JP2003524417A

JP2003524417A - バルク液から微生物を表面培養するための装置および方法

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Publication number: JP2003524417A
Application number: JP2001558200A
Authority: JP
Inventors: ハイマン，ジョーンズ・エム; マツムラ，ポール・エム; ジェフリー，スコット・アール; メアシュ，マーティン・ジェイ; ソープ，サーマン・シー
Original assignee: Biomerieux Inc
Current assignee: Biomerieux Inc
Priority date: 2000-02-11
Filing date: 2001-02-06
Publication date: 2003-08-19
Anticipated expiration: 2021-02-06
Also published as: JP4763956B2; WO2001059060A2; CA2399150A1; BR0108258A; MXPA02007800A; AU2001234859A1; WO2001059060A3; NO20023790L; US6596532B1; US20030203477A1; EP1297105A2; NO20023790D0; US7183073B2

Abstract

(57)【要約】容器と、前記容器内にポリマー鎖が相互に連結した網から作られている不動化層とを含む微生物を培養するための装置。この相互に連結したポリマー鎖の間の間隙は、培養中にサンプル内の微生物の実質的に全部が前記不動化層の表面上で不動化されるように、培養される微生物の平均のサイズより平均して小さい。微生物を検出するための関連方法は、上記の装置を提供することと、該装置に液体サンプルを添加することとを含む。液体サンプルは潜在的に微生物を含有しており、不動化層の表面積１ｃｍ²当たり少なくとも０．０４ｍＬの容量である。本方法は、その後液体サンプルが不動化層内に完全に吸収されて不動化されることを可能にするが、その間に液体サンプル内に存在する実質的に全部の微生物は不動化層の上面に不動化される。液体サンプルを含む装置は、存在する微生物の増殖を可能にするように一定期間インキュベートすることができる。本方法はその後、不動化層上に存在する微生物を検出することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】［発明の背景］本出願は、ここに引用することで本明細書の一部をなすものとする１９９７年
１２月１２日に出願したＪｅｆｆｒｅｙらの米国特許出願第０８／９８９，５６
０号、およびＭａｒｅｓｃｈらの米国特許出願第０９／１１３，９２９号（現在
は、米国特許第５，９１２，１１５号）に関連する。

【０００２】臨床検査材料中の微生物汚染の存在は、従来は栄養物の存在下で検査材料をイ
ンキュベートし、一定期間後における検査材料中または検査材料上方の空気中の
変化を通して微生物活性を検出することによって決定されている。例えば、Ａｈ
ｎｅｌｌらに付与された米国特許第４，１８２，６５６号では、サンプルは炭素
１３標識化発酵性基質を含有する培地を含む容器内に置かれる。容器を密封して
生物学的活性を誘導する条件に検査材料が曝された後、検査材料上方のガス状空
気中の炭素１３対炭素１２の比率が測定され、初期比と比較される。米国特許第
４，１５２，２１３号では、容器内のガス圧を監視することを通して検査材料上
方の空気中の酸素含量の減少を検出することによって検査材料中の酸素消費細菌
の存在が測定される方法が開示されている。米国特許第４，０７３，６９１号は
、一定期間後に検査材料上方のガス状空気の特徴における変化を測定することに
よって培地を含有する密封容器内で細菌を含む生物学的活性物質の存在を決定す
るための方法を提供している。

【０００３】Ｃａｌａｎｄｒａらの米国特許第５，０９４，９５５号によって教示されてい
る非侵襲性検出方法には、透明密封容器中の無菌液体増殖培地を用いて検査材料
を培養することによって、例えば血液またはその他の体液のような臨床検査材料
中および非臨床検査材料中の微生物の存在を検出するための装置が開示されてい
る。微生物の存在は、容器の内面または容器を密封するために使用される密封手
段に貼付されたセンサーを用いて検査材料のｐＨにおける変化または検査材料内
の二酸化炭素の産生における変化を検出または測定することによって決定される
。Ｃａｌａｎｄｒａらの特許では、非放射分析的および非侵襲性手段を通して例
えば高濃度の赤血球のような妨害物質の存在下で微生物を検出することができる
。

【０００４】Ｃａｌａｎｄｒａらの検出システムの短所の１つは、微生物の存在を検出する
ために必要な時間がサンプル内の微生物の数に関連している点にある。さらに、
微生物のための増殖培地が液体であるため、培養中は容器を常に攪拌していなけ
ればならない。これには培養装置を製造する際の追加の費用、並びに機械的故障
が発生する可能性の増加が関係してくる。さらに、そのようなシステムは微生物
の存在を決定することはできるが、計数を行うことはできない。さらにその上、
しばしば微生物の検出後には、微生物を識別するおよび／または様々な抗生物質
に対するそれらの感受性を決定することが望ましい。Ｃａｌａｎｄｒａタイプの
システムでは、感受性または識別検査を実施する前に混合種の単離を保証するた
めに液体培地から微生物をプレートアウトすることが必要になるであろう。これ
には追加の時間（患者の病気が極めて重篤な場合は必ずしも利用できない時間）
が関連してくる。さらに、Ｃａｌａｎｄｒａタイプのシステムは、抗生物質感受
性および／または微生物識別のためにプレートを読み取る／画像描出する追加の
機能を果たすことはできないであろう。

【０００５】さらにまた、サンプルがゲル（寒天）プレート上に置かれる微生物を検出する
ためのよく知られた方法もある。そのような方法では、サンプルはゲルプレート
の至る所に塗布または「縞状塗布」され、サンプルがゲル上に塗布された場所で
増殖が発生するかどうかを判定するためにプレートを画像描出することによって
微生物の増殖が決定される。このタイプの検出は、表面コロニー（抗生物質感受
性および／または微生物識別について即時に検査できる）については望ましいが
、例えば血液培養のような多数の手技によって必要とされる大量のサンプル量を
取り扱うことができない点では望ましくない。

【０００６】同時の微生物培養およびバルク液からの単離を容易にする一部の従来型システ
ムは、脱水顆粒状ゲル化培地、または微生物が導入された後にゲルを形成する液
体ゲル化成分の使用を含んでいる。どちらの場合も、微生物は表面上だけではな
く、培地全体に捕捉されている。これは、その後の検査のための微生物の採取を
困難にする。

【０００７】液体サンプルからの微生物の表面培養は、例えば寒天のような標準半固形培地
上で実施できる。しかし、そのような培地は実質的に膨潤させるためには硬過ぎ
、さらに典型的には開始時ゲル量の５％未満の量の液体しか吸収することができ
ない。濾過法は大量の液体から微生物を捕捉することができるが、実際所要時間
の増加、高額の材料費、汚染のリスク、およびサンプルを含有する微粒子に関す
る困難さを含む数多くの短所を有している。

【０００８】［発明の概要］本発明では、おそらく微生物を含有している「バルク」液サンプルがゲルマト
リックスの表面へ注がれる、またはさもなければ塗布される。サンプル中の液体
はゲルによって吸収されるが、それでも微生物は表面に保持される。培養後、相
互に分離された微生物コロニーは、採取およびその後の検査のために培地の表面
上で容易に入手することができる。これは、以前にはツーステップ・プロセスと
して実施されていたバルク液からの微生物の培養および単離をシングルステップ
で遂行でき、臨床的に重要な結果を達成するために必要な時間を１日以上削減で
きるという長所を提供する。もう１つの長所は、局所的な微生物増殖とともに、
微生物増殖によって惹起される培養環境における代謝変化もまた局所化され、こ
れがこれらの変化の検出を、および従って微生物自体の検出をより容易かつ迅速
にさせるという点にある。

【０００９】本発明のゲルマトリックスは、好ましくは本質的に、および／または製造方法
によって一連のユニークな特性を提供するポリマー材料から構成されている。ゲ
ルマトリックスは、サンプルから過剰な液体を引き出すために十分に吸収性であ
るが、表面で微生物を濾過するため、または罠にかけるために十分に小さい孔径
を備えている。サンプル中の液体は、典型的には数分間から数時間の範囲内の時
間尺度で、増殖中の微生物が培地の表面全体に広がるよりむしろ別々のコロニー
を形成するのに十分な速度でゲルに吸収される。

【００１０】出発材料として有用である本発明のために適切な（好ましい実施形態における
）ポリマーの範囲は実際的には無限であるが、本発明のために有用な物理的特性
は明確に定義されている。ポリマーは、１）液体のバルク流れが試験条件下で静
止されるゲルもしくは高粘性液を形成しなければならない、２）凝集力を失わず
に水性溶液もしくは懸濁液から液体を吸収しなければならない、３）表面上また
は近くで培養されて高度に不動化される微生物を保持しなければならない、およ
び４）当該微生物の増殖を許容しなければならない。様々なポリマー材料から製
造される本発明のゲルマトリックスは、これらの特性すべてを有することが証明
されており、寒天プレートを用いて可能であるよりも単位面積当たり数倍以上多
いサンプル容量から微生物を単離および増殖させるであろう。

【００１１】本発明の装置は、容器と、その容器内にポリマー鎖が相互に連結した網から作
られた不動化層とを含んでなり、このポリマー鎖が相互に連結した網の間の間隙
は培養される微生物の平均のサイズより平均して小さいサイズであるので、培養
中のサンプル内の微生物のほとんど全部（または全部）が前記不動化層の表面上
で不動化される。微生物コロニーを不動化層の表面上に維持しながら、不動化層
の表面積１ｃｍ平方当たり少なくとも０．０４ｍＬの容量を添加して不動化層に
吸収させることができる。バルク液サンプルは、全血（または一部の分画）、そ
の他の体液、工業生産による液、食品サンプルその他であってよい。

【００１２】［好ましい実施形態の詳細な説明］図１は、少なくとも１つの面（例、底面）が透明または半透明である平らで底
の浅い容器の形状を有することができるセンサープレート１を示す図である。容
器は開いていてよい（または単純に基質であってもよい）が、好ましくは密封容
器もしくは密封可能な容器であり、さらに好ましくはセンサープレート層の上方
にヘッドスペースの空間を備えている。容器には、ストッパー３、スクリューキ
ャップ、セプタム（隔壁）、もしくはそれらの組み合わせ（または他のシーリン
グデバイス）を用いて密封できるポート２を備えることができる。サンプルが容
器内に収集されると、センサープレートは微生物の増殖要件に依存してガス透過
性またはガス不透過性容器のどちらかとして構成することができる。この構成は
、様々なプレート構成材料、ラミネート（ガス不透過性および／または疎水性ガ
ス透過性膜）、および／または構成可能なベント（例、容器壁の開口部における
ガス透過性膜）を使用することによって達成できる。

【００１３】センサープレートデバイスの容器内では、微生物のコロニーが局所的に増殖で
きるようにサンプルを不動化／吸収するのに役立つ１つ以上の層があり、これが
微生物のコロニーを検出する能力を増加させる。ある実施形態では、装置内の少
なくとも１つの層は微生物の可視化に不都合な影響を及ぼすマトリックスを有す
る。図２から明らかなように、不動化層１０（試験サンプルを完全に不動化する
、または少なくとも局在化させるマトリックス層）およびセンサー層１２が用意
されている。後により十分に説明するこれらの２つの層は、さらに単一層に一緒
に組み合わせることができるが、２つの層を別々に用意するのが好ましい（いず
れにせよセンサー層が用意されることを想定して）。さらにまた図２には、好ま
しくは微生物の増殖を原因とするセンサー層における変化を視認／画像描出する
ために透明であるプレート底部１４が示されている。

【００１４】光学センサー層１２は、紫外線、可視光線および／または赤外線スペクトルに
おける緊密に局在化された劇的な変化を提供することによって微生物増殖の場所
を指示する目的のために用意できる。この局在化変化は、微生物増殖に近いセン
サー表面の反対側であるプレート底面で検出可能である。センサー層は、好まし
くは不透明であるマトリックス（支持体）上および／または中に包埋されている
検出可能な特性（例、インジケーター）において変化を受ける物質を含有してい
る。「不透明」とは、センサー層がセンサー層の反対側（例、半不透明、実質的
に不透明、または完全に不透明）からの不動化層に不動化された試験サンプルお
よび／または実際の微生物コロニーの視認または検出（いずれかの重要な電磁領
域において）を十分に遮断することを意味する。試験サンプルもまた実質的に透
明である場合（そのような場合には微生物コロニーの存在下でセンサー層は透明
から不透明への局在化された変化を受ける）に透明なまたは比較的に透明なセン
サー層を有することは可能であるが、センサー層は透明ではないことが好ましい
。センサー層が不透明な場合には検出および計数を妨害するであろう試験サンプ
ル中の微生物を検出する際に改良された結果が入手される。試験サンプル自体が
不動化層において直接に微生物の存在または増殖を可視化／検出すること（例、
裸眼または器械を用いて）を妨害する場合は、不動化層における微生物の存在／
増殖に対応するセンサー層における変化を検出する代わりに、少なくとも１つの
不動化層またはセンサー層（好ましくはセンサー層）が実際の試験サンプルおよ
び／または実際の微生物の検出／可視化を遮断することができるのが好ましい。
不動化層はさらにまた不透明であってよく、さらに本発明を実行する１つの実施
形態では、センサー層、不動化層、およびサンプルすべてが不透明である。

【００１５】センサーは、それの上または中に不動化されたインジケーター媒質とともに固
体合成物もしくは膜を備える。センサー層は、外部からセンサー層を見ることが
できるように、好ましくは容器の内面に対して同一平面に、もしくは容器を密封
するために使用されるシーリング手段内に配置されるか、または密封手段に取り
付けられている。センサー層は、好ましくは、細胞、タンパク質、その他の固体
または他の不透明もしくは着色コンポーネントがセンサー層と容器表面との間に
入ってしまうことを防止するために容器に貼付される。ある実施形態では、セン
サー層は膜または他の固体層によって検査材料およびそれの増殖培地から分離さ
れている。

【００１６】センサーは次の点において有用である。１）微生物代謝（例、代謝を原因とす
るガス構成成分における増加または減少）を原因とするセンサー層内の変化が検
査材料の上方の空気中よりも固体もしくは半固体の不動化層から検出される、２
）センサーがプレートの内面またはクロージャーまたはシーリング手段へ貼付さ
れている、またはクロージャーもしくはシーリング手段の外側を通して取り付け
られているので、プレートの完全性を侵害する必要なくプレートの透明な壁もし
くはシーリング手段の外側から測定を行うことができる、３）外部測定を視覚的
検査または反射率、蛍光その他によって、もしくは画像収集によって測定する装
置を用いて行うことができる、４）検査材料中の不透明／着色もしくは蛍光成分
が変化を検出する能力またはそれらの変化の測定を妨害しない、および５）変化
を容易に観察もしくは検出できるように、センサー内の小容積内（例、ポリマー
エマルジョンないもしくは膜上で）に高濃度のインジケーター分子を保持するこ
とができる。

【００１７】複雑な微生物媒質を作り上げる栄養成分は、微生物によって使用される代謝経
路に影響を及ぼす。有機酸類、塩基類および様々なガスが利用可能な栄養素に依
存する比率で産生する。これらの生成物はさらにまた微生物の種毎に相違する。
不動化層内のこれらの生成物の存在はそのｐＨを変化させる可能性がある。本発
明で使用されるセンサー層は、ｐＨ変化に反応して測定可能な変化を生じるｐＨ
感受性インジケーターを含有することができよう。または、例えばＣＯ₂のよう
なインジケーターのｐＨに影響を及ぼすガスの存在を測定することができよう。
微生物増殖は、さらにまたＯ₂および／または蛍光における変化の測定によって
検出することもできる。センサー層は、微生物の代謝を原因とするＯ₂濃度の減
少に反応するように設計することができる。さらに、色もしくはその他のパラメ
ーターにおける変化よりむしろ蛍光における変化を受けるインジケーターを選択
することができよう。二酸化炭素はほとんどの微生物が産生する一般的代謝物で
あるので、このため微生物増殖を検出するための好ましい代謝物である。どのよ
うな機構を利用しても、ある好ましい実施形態では、センサー層はほとんどの微
生物の存在／増殖に反応して検出可能な変化を受けるであろう。

【００１８】インジケーターは、支持体へ共有的または非共有的のどちらかで取り付けるこ
とができる。あるいはまた、インジケーターは例えば硬化する前にポリマーマト
リックス内で乳化されるようにポリマーマトリックス内に封入することができる
。

【００１９】ｐＨ、Ｈ₂、Ｈ₂Ｓ、ＮＨ₃、Ｏ₂もしくはＣＯ₂センサー中の活性分子種として
様々な相違する蛍光および可視ｐＨインジケーターを使用することができる。一
般に、インジケーターの選択に関する制限は、それらが赤外線、蛍光、反射率お
よび／またはイメージング技術によって検出可能である容認可能なダイナミック
レンジおよび波長を有するという要件だけである。

【００２０】本発明に従った培地中のｐＨ変化を検出するためのセンサーは、好ましくは約
５．０〜約８．０のｐＨ範囲に渡って蛍光強度または目に見える色における変化
を示す。

【００２１】ＣＯ₂センサーのためのインジケーターは、ＣＯ₂濃度における変化を検出する
ために、好ましくはｐＨ約１３〜約５、および最も好ましくはｐＨ約１３〜約９
の範囲内で赤外線強度、蛍光強度または目に見える色における変化を示さなけれ
ばならない。

【００２２】支持体に共有的もしくは非共有的に結合してそれらのｐＨ指示特性を維持する
ことができるのは、一定のｐＨインジケーターだけである。キサンチン、フェノ
ールフタレインおよびフェノールスルホフタレイン基に属するインジケーターが
有用である。これらの例には、フルオレセイン、クマリン、フェノールフタレイ
ン、チモールフタレイン、ブロモチモールブルー、チモールブルー、キシレノー
ルブルー、オルトクレゾールフタレイン、およびα−ナフトールベンゼインが含
まれる。

【００２３】支持体は、それにｐＨインジケーターが有機反応を使用して共有的に付着する
ことのできる例えばセルロースもしくは一定のシリコーン類のような基質であっ
てよい。ｐＨインジケーターの非共有的付着は、例えば正もしくは負のゼータ電
位を有するナイロン膜のようなイオン性支持材であってよい。その他の使用でき
るイオン性支持材は、例えばジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）樹脂またはＤＥ
ＡＥセルロースのような正もしくは負荷電イオン樹脂である。インジケーター膜
を微生物増殖培地と直接に接触させなければならない場合は、タンパク質を用い
た支持材の前処理が必要になることがある。

【００２４】ｐＨインジケーターセンサーは、微生物増殖培地のｐＨ環境を原因とするｐＨ
変化を直接に検出する。しかし、これらのセンサーは微生物代謝を原因とするガ
ス（例、二酸化炭素、アンモニア、水素、硫化水素、または酸素）に選択的に反
応するように作製することができる。センサー層の上には、例えばシリコーン、
ラテックス、テフロン（登録商標）またはイオンの通過を防止しながらガスの拡
散を選択的に許容する能力を特徴とする様々なプラスチックのような選択的半透
過性組成物もしくは膜を用意することができよう。ポリマーマトリックス内に封
入されたインジケーターを備えるセンサーについては、そのマトリックスを形成
するポリマーはガスの通過は許容するがイオンの通過を許容しない半透過性障壁
として機能することができる。

【００２５】ある実施形態では、ＣＯ₂センサーは複数のコンポーネントから構成される。
第１コンポーネントは、６〜１０のｐＨ範囲で反応性である視覚的もしくは蛍光
ｐＨインジケーターである。この基準を満たすインジケーターの例は、ブロモチ
モールブルー、チモールブルー、キシレノールブルー、フェノールフタレイン、
オルトクレゾールフタレイン、クマリンおよびフルオレセインである。必要な場
合の第２コンポーネントは、選択されたｐＨインジケーターによるＣＯ₂の検出
のための最適なｐＨ環境を維持する酸、塩基もしくは緩衝液である。第３コンポ
ーネントは、非硬化ポリマー内で乳化されたインジケーター液の液滴を産生する
ことのできるグリセロールもしくは透過の乳化剤であってよい。第４コンポーネ
ントは、例えば酸化チタン、酸化亜鉛、酸化マグネシウム、酸化第一鉄等のよう
な顔料であってよい。第５コンポーネントは、インジケーターのための適正な環
境を維持する例えばシリコーンのような非硬化ポリマーであってよい。それがガ
スにとっては透過性であるがイオンにとっては透過性ではなく、さらに滅菌処理
を受けたときにこれらの特性が変化しない限り、固有の化学的もしくは物理的特
性または硬化のための要件のどちらかからもインジケーターの化学的活性に余り
大きな影響を及ぼさないあらゆるポリマーを使用することができる。さらに良好
な結果が得られる他のシリコーンポリマーは、高温によって、触媒活性によって
、または紫外線硬化によって硬化するシリコーンポリマーである。エマルジョン
は様々なコンポーネントから調製され、ポリマーは不動化層からのＣＯ₂および
他のガスの選択的拡散を許容し、その結果としてセンサー層における局所的に測
定可能な変化を生じさせるｐＨインジケーターの液滴の周囲で半透過性マトリッ
クスを形成するために硬化させられる。センサー層は、例えば金型内でのように
個別に調製し、硬化させ、その後シリコーン接着剤のような適切な接着剤を用い
てプレートへ取り付けることができる。あるいはまた、および好ましくは、セン
サーは容器の底部上で形成され、インサイツで硬化させられる。硬化後、センサ
ーを含む容器は例えばオートクレーブまたはγ線照射によって滅菌することがで
きる。便利なことに、滅菌前に不動化層および追加の任意の層をセンサープレー
ト内に導入し、同様にそのプロセスによって滅菌することができる。

【００２６】さらに別の実施例では、センサー層は着色シリコーンマトリックス内に乳化さ
れたインジケーター液を備える。インジケーター液は、０．８Ｍ水酸化カリウム
（１０．０ｍｌ）およびイソプロピルアルコール（１０．０ｍｌ）の溶液内に溶
解させたチモールブルーインジケーター（０．６５ｇ）から構成される。インジ
ケーター液（５．０ｇ）はその後着色シリコーンコンポーネントと混合される。
着色シリコーンマトリックスは、シルガード（Ｓｙｌｇａｒｄ）１８４シリコー
ン（コンポーネントＡ（５０．０ｇ）およびＢ（５．０ｇ））および白色顔料（
製品番号６１−１８０００、フェロ（ＦｅｒｒｏＣｏｒｐ．）社製、ニュージ
ャージー州）（１．０ｇ）から構成される。センサー材料はその後、薄い層（約
０．２〜０．５ｍｍ）でプレート上に注入されて広げられる。

【００２７】また別の実施例では、センサー層は着色シリコーンマトリックスと混合された
インジケーター液を備える。インジケーター液はイソプロピルアルコール（５．
０ｍｌ）および０．９Ｍ水酸化カリウム（５．０ｍｌ）の溶液内に溶解させたオ
ルトクレゾールフタレインインジケーター（２．０ｇ）から構成される。インジ
ケーター液（２．５ｇ）はその後着色シリコーンコンポーネントと混合される。
着色シリコーンマトリックスは、シルガード（Ｓｙｌｇａｒｄ）１８４シリコー
ン（コンポーネントＡ（２５．０ｇ）およびＢ（２．５ｇ））および白色顔料（
製品番号６１−１８０００、フェロ（ＦｅｒｒｏＣｏｒｐ．）社製、ニュージ
ャージー州）（０．５ｇ）から構成される。センサー材料はその後、薄い層（約
０．２〜０．５ｍｍ）でプレート上に注入されて広げられる。この実施例の変形
では、上記オルトクレゾールフタレインセンサー層は着色シリコーンマトリック
スを備えるオーバーコート層で被覆されている。

【００２８】さらになおまた別の実施例では、センサー層は顔料液およびシリコーンマトリ
ックスと混合されたインジケーター液を備える。インジケーター液はイソプロピ
ルアルコール（１０．０ｍｌ）および０．８Ｍ水酸化カリウム（１０．０ｍｌ）
の溶液内に溶解させたオルトクレゾールフタレインインジケーター（２．０ｇ）
から構成される。顔料液はシリコーン油（４０．０ｇ）、白色顔料（製品番号６
１−１８０００、フェロ（ＦｅｒｒｏＣｏｒｐ．）社製、ニュージャージー州
）（４．０ｇ）から構成される。シリコーンマトリックスは、ワッカー・エラス
トシル（ＷａｃｋｅｒＥｌａｓｔｏｓｉｌ）ＲＴ６０１シリコーン（コンポ
ーネントＡ（２００．０ｇ）およびＢ（２０．０ｇ））およびトルエン（４０．
０ｇ）から構成される。インジケーター液（２０．０ｇ）はその後顔料液（４０
．０ｇ）およびシリコーンコンポーネントと混合される。センサー材料はその後
、薄い層（約０．１〜０．３ｍｍ）でプレート上にスプレーされる。

【００２９】上記のような酸素、二酸化炭素およびｐＨにおける変化に対して反応性である
インジケーターに加えて、アンモニア、酸化還元電位、水素、硫化水素、または
微生物の存在もしくは増殖を原因とする変化を受ける他の基質における変化を検
出するインジケーターもまた利用できよう。さらに、センサー層（または複数の
センサー層）において複数の相違するインジケーターを使用することができよう
。

【００３０】センサー層は、好ましくはサンプルの特性（例、自然蛍光、不透明性等）がセ
ンサーの反応に影響を及ぼす、または遮蔽することを防止できるように不透明で
ある。センサー層は、その変化が画像収集および処理によって検出可能である場
合に、好ましくは微生物の存在下で１つの不透明状態から別の不透明状態に変化
する。１つの例として、センサー層は白色着色シリコーンのオーバーレイを伴っ
て、白色着色シリコーンマトリックス内のオルトクレゾールフタレインインジケ
ーターの乳化混合物であってよい。または、センサー層は例えばチモールブルー
インジケーター、キシレノールブルーインジケーター、または「汎用」インジケ
ーターのような１種以上のインジケーターと一緒に乳化された着色シリコーンマ
トリックスであってよい。センサー層内のマトリックスは、適切なラテックス、
ポリウレタン、ナイロン膜（例、荷電ナイロン膜）またはセルロース粉末であっ
てよい。センサー層マトリックスはさらにまた、例えばシルガード１８４、ワッ
カー６０１、もしくはワッカー９３４のようなシリコーンマトリックスであって
もよい。または、センサー層は例えばインジケーター層と不透明層のような２つ
の層から作り上げることもできよう。

【００３１】センサープレートデバイス内のもう１つの重要な層は不動化層１０である。本
発明の不動化層は、単独で、または上記のセンサー層のような他の層と組み合わ
せて用意することができる。不動化層の目的は、マトリックスの表面上にサンプ
ル内の微生物を不動化させることである。サンプル自体は液体であっても懸濁液
であってもよい。サンプルは、ゲルの表面上に微生物を不動化できるように、既
にゲル化したマトリックス上に、または脱水させたもしくは部分的に脱水させた
ゲルマトリックス上に塗布することができよう。ゲル化剤は、物理的支持を追加
するためにサポートマトリックス内に包埋することもできよう。例には、ガラス
、セルロースまたは全体が混合された、もしくは織布もしくは不織布の形状の合
成ポリマー繊維が含まれる。

【００３２】センサープレートデバイスには、一緒に混合した層もしくは個別層としてのど
ちらかで、１種以上のゲル化剤を利用することができよう。例えば、２：１の適
切な重量比で結合させたグアールゴムとキサンタンゴムの混合物を使用できよう
。天然および合成ヒドロゲル粉末を含むその他のゲル化剤を単独または組み合わ
せて使用することができよう。ゴム、寒天、アガロース、カラゲナン、ベントナ
イト、アルギン酸塩、コラーゲン、ゼラチン、溶融ケイ酸塩、水溶性デンプン、
ポリアクリレート、セルロース、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、
酸化ポリエチレン、ポリビニルアルコール、デキストラン、ポリアクリルアミド
、多糖類またはその他のゲル化剤もしくは増粘剤から選択した１種以上のゲル化
剤を組み合わせることができよう。

【００３３】１種以上の合成もしくは天然親水性ポリマーを含む脱水させたおよび／または
部分的に脱水させたゲルマトリックスは、表面コロニー単離／不動化のために使
用できよう。１種以上のゲル化剤を使用する場合は、そのようなゲル化剤は一緒
に混合する、または複数の層で提供することができよう。ある実施例では、上層
は主として表面に微生物を捕捉するために用意でき、さらに下層は上層（例、変
性セルロース、合成ポリマーまたはヒドロゲル上方の薄い寒天層）寒天層を通し
て液体サンプルを引き出すための強化吸収剤として用意できよう。

【００３４】センサー層が使用される場合は、不動化層はセンサー層に有害な影響を及ぼし
てはならない。センサー層がｐＨ変化を原因とする検出可能な変化を受ける場合
は、極めて酸性のゲル層はセンサー層に有害な影響を及ぼすであろう（さらに一
部の製造プロセスは酸性であり、センサー層に有害な影響を及ぼす可能性がある
酸性残留物を残す可能性があろう）。さらにその上、この層がサンプルと混合さ
れたときに酸性に変化しないことが確実でなければならないが、それはこれは微
生物の不在下でさえセンサー層の変化を惹起する可能性があるためである。

【００３５】図２から詳細に読み取ることができるように、任意のコンディショニング層１
６を不動化層の上（または中もしくは下方）に用意することができる。図２にお
いては不動化層から別個に示されてはいるが、コンディショニング層からのコン
ディショニング材は好ましくは不動化層自体の中に組み込まれる。不動化層の中
もしくは個別の層のどちらに用意されていようと、コンディショニングコンポー
ネントは微生物増殖のための１つ以上の媒質、溶解剤、溶解酵素、抗菌性中和剤
、界面活性剤または微生物検出および／または計数能力を改良するために有用な
他の物質を含むことができる。コンディショニングコンポーネントは、さらにま
た同一センサープレートデバイスにおける不動化層内および個別層の両方に用意
することもできる。

【００３６】コンディショニングのための溶解剤は、ゲルをより平滑にするため、および／
またはゲルのより良好な再水和を可能にするために試験サンプル中の血球を溶解
させるために添加できる。可能性のある溶解剤の例には、サポニン、ジギトニン
、Ｔｗｅｅｎｓ（商標）、ポリソルビタンモノラウレート、およびその他の界面
活性剤が含まれる。典型的には必ずしもタンパク質分解酵素ではない溶解酵素は
、ゲルをより平滑にするため、および／またはゲルのより良好な再水和を可能に
するために血液サンプル中の細胞物質を消化するために添加することができる。
コンディショニングのための溶解酵素は、例えばアスペルギルスオリーゼ等に由
来する酵素混合物のような１種以上のプロテアーゼを含むことができる。

【００３７】抗菌性中和剤は、コンディショニングのため、特に試験サンプル中の微生物の
より迅速および／またはより良好な回収のために添加することができる。１種以
上のそのような中和剤は樹脂、ゴムおよび炭素を基剤とする物質（例、活性炭ま
たはＥｃｏｓｏｒｂ（商標））、または特に様々な抗生物質を変性させる種々の
酵素（例、βラクタマーゼ）の１つから選択することができよう。

【００３８】さらにまたコンディショニングのために媒質を（不動化層へ直接に、または個
別に）添加することができる。媒質は微生物の増殖のための栄養素を提供するた
めに添加される。種々のタイプの微生物のために数多くのタイプの媒質を使用で
きるが、微生物が好気性微生物である場合は、媒質は１つの例として下記を含む
ことができよう（各々の代表的な量は括弧内に単位ｇ／Ｌで挙げられている）。
トリプトン（１７）、ソイトン（３）、プロテオースペプトン（５）、麦芽エキ
ス（２．５）、デキストロース（２．５）およびＭＯＰＳ（２３）。微生物が嫌
気性微生物である場合は、媒質はさらに好気性微生物のために上記に列挙した媒
質並びにヘミン（０．００５）、Ｌ−シスチン（０．２）、Ｎａ−ｍ−二硫化物
（０．２）およびメナジオン（０．０００５）を含むことができよう。

【００３９】大腸菌に対しては、媒質は一例としてラクトース（５）、胆汁酸塩＃３（０．
８）、Ｋ₂ＨＰＯ₄（７）、ＫＨ₂ＰＯ₄（３）、（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄（０．５）、Ｍ
ｇＳＯ₄（０．１）、Ｎａ−ｍ−二硫化物（０．４）およびＳＤＳ（ドデシル硫
酸ナトリウム）（０．１）を含むことができよう。酵母、糸状菌およびその他の
追加の耐性微生物に対しては、媒質は１例としてデキストロース（１０）、酵母
エキス（１０）、（ＮＨ₄）クエン酸塩（２）およびｐＨ５．５までの酒石酸を
含むことができよう。

【００４０】さらにまた図２から明らかであるように、容器の壁には、それの下が疎水性ガ
ス透過性フィルム２２であり、それの上方がガス不透過性（取外し可能）フィル
ム２４である開口部２０を用意することができる。または、容器には一緒に付着
して開口部を被覆しているガス不透過性フィルムおよび疎水性ガス透過性フィル
ムを備えた開口部を壁に用意することができよう。微生物が嫌気性である場合は
、ガス不透過性フィルムはその場所に残されるであろう。しかし、微生物が好気
性である場合は、ガス不透過性フィルムはセンサープレートデバイスへ試験サン
プルを添加する時点に取り除かれるであろう。当然ながら、疎水性ガス透過性フ
ィルムは少しも用意する必要はないが、それは汚染物質が容器内に侵入するのを
防止するために、および潜在的感染性試験材料がデバイスの外部へ漏出するのを
防止するために有益である。

【００４１】図２におけるエリアＡは図３および４においてさらに詳細に示されている。図
３から読み取ることができるように、センサープレートデバイスのまた別の実施
形態では、単一の不動化マトリックス層の代わりに、次のうちの１つ以上を用意
することができる。増殖後の表面捕捉および回収を可能にするための半硬質表面
のための単離ゲル層３０、接着層３１、吸収性ゲル層３２および追加の接着層３
３。吸収性ゲル層３２は１つ以上のコンディショニングコンポーネント（ゲル中
に）、微生物増殖のための媒質、溶解酵素および抗菌性中和剤を含むことができ
る。さらに図３から詳細に読み取ることができるように、単一センサー層の代わ
りに、次のうちの１つ以上を用意することができる。オーバーコート層３４、接
着層３５、インジケーター層３６、およびプレート底部３８と接触している追加
の接着層３７。

【００４２】図４に示されている本発明の追加の実施形態では、下記を備えるマトリックス
層４０が用意されている。脱水されたゲル化層、および例えば媒質、溶解酵素お
よび抗菌性中和剤のような乾燥コンディショニングコンポーネント。図３におけ
ると同様に、単一センサー層の代わりに、次のうちの１つ以上を用意することが
できる。接着層４１、オーバーコート層４２、接着層４３、インジケーター層４
４、およびプレート底部４６と接触している追加の接着層４５。

【００４３】センサープレートデバイスのサイズは、所望のサンプルサイズに依存して相違
してよい。ある実施例では、センサープレートデバイスは７４ｍｍ×１１７ｍｍ
の寸法の不動化層を有している。不動化層がウエットタイプのゲルを備える場合
は、サンプルサイズは極めて少量（例、１ｍＬ以下）にすることができよう、ま
たは例えば血液サンプルを用いる場合は、１５ｍＬまでにすることができよう。
他方、不動化層が脱水されたゲルを備える場合は、サンプルサイズはゲルおよび
サンプルのタイプに依存してもっと大きくてもよいであろう（例、サンプルは３
０ｍＬ以上であってよいであろう）。

【００４４】使用時に、液体サンプルはセンサープレートデバイス内に導入される。サンプ
ルは、それがセンサープレートの底面全体に広がるにつれて（所望の場合は）「
コンディショニング」される。サンプルは、不動化マトリックス層内へ吸収され
る。その後、センサープレートは微生物コロニーの増殖を促進するために培養さ
れる。センサープレートデバイスの底面に向かって配置されたセンサー層は、微
生物コロニーの存在を指示できるように検出可能な変化を受ける。最後に、セン
サープレートデバイスは、微生物コロニーの存在および所在位置を決定するため
に手作業で、または自動的に検査される。

【００４５】本装置はセンサープレート上で３つの主要機能を実行する。プレート培養、画
像収集／捕捉、および画像処理。本装置は周囲より高い温度で培養を行わなけれ
ばならない場合（必ずしもすべての状況において高温が必要とされるわけではな
い）はヒーターを含むことのできる、プレートを培養するために制御された環境
を提供する。液体サンプルがセンサープレートデバイスに添加され、その後セン
サープレートは、培養期間中に画像収集／捕捉装置（例、カメラまたはスキャナ
ー）によって引続いて感知／観察が行われる装置内に置かれる。

【００４６】センサープレートデバイスの底部の画像は、微生物コロニーがセンサープレー
ト上に存在するかどうかを決定するために、定期的な規定間隔で捕捉し、引続い
て１種以上の画像処理技術およびアルゴリズムを用いて解析することができる。
微生物を検出および計数するために実行される画像処理アルゴリズムは、１つ以
上の下記のステップから構成される。ａ）外部画像データから当該領域を分離するための画像マスキング、ｂ）相違する時間間隔で入手された２枚の画像間の変化の領域を分離するため
の画像サブトラクション、ｃ）サブトラクションされた画像に現れた変化の大きさを増幅するための画像
均等化、ｄ）均等化画像における単一画素ノイズの作用を減少させるための画像ブルー
リング（低域通過フィルター）、ｅ）さらにフィルタリングされた画像における局所的相違を増幅させるための
画像コントラストおよびブライトネス増強、ｆ）コロニー検出／計数アルゴリズムのために画像を準備するための画像閾値
設定（必要な場合は、数種の閾値を用いて）、および／またはｇ）プレート上の微生物の存在を決定するため、プレート上のコロニー数を計
数するためおよび／またはプレート上のコロニーを分類するためのカラー解析を
実行するためのコロニー検出、計数および分類。

【００４７】本発明のある好ましい実施形態では、不動化層は大量のバルク試験サンプル液
を吸収するが、それでも不動化層の表面上または近くに表面コロニーとしてバル
ク液サンプル中に存在する微生物を保持するように設計されている。この場合、
表面コロニーは媒質に浸透することなく表面から接近できるコロニーであると定
義されているが、コロニーは実質的に媒質内に包埋されていることがある。一次
培養直後には、採取およびその後の検査のために分離された微生物のコロニーは
入手可能であり、容易に接近可能である。その最も単純な形態では、本デバイス
は容器内（例、プレートまたは単純基質上）にセンサー層の不在下で不動化層を
備えている。不動化層は、大量のサンプル液を吸収することのできるマイクロポ
ーラスの高度に膨潤性の媒質を備える。

【００４８】本発明のための調製されるように、親水性ポリマーはポリマー鎖の撚り糸間の
絡み合いおよび／または架橋結合によってゲルを形成することができる（ここで
使用するポリマー鎖は、ポリマーの分子鎖を意味する）。本発明では、ゲル内の
ポリマー鎖が連続性のマイクロポーラスおよび高度に膨潤性の網に形成されるの
で、バルク液からの微生物の表面捕捉が可能になる。本質的にはポリマー鎖間の
間隙である孔は、当該微生物がゲル内の遠くに浸透することはできないが、例え
ば水、塩、タンパク質および栄養素のようなより小さな微粒子もしくは分子は至
る所で自由に通過できるようなサイズであってよい。

【００４９】この実施形態における不動化層の主要コンポーネントは、その半固形もしくは
高度に粘性のマイクロポーラスの性質を失わずに水性液体を実質的に吸収して膨
潤することができる親水性ポリマー網もしくはヒドロゲルから構成される吸収性
培地である。水性液体がそのようなポリマー網の表面に塗布されると、液体は網
内に拡散し、網は結果として膨張する。ポリマー網の孔径より小さな水および分
子もしくは粒子はゲル全体に自由に拡散するであろう。例えば微生物のようなゲ
ルの孔径より大きな粒子は表面上または表面の近くに捕捉される。図６で明らか
なように、微生物について検査される大量の液体サンプル６０が容器６２（その
中にマイクロポーラスの高度に膨潤性媒質６４を有する）へ添加される。図７で
明らかなように、マイクロポーラスの媒質はバルク液サンプルの吸収を原因とし
て高度に膨張するが、他方媒質のポリマー網は無傷のまま残る。

【００５０】不動化層（ゲルポリマー層）は検出すべき微生物の増殖を阻害してはならない
。１つのゲル化媒質は一部の微生物の増殖を阻害する可能性があるが、同一媒質
は他の微生物の増殖を促進する可能性がある。一定の微生物の選択的阻害を長所
とするために使用することができるが、本発明のある好ましい実施形態では、ゲ
ル化媒質は広範囲の微生物の増殖を増強も阻害もせず、むしろ微生物増殖のため
の不活性足場として機能する。ゲル化媒質を作り出すために使用されるポリマー
は、好ましくは親水性である。一般に、ポリマーが親水性であればあるほど、そ
れはサンプル液によってより迅速に膨潤するであろう。所望の特性を付与するた
めにマトリックスの一部として余り親水性ではない、または疎水性のポリマーを
使用することができるが、ゲル化媒質の大部分は親水性でなければならない。

【００５１】ポリマーによって形成されたゲルは、使用条件下で凝集力または高度の粘性を
維持しなければならない。ゲルはその使用によって要求される容量および温度の
変化を通して完全性を維持しなければならない。さらにまた、微生物によって容
易に変質することのないポリマーが培養されることが望ましい。さらに、ゲル化
ポリマーの鎖間架橋結合または絡み合いは、ゲル化もしくは高粘度を維持するた
めに十分に高くなければならないが、高度の膨潤を許容するのに十分に低くなけ
ればならない。より詳細には使用される材料（天然、合成、もしくは半合成ポリ
マー、または他の材料）とは無関係に網を崩壊させることなく液体を吸収するの
に十分に柔軟性であるポリマー鎖が相互に連結した網が提供されることが好まし
い。相互連結ポリマー鎖間の間隙空間は培養される微生物の平均サイズより小さ
い平均サイズであるので、その結果検査されるサンプル内の実質的すべての微生
物がポリマーゲル（「不動化層」）の表面上で不動化させられる。相互連結して
いるとは、ポリマー鎖が物理的に絡み合っているおよび／または架橋結合してい
ることを意味する。

【００５２】物理的特性に基づくと、本発明の吸収性培地の基礎として使用できる２つの主
要なクラスのゲル化材料、つまり硬質ゲルおよび軟質ゲルがある。各々は相違す
る製造方法を必要とする。

【００５３】硬質ゲルは通例は均質に架橋結合しておリ、ゼラチン様一貫性を有している。
架橋結合は共有結合、イオン結合、または水素結合、疎水性相互作用、またはこ
れらのいずれかもしくは全部の混合から構成することができる。このタイプのゲ
ルは一般に硬く脆性であるが、架橋結合の量を制限することによって本発明にお
いて使用するために極めて柔軟性かつ膨潤性に製造することができる。このタイ
プのゲルは最終所望寸法に鋳造し、その後使用前に脱水されるであろう。あるい
はまた、ゲルは、液体サンプルを用いて膨潤した後に所望の形状に到達するよう
に脱水形で鋳造することもできよう。

【００５４】例えばアガロースおよびゼラチンのような一部の天然ゲル化材は、本発明にお
いて限定的に使用される硬質ゲルを形成するであろう。いったん形成されると、
これらのゲルはバルクサンプル液を添加しても目に見えて膨潤しないであろう。
乾燥させ、引続き脱水させても、それらは元の寸法には戻らないであろう。これ
は、ゲルを一緒に保持してゲルが脱水によって収縮するにつれてより緊密な架橋
結合を形成する制御されない数の関連架橋結合（水素結合もしくはイオン結合）
のために発生する。

【００５５】吸収性培地のためにより有用なゲルは、注意深く制御された架橋結合を用いて
、より弱い関連結合を有する、またはそれらの関連結合が化学的修飾によって弱
められるポリマーから形成することができる。このタイプのゲルは、多数のプロ
セスによって製造することができる。同時の遊離基重合および架橋結合、例えば
エレクトロフォレーシスで使用するものに類似するポリアクリルアミドゲルを使
用して本発明のために適切なゲルを製造することができる。あるいはまた、ポリ
マーを重合後に化学的に架橋結合させることができる。そのようなゲルの例には
、ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＥ）と架橋結合させたデキストラ
ン、多価カチオン類と架橋結合させたＣＭＣ、グルタールアルデヒド（ＧＡ）と
架橋結合させたゼラチン、およびＧＡと架橋結合させたポリビニルアルコールが
含まれる。

【００５６】化学的架橋結合に対する効率的な代替法は放射線を用いた架橋結合である。例
えばγ線または電子ビームのような高エネルギー放射線に曝露させられたポリマ
ー鎖は放射線により開始される遊離基を通して自然に架橋結合するであろう。ほ
ぼあらゆるポリマーはこのプロセスによって架橋結合させることができる。例え
ばポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ＰＥＯ、および線状ポリアクリルアミドの
ような親水性ポリマーは、微生物滅菌という本発明にとって付加利益を伴って、
この方法に適用できることが証明されている。

【００５７】本発明に使用できるもう１つのタイプのゲル（物理的特性に基づく）は軟質ゲ
ルである。軟質ゲルは、ゲル化媒質の組成およびその濃度に依存して粘性液体か
ら柔軟な固体にまで及ぶ連続体において所見されるプディング様一貫性を有して
いる。そのようなゲルは低い剪断作用下で流れに抵抗するが、充分な圧力下では
あらゆる形状に成形できるという望ましい特性を有している。軟質ゲルの特性は
、主として長い、しばしば分岐状のポリマー鎖の絡み合いを通して発生する。

【００５８】ほとんどの天然ゴムおよび多数の非架橋結合、または最小架橋結合合成ポリマ
ーは軟質ゲルを作り上げるであろう。これらのゲルの製造プロセスは、フィルム
を形成するためのポリマーの溶液もしくは懸濁液を乾燥させるステップ、または
部分的に脱水されたポリマーペーストを所望の形状にする押出し加工、打抜き加
工または圧延加工をのいずれかを含むであろう。

【００５９】本発明に使用できるポリマー材料の特定タイプ、およびそれが硬質ゲルもしく
は軟質ゲルであるのか、またはそれが天然、合成、もしくは半合成であるのかは
余り重要ではない。より重要なのは、本発明に利用される材料の特定の物理的特
性である。本発明に有用な可能性があるポリマーには下記のものが含まれるが、
それらに限定されない。例えばキサンタンゴム、グアールゴム、イナゴマメゴム
、ペクチン、デンプン、トラガカントゴム、デキストラン、寒天、アガロース、
カラゲナン、アルギン酸塩、およびその他の天然ゴムのような多糖類、例えばカ
ルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）およびヒドロキシエチルセルロースおよび
その他のセルロース、デンプン、グアール、アルギン酸塩、キチンおよびデキス
トラン誘導体のような半合成ポリマー類、アクリル酸、アクリルアミド、ビニル
−ピロリドン、ビニル−アルコール、ヒドロキシエチルメタクリレートおよび多
数の他のアクリル、ビニルもしくはスチレンを基剤とするモノマー類を含むモノ
マー類のいずれかもしくは組み合わせ並びにポリエチレングリコール、酸化ポリ
エチレン、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコール、および上記の
いずれかのコポリマー類もしくは混合物から製造された合成ポリマー類。

【００６０】本発明の好ましい実施形態では、不動化層は相互に連結した網を崩壊させるこ
となく大量の液体サンプルを吸収するために十分に柔軟性であるポリマー鎖が相
互に連結した網から作られており、このとき相互連結ポリマー鎖間の間隙空間の
サイズは培養／検出される微生物の平均サイズより平均して小さい。このため、
サンプル内の微生物の全部または大部分は、サンプル量が大量である場合にさえ
不動化層の上面で不動化されるであろう。多くの微生物は、直径がおよそ０．１
〜１マイクロメーターである。このため、本発明のある好ましい実施形態では、
相互連結ポリマー鎖間の間隙空間は１マイクロメーター未満であり（例、０．１
〜１マイクロメーター）、より好ましくは０．５マイクロメーター未満であり、
さらに一層０．１マイクロメーター以下と小さい場合さえある。

【００６１】微生物を培養するために使用される典型的な寒天プレートは、その上に添加さ
れる約０．０２ｍＬ／ｃｍ²以下のサンプル液を吸収する。本発明では、ポリマ
ー鎖が相互に連結した網はポリマー網の初期容積の５０％〜４００％の液体サン
プルを吸収することができる。本発明では、０．０４ｍＬ／ｃｍ²より多量（例
、０．０４〜１．０ｍＬ／ｃｍ²、または標準寒天プレートの容積の２〜５０倍
）の液体容量を吸収することができる。ある好ましい実施形態では、０．０５ｍ
Ｌ／ｃｍ²より多量の、または例えば０．１ｍＬ／ｃｍ²〜０．７ｍＬ／ｃｍ²の
（標準プレートの容積の５〜３５倍）ような０．１ｍＬ／ｃｍ²より多量さえの
液体容量を吸収することができる。また別の好ましい実施形態では、例えば０．
２ｍＬ／ｃｍ²〜０．４ｍＬ／ｃｍ²（標準寒天プレートの容積の１０〜２０倍）
のような０．２ｍＬ／ｃｍ²より多量の液体容量を吸収することができる。その
ような容量の液体は、２０時間以内、好ましくは１０時間以内、または４時間未
満以内でさえ前記不動化層によって吸収することができる（一部の実施形態では
、バルク液は１５分間以内に吸収される）。

【００６２】表面上に微生物をまだ保持しながらそのような大量のサンプル液を吸収するこ
の能力は、直接にプレート上での血液のプレーティング（例、患者からの直接吸
引）を含む広範囲の領域における培養／検出デバイスの使用を可能にする。溶解
剤および／または溶解酵素は血液サンプル中の開放気泡を破壊させるために不動
化層上および／または中に分散させることができる。さらに、サンプル（例、食
品サンプル、製造液または飲料水）が極めて低濃度である場合は、プレートへ添
加されるサンプル内に微生物が存在する機会はプレーティングされたサンプル容
量が増加するにつれて増加するので、従って検査の効率が改善される。

【００６３】不動化層は、（ゲルマトリックスに追加して）培地、抗生物質、抗菌性中和剤
、インジケーター（指示薬）、洗浄剤、溶解剤、または１種以上のサポートマト
リックス（デバイスの最終的使用に依存して）を含むことができる。サポートマ
トリックスは、ゲル層に物理的強度を追加するため、またはデバイスの製造にお
いて役立つように追加することができる。サポートは、それが液体を通過させる
ために十分に多孔性である限りは、織布もしくは不織布、フィルター膜もしくは
個別ファイバーであってよい（サポートがその上にバルク液サンプルが添加され
る不動化／ゲルマトリックス層の上部に配置される場合は、液体通路が必要であ
る）。サポートはさらにまた不動化層とセンサー層（一方が用意される場合）の
間に配置する、または不動化層全体に分散させることもできよう。図８から明ら
かなように、１つの例としてトップサポート層８０は、第２サポート層８４の上
に置かれている不動化層８２の上に配置されており、第２サポート層８４は順に
センサー層８６の上に置かれており、それらは全部が容器８８の中にある。

【００６４】現在までに本発明の数種の実施例が試験され、実現可能性が証明されている。
様々な方法が、このコンセプトを広範囲の適用のためにどのように調整できるか
を証明している。

【００６５】［実施例１］ＣＭＣ乾燥フィルム１．５％（ｗ／ｖ）カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ、オールドリッチ・
ケミカル（ＡｌｄｒｉｃｈＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ）社製、平均分
子量：７００，０００）を１５分間、１２１℃での液体サイクルでオートクレー
ブ滅菌した。冷却後、この溶液を１０ｍＬずつ径６０ｍｍ（内径５２ｍｍ、２１
．２ｃｍ²）のペトリ皿へ添加し、５０℃で一晩かけて乾燥させた。その後汚染
からの細菌負荷を減少させるために１時間に渡り８０℃へ温度を上昇させた。

【００６６】ヒツジ血に約１０ＣＦＵ／ｍＬの濃度で黄色ブドウ球菌（ＡＴＣＣ＃２５９２
３）をスパイクし、最終濃度０．５％（ｗ／ｖ）となるまでサポニンを添加する
ことにより溶解させた。乾燥ＣＭＣフィルムに２．５ｍＬの溶解血液溶液を接種
し、被覆し、３５℃で一晩インキュベートした。

【００６７】一晩のインキュベーション後、全部の液体はゲル内に吸収されており、相互に
分離された黄色ブドウ球菌のコロニーがゲルの表面上で容易に観察され、さらに
そこから採取された。ゲル内への細菌の目に見える浸透はなく、さらにゲルのバ
ルク内に捕捉されているコロニーも見られなかった。この実施例では、単位表面
積当たりの吸収された液体量は０．１２ｍＬ／ｃｍ²であった。

【００６８】［実施例２］ポリアクリルアミド光開始ポリアクリルアミドゲルを形成するための前重合液は下記の組成物を用
いて作成した。アクリルアミド／ビスアクリルアミド（１０％Ｔ、０．４％ＣＯ
、ＴＥＭＥＤ（０．０４％ｖ／ｖ）、リン酸リボフラビン（０．００２５％、ｗ
／ｖ）、およびリン酸ナトリウム（１０ｍｍｐＨ６．５、最終濃度）。この溶
液を２０ｍＬずつ径９０ｍｍ（内径８６ｍｍ、５８．１ｃｍ²）のペトリ皿へ添
加した。ペトリ皿を積み重ね、嫌気性大気発生器パックを用いて嫌気性培養ビン
中に密封した。嫌気性ビンはその後、重合前に酸素が除去されるように暗所に３
０分間置いた。

【００６９】ビンの中のプレートをその後、約２３℃で一晩かけて、約１０ｃｍの距離から
１５Ｗ卓上用蛍光灯スタンド下で照明した。重合後、各ゲルの上部に５ｍＬの１
０％グリセロールを添加し、その後ゲルを３５℃で一晩乾燥させ、細菌汚染を減
少させるために６５℃で１時間焼成した。

【００７０】これらのゲルは１０ｍＬのトリプシンソイブロス（ＴＳＢ）を用いて部分的に
再水和させた。ＴＳＢを吸収させた後、ゲルに約１０ＣＦＵ／ｍＬの密度で大腸
菌（ＡＴＣＣ＃２５９２２）をスパイクした５ｍＬのＴＳＢの添加によって接種
した。接種されたゲルを被覆し、３５℃で一晩インキュベートした。

【００７１】一晩のインキュベーション後、全部の液体はゲル内に吸収されており、相互に
分離された大腸菌のコロニーがゲルの表面上で容易に観察され、さらにそこから
採取された。この実施例では、単位表面積当たりの吸収された液体量は０．２６
ｍＬ／ｃｍ²であった。

【００７２】［実施例３］サポートを含むキサンタン／グアールペーストペーストは、１０ｇの前水和キサンタンゴムおよび２．５ｇの前水和グアール
ゴムを５０ｍＬのトリプシンソイブロス（ＴＳＢ）と一緒に結合することによっ
て作製した。ペースト部分を２層の織られたナイロンサポートメッシュの間に挟
み、１．５ｇのペーストが約６０ｍｍ径の円を形成するまでプラスチック板の間
に挟んでプレスした。５１ｍｍ径のパンチを使用してペースト・サンドイッチの
円を切り抜き、これをポリカーボネートシートへ移し、オートクレーブにより滅
菌した。冷却後、ペーストを部分的に水和させてディスクの配置に役立つように
ペースト円を０．５ｍＬのＴＳＢと一緒に径６０ｍｍ（内径５２ｍｍ）のペトリ
皿へ移した。

【００７３】抗凝固剤としてＳＰＳを用いてヒト血液を採取し、約２５ＣＦＵ／ｍＬの濃度
で黄色ブドウ球菌（ＡＴＣＣ＃２５９２３）または大腸菌（ＡＴＣＣ＃２５９２
２）を用いてスパイクした。スパイク血は２．０％サポニン（ｗ／ｖ）と等量の
ＴＳＢの添加によって溶解させた。ガムペーストディスクに５．０ｍＬの溶解血
液溶液を接種し、被覆し、３５℃で一晩インキュベートした。

【００７４】一晩のインキュベーション後、全部の液体はゲル内に吸収されており、相互に
分離された黄色ブドウ球菌および大腸菌のコロニーがゲルの表面上で容易に観察
され、さらにそこから採取された。ゲル内への細菌の目に見える浸透はなく、さ
らにゲルのバルク内に捕捉されているコロニーも見られなかった。この実施例で
は、単位表面積当たりの吸収された液体量は０．２４ｍＬ／ｃｍ²であった。

【００７５】［実施例４］炭を含むキサンタン／グアールペーストペーストは、１０ｇの薬用粉炭（抗菌性中和剤）を混合物に添加すること以外
は、実施例３に従って調製した。この調製物のペーストディスクを製造し、実施
例３と同様に接種した。液体の吸収および微生物の増殖は実施例３と比較して顕
著に影響を受けなかった。

【００７６】［実施例５］膜フィルター、サポートを含むキサンタン／グアールペーストペーストディスクは、上を向いているサポートが膜フィルター（ＧｅｌｍａｎＳｕｐｏｒ−４５０）であること以外は、実施例３と同様に製造かつ接種した
。液体の吸収は実施例３と比較して顕著な影響を受けなかったが、増殖培地の表
面はより平滑な外観を有しており、細菌コロニーをより容易に視認することがで
きた。

【００７７】［実施例６］キサンタン／グアールペースト対寒天ペーストは、ペーストを２０ｇの前水和キサンタンゴム、５ｇの前水和グアー
ルゴムおよび５０ｍＬのトリプシンソイブロス（ＴＳＢ）から構成したこと以外
は、実施例３に従って調製した。この調製物のペーストディスクは実施例３と同
様に製造し、ＴＳＢ中の約２５ＣＦＵ／ｍＬの濃度の大腸菌（ＡＴＣＣ＃２５９
２２）を用いて接種した。接種量の範囲は１０．６ｍＬまで試験した。同時に、
市販で入手可能な９０ｍｍ血液寒天プレート（内径８６ｍｍ、５８．１ｃｍ²）
を同様に２．０ｍＬまでの用量で接種した。どちらのセットの接種プレートも穿
孔したプラスチックバッグ内に封入し、３５℃で一晩インキュベートした。イン
キュベーション後、プレートを取り出し、液体取り込みおよび細菌コロニーにつ
いて試験した。

【００７８】全部のペーストディスクが１０．６ｍＬまでの接種液を全部吸収しており、さ
らに細菌コロニーを表面上で視認できた。血液寒天プレート上では、吸収最高量
は１．０ｍＬであった。この実施例では、ペーストディスクは０．５０ｍＬ／ｃ
ｍ²を吸収していたが、寒天プレートは０．０２ｍＬ／ｃｍ²未満しか吸収しなか
った。

【００７９】上記の説明を読めば、当業者であれば十分に本発明を実践することができる。
ここに記載した実施例は決してクレームの範囲を限定するものであると解釈され
てはならない。実際に、ここに図示かつ記載したものに加えて本発明の様々な変
形は、上記の説明を読めば当業者には明白となり、添付のクレームの範囲内に含
まれるであろう。

【図面の簡単な説明】

【図１】微生物の表面培養を実施するための装置の一実施形態を示す図である。

【図２】図１の装置の断面図である。

【図３】表面培養装置の別の実施形態を示す断面図である。

【図４】表面培養装置のさらに別の実施形態を示す断面図である。

【図５】大腸菌に対して陽性の３つの表面培養装置の底部を示す図である。

【図６】微生物の表面培養を実施するための装置へのバルク液サンプルの添加を示す図
である。

【図７】バルク液サンプルが微生物を表面上に留まらせたまま吸収されている本発明の
装置を示す図である。

【図８】本発明のさらに別の実施形態を示す横断面である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ジェフリー，スコット・アールアメリカ合衆国ノースカロライナ州27613，ローリー，ヴィクトリア・ウッズ・ドライヴ 12712 (72)発明者メアシュ，マーティン・ジェイアメリカ合衆国ノースカロライナ州27712，ダーラム，ドレイトン・コート３ (72)発明者ソープ，サーマン・シーアメリカ合衆国ノースカロライナ州27712，ダーラム，リプスコーム・ドライヴ 6713 Ｆターム(参考） 4B029 AA07 AA21 BB01 CC02 CC07 FA02 4B063 QA01 QQ05 QR68 QR69 QS39

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】容器と、前記容器内にポリマー鎖が相互に連結した網から作
られている不動化層とを含んでなる微生物を培養するための装置であって、培養
中にサンプル内の微生物の実質的に全部が前記不動化層の表面上で不動化される
ように、前記相互に連結したポリマー鎖の間の間隙の平均のサイズが培養される
微生物の平均のサイズより小さい装置。
【請求項２】前記間隙が１０マイクロメーター未満である請求項１に記載
の装置。
【請求項３】前記間隙が１．０マイクロメーター未満である請求項２に記
載の装置。
【請求項４】前記間隙が０．１マイクロメーター未満である請求項３に記
載の装置。
【請求項５】前記ポリマー鎖が相互に連結した網が、前記不動化層の表面
積１ｃｍ²当たり０．０４ｍＬより多量のサンプルを吸収することのできる請求
項１に記載の装置。
【請求項６】前記ポリマー鎖が相互に連結した網が、前記不動化層の表面
積１ｃｍ²当たり０．０５ｍＬより多量のサンプルを吸収することのできる請求
項５に記載の装置。
【請求項７】前記ポリマー鎖が相互に連結した網が、前記不動化層の表面
積１ｃｍ²当たり０．１ｍＬより多量のサンプルを吸収することのできる請求項
６に記載の装置。
【請求項８】前記不動化層の上および／または中に分散された溶解剤およ
び／または溶解酵素をさらに含んでなる請求項１に記載の装置。
【請求項９】前記不動化層が固体または半固体の層である請求項１に記載
の装置。
【請求項１０】前記不動化層が親水性ポリマーを含んでなる請求項９に記
載の装置。
【請求項１１】前記不動化層が微生物の増殖を促進するための栄養素を含
んでなる請求項１に記載の装置。
【請求項１２】前記不動化層が抗生物質、抗菌性中和剤、インジケーター
、洗浄剤、選択的物質および培地のうちの少なくとも１つをさらに含んでなる請
求項１に記載の装置。
【請求項１３】サポートマトリックスをさらに含んでなる請求項１に記載
の装置。
【請求項１４】前記サポートマトリックスが不動化層の中におよび／また
はその隣接層として用意されている請求項１３に記載の装置。
【請求項１５】前記不動化層と前記容器との間に配置されたセンサー層を
さらに含んでなる請求項１に記載の装置。
【請求項１６】前記センサー層は、前記不動化層がその上で微生物を有す
る部分に隣接する領域で前記センサー層の色の変化を起こすインジケーターを含
んでなる請求項１５に記載の装置。
【請求項１７】前記センサー層が紫外線、可視光線および／または赤外線
スペクトルにおける局所的変化を受けることのできる請求項１５に記載の装置。
【請求項１８】前記局所的変化が前記容器の壁を通して検出可能である請
求項１７に記載の装置。
【請求項１９】前記不動化層の近くまたは中にコンディショニング剤をさ
らに含んでなる請求項１に記載の装置。
【請求項２０】前記センサー層が不透明である請求項１５に記載の装置。
【請求項２１】容器と、前記容器内にポリマー鎖が相互に連結した網から
作られている不動化層とを含んでなる微生物を培養するための装置であって、前
記相互に連結したポリマー鎖の間の間隙の平均のサイズが培養される微生物の平
均のサイズより小さい装置を提供することと、潜在的に微生物を含有する液体サンプルを、前記不動化層の表面積１ｃｍ²当
たり少なくとも０．０４ｍＬの容量で前記装置に添加することと、前記液体サンプルを前記不動化層内に完全に吸収させて不動化させるとともに
、前記液体サンプル内に存在する実質的に全部の微生物を前記不動化層の上面に
不動化させることと、存在する微生物の増殖を可能にするために、一定期間に渡って前記サンプルを
含む装置をインキュベートすることと、前記不動化層上に存在する微生物を検出することとを含んでなる微生物を検出するための方法。
【請求項２２】前記微生物の検出後に、さらなる検査をするために、前記
不動化層の前記上面から少なくとも１つの微生物コロニーを取り出だす請求項２
１に記載の方法。
【請求項２３】前記さらなる検査が抗生物質感受性検査および／または識
別検査である請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】前記サンプルが不透明な液体サンプルである請求項２１に
記載の方法。
【請求項２５】前記サンプルが全血またはその一部分である請求項２４に
記載の方法。
【請求項２６】前記サンプルが体液または食品サンプルである請求項２１
に記載の方法。
【請求項２７】前記液体サンプルの容量が前記不動化層の表面積１ｃｍ²
当たり少なくとも０．０５ｍＬである請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】前記液体サンプルの容量が前記不動化層の表面積１ｃｍ²
当たり少なくとも０．１ｍＬである請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】前記不動化層の間隙が１０マイクロメーター未満である請
求項２１に記載の方法。
【請求項３０】前記不動化層の間隙が１．０マイクロメーター未満である
請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】前記不動化層の間隙が０．１マイクロメーター未満である
請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】前記サンプル内に存在する微生物が別々のコロニーとして
不動化層の表面で不動化するように、一定の期間内に前記ポリマー鎖が相互に連
結した網に前記サンプルを吸収させる請求項２１に記載の方法。
【請求項３３】前記ポリマー鎖が相互に連結した網に前記液体サンプルを
２０時間以内に吸収させる請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】前記ポリマー鎖が相互に連結した網に前記液体サンプルを
１０時間以内に吸収させる請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】前記ポリマー鎖が相互に連結した網に、網の初期容量の５
０％〜４００％の液体サンプルを吸収させる請求項２１に記載の方法。
【請求項３６】微生物の視認性を向上して微生物の採取を容易にするため
に、前記不動化層上の膜をさらに含んでなる請求項１に記載の装置。
【請求項３７】前記サンプル内に存在する微生物が別々のコロニーとして
不動化層の表面で不動化するように、一定の期間内に前記ポリマー鎖が相互に連
結した網が前記サンプルを吸収することができる請求項１に記載の装置。
【請求項３８】前記ポリマー鎖が相互に連結した網が、２０時間以内に前
記サンプルを吸収することができる請求項３３に記載の装置。
【請求項３９】前記ポリマー鎖が相互に連結した網に前記サンプルを４時
間以内に吸収させる請求項３４に記載の方法。
【請求項４０】前記ポリマー鎖が相互に連結した網に前記サンプルを１５
分間以内に吸収させる請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】前記ポリマー鎖が相互に連結した網が、４時間以内に前記
サンプルを吸収することができる請求項３８に記載の装置。
【請求項４２】前記ポリマー鎖が相互に連結した網が、１５分間以内に前
記サンプルを吸収することができる請求項４１に記載の装置。