる。

本発明の計測方法を適用しうる検体としては、特に限定されないが、飲料水、清涼飲料水、工業用水、製薬用水、透析水、尿等の液体検体等が好ましく挙げられる。また、これらの検体を予めトリプトソイブイヨン等で培養した培養液であってもよい。
また、本発明の計測方法は希釈した検体にも適用可能であり、検体中の微生物量が、例えば３００ＣＦＵ／ｍＬ以下である場合にも、本発明の計測方法に好ましく供することができる。

次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

（１）培養器材の作製
透明なアクリル板を用いて、直径４４ｍｍ、高さ１ｍｍの円柱状の凸部を有する上部材と、直径４５ｍｍ、深さ１ｍｍの円柱状の凹部を９０ｍｍ×６０ｍｍの長方形の中央に有する下部材とをそれぞれ作製した。
１００ｍＬ調製用量のトリプトソイブイヨン培地粉末（ベクトン・ディッキンソン）、０．００２５ｇのＴＴＣ、１ｇのポリアクリル酸ナトリウム（アクアリックＣＡ（株式会社日本触媒））、及び０．１ｇのヒドロキシプロピルセルロースを、５０ｍＬのエタノールに懸濁した。該混合溶液５００μＬを、上記作製したアクリル板製の下部材の凹部に添加し、均一に広げた後、乾燥させた。

（２）菌株の供試
供試菌株はBacillus subtilis NBRC3134、及びEscherichia coli NBRC102203を使用した。これらをそれぞれ、トリプトソイ寒天培地で２４時間前培養した後、マクファーランド比濁＃１相当（約３．０×１０^８ＣＦＵ／ｍＬ）になるように滅菌綿棒を用いて滅菌生理食塩水に懸濁し、菌原液とした。各菌原液を用いて、滅菌生理食塩水にて１０倍段階希釈を１０^−８まで繰り返し、数ＣＦＵ／１ｍＬの菌希釈試料を調製した。該菌希釈試料１ｍＬを（１）で作製した培養器材の下部材の凹部に接種し、すぐに上部材の凸部を嵌合して、菌希釈試料を凹部に均一に広げ、培地成分に浸透させて、培地を形成させた。３５℃で２４時間培養した後、発育の有無を確認した。

図５に、Bacillus subtilisのコロニーを示す。
本発明の培養器材を用いると、スプレッダー等の器具や不織布等による毛細管現象に依らずとも均一に液体試料を培地領域全体に広げることができた。また、培地成分中のポリ
アクリル酸ナトリウムのゲルは速やかに固化し、培養後は図５に示すように透明のゲルの中に赤色のコロニーが目視により確認でき、容易にその数を計測することができた。また、本発明の培養器材は複雑な構成ではないため、容易に作製することができた。

本発明によれば、検体中の微生物を、簡便な操作で培養し、その数を容易に計測することができる。また、本発明の培養器材は、複雑な構成ではないため、製造も簡単であるため、産業上有用である。

１：培養器材
１０：下部材
２０：培地成分
３０：上部材

Claims (11)

1. （ａ）上部材、（ｂ）凹部を有する下部材、及び（ｃ）培地成分を有し、
   （ｃ）培地成分は、（ｃ１）加熱による溶解を経ずに、かつ冷却によらず、流動性のない透明なゲルを形成しうる高分子化合物と、（ｃ２）栄養成分とを含有する、微生物の培養器材。
2. 前記（ｃ１）高分子化合物が、自重の１０倍以上抱水できるものである、請求項１に記載の培養器材。
3. 前記ゲルが離水を生じない、請求項１又は２に記載の培養器材。
4. 前記（ｃ１）高分子化合物が、アクリル酸をモノマー単位として有するものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の培養器材。
5. 前記（ｃ１）高分子化合物が、ポリアクリル酸及び／又はその塩、並びにそれらの誘導体から選択される一以上である、請求項４に記載の培養器材。
6. （ａ）上部材が、（ｂ）下部材の凹部と（ｃ）培地成分を介して互いに嵌合しうる形状である凸部を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の培養器材。
7. （ｃ）培地成分は、（ａ）上部材の凸部及び／又は（ｂ）下部材の凹部の少なくとも一部に塗着している、請求項６に記載の培養器材。
8. （ａ）上部材及び／又は（ｂ）下部材が透明である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の培養器材。
9. 請求項１〜８のいずれか一項に記載の培養器材を用いて、検体中の微生物を培養し、微生物数を計測する方法。
10. （ｂ）下部材の凹部に検体を添加する工程、
    （ａ）上部材を（ｂ）下部材の凹部に被せる工程、
    前記検体に含まれる微生物を培養する工程、及び
    前記微生物のコロニー数を計測する工程を含む、請求項９に記載の方法。
11. 培養器材の（ａ）上部材が、（ｂ）下部材の凹部と（ｃ）培地成分を介して互いに嵌合しうる形状である凸部を有し、
    （ｂ）下部材の凹部に検体を添加する工程、
    （ａ）上部材の凸部を（ｂ）下部材の凹部に嵌合する工程、
    前記検体に含まれる微生物を培養する工程、及び
    前記微生物のコロニー数を計測する工程を含む、請求項９に記載の方法。

Images