JPS6339239B2

JPS6339239B2 -

Info

Publication number: JPS6339239B2
Application number: JP57159693A
Authority: JP
Inventors: Uiiringaa Hansu; Uiitsuoreku Rotaaru; Buraisutainaa Manfureeto
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1981-09-16
Filing date: 1982-09-16
Publication date: 1988-08-04
Also published as: ATE17871T1; EP0075215B1; JPS5860999A; FI71164B; FI823192L; FI823192A0; EP0075215A1; DE3136695A1; FI71164C; DE3268964D1

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、微生物抑制物質を検出する部材に関
する。抗生物質及び他の微生物の生長を抑制する物質
の検出は、一般に寒天拡散（Agardiffusion）の
原理（例えば薄片試験：Bla¨ttchentest、寒天孔
試験：Agarlochtest）に従がい実施される。指
示生体としては、一般に、その顕著な形態発育が
バイオーアツセイに利用されるバシルス属
（Bacillaceae）の微生物が使用される。この細菌
の内生芽胞形成能力は、それが環境の影響例えば
熱、乾燥、毒物及び照射線に対する高い抵抗を示
すので、生態学的及び使用技術的に重要である。
その隠匿状態で、胞子発芽及び引続く植物生長が
最適環境条件に達するまで内生芽胞を持続する。
他方、芽もしくは植物相の間の生長抑制物質（抗
生物質、界面活性剤、物質代謝拮抗物質等）に対
する比較的高い感度は、これら物質の定性定量検
出に利用することができる。バシルス属の細菌を
生長抑制物質の検出のための生体指示薬として使
用することは、現在慣用されている。このため
に、これら細菌の内生芽胞を栄養寒天中に埋め込
み、被検物質を寒天拡散原理により試験する。医療において、体液中の細菌性伝染病の診断
は、屡々、抑制物質の存在により困難にされる。
抑制物質に基づく誤まつた陰性所見は、例えば、
尿診断では被検尿の30％までも達しうる。この理
由から、慣用の細菌検査に平行して、抑制物質の
存在に関する試験が必要になつているが、これ
は、そのきまりきつた検査のための複雑な経過に
基づき、一般に経費がかかり、従つて実施される
ことはまれである。この種の試験においては、ペ
トリ皿中の栄養寒天中に内生芽胞を埋め込み、こ
の上に、試料を含浸し、乾燥されている濾紙薄片
を置き、低温で予備インキユベートし、、恒温保
持する。抑制物質の存在する場合には相応する濾
紙薄片のまわりで細菌の生長が停止する。この方
法の使用は、複雑な取扱いと共に、この種の方法
における比較的困難な試料同定に基づき問題があ
り、更に、この方法は、少ない試料数では非能率
的である。更に、胞子の加えられた寒天プレート
の非常に低い安定性もあり、これは冷蔵庫内でも
数週間貯蔵できるだけである。乳製品及び肉製品中で、試料の抗生物質不含を
検査することは義務として規定されている。この
ためには、指示微生物として特バシルス・ステア
ロテルモフイルス・バール・カリドラクチス
（Bacillus stearothermophilus var.calidolactis）
が使用される。試料の検査は、前記の尿試料に関する記載と同
様に経費のかかる方法で行なわれる。本発明の課題は、細胞が封入法の間には害され
ず、その発芽性及び分裂性が完全に保持され、発
芽性胞子の抗生物質に対する感度はあまり影響さ
れず、封入された細胞が封入マトリツクスで技術
的に問題なく加工することのできる、生細胞の固
定もしくは封入法を見つけることである。細胞は、封入された状態での貯蔵の間には潜在
的に生長可能のまま残り、その生長は、マトリツ
クスの外から加えられる刺激によつてはじめて誘
起されるべきである。マトリツクスのこの支持構
造は、細胞生長をあまり限定してはならない。こ
の封入法のためには、細胞と反応する試薬又は、
細胞の生長に害を及ぼすようなものを使用しては
ならない。微生物の担体固定のためには種々の方法が公知
であり、これらは次のカテゴリーに分けることが
できる：表面での吸着、表面への共有結合、細胞
相互の網状化、細胞のカプセル封入、多孔性マト
リツクス中への細胞の封入（J.Klein.Kontakte
３／８０Firmenzeitschrift der Firma E.Merck.
Darmstadt参照）。これらの方法はすべて、細胞の酵素的潜在能力
をできるだけ狭い空間に集約し、酵素活性が種々
な変換反応に関するある種のケージ（Ka¨fig）を
供給できるように固定することを意図している。この目的は、ポリマー網中に固定及び／又は封
入することにより達成される。従来公知の方法
を、前記文献から取り出し次表に示す：

【表】

【表】この課題の評価のもとで、従来公知のいずれの
方法も、解決法としては適当ではない。それとい
うのも、公知のプレパレーシヨン法は、細胞の必
要量を封入することのできない攻撃的な試薬を必
要とするか又はマトリツクスから技術的に問題な
く加工できるフイルムを製造することができない
からである。試薬としてのプレパレーシヨン形の
使用にとつて、フイルムの製造は、唯一の実際的
可能性である。それというのも、他のすべての変
法は大きい容量を必要とし、従つて取扱いが困難
であるからである。この課題は次のようにして解決される：細胞を水性プラスチツク分散液及びオープナー
（O¨ffnern）の水溶液よりなる混合物（この中に
なお添加物が入れられていてもよい）中に撹拌導
入する。このフイルム原料を常法でベース材上に
例えば注ぐか、塗布するか又はドクター塗布し、
引続き乾燥させる。こうして製造したフイルム中
に細胞を大きな機械的負荷によつてのみ取り出す
ことができるように、堅固に固定する。乾燥フイ
ルムは、微生物を10〜10⁹個／ｇの量でかつ水溶
性又は水膨潤性の高分子のオープナー並びに場合
により他の添加物を含有し、この際、プラスチツ
ク対オープナーの量比は1000：１〜１：10であ
る。分散粒子及びオープナーの機能は次のように説
明することができる：オープナー即ち、水溶性又は水膨潤性の高分子
物質を、分散液フイルム中に封入することによ
り、このフイルムの特性を、それが、オープナー
を有しないフイルムよりも著るしく多くの水を吸
収するように変える。水を良好に吸収する能力
と、フイルム中への水溶性物質例えば栄養物もし
くは抑制物質を困難なく拡散導入することができ
る事実も結合している。オープナーは、分散粒子
の球包装中に開放位置を穿孔し、この中に細胞が
入り貯蔵されるが、フイルム構造はフイルム形成
がもはやできない程度まで害されることはない。フイルムの外側から湿らせると、細胞上へ生長
刺激作用が及び、細胞はフイルムの開放部から充
分に生長しはじめる。栄養物質と同時に抑制物質
も細胞に近づくと、コロニー形成の生長は停止す
る。生じたコロニーは公知方法で指示薬例えばPH
−指示薬、トリフエニルテトラゾリウム塩等を用
いて眼に見えるようにすることができる。これに反して、細胞をプラスチツク分散液（こ
れにはオープナーは混入されていない）中に導入
し、フイルムを形成すると、細胞は気密に封入さ
れる。水吸収能を有するフイルムを形成する分散
液を使用すると、栄養物質もしくは抑制物質の侵
入は、この種のフイルムには開放位置が存在しな
いので著るしく害されるから、僅かな発芽及びコ
ロニー生長が観察されるだけである。多かれ少なかれ疎水性フイルムを形成する分散
液の場合には、一般にコロニー生長はもはや認め
られない。本発明方法にとつて多くの原料が使用可能であ
る。原料を後に詳述する。これらには、使用細胞に
対する抑制物質ではなく、抑制物質で不純化され
ておらず、かつ抑制物質の作用を排除しないこと
が重要な前提となる。原料管理にとつて必要である抑制物質不含に関
する試験は、公知の典型的方法例えば寒天稀釈試
験で困難なく実施することができる。フイルム形成剤としては、実際に、すべての水
性プラスチツク分散液例えば酢酸ビニルからホモ
ポリマー、アクリル酸エステルからのホモポリマ
ー、酢酸ビニルとプロピオン酸ビニルとからのコ
ポリマー、プロピオン酸ビニル、アクリロニトリ
ル及びアクリル酸エステルからのコポリマー、酢
酸ビニルとフレイン酸エステルからのコポリマ
ー、ブタジエンとスチロールとからのコポリマ
ー、塩化ビニルとプロピオン酸ビニルとからのコ
ポリマー等が挙げられる。オープナーとしては原則的にすべての高分子の
水溶性物質が使用可能である。これには、例えば
水溶性の全合成高分子ポリマー例えばポリビニル
ピロリドン、ポリビニルアルコール、部分鹸化さ
れた酢酸ポリビニル、酢酸ビニルとビニルピロリ
ドンとからのコポリマー、ポリエチレングリコー
ル、ポリエチレンオキシド樹脂、アクリル酸ポリ
マー、メチルビニルエーテルと無水マレイン酸と
からの共重合体等が挙げられる。同様に水溶性の
半合成生成物及び純粋な天然物例えばメチルセル
ロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキ
シプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロ
ース、アルギン酸塩、ゼラチン、多糖類、デンプ
ン等並びにこれら物質の混合物も挙げられる。添
加物としては、緩衝塩、中性塩、糖、蛋白質、湿
潤剤、顔料、軟化剤、例えばグリセリン、ポリグ
リコール等並びに微生物の生長を示す指示薬、例
えばPH指示薬、トリフエニルテトラゾリウム誘導
体等を使用することができる。フイルム原料は、１容器中にプラスチツク分散
液を準備し、これにオープナーの溶液及び添加物
を加え、撹拌下にホモゲナイズしてフイルム原料
にすることにより製造する。この場合、分散液か
らの固体成分とオープナー及び添加物固体成分と
の間の混合割合を大きい範囲内で選択することが
できる。混合比は次の観点により決めるべきであ
る：ａフイルム原料から生じるフイルムは、それ自
体閉じられた単位を形成すべきである。即ち、
フイルムは亀裂を示してはならず、充分に物質
特異性及び分散液及びオープナーの交換作用に
より決められる現象を示す。ｂフイルムは、栄養物質及び場合によつては抑
制物質が充分に細胞へ入ることが可能であるよ
うに開放されているべきであり、即ち同様に充
分に物質特異性及び分散液とオープナー並びに
添加物の交換作用により決められる現像を示
す。ｃある程度、混合割合は、分散液及びオープナ
ー溶液の粘度によつても決められる。この場合
にはフイルム原料の粘度は、もちろん、工業的
に更に加工可能であるように調節されるべきこ
とのみに注意すべきである。即ち、例えば低粘
度物質のものよりも高粘度オープナーを少なく
使用することができる。前記のすべての事実を考慮して、分散液固体対
オープナー固体の混合比を1000：１〜１：10に選
択することができる。添加物の濃度は、その都度の個々の要求に応じ
て選択される。指示薬、軟化剤及び湿潤剤は、こ
れら物質が細胞に抑制作用を及ぼすか、もしくは
フイルムを軟かすぎるか又は脆すぎるようになる
時に合せて比較的低い濃度で使用されることは明
白である。選択すべき塩濃度及び糖及び蛋白質の
濃度は細胞の生長能力に負の影響を及ぼしてはな
らない。同様に、助剤によりフイルムの安定性に
負の影響があつてはならない。即ち、その濃度は
一定上限を越えてはならない。フイルム原料からフイルムに加工する前に、細
胞を10〜10⁸個／ml（原料）の濃度でこの中に撹
拌導入する。フイルムの形成は公知方法で、例え
ば型への注入、担体の被覆、フイルム材料中に封
入される支持組織の被覆などにより行なわれる。本発明方法の有利な用途は、微生物の貯蔵及び
搬送装置の製造のためにこの方法を使用すること
である。このために、細胞をフイルムマトリツク
ス中に封入し、これを乾燥貯蔵する。微生物が必
要になつたら、そこでフイルムに栄養ブイヨンを
塗布するかこの中に入れ、恒温保持し、微生物を
増殖させる。もう１つの使用可能性は、医学、獣
医学及び食品管理等の検査の分野における生物学
的物質中の抑制物質の検出のための胞子フイルム
の使用である。このために、抑制物質に対して特
に敏感な微生物の胞子例えばバシルス・スブチリ
ス又はバシルス・ステアロテルモフイルスからの
胞子をフイルム原料中に導入する。この原料か
ら、透明な担体上にフイルムを塗布し、乾燥さ
せ、かつフイルムを取扱いに便利な大きさに切断
する。この胞子フイルムを栄養厚紙と共に被験溶
液例えば尿、ミルク、肉汁等中に潰け、恒温保持
する。抑制物質の不存在時には、この胞子は発芽
し、引続く生長を指示薬で検出することができ
る。指示薬としては、コロニーを着色する物質、
例えばトリフエニルテトラゾリウム化合物又は芽
の生長によるPHを−変化を指示するPH−指示薬が
使用される。有利な工業的実施形は、試験片で慣用であると
同様な構造を選択することである。このために、
担体上に栄養厚紙及びその上にある透明担体上に
形成される胞子フイルムを網を用いて、胞子フイ
ルムのフイルム側が栄養厚紙の担体と反対側の上
にくるように固定する。栄養厚紙としては、それぞれ微生物にとつて好
適な栄養物質で含浸された吸着性材料、有利に濾
紙、ガラス繊維又はプラスチツクフリース又は乾
燥状態で充分に安定なゲルを使用することができ
る。乾燥した寒天層又は類似物質は、それらが
徐々に液体を再吸収するので使用できない。次に本発明の方法を実施例につき詳述する。例１この例では、使用プラスチツク水性分散液の広
く平面状にする可能性を示す：担体マトリツクス（この中に細胞が細胞が封入
される）の製造は次のように行なう：１容器中にプラスチツク分散液60ｇを準備す
る。こ分散液は例えば次の慣用の水中の50〜60％
分散液を使用することができる：酢酸ビニルよりなるホモポリマー、アクリル酸
エステルよりなるホモポリマー、酢酸ビニルとプ
ロピオン酸ビニルとからのコポリマー、プロピオ
ン酸ビニル、アクリロニトリル及びアクリル酸エ
ステルからなるコポリマー、酢酸ビニルとマレイ
ン酸エステルとのコポリマー、ブタジエンとスチ
ロールとのコポリマー、塩化ビニルとプロピオン
酸ビニルとのコポリマー等。これら分散液を1/15Ｍ燐酸塩緩衝液（PH6.5）
中のポリビニルピロリドンの40％溶液35ｇと共に
撹拌し、PH値を検査し、場合によつては後調節す
る。次いで、混合物を無菌の蒸留水200mlで稀釈
し、例えばバシルス・スブチリスの胞子10³〜10⁷
細胞を、分散液−オープナー混合物１ｇ当りに加
え、撹拌する。こうして得たフイルム原料0.5ml
を一辺の長さ２cmの立方体容器中にピペツト導入
し、乾燥させる。こうして製造したフイルム上に、トリフエニル
テトラゾリウムクロリド（TTC）0.02％を含有
する栄養ブイヨン１mlを置き、閉じた容器中で恒
温保持すると、容器の下側に生長したコロニー
が、微生物の濃度に応じて赤色点〜濃い均一な赤
色領域として生じる。この例は使用可能なオープナーの可能性に関す
る： 2a １容器中に、例えば酢酸ビニルとプロピオ
ン酸ビニルとの共重合体の分散液62ｇを水200
mlと共に入れる。これに、オープナーの溶液37
ｇを加え充分に撹拌する。オープナー溶液は、
１／１５Ｍ燐酸塩緩衝液（PH6.5）中に、表中に記
載の濃度のオープナーを溶かして製造する。酸
性反応をするオープナーでは、苛性ソーダで溶
液を調節する。第３表は、緩衝液中のオープナーの可能な濃度
及びこれら混合物から膜状で生じるプラスチツク
分散液からの固体とオープナーからの固体との混
合割合を記載している：

【表】酸ビニルとからのコポ
リマー
2b 例2aを変更して、比較的高濃度のオープナ
ー溶液から出発してもよく、これは、常にオー
プナーが比較的低粘度の溶液を生じる際に可能
である。第４表にこの可能性を示す。

【表】セルロース２％溶
液
2c 例2aを変更して、種々異なるオープナー物
質の混合物も使用できる。酢酸ビニルとプロピオン酸ビニルとの共重合体
の水性分散液46ｇ、1/15Ｍクエン酸塩緩衝液（PH
6.5）中のポリエチレングリコールの４％溶液4.2
ｇ、1/5Ｍクエン酸塩緩衝液（PH6.5）中のポリビ
ニルピロリドンの40％溶液16.0ｇ、グリセリン
0.4ｇ及び水200mlを撹拌して均一物質にする。前記のフイルム原料中に、バシルス・スブチリ
スの胞子をフイルム原料１ｇ当り10⁶個の濃度で
導入する。こうして製造した胞子フイルム原料か
ら各0.5mlを一辺の長さ２cmの容器中にピペツト
導入し、乾燥させる。このように製造したフイル
ム上にトリフエニルテトラゾリウムクロリド0.02
％を含有する栄養ブイヨン１mlを施こし、閉じた
容器を恒温保持すると、生長したコロニーは赤色
点として現われる。栄養溶液に抑制物質例えば抗
生物質を相応する濃度で含有する試料を混入する
際にこの生長は止まる。例３牛乳中の抗生物質の検出法酢酸ビニルとプロピオン酸ビニルとのコポリマー
の分散液50ｇ、水17ml中のポリビニルピロリドン
12ｇの溶液20ｇ、グルコース１ｇ及びバシルス・
ステアロテルモフイルス・バール・カリドラクチ
ス（Bacillns stearothermophilus var.
Calidolactis）の胞子10⁸個を均一に撹拌し、引続
き水150mlで稀釈し、苛性ソーダでPHを7.0に調節
する。こうして作つたフイルム材料から、それぞ
れ0.1mlを平底を有する直径１cmの円筒容器中に
ピペツト導入し、乾燥させる。牛乳中の抗生物質
の試験のために、指示薬ブロムクレゾールブルー
を含有する牛乳媒体で作つた栄養厚紙を試料中に
浸漬させ、このフイルム上にのせ、容器を密閉
し、60℃で恒温保持する。抑制物質が不在の際に
は、栄養厚紙はオリーブ緑色を示し、抑制物質が
存在する際には、恒温保持の後にも青色のまま残
る。この方法では、抗生物質が抑制物質としてのそ
の作用に関して検出できる。重要な抗生物質例え
ばペニシリン、テトラサイクリン及びクロムフエ
ニコールはこの方法で次の濃度以上で測定でき
る。ペニシリン0.002μｇ／ml、テトラサイクリン
0.1μｇ／ml、クロラムフエニコール4μｇ／ml。例４液体中の抗生物質を検出する部材酢酸ビニルとプロピオン酸ビニルとからの分散
液200ｇ、ポリビニルピロリドン30ｇの溶液90ｇ、
0.2モルのクエン酸塩緩衝液（PH6.5）100ml中の
ポリエチレングリコール10ｇ、グルコース５ｇ、
ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート
7.2ｇ、バシルス・スブチリスATCC6051の胞子
10⁹個を撹拌して均一物質にする。このフイルム原料を100μの厚さで透明シート
上に塗布し、乾燥させ、引続き幅１cmの帯状物に
切断する。この帯状フイルムを、抗生物質試薬媒
体用栄養物及びトリフエニルテトラゾリウムクロ
リドで含浸した栄養厚紙と一緒に、公知方法で栄
養厚紙が担持シート上に存在し、フイルム側を有
する胞子フイルムが栄養厚紙上に存在し、双方
が、栄養厚紙と並んでこのシート上に固定されて
いる網で固定されるように１cm幅の試薬片に加工
する。こうして製造した試験片で、後記の濃度以上の
抗生物質が、その抑制作用に関して検出できる。
このために、試験すべき水性溶液中にこの試験片
を浸漬し、37℃で恒温保持する。抑制物質の不存
在時には、試験部位に深赤色に着色し、抑制物質
が存在する際には、後に記載の濃度までに脱色が
現われる。高い抑制濃度では、胞子の生長を完全
に抑制し、試験領域は呈色しない。

【表】例５液体中の抗生物質を検出する部材酢酸ビニルとプロピオン酸ビニルとからの分散
液450ｇ、水155ml中のデキストラン80ｇ、クエン
酸5.6ｇ、NaOH3.8ｇ、１，２―プロパンジオー
ル4.5ｇの溶液230ｇ、グルコース10ｇ、バシル
ス・スブチリスの胞子２×10⁹個を有する懸濁液
２mlを均一に撹拌する。このフイルム原料を透明なシート上に120μの
厚さで塗布し、乾燥させ、引続き幅１cmの帯状物
に切断する。濾紙厚紙２−（Ｎ−モルホリノ）―エタンスル
ホン酸の1/15Ｍ緩衝液（PHを6.5）より成り、慣
用の組成の栄養物質及びトリフエニルテトラゾリ
ウムクロリド0.04％を溶解含有する栄養ブイヨン
で含浸することにより栄養厚紙を作る。この栄養厚紙を同様に幅１cmの帯状物に切断す
る。胞子フイルム及び栄養厚紙を公知方法で、栄
養厚紙が担持シート上に存在し、胞子膜が栄養厚
紙のフイルム側に存在し、双方が、栄養厚紙と隣
接してシート上に固定されている網で固定するよ
うに加工して幅１cmの試験片にする。前記の緩衝液は常法で使用される緩衝液と比べ
て、尿の高い滲透圧に帰因する胞子の生長に対す
る障害が著るしく低下される利点を有する。こうして作つた試験片で、後に記載の濃度以上
の抗生物質をその抑制作用に関して検出すること
ができる。このために、試験片を被検体液中に浸
漬し、37℃で恒温保持する。抑制物質不含の際に
は試験領域は深赤色に着色し、抑制物質が存在す
る際には、後に記載の濃度までで、脱色する。よ
り高い抑制物質濃度では、胞子の生長は完全に抑
止され、試験領域の呈色は現われない。

【表】

Claims

【特許請求の範囲】１栄養基質及び微生物を含有する基質よりな
る、液体試料中の微生物抑制物質を検出する部材
において、この微生物を含有する基質は、微生物
を10〜10⁹個／ｇの量で、かつ水溶性又は水膨潤
性の高分子のオープナー並びに場合によつては他
の添加物を含有する水性プラスチツク分散液から
製造した乾燥フイルムであり、ここでプラスチツ
クとオープナーとの量比は1000：１〜１：10であ
ることを特徴とする、液体試料中の微生物抑制物
質を検出する部材。２分散液フイルムが透視性担持材上に固定され
ている、特許請求の範囲第１項記載の部材。３担持材は、その底部又は壁にフイルムが固定
されている容器である、特許請求の範囲第２項記
載の部材。４栄養基質を無菌の乾燥ゲルもしくは凍結乾燥
物として含有する、特許請求の範囲第３項記載の
部材。５栄養基質は、層状で、栄養物質で含浸され、
担体上に固定され、かつ被覆している担体に固定
されている分散液フイルムで被われている吸着性
物質よりなる、特許請求の範囲第１項又は第２項
記載の部材。６吸着性物質は濾紙又はフリースである、特許
請求の範囲第５項記載の部材。