FI71164C - Anordningar foer paovisning av aemnen som haemmar tillvaexten av mikroorganismer - Google Patents

Description

1 71164

Laitteet, joilla voidaan osoittaa mikro-organismien kasvua ehkäiseviä aineita

Keksintö koskee laitteita, joilla voidaan osoittaa mikro-organismien kasvua ehkäisevien aineiden olemassaolo.

Antibioottien ja muiden mikro-organismien kasvua ehkäisevien aineiden osoittaminen tapahtuu yleisesti agar-diffuusion perusteella (esimerkiksi levytesti ja agarreikätesti). Indikaattoriorganismeina käytetään yleensä Bacillaceae-heimoon kuuluvia mikro-organismeja, joiden selväpiirteistä morfogeneesiä käytetään hyväksi biokokeessa. Näiden bakteerien endosporien muodostuskyvyllä on suuri ekologinen ja tekninen merkitys koska ne saavuttavat hyvin suuren resistenssin ympäristön vaikutuksiin kuten kuumuuteen, kuivuuteen, toksisiin aineisiin ja säteilyyn nähden. Endosporit oysy-vät elossa tässä kryptobioottisessa tilassa niin kauan, kunnes suotuisat miljööolosuhteet tekevät mahdolliseksi itiöiden kasvun ja sitä seuraavan vegetatiivisen kasvun. Toisaalta voidaan käyttää hyväksi niiden suhteellisen suurta herkkyyttä kasvua ehkäisevien aineiden suhteen (antibiootit, pesuaineet, aineenvaihdunnan antagonistit jne.) itiöiden muodostumisvaiheen tai vegetatiivisen vaiheen aikana näiden aineiden kvalitatiiviseen ja kvantitatiiviseen osoittamiseen. Bacillaceae-heimon bakteerien käyttö bioindikaattoreina kasvua ehkäisevien aineiden osoittamiseksi on nykyään jo rutiininomaista. Tätä varten pannaan näiden bakteerien endosporeja ravinneagariin ja tutkittava aine testataan agar-dif fuusioperiaatteen perusteella.

Humaanilääketieteessä vaikeuttaa ehkäisevien aineiden mukanaolo usein ruumiin nesteissä olevien bakteerien aiheuttamien infektiosairauksien diagnoosia. Esimerkiksi virtsadiagnostii-kassa saattaa väärien negatiivisten lausuntojen lukumäärä nousta jopa 30 %:iin tutkituista virtsoista ehkäisyvaikutuksen 2 71164 vuoksi. Tästä syystä vaaditaan rinnakkaisesti rutiininomaisen bakteerien osoittamisen kanssa ehkäisevien aineiden testi, joka on kuitenkin monimutkaisen luonteensa vuoksi tavallisesti liian hankala rutiinitutkimuksia varten, ja suoritetaan sen vuoksi vain harvoin. Tällaisessa testissä upotetaan endosporeja petrimaljoissa ravinneagariin, pannaan suodatinliuskojen päälle, jotka on kostutettu näytteen kanssa ja kuivattu, ja sitten alhaisessa lämpötilassa esi-inkuboidaan ja inkuboidaan. Jos ehkäiseviä aineita on mukana, puuttuu bakteerien kasvu vastaavan suodatinliuskan ympäriltä. Paitsi monimutkaista käsittelyä on tämän menetelmän käyttäminen ongelmallinen myös tällaisissa menetelmissä melko vaivalloisesti suoritettavan näytteen identifioimisen vuoksi ja sitä paitsi on menetelmä pienten näytemäärien vuoksi epärationaalinen.

Tähän tulee lisäksi myös hyvin heikko varastointikestävyys, sillä agarlevyt, joissa on itiöitä säilyvät vain muutamia viikkoja jääkaapissa.

Maito- ja lihataloudessa on tuotteiden antibioottipuhtauden toteaminen ehdottoman pakollista. Tällöin käytetään indi-kaattorimikro-organismina etupäässä Bacillus stearothermophilus var.calidolactis'ta.

Kokeiden tutkiminen tapahtuu samalla hankalalla tavalla kuin edellä on selostettu virtsakokeista.

Kyseessä olevan keksinnön tehtävänä oli löytää elävien solujen kiinnittämis- tai sulkemismenetelmä, jossa solut eivät vahingoitu sulkemismenetelmän aikana .niiden itämis- ja jakau-tumiskyky säilyy täydelleen, kehittyvien itiöiden herkkyys antibioottien suhteen ei muutu olennaisesti ja suljettujen solujen jatkokäsittely sulkemismatriisin kanssa on teknisesti mahdollista.

Solujen on siis pysyttävä suljetussa tilassa säilyttämisen aikana potentiaalisesti kasvukykyisinä ja kasvu indusoidaan vasta matriisin ulkopuolelta tulevan ärsytyksen kautta.

3 71164

Matriisin tukikudos ei saa rajoittaa solun kasvua olennaisesti. Sulkemismenetelmässä ei saa käyttää mitään reagens-seja, jotka reagoisivat solujen kanssa tai sellaisia, jotka voisivat vaikuttaa solujen kasvua vahingoittavasti.

Mikro-organismien kiinnittämiseksi alustaan tunnetaan useita erilaisia menetelmiä, jotka voidaan jakaa seuraaviin kategorioihin: adsorboiminen pintaan, kovalenttinen sitominen pintaan, solujen verkkouttaminen keskenään, solujen kapseloiminen, solujen sulkeminen huokoiseen matriisiin. (Vrt.

J.Klein, Kontakte 3/80 firma E.Merck, Darmstadt, firmanlehti).

Kaikki menetelmät pyrkivät konsentroimaan ja kiinnittämään solujen entsymaattisen potentiaalin mahdollisimman ahtaaseen tilaan, niin että entsyymiaktiviteetti olisi eräänlaisessa häkissä käyttövalmiina mitä erilaisimpia reaktioita varten.

Tähän päämäärään päästään kiinnittämällä ja/tai sulkemalla polymeeriseen verkostoon. Tähän asti tunnetut menetelmät esitetään seuraavissa kahdessa taulukossa, jotka on otettu alan kirjallisuudesta (j. Klein, KOntakte 3/80 firma E. Merck, Darmstadt, firmanlehti).

4 71164 S, 3 fO c •n tn 3 Hl Φ

3 -H -P X -H

tn 3 -P tn o § tn 3 tn o £> 3 £ 3 -y jo -h 3 3 -h >, 3

t3 P rH -H in rH H H

*r~t to -H rH *H 3 •H > -H a) M C > s s-S s S5 S o P 3 -P 3 -H tn tn 3 ή tn -h tn 3 -h -h

HQ G1 -H Dj rH O

ctöinco e _ <o tn o s> „ § rH o 3 to tn

X to H C O -H -n e 3 C

O -P Φ -H -h 0 3 3 -Ρ -P 3 3 tn :ctj a) -h en e

tn -H -H m >i 44 rH o -P -H -H

oO <xi m 2hh v tn :3

p $ Il "i äo|^H iS

P « > g w X -P tn £ -P >

m ä -H 5 I

φ -H 3 % 'S f 3 g -h h οΝ-ρ-ηώρη >, 3 -P -h -H rH -p H S -H >1

•y -H 3 3 Ή -P -H 3 φ 3 3 ij rHH

77 -h cc tn-h op» -Pg g tn ί m o. 2 SS 8 s M «5 Is ?! P 3 3 Ή 3 -P 3 ttJrH X rH -h h 44(1) h 92 ,33 3 m tn to 3 O O Q 3 tn 3 73 g -h rH tn § 3 H p H-P >. H -Η.Η&ΛΗ 44 >1 >,5,-0

"H 3 ' lp '—I D H Ό Dj H i—I O 1—I 1—I ·—I *H

44 co 303 Φ tn O 3 ι-j .p 3 3 Φ UjO O O g 0<L) w <1 X X CO 3 CU W rtj CO .3 X tn W CU ftft s 44 tn 44 -H 3 g rH φ 3 44

3 >—I

^ ^ W S S

w -H 3 C O

£ Ή *H ·Η ·Η ·Η *H

C “ M-l 4-j -p -p .p -P

3 O tn tn e cc 3 |u & a s s X X tn to -H (0 33 O p 73 :3 :3 e > >>

tn Φ Φ & Dj O O OO

> p w ω h x xx e φ

-P

tn l •H 3 3 n e g o

44 6 Q

0 55 ^ -h -h * *a i ΐ s s ii 1¾¾¾ i, li &

2 S ä e! ·3 3 3 3 S

Ο X CU CU CU O OS

1 s f k 44 | S CU (!) 3 e? 3 h g e o. 3 Φ 3 tn > t I 8 * I Ή p

p «. 5 S ΰ-si s-2 I

tn >i rH tn ΟΉ-Ρ >,+jPi X+j Φ O coin rH 3 ' i o

>H -H ,Φ 3 O Φ Q 0 3 O -H

g Ö to H 3 Ό CU tn CU -P

-H . .

2 Ή γη ro Ό· in 5 71164

Taulukko 2

Kaksivaihemenetelmä kokonaisten solujen sulkemiseksi polymeerin verkostoon

Menetelmien yhdistelmä Esimerkki 1. Geeliyttäminen ja konden- Kollageeni ja glutar- saatio aldehydi

Karrageenani ja glutar-aldehydi 2. Ionotrooppinen geelin muodostuminen ja kontrolloitu Alginaatti/Ca kuivaus 3. Ionotrooppinen geelin muodos- Alginaatti ja epoksidi tuminen ja polykondensaatio 4. Polykondensaatio ja poly- Epoksidi ja polymetakryyli- merointi amidi

Arvioitaessa asetettua tehtävää on ilmeistä, ettei mikään tähän asti tunnetuista menetelmistä ole soveltuva ratkaisuksi, koska tunnetuissa valmistusmenetelmissä vaaditaan joko agres-siivisia reagensseja, tarpeellisia määriä soluja ei voida saada suljetuiksi, tai matriisista ei voida valmistaa ilman teknisiä vaikeuksia kalvoja. Kalvojen valmistaminen on preparaatti-muodon puolesta reagenssina ainoa käyttökelpoinen ratkaisu, koska kaikki muut variaatiot ovat liian suuria tilavuudeltaan ja siten liian vaikeita käsitellä.

Asetettu tehtävä ratkaistiin seuraavalla tavalla:

Solut sekoitetaan seokseen, joka muodostuu vesipitoisesta muo-vidispersiosta ja "aukaisijoiden" vesiliuoksesta, johon on vielä voitu lisätä lisäaineita. Tämä raakakalvomassa esimerkiksi valetaan, sivellään, levitetään pyyhkäisyterällä jne. alustan päälle tavalliseen tapaan ja sen jälkeen kuivataan. Näin valmistetuissa kalvoissa ovat solut lujasti kiinnitettyinä, niin että ne saadaan ulos vain voimakkaalla mekaanisella kuormi- g tuksella. Kuivat kalvot sisältävät mikro-organismeja 10-10 /g ja vesiliukoisia tai vedessä paisuvia makromolekyylisiä aukaisevia aineita sekä mahdollisesti muita lisäaineita, ja muovin 6 71164 ja aukaisevien aineiden määräsuhde on 1000:1-1:10.

Dispersiohiukkasten ja "aukaisevan aineen" toimintatapa voidaan selittää seuraavalla tavalla:

Kun "aukaisevia aineita" so. vesiliukoisia tai vedessä paisuvia makromolekyylisiä aineita lisätään dispersiokalvoihin, muuttuvat nämä kalvot ominaisuuksiltaan siten, että ne pystyvät imemään olennaisesti enemmän vettä itseensä kuin kalvo, jossa ei ole aukaisevia aineita. Veden hyvään imukykyyn liittyy myös se seikka, että kalvoon voivat vesiliukoiset aineet kuten ravinteet tai estoaineet helposti diffundoitua. Aukaisevat aineet muodostavat ennakolta dispersiohiukkasten tiiviiseen palloon "avoimia kohtia", joihin solut ovat varastoituneet ilman, että ne kuitenkaan häiritsisivät kalvon rakennetta niin, ettei kalvon muodostuminen enää olisi mahdollista.

Jos nyt kalvon ulkopuolelta sitä kostuttamalla kohdistetaan soluihin kasvuärsytys, ne alkavat kasvaa kalvon "avoimista osista" lähtien. Jos samanaikaisesti tuodaan ravinteiden kanssa esto-aineita soluihin, jää kasvaminen oesäkkeiksi tapahtumatta. Muodostuneet pesäkkeet saadaan näkyviksi tunnetulla tavalla indikaattorien kuten esimerkiksi pH-indikaattorien ym. avulla.

Jos sen sijaan soluja pannaan muovidispersioihin, joihin ei lisätä mitään aukaisevia aineita, ja muodostetaan kalvoja, ovat solut tiiviisti sisäänsuljettuja. Jos käytetään dispersioita, joista muodostuu kalvoja, joilla on vedenimukyky, voidaan havaita vain vähäistä itämistä ja oesäkkeiden kasvua, koska ravinteiden tai estoaineiden sisäänpääsy on voimakkaasti estynyttä, koska sellaisissa kalvoissa ei ole mitään "avoimia kohtia".

Dispersioissa, jotka muodostavat enemmän tai vähemmän hydrofobisia kalvöja, ei ole havaittavissa yleensä enää minkäänlaista pesäkkeiden muodostumista.

7 71164

Keksinnön mukaisessa menetelmässä soveltuvat useat raaka-aineet käytettäviksi.

Raaka-aineet tullaan jäljempänä selostamaan tarkemmin. On olemassa ainoastaan yksi tärkeä ehto, että ne eivät ole minkäänlaista estoainetta käytettäville soluille, että estoai-neet eivät ole saastuttaneet niitä ja että ne eivät lisää esto-aineiden vaikutusta.

Raaka-ainekontrollina käytetty estoaine-puhtaustesti voidaan helposti suorittaa tunnetuilla klassisilla menetelmillä, esimerkiksi agarlaimennustestillä.

Kalvonmuodostajina voidaan käyttää käytännöllisesti katsoen kaikkia vesipitoisia muovidispersioita kuten esimerkiksi vi-nyyliasetaatin ja akryylihappoestereiden homopolymeerejä, kopolymeerejä vinyyliasetaatista ja vinyylipropionaatista, vinyylipropionaatista, akryylinitriilistä ja akryylihappoes-tereistä, vinyyliasetaatista ja maleiinihappoestereistä, butadieenistä ja styrolista, vinyylikloridista ja vinyylipropionaatista jne.

Aukaisevina aineina ovat periaatteessa kaikki vesiliukoiset makromolekyyliset aineet sopivia. Niitä ovat esimerkiksi vesiliukoiset täyssynteettiset suurmolekyyliset polymeerit kuten polyvinyylipyrrolidonit, polyvinyylialkoholit, osittain saippuoituneet polyvinyyliasetaatit, kopolymeerit vinyyliasetaatista ja vinyylipyrrolidonista, polyetyleeniglykolit, poly-etyleenioksidihartsit, akryylihappopolymerisaatit, sekapoly-merisaatit metyylivinyylieetteristä ja maleiinihappoanhydri-distä jne. Samoin vesiliukoiset puolisynteettiset tuotteet ja puhtaat luonnontuotteet kuten esimerkiksi metyyliselluloosa, hydroksietyyliselluloosa, hydroksipropyyliselluloosa, karboksi-metyyliselluloosa, alginaatit, gelatiinit, polysokerit, tärkkelykset jne. sekä näiden aineiden seokset. Lisäaineina voidaan käyttää: puskurisuoloja, neutraaleja suoloja, sokeria, valkuaisaineita, kostutusaineita, pigmenttejä, pehmentäjiä kuten esimerkiksi glyseriiniä, propyylialkoholia jne., samoin kuin 8 71164 indikaattoreita, jotka ilmaisevat mikro-organismien kasvun, kuten esimerkiksi pH-indikaattorit, trifenyylitetra-atsoliumjohdannaiset jne.

Kalvon raakamassat valmistetaan siten, että ensin pannaan astiaan muovidispersio, siihen aukaisevan aineen liuos ja lisäaineet ja homogenoidaan raakamassa sekoittamalla. Tällöin voidaan sekoitussuhde dispersion kiinteiden aineiden, aukaisevan aineen kiinteiden aineiden samoin kuin lisäaineiden osuuksien välillä valita laajoissa rajoissa. Sekoitussuhteet saadaan selville seuraavien näkökohtien mukaisesti: a) Kalvon raakamassasta muodostettujen kalvojen on muodostettava suljettu yksikkö, so. niissä ei saa olla halkeamia, ilmiö joka määräytyy paljolti aineelle spesifisistä ominaisuuksista ja dispersion ja aukaisevan aineen vuorovaikutuksista.

b) Kalvojen tulee olla riittävän "avoimia" päästääkseen ravinteita ja mahdollisesti estoaineita riittävästi soluihin, tämäkin ilmiö on paljolti aineelle spesifisistä ominaisuuksista ja dispersioiden ja aukaisevien aineiden vuorovaikutuksista riippuvainen.

c) Sekoitussuhde määräytyy myös jossain määrin dispersioiden ja aukaisijaliuosten viskositeetin mukaan. Tällöin on otettava huomioon, että kalvon raakamassan viskositeetti on säädettävä luonnollisesti vain sellaiseksi, että sitä voidaan teknisesti valmistaa edelleen. Tämä merkitsee sitä, että hyvin viskooseja aukaisevia aineita voidaan käyttää vain vähemmän kuin alemman viskositeetin omaavia aineita.

Kun otetaan huomioon kaikki edellä mainitut seikat, voidaan sekoitussuhteet dispersioiden kiinteiden aineiden ja aukaisevien aineiden kiinteiden aineiden välillä valita esimerkiksi näin: 1000: 1-1:10.

9 71164

Lisäaineiden konsentraatiot valitaan kulloinkin esiintyvien yksittäisten tarpeiden mukaan. On selvää, että indikaattoreita, pehmentäviä aineita ja kostutusaineita lisätään suhteellisen alhaisissa konsentraatioissa, jotka määräytyvät sen mukaan mistä alkaen nämä aineet vaikuttavat estävästi soluihin, tai tekevät kalvot liian pehmeiksi tai liian hauraiksi. Valittavilla suolakonsentraatioilla ja sokeri- ja valkuais-ainekonsentraatioilla ei saa olla minkäänlaista negatiivista vaikutusta solujen kasvamiskykyyn. Samoin on varottava, ettei lisäaineiden vuoksi kalvojen stabiilisuuteen tule negatiivista vaikutusta, eli niiden konsentraatio ei saa ylittää ylärajaa.

Ennen kalvojen raakamassan valmistusta kalvoiksi sekoitetaan

O

siihen soluja konsentraatioon 10-10 /ml kohti raakamassaa. Kalvojen valmistus voi tapahtua tunnettujen menetelmien mukaan, kuten valamalla muotteihin, alustoja päällystämällä, tuki-kudoksia päällystämällä, jotka suljetaan kalvon massaan jne.

Keksinnön mukaisen menetelmän parhaana pidetyt käyttöalueet ovat:

Menetelmää käytetään valmistamaan varastointi- ja kuljetus-laitteita mikro-organismeille. Tätä varten solut suljetaan kalvomatriisiin ja nämä varastoidaan kuivina. Kun mikro-organismeja tarvitaan, niin kalvo peitetään ravinneliemellä tai pannaan siihen, inkuboidaan ja siten mikro-organismi lisääntyy. Toinen käyttömahdollisuus on itiökalvojen käyttö esto-aineiden osoittamiseen biologisessa materiaalissa humaanilää-ketieteen tutkimusten piirissä, eläinlääketieteen ja elintarvikkeiden kontrollin piirissä jne. Tällöin menetellään seuraavasti: Estoaineita vastaan erikoisen herkkiä mikro-organisme ja esimerkiksi Bacillus subtilis tai Bacillus stearothermophilus sekoitetaan kalvon raakamassaan. Näistä raakamassoista sivellään läpinäkyvän alustan päälle kalvo, kuivataan ja leikataan kalvot sopivan kokoisiksi. Itiökalvo kastetaan yhdessä ravin-nekartongin kanssa tutkittaviin liuoksiin kuten virtsaan, maitoon, lihamehuun jne. ja inkuboidaan. Kun estoaineita ei ole, kehittyvät itiöt ja sitä seuraava kasvu voidaan osoittaa indikaattorilla. Indikaattoreiksi käytetään aineita, jotka joko 10 71164 värjäävät pesäkkeet kuten esimerkiksi trifenyylitetra-atso-liumyhdisteet tai pH-indikaattoreita, jotka ilmaisevat itiöiden kasvun aiheuttaman pH-muutoksen.

Parhaana pidetty tekninen toteutusmuoto on se, että valitaan sama rakenne kuin on testiliuskoissa tavallisesti. Alustan päälle kiinnitetään ravinnekartonki ja tämän päälle läpinäkyvän alustan päälle muodostettu itiökalvo verkon avulla siten, että itiökalvon kalvon puoli tulee ravinnekartongin alustasta poispäin olevalle sivulle.

Ravinnekartonkina voidaan käyttää kulloinkin kyseessä oleville mikro-organismeille sopivilla ravinteilla impregnoitua imukykyistä materiaalia, etupäässä suodatinpaperia, lasikuitu-tai muovikarstaharsoa, tai kuivassa tilassa riittävän stabiilia geeliä.

Kuivuneita agarkerroksia tai sen kaltaisia aineita ei voida käyttää, koska ne imevät liian hitaasti nestettä.

Keksinnön mukaista menetelmää valaistaan esimerkkien avulla lähemmin.

Esimerkki 1 Tässä esimerkissä tullaan esittämään käytettävien muovidis-persioiden hyvin laajoja mahdollisuuksia.

Alustamatriisin valmistamista varten, johon solut ovat suljettuina, menetellään seuraavalla tavalla:

Astiaan pannaan 60 g muovidispersiota. Dispersiona voidaan käyttää esimerkiksi seuraavia kaupasta saatavia 50-60 %:sia vesidispersioita: homopolymeerejä vinyyliasetaatista, akryyli- happoestereistä, kopolymeerejä vinyyliasetaatista ja vinyyli-propionaatista, vinyylipropionaatista, akryylinitriilistä ja akryylihappoestereistä, vinyyliasetaatista ja maleiinihappo-estereistä, butadieenistä ja styreenistä, vinyylikloridista ja vinyylipropionaatista jne.

11 71164

Dispersiot sekoitetaan 35 g:n kanssa 40-prosenttista polyvi-nyylipyrrolidoniliuosta 1/15 molaariseen fosfaattipuskuriin pH 6,5, pH-arvo tarkistetaan ja mahdollisesti säädetään uudestaan. Sitten seos laimennetaan 200 ml:11a steriiliä tislattua 3 7 vettä ja siihen lisätään 10 -10 solua esimerkiksi Bacillus subtilis-itiöitä grammaa kohti dispersio-aukaiseva aine-seosta ja sekoitetaan hyvin. 0,5 ml näin saatua raakakalvomassaa pipetoidaan neliön muotoisiin astioihin, joiden sivu on 2 cm ja kuivataan.

Jos näin valmistettujen kalvojen päälle tuodaan 1 ml ravinne-liuosta, joka sisältää 0,02 % trifenyylitetra-atsoliumklori-dia (TTC) ja inkuboidaan suljettuja astioita, niin kasvaneet pesäkkeet tulevat esiin astian alapuolella aina mikro-organismin konsentraatiosta riippuen punaisina pisteinä tai tiheänä homogeenisenä punaisena kenttänä.

Esimerkki 2 Tässä esimerkissä käsitellään sopivan aukaisevan aineen mahdollisuuksia .

2 a) Astiaan pannaan 62 g esimerkiksi vinyyliasetaatin ja vi-nyylipropionaatin kopolymeerin dispersiota ja 200 ml vettä. Tähän lisätään 37 g aukaisevan aineen liuoksia ja sekoitetaan hyvin. Aukaisevan aineen liuokset valmistetaan siten, että liuotetaan 1/15 molaariseen fosfaattipuskuriin, pH 6,5 aukaisevia aineita taulukossa ilmoitetut konsentraatiot. Happaman reaktion omaavilla aukaisevilla aineilla liuokset säädetään natronlipeällä.

Taulukko 3 sisältää esimerkkejä aukaisevien aineiden mahdollisista konsentraatioista puskuriliuoksessa ja ilmoitukset näistä seoksista kalvossa syntyvistä sekoitussuhteista muovidispersion kiinteiden aineiden ja aukaisevan aineen kiinteiden aineiden välillä.

12 71164

Taulukko 3

Aukaiseva Aukaisevan ai- Sekoitussuhde aine neen konsentraa- dispersion kiintiö käytetyssä teiden aineiden puskuriliuoksessa ja aukaisevan ai neen kiinteiden aineiden välillä kalvossa Tärkkelys 1 % 80:1

Dekstraani 43 % 2:1

Alginaatti 2,35 %' 36:1

Metyyliselluloosa 1,5 % 57:1

Metyleenihydroksi- etyyliselluloosa 2,5 % 34:1

Metyylihydroksi- propyyliselluloosa 4,0 % 21:1

Hydroksipropyyli- 4,0 % 21:1 selluloosa 0,5 % 170:1

Hydroksietyyliselluloosa 4,0 % 21:1

Polyvinyylialkoholi 8,0 % 10:1

Polyetyleenigly- 15,0 % 5,5:1 kolihartsi 5,0 % 17:1

Polyakryylihappo 1,7 % 50:1

Kopolymerisaatti metyyli-vinyylietaanista ja maleiini- happoanhydridistä 23 % 3,7:1

Kopolymerisaatti vinyylipyrro-lidonista ja vinyyliase- tista 15 % 5,5:1 2 b) Muutoksena esimerkkiin 2 a voidaan lähteä myös suhteellisen korkeaprosenttisesta aukaisevan aineen liuoksesta, mikä on aina silloin mahdollista, kun aukaiseva aine muodostaa suhteellisen matalaviskoosisen liuoksen.

Taulukko 4 esittää tätä mahdollisuutta.

13 71164

Taulukko 4

Aukaiseva Vesipitoisen dis- Sekoitussuhde aine persion ja aukaise- dispersion kiin- van aineen liuok- teiden aineiden sen painosuhteet ja aukaisevan aineen kiinteiden aineiden välillä kalvossa

Polyetyleeniglykolin 50-prosenttinen liuos 50 g:450 g - 450 g:50 g 1:9 - 9:1

Polyvinyy1ipyrrolidonin 42-prosenttinen liuos 10 g:90 g - 90 g:10 g 1:7-11:1

Karboksimetyyliselluloosan 2-prosenttinen liuos 8 g:100 g 2:1 2 c) Muutoksena esimerkkiin 2 a voidaan käyttää myös erilaisten aukaisevien aineiden seoksia.

46 g vesipitoista vinyyliasetaatin ja vinyylipropionaatin seka-polymerisaatin dispersiota, 4,2 g 40-prosenttista polyetyleeniglykolin liuosta 1/15 molaarisessa sitraattipuskurissa pH

6,5, 16,0 g 40-prosenttista polyvinyylipyrrolidonin liuosta 1/15 molaarisessa sitraattipuskurissa, pH 6,5, 0,4 g glyserii-niä ja 200 ml vettä sekoitetaan homogeeniseksi massaksi.

Edellä selostettuun raakakalvomassaan lisätään Bacillus g subtilis-itiöitä konsentraation ollessa 10 grammaa kohti raakakalvomassaa. Näin valmistetusta itiöitä sisältävästä kalvon raakamassasta pipetoidaan aina 0,5 ml astioihin, joiden sivu on 2 cm ja kuivataan. Jos näin valmistettujen kalvojen päälle pannaan 1 ml ravinneliuosta, joka sisältää 0,02 % trifenyylitetra-atsoliumkloridia ja inkuboidaan suljetuissa astioissa, tulevat kasvaneet pesäkkeet esiin punaisina pisteinä. Kasvu jää tapahtumatta, jos ravinneliuokseen on sekoitettu näytettä, joka sisältää estoaineita, esimerkiksi antibioottia vastaavassa konsentraatiossa.

Esimerkki 3

Menetelmä antibiootin osoittamiseksi maidossa.

14 71164 50 g vinyyliasetaatin ja vinyylipropionaatin kopolymeerin dispersiota, 20 g liuosta, jossa on 12 g polyvinyylipyrrolidonia 8 17 ml:ssa vettä, 1 g glukoosia ja 10 Bacillus stearothermophilus var. calidolactis-itiöitä sekoitetaan keskenään homogeenisesti, laimennetaan sitten 150 ml :11a vettä ja säädetään natron-lipeällä pH-arvoon 7,0. Näin valmistetusta kalvomassasta pipetoidaan kulloinkin 0,1 ml lieriömäisiin astioihin, joiden läpimitta on 1 cm ja pohja tasainen, ja kuivataan. Maidossa olevan antibiootin testaamiseksi kastetaan näytteeseen ravinne-kartonkeja, jotka on valmistettu maitoväliaineesta, jossa on bromikresolisini-indikaattoria, pannaan kalvojen päälle, suljetaan astiat tiiviisti ja inkuboidaan 60°C:ssa. Jos estoaineita ei ole mukana, saavat ravinnekartongit oliivinvihreän värin, estoaineiden mukana ollen ne pysyvät inkuboimisen jälkeenkin sinertävinä.

Tämän menetelmän mukaan voidaan osoittaa antibiootit niiden vaikutuksen perusteella estoaineina. Tärkeitä antibiootteja kuten esimerkiksi penisilliini, tetrasykliini ja kloramfenikoli voidaan osoittaa tämän menetelmän avulla seuraavista konsentraa-tioista alkaen: Penisilliini alkaen 0,002 ^ug/ml, tetrasyklii ni alkaen 0,1 ^,ug/ml, kloramfenikoli alkaen 4 ^ug/ml.

Esimerkki 4

Testilaite antibioottien osoittamiseksi nesteissä.

200 g vinyyliasetaatin ja vinyylipropionaatin dispersiota, 90 g liuosta, jossa on 30 g polyvinyylipyrrolidonia, 10 g polyetyleeniglykolia 100 ml:ssa 0,2 molaarista sitraattipusku-ria pH 6,5, 5 g glukoosia, 7,2 g polyoksietyleenisorbitan- 9 mono-oleaattia, 10 Bacillus subtilis-itiöitä ATTC 6051 sekoitetaan homogeeniseksi massaksi.

Tällä kalvoraakamassalla päällystetään läpinäkyvä folio, kerroksen paksuus on 100 ^um, kuivataan ja tämän jälkeen leikataan 1 cm:n levyisiksi nauhoiksi. Nämä kalvonauhat yhdessä ravin-nekartongin kanssa, joka on impregnoitu antibioottien testi- ι5 71164 liuoksissa käytetyillä ravinteilla ja trifenyylitetra-atsoliumkloridillä, tunnetulla tavalla valmistetaan 1 cm:n levyisiksi testiliuskoiksi siten, että ravinnekartonki tulee olemaan alustafolion päällä ja itiöfilmi on kalvonsivu ravinne-kartongin päällä ja molempia pitää paikoillaan verkko, joka on kiinnitetty ravinnekartongin viereen folion päälle.

Näin valmistetulla testilaitteella voidaan osoittaa antibiootteja jäljessä esitetyistä konsentraatioista alkaen niiden esto-vaikutukseen perustuen. Tätä varten testiliuskat upotetaan tutkittaviin vesiliuoksiin ja inkuboidaan 37°C:ssa. Jos esto-aineita ei ole mukana, värjäytyvät testialueet syvän punaisiksi, estoaineiden kanssa tulee jäljessä ilmoitettuihin konsentraa-tioihin asti väri kirkkaammaksi. Korkeammissa estoaine-konsentraatioissa jää itiöiden kasvu täysin pois eikä testi-alueella esiinny mitään värinmuutosta.

Taulukko 5

Antibiootin minimi-estokonsentraatio on ilmoitettu Bacillus subtilis ATCC 6051:n suhteen agarlaimennustestissä (AVT) ja keksinnön mukaisessa menetelmässä.

Antibiootti Agarlaimennus- Testiliuska testi ^ug/ml yug/ml_ G-penisilliini 0,002 0,002

Kanamysiini 4 4

Tetrasykliini 4 1

Polymyksiini 32 16

Erytromysiini 0,125 0,32

Gentamysiini 0,125 0,2

Kloramfenikoli 2 2

Kotrimoksatsoli 8 8

Keftitsoksiimi 8 8

Esimerkki 5

Testilaite antibioottisesti vaikuttavien aineiden osoittamiseksi nesteissä.

i6 7116 4 450 g vinyyliasetaatin ja vinyylipropionaatin dispersiota, 230 g liuosta, jossa on 80 g dekstraania; 5,6 g sitruunahappoa; 3,8 g NaOH; 4,5 g 1,2-propandiolia 155 ml:ssa vettä; 10 g g glukoosia; 2 ml suspensiota, joka sisältää 2 x 10 Bacillus subtilis-itiöitä, sekoitetaan homogeeniseksi.

Tällä kalvon raakamassalla päällystetään läpinäkyvä folio ja kerroksen paksuudeksi tulee 120 ^um, kuivataan ja leikataan tämän jälkeen 1 cm:n levyisiksi nauhoiksi.

Valmistetaan ravinnekartonki siten, että impregnoidaan suoda-tinkartonki ravinneliuoksella, jossa on 1/15 molaarista puskuria 2-(N-morfoliino)-etaanisulfonihappo, pH-arvo 6,5, johon on liuotettu tavanmukaisen kokoomuksen omaavia ravinteita ja 0,04 % trifenyylitetra-atsoliumkloridia.

Tämäkin ravinnekartonki leikataan 1 cm:n levyisiksi nauhoiksi. Itiökalvo ja ravinnekartonki valmistetaan ennestään tunnetulla tavalla 1 cm:n levyisiksi testiliuskoiksi niin, että ravinnekartonki tulee olemaan alustafolion päällä, itiökalvo kalvosivullaan ravinnekartongin päällä ja molemmat pysyvät kiinni verkon avulla, joka on kiinnitetty ravinnekartongin viereen folion päälle.

Edellä olevalla puskurilla on verrattuna tavallisesti käytettyihin puskureihin se etu, että häiriöt itiöiden kasvussa, jotka johtuvat virtsan korkeista osmoottisista paineista, vähenevät huomattavasti.

Tällä tavoin valmistetulla testilaitteella voidaan osoittaa antibiootteja seuraavassa esitetyistä konsentraatioista alkaen niiden estovaikutuksen perusteella. Tätä varten testiliuskoja kastetaan tutkittaviin ruumiinnesteisiin ja inkuboidaan 37°C:ssa. Jos estoaineita ei ole mukana, värjäytyvät testi-alueet syvän punaisiksi, jos estoaineita on mukana, ilmestyy jäljessä ilmoitetuista konsentraatioista alkaen värin kirkastuminen. Korkeammilla estoainekonsentraatioilla jää itiöiden 17 71164 kasvu pois kokonaan, testialueella ei tapahdu mitään värin-muutosta.

Taulukko 6

Antibiooteista on ilmoitettu niiden minimiestokonsentraatio, joka löydettiin keksinnön mukaisella menetelmällä ja kirjallisuudesta tunnetulla vertailumenetelmällä /Levymenetelmä, Ärztl. Lab.10, 208-210 (19705/ virtsoista.

Antibiootti Keksinnön mukainen Vertailumene- menetelmä (^ug/ml) telmä (^ug/ml)

Ampisilliini 0,016 0,125

Kefatsoliini 0,125 2

Kloramfenikoli 2 8

Fosfomysiini 256 256

Gentamysiini 8 1

Nitrofurantoiini 16 64 G-penisilliini 0,016 0,031

Pipemidihappo 32 64

Polymyksiini B 512 512

Tetrasykliini 1 8

Trimetopriimi 16 32

Cotrimoksatsoli 2 128

Claims (7)

711 64

1. Laite mikro-organismien kasvua estävien aineiden osoittamiseksi nestemäisessä näytteessä ja laite muodostuu ravin-nesubstraatista ja mikro-organismeja sisältävästä substraatista, tunnettu siitä, että mikro-organismeja sisältävä substraatti on muovidispersiosta valmistettu kuiva kal- 9 vo, joka sisältää mikro-organismeja 10 - 10 /g ja vesiliukoisia tai vedessä paisuvia makromolekulaarisia aukaisevia aineita sekä ainakin yhtä lisäainetta, ja muovidis-persion ja aukaisevan aineen määräsuhde on 200:1 - 1:10.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen laite, tunnettu siitä, että dispersiokalvo on kiinnitetty läpinäkyvän alustan päälle.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen laite, tunnettu siitä, että alusta on astia, jonka pohjalle tai seinämälle kalvo on kiinnitetty.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen laite, tunnettu siitä, että ravinnesubstraatti on stabiilina kuivana geelinä tai lyofilisaattina.

5. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen laite, tunnettu siitä, että ravinnesubstraatti on kerroksen muodossa oleva, ravinneaineilla impregnoitu imukykyinen aine, joka on kiinnitetty alustaan ja peitetty dispersiokalvolla, joka puolestaan on kiinnitetty peittävään alustaan.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen laite, tunnettu siitä, että imukykyinen aine on suodatinpaperia tai karsta-harsoa .

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen laite, tunnettu siitä, että käytettävä lisäaine on puskuri, kostutusaine, orgaaninen happo ja/tai sokeri.