BR112015001166B1

BR112015001166B1 - método para isolar um micro-organismo de uma amostra que pode estar contaminada com o referido microorganismo, dispositivo e uso do mesmo

Info

Publication number: BR112015001166B1
Application number: BR112015001166-7A
Authority: BR
Inventors: Jean-Pierre Flandrois; Bernard Limon; Christine Rozand; Marie-Pierre Montet
Original assignee: bioMérieux
Priority date: 2012-07-20
Filing date: 2013-07-22
Publication date: 2020-11-17
Also published as: US20180135096A1; US10704078B2; CN104487563A; FR2993573B1; IN2015DN00441A; ES2676439T3; US20150176048A1; EP2875117A1; WO2014013089A1; BR112015001166A2; FR2993573A1; CN104487563B; US9902988B2; EP2875117B1

Abstract

MÉTODO PARA ISOLAR MICRO-ORGANISMOS EM UM MEIO DE CULTURA E DISPOSITIVO RELACIONADO. Trata-se de um método para isolar pelo menos um micro-organismo de uma amostra propensa a ser contaminada pelo dito micro- organismo, que inclui as seguintes etapas: (a) fornecer um dispositivo para isolar micro-organismos que inclui uma camada de fundo à prova d'água, uma camada nutricional, que é colocada na camada de fundo e que inclui um meio de cultura desidratado, uma camada de isolamento que é permeável aos elementos incluídos na camada nutricional e que tem capacidade de reter a superfície da mesma e cobrir toda ou parte da camada nutricional e uma camada de topo protetora; (b) depositar um volume predeterminado da amostra na camada de isolamento; (c) isolar os micro-organismos por meio de empobrecimento ou estratificação da amostra com o uso de um meio de isolamento; (d) incubar o dispositivo por uma quantidade predeterminada de tempo a uma temperatura predeterminada de modo a habilitar o crescimento dos micro-organismos, em que o dito método também inclui pelo menos uma etapa de reidratação do meio de cultura com o uso de um volume predeterminado de líquido antes ou ao mesmo em (...).

Description

[0001] A presente invenção refere-se em geral ao campo de análise microbiológica. Mais particularmente, refere-se a um método para isolar pelo menos um micro-organismo obtido a partir de uma amostra contaminada.

[0002] O isolamento de micro-organismos em um meio de cultura coloide, a começar de uma amostra a ser analisada ou uma suspensão de micro-organismos, é frequentemente uma etapa indispensável em muitos métodos de análise microbiológica. Essa etapa é notavelmente usada para realizar identificações, com a verificação da pureza microbiana de uma amostra, ou para realizar uma contagem bacteria- na pela contagem das colônias isoladas assim obtidas.

[0003] O objetivo das técnicas de isolamento é obter, na superfície de um meio de nutrientes coloide, colônias que sejam usáveis diretamente (CDU) para identificar e determinar a sensibilidade a antibióticos. As mesmas são conhecidas por uma pessoa versada na técnica, em que uma técnica de riscado é a técnica de referência. A última consiste em depositar o inoculo pela riscagem em uma superfície com uma probabilidade igual por unidade de área atravessada. A densidade local distribuída diminui quase exponencialmente durante a passagem da ferramenta. Assim, várias áreas de dispersão são preparadas a partir de um inoculo único, com ou sem sobreposição das áreas, a fim de obter o efeito adequado de distribuição e um desbastamento de bactérias no próximo segmento de dispersão. Ao final da dispersão, as células estão suficientemente isoladas entre si de modo que desenvolvimentos microbianos na forma de CDU (colônias ou microcolônias visíveis) não estejam superpostas, nem ao menos parcialmente. Essa técnica também pode ser executada por uma inoculação única e continua em uma espiral por meio de um prato giratório ou por um rebordo magnético acionado por um dispositivo que produz inoculação contínua que não causa sobreposição ou que opcionalmente não causa sobreposição adicional.

[0004] Outra técnica amplamente usada consiste no isolamento em uma placa de meio coloide por dispersão na superfície. Nesse caso, uma mistura de células a uma baixa concentração celular que permite que de 30 a 300 células sejam postas em cultura é espalhada na superfície do gel em uma placa de Petri com um diâmetro de 9 cm, em que cada célula se desenvolve em uma colônia isolada. Quando menos de 30 células são postas em contato com o gel nutriente, pro-blemas estatísticos afetam a exatidão da contagem.

[0005] Quando a quantidade contada está acima de 300 células, erros de contagem surgem devido à sobreposição das superfícies das colônias. A dispersão é normalmente efetuada com uma ferramenta que compreende, por exemplo, uma parte linear que está em contato com o gel ou com o uso de rebordos de poucos milímetros de diâmetro que rolam aleatoriamente na superfície em movimento desordenado. Essa técnica é adequada apenas para uma amostra levemente con-taminada ou diluída, uma vez que uma alta quantidade de células aumenta a probabilidade de confluência das colônias como um resultado de crescimento.

[0006] Também é possível realizar o isolamento em uma placa por inoculação profunda. A amostra inicial é diluída várias vezes para que reduza a população microbiana suficientemente e obtenha colônias separadas. Pequenos volumes de cada uma das amostras diluídas são, então, misturados com um gel líquido, normal mente de ágar su- per-resfriado a cerca de 45°C. As misturas são imediatamente despejadas nas placas de cultura estéril e após isso gelificação e incubação, cada célula é imobilizada e forma uma colônia.

[0007] Certos métodos manuais foram automatizados devido ao desenvolvimento de dispositivos. Isso se dá, por exemplo, no caso do documento EP-0.242.114, que descreve um equipamento e um método para inoculação de um meio de cultura com uma amostra. O método consiste de realizar vários segmentos de distribuição a partir de um inoculo. Esses segmentos estão na forma de arcos circulares e são realizados por meio de quatro diferentes cabeças de dispersão. Um efeito da diluição da amostra é obtido pela sobreposição parcial dos segmentos subsequentes. O método descrito no documento é, na verdade, muito similar ao método de referência de isolamento manual.

[0008] Mais recentemente, novos métodos de isolamento foram desenvolvidos, o que permitiu o melhoramento da exaustão bacteriana pelo uso de um aplicador otimizado conforme descrito no documento WO-A-2005071055. Isso se aplica notavelmente ao método de inoculação empregado no dispositivo automático comercializado pela requerente sob a referência PREVI™ Isola.

[0009] Entretanto, essas técnicas de isolamento são apenas efetivas em meios de cultura gelificados.

[0010] Nas áreas de diagnóstico clínico e de controle microbiológi- co industrial na comida, indústria farmacêutica ou cosmética, meios de cultura gelificados em uma placa de Petri, mais frequentemente ágar, constituíram, desde o final do século XIX, uma ferramenta indispensável para a detecção e identificação de micro-organismos patogênicos.

[0011] Entretanto, uma grande quantidade de produtos foi desenvolvida para substituir a placa de Petri. Para esses produtos, a reidra- tação é executada in situ, isto é, diretamente no espaço que serve para inoculação e para incubação. Um desses, o sistema petrifilm™, que compreende nutrientes reidratáveis, é muito amplamente usado. Outro sistema desenvolvido pela empresa Nissui Pharmaceutical, o Compact Dry, também consiste em um meio desidratado. Esses meios de cultura têm a vantagem de que se mantêm por mais tempo que um meio de cultura de ágar pronto para uso. Os mesmos também podem, como o petrifilm™, ser compactos e assim usar um espaço de incubação pequeno. A superfície disponível para cultura é limitada e os nutrientes disponíveis por célula são de concentração adequada para dar colônias de menor diâmetro que no meio coloide convencional e a formas das colônias também podem ser modificadas à baixa solidez do gel usado ou altos coeficientes de difusão das bactérias.

[0012] Contudo, o isolamento de colônias nesses meios só é possível pela inclusão no gel formado durante a reidratação e, portanto, a partir de uma amostra inicial com baixo nível de contaminação ou que passou por uma série de diluições. A concentração final a ser depositada no meio deve estar abaixo de 300 CFU/ml (CFU: unidade de formação de colônia), esses dados convencionais dependendo do tamanho da colônia.

[0013] Além disso, esses meios não conseguem resistir à tensão mecânica de um meio de isolamento por exaustão ser passar por deterioração. Assim, um dos principais problemas desses meios de cultura que são reidratáveis in situ, isto é, diretamente no espaço que serve para inoculação e incubação, é que os mesmos não são compatíveis com isolamento mecânico manual ou automatizado de micro- organismos. Quando a amostra inicial está altamente contaminada (acima de 300 CFU/ml), os mesmos exigem que uma série de diluições a serem executadas, o que significa usar uma amostra maior, a perda de tempo e o consumo de uma quantidade maior de reagentes (meio de cultura, tubos de diluentes, etc.), o que gera um grande volume de desperdício (realização de autoclave, custo de tratamento). Além disso, se uma grande quantidade de diluições é executada, exis-te um riso de perder, pelo efeito de diluição, o micro-organismo pato- gênico alvo, se o último estiver presente em uma pequena quantidade em relação à microflora total.

[0014] É claro, a partir da técnica anterior, que se considera que nenhum método de isolamento que seja simples de executar a partir de uma amostra a ser analisada ou uma suspensão bacteriana, em um meio de cultura reidratável in situ, que permite que colônias isoladas sejam obtidas está disponível.

[0015] Um primeiro objetivo da presente invenção é, portanto, fornecer um método para isolar micro-organismos e um dispositivo relacionado que ofereça melhor desempenho e seja mais simples de aplicar que os métodos e dispositivos da técnica anterior.

[0016] Um segundo objetivo da presente invenção é fornecer um dispositivo e um método para isolar micro-organismos que pode ser usado em um meio de cultura que é reidratável, ou reidratado apenas antes ou ao mesmo tempo que o isolamento microbiano, diretamente no espaço que serve para inoculação e incubação.

[0017] Um terceiro objetivo da presente invenção é fornecer um método para isolar micro-organismos de uma amostra que tem uma alta concentração microbiana inicial.

[0018] Um quarto objetivo da presente invenção é fornecer um método de isolamento que seja também compatível com a contagem dos micro-organismos.

[0019] Um quinto objetivo da presente invenção é fornecer um dispositivo e método de isolamento compatível com o uso dos meios cromogênios.

[0020] Esses objetivos, entre outros, são alcançados pela presente invenção, que propõe um método para isolar pelo menos um microorganismo de uma amostra que pode ser contaminada com o dito micro-organismo, que compreende as seguintes etapas: (a) abastecer um dispositivo para isolamento de micro- organismos que compreende o uma camada de fundo impermeável à água, o uma camada de nutrientes, disposta na camada de fundo, que compreende um meio de cultura desidratado, o uma camada de isolamento permeável aos elementos compreendidos na camada de nutrientes, com capacidade para reter as bactérias na própria superfície e cobrir toda ou uma porção da camada de nutrientes, o uma camada de topo protetora, (b) depositar um volume definido da amostra na camada de isolamento (c) isolar os micro-organismos por exaustão ou por revestimento da amostra com o uso de meios de isolamento, (d) incubar o dispositivo por um tempo predeterminado e a uma temperatura predeterminada que permita o crescimento dos micro-organismos, sendo que o dito método também compreende pelo menos uma etapa de reidratação do meio de cultura com um volume predeterminado de líquido antes ou ao mesmo tempo que a etapa b) e/ou c) e/ou d), de preferência antes ou ao mesmo tempo que a etapa b) e/ou c).

[0021] De acordo com uma modalidade preferencial, o dispositivo mencionado na etapa a) é obtido pelo método que compreende as seguintes etapas: - despejar o dito volume predeterminado de líquido na camada impermeável à água, - dispor a camada de isolamento na camada de nutrientes, em que toda é colocada na camada impermeável à água que recebeu anteriormente o dito volume predeterminado de líquido a fim de permitir reidratação instantânea e homogênea do dito meio de cultura desi- dratado, e - então, superpor a camada de topo protetora. Em outras palavras, o dito dispositivo é de modo vantajoso obtido por superposição sucessiva das seguintes camadas: 1) camada impermeável à água (que de preferência recebeu o dito volume predeterminado de líquido), 2) camada de nutrientes, 3) camada de isolamento e 4) camada de topo protetora, pelo menos a camada de nutrientes 2) e camada de isolamento 3) sendo mecanicamente independentes entre si, de modo que as mesmas possam ser facilmente sepa-radas. Isso oferece notavelmente a vantagem de que cada uma das duas camadas mencionadas acima pode ser vendidas e/ou armazenadas separadamente. As mesmas, então, podem ser facilmente superpostas pelo usuário. De preferência, todas as camadas são mecanicamente independentes entre si, de modo que as mesmas podem ser facilmente separadas uma da outra.

[0022] "Camadas mecanicamente independentes entre si" significa camadas que não estão juntadas pelo menos um meio de união, o dito meio de união que pode ser notavelmente de uma: - natureza física, por exemplo, um ou mais grampos, ou - natureza química, tal como cola, derretimento de toda ou parte das duas camadas sob a ação de um solvente para fazer surgir uma camada compósita/híbrida (também chamada de "camada de união"), ou de outra maneira um gel ou um agente de gelificação que é interposto pelo menos parcialmente entre as ditas camadas (a saber pelo menos parcialmente na interface entre as ditas camadas).

[0023] Apesar da vantagem mencionada acima (venda e/ou armazenamento separadamente das camadas de nutrientes e de isolamento), a requerente concluiu, contra todas as expectativas, que omitir um meio de união que forma uma interface entre a camada de nutrientes e a camada de isolamento torna possível, pela redução da distância en tre essas duas camadas, obter melhor crescimento e/ou sobrevivência dos micro-organismos depositados na camada de isolamento. Na verdade, um meio de união desse tipo é de tal natureza que reduz a velocidade da passagem dos nutrientes da camada reidratada de nutrientes para os micro-organismos presentes na camada de isolamento, o que reduz assim o crescimento e/ou as chances de sobrevivência desses micro-organismos.

[0024] Amostra significa uma pequena porção ou pequena quantidade separada de uma entidade por um ato subtrativo normalmente chamado amostragem, para propósitos de análise.

[0025] A amostra pode ser de origem biológica, humana, animal, vegetal ou ambiental. Pode se relacionar a um produto no curso de um processo industrial ou um produto final, por exemplo, comida. A mesma pode, portanto, corresponder a uma amostra de fluido biológico (sangue total, soro, plasma, urina, fluido cérebro-espinhal, secreção orgânica), uma amostra de tecido ou amostra de células isoladas. A mesma pode ser de origem industrial, isto é, de acordo com uma lista não exaustiva, uma amostra de ar, uma amostra de água, amostragem proveniente de uma superfície, um pedaço ou um produto no curso de tratamento ou fabricação, um produto de origem alimentícia. Entre amostras de origem alimentícia, podemos mencionar não exaustivamente uma de laticínios (iogurtes, queijos, etc.), carne, peixe, ovos, frutas, vegetais, água, bebidas (leite, sucos de fruta, refrigerantes, etc.) e o constituinte ou produtos auxiliares do produto final. Uma amostra alimentícia pode finalmente ser obtida a partir da alimentação preten-dida para animais, tais como, notavelmente, carne como alimentação animal. Antes da análise, essa amostra pode passar por preparação tal como enriquecimento, extração, concentração, purificação, por métodos conhecidos por uma pessoa versada na técnica. De acordo com uma modalidade preferencial, o volume de amostra depositado no meio de cultura está entre 10 e 1.000 pl.

[0026] No sentido da presente invenção, o termo micro-organismo cobre bactérias Gram-positivas ou Gram-negativas, leveduras, bolores, amebas e, mais geralmente, organismos unicelulares, invisíveis a olho nu, os quais podem ser manipulados e multiplicados em laboratório.

[0027] De acordo com uma modalidade preferencial da invenção, o micro-organismo é uma bactéria Gram-negativa ou Gram-positiva ou uma levedura.

[0028] Como bactérias Gram-positivas, podemos mencionar as bactérias dos seguintes gêneros: Enterococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Bifidobacteium, Staphylococcus, Bacillus, Listeria, Clostridium, Mycobacteria, Nocardia, Corynebacteria, Micrococcus e Deino- coccus.

[0029] Como leveduras, podemos mencionar as leveduras dos seguintes gêneros: Candida, Cryptococcus, Saccharomyces e Trichospo- ron.

[0030] Como bolores, podemos mencionar os bolores dos seguintes gêneros: Aspergillus, Penicillium, Cladosporium.

[0031] A presente invenção também refere-se a um dispositivo para cultura de micro-organismos que compreende o uma camada de fundo impermeável à água, o uma camada de nutrientes, disposta na camada de fundo, que compreende um meio de cultura desidratado, o uma camada de isolamento permeável aos elementos compreendidos na camada de nutrientes, com capacidade para reter as bactérias na própria superfície e cobrir toda ou uma porção da camada de nutrientes, o uma camada de topo protetora.

[0032] De preferência, a camada de nutrientes e a camada de iso- lamento são mecanicamente independentes entre si, conforme já mencionado.

[0033] No sentido da presente invenção, a camada de nutrientes compreende um suporte que contém um meio de cultura desidratado. O suporte pode ser baseado em vários compostos absorventes com retentividade de água muito forte tal como fibras de celulose de raiom, algodão, natural ou modificadas quimicamente como carboximetilcelu- lose, polímeros químicos absorventes ou superabsorventes tais como sais de poliacrilato, copolímero de acrilato/acrilamida. Esse suporte pode ser impregnado com um meio de cultura em forma líquida e, então, desidratado, isto é, que tem uma Aw (atividade de água) incompatível com desenvolvimento microbiano. De modo alternativo, o mesmo é coberto ou impregnado a seco com um meio de cultura ou constituintes do mesmo na forma de pó. De modo alternativo, a impregnação de líquido pode, após desidratação, ser suplementado pela adição de pó de acordo com o meio descrito acima.

[0034] Meio de cultura significa um meio que compreende todos os elementos necessários à sobrevivência e/ou crescimento de micro- organismos. Na prática, uma pessoa versada na técnica selecionará o meio de cultura conforme uma função dos micro-organismos alvo, de acordo com critérios perfeitamente conhecidos e dentro da capacidade da pessoa versada na técnica.

[0035] A camada de nutrientes de acordo com a invenção pode conter aditivos opcionais, por exemplo: peptonas, um ou mais fatores de crescimento, carboidratos, um ou mais agentes seletivos, tampões, corantes, um ou mais agentes de gelificação, hidrogéis, agente viscoso, etc..

[0036] De preferência, o meio contém pouco ou nenhum agente de gelificação a frio, tal como, por exemplo, ágar, agarose, poloxâmeros, goma guar, xantana, etc.. Geralmente, a camada de nutrientes pode adicionalmente conter um substrato que permite a detecção de uma atividade enzimática ou metabólica dos micro-organismos alvo com base em um sinal detectável diretamente ou indiretamente. Para detecção direta, esse substrato pode ser unido a uma parte que serve como marcador fluorescente ou cromogênio. Para detecção indireta, a camada de nutrientes de acordo com a invenção pode adicionalmente compreender um indicador de pH, sensível à mudança de pH induzido pelo consumo do substrato e com a revelação do crescimento dos micro-organismos alvo. O dito indicador de pH pode ser um cromóforo ou um fluoróforo. Como exemplos de cromóforos, podemos mencionar vermelho neutro, azul anil, azul de bromocresol. Os fluoróforos compreendem, por exemplo, 4-metilumbeliferona, derivados de hidroxicu- marina ou derivados de resorufina. Assim, o substrato fluorescente de PC-PLC de preferência usado para executar o método de acordo com a invenção corresponde a um fosfato 4-metil-umbeliferil-colina (4 MU- CP).

[0037] De acordo com uma modalidade preferencial da invenção, após a impregnação seca da camada de nutrientes com o meio de cultura desidratado, a última passa por uma operação de calandragem. A calandragem, pela pressão e pela temperatura de aquecimento gerados, permite a retenção e estabiliza a manutenção pelo tempo do meio de cultura desidratado na camada de nutrientes, o que assegura a retenção dos nutrientes na camada de nutrientes. A mesma também torna possível obter uma superfície rigorosamente lisa e plana da camada de nutrientes. Isso é particularmente vantajoso para assegurar uma boa coesão entre a camada de nutrientes e a camada de isolamento quando a última estiver disposta na camada de nutrientes. Apesar de acelerar a reidratação da camada de nutrientes em relação a uma camada não calandrada de nutrientes, a calandragem permite a compressão das fibras que constituem a camada de nutrientes. Essa com- pressão, combinada com a presença do meio desidratado dentro da camada de nutrientes, gera um grande aumento na capacidade capilar da última, o que causa reidratação quase instantânea da mesma e que gera um fenômeno de aspiração da camada de isolamento disposta na própria. A camada de isolamento é, então, achada contra a camada de nutrientes (embora seja mecanicamente independente da última), assegurando, assim, a ausência de espaço entre as duas camadas e em consequência o crescimento e/ou sobrevivência microbiana ideal na superfície inteira da camada de isolamento. Assim, não há necessidade de ter recurso a um meio de união (por exemplo, uma camada de união) entre a camada de isolamento e a camada de nutrientes. Isso representa uma vantagem significante, em que os ditos meios de união diminuem a velocidade de passagem dos nutrientes provenientes da camada reidratada de nutrientes para os micro-organismos presentes na camada de isolamento, o que reduz, assim, o crescimento e/ou as chances de sobrevivência desses micro-organismos.

[0038] Conforme notado acima, a possibilidade de separar a camada de nutrientes e a camada de isolamento, e assim permitir que duas camadas sejam vendidas e/ou armazenadas separadamente, representa um benefício industrial real. Tal efeito técnico, então, permite que as camadas de nutrientes e de isolamento sejam consideradas independentemente entre si, incluindo de um ponto de vista comercial e/ou logístico (armazenamento). Isso representa uma vantagem signi-ficante para o usuário, que pode notavelmente combinar à vontade as camadas de nutriente e de isolamento com diferentes propriedades, adequadas para que os micro-organismos sejam detectados.

[0039] Camada de isolamento significa uma camada cujo principal constituinte é um material que pela própria natureza, próprio tamanho e própria disposição estérica, retém os micro-organismos na própria superfície embora seja permeável aos elementos compreendidos na camada de nutrientes localizada sob a camada de isolamento.

[0040] A camada de isolamento pode ser baseada em um ou mais materiais ou derivados desses materiais tais como látex, politatrafluo- retileno, fluoreto de poli(vinilideno), policarbonato, polietireno, poliami- do, polisulfona, poliéter-sulfona, celulose, uma mistura de celuloses e nitroceluloses. De modo vantajoso, a camada de isolamento é porosa, de preferência é uma membrana porosa permeável aos elementos compreendidos na camada de nutrientes, com capacidade para reter os micro-organismos na própria superfície e cobrir toda ou uma porção da camada de nutrientes. A requerente concluiu que as membranas para microfiltração de água (e geralmente de líquidos) comercializadas atualmente geralmente têm as propriedades exigidas para uso como a camada de isolamento. As mesmas tornam possível obter resistência muito boa a rasgamento durante manipulação, porosidade controlada, um caráter perfeitamente liso, pouca espessura e, na maioria das vezes, são altamente hidrofílicas. A cor das mesmas, geralmente branco, torna possível otimizar a diferenciação de colônias manchadas na superfície das mesmas. A requerente concluiu, surpreendentemente, que o uso dessas membranas de filtração não por uma função de filtração "tradicional" de líquidos (como é feito para água ou geralmente para líquidos), mas como um suporte que é liso e forte para isolar a amostra de teste na superfície das mesmas foi particularmente adequado para executar a presente invenção. Em consideração à capacidade de filtração e à hidrofilia da membrana de filtração, as mesmas são utilizadas a fim de permitir e otimizar a passagem dos nutrientes líquidos presentes na camada de nutrientes (após reidratação da mesma) para a camada de isolamento embora previna as bactérias, leveduras e bolores semeados na superfície da camada de isolamento de migrar na direção contrária.

[0041] Para os propósitos do presente pedido, as membranas de filtração citadas acima são designadas tanto como "membranas de filtração" como "membranas de microfiltração" ou mesmo "membranas filtrantes", em que essas expressões são sinônimas entre si. Essas membranas de filtração estão compreendidas no grupo que consiste nas membranas porosas.

[0042] Em uma modalidade da invenção, a camada de isolamento está ativa. A mesma pode, assim, conter áreas específicas que são receptores de bactérias tais como anticorpos ou fragmentos de anticorpos, bacteriófagos ou fragmentos de bacteriófagos, aptâmeros ou quaisquer ligantes específicos que podem ser fixados de modo cova- lente ou indiretamente por elementos bioquímicos similares, pelo menos um dos quais é fixado de modo covalente, por exemplo, um sistema com o uso de estreptavidina e biotina.

[0043] De modo alternativo, a camada de isolamento está ativa, em que contém compostos que inibem ou destroem bactérias tais como bacteriófagos, peptidas antibacterianas, antibióticos, que podem ou não estar fixados dentro ou sobre a camada de isolamento. Os compostos podem estar fixados de modo covalente ou indiretamente por elementos bioquímicos relacionados. Além disso, em outra modalidade da invenção, a camada de isolamento está ativa, em que contém ele-mentos que estimulam ou aceleram o crescimento dos micro- organismos. Como um exemplo, um agente viscoso tal como polietileno glicol está disposto na camada de isolamento.

[0044] O isolamento pode ser executado em toda ou em parte da camada de isolamento, o que define a superfície útil para isolamento.

[0045] A camada de isolamento consiste em uma superfície que permite a passagem dos elementos provenientes do meio e agentes seletivos ou reativos.

[0046] De modo vantajoso, a camada de isolamento compreende poros cujo diâmetro está entre 0,01 e 0,8pm e de preferência entre 0,2 pm e 0,6 pm para que retenha as bactérias, leveduras e bolores na própria superfície. De acordo com uma modalidade particular, a camada de isolamento compreende poros cujos diâmetros está entre 0,25 pm e 0,6 pm, por exemplo, entre 0,3 pm e 0,6 pm, ou ainda entre 0,4 pm e 0,6 pm.

[0047] De modo alternativo, a mesma pode ser uma camada que não tem poros mensuráveis, tais como uma membrana de diálise, uma membrana de celulose permeável à água e a compostos químicos e definidos pela própria capacidade para retenção de compostos com um tamanho molecular acima de um limiar. De modo vantajoso, a membrana permitirá a retenção de moléculas químicas com um peso molecular maior que 500.000 dalton (ou entre 5.000 e 500.000 dalton).

[0048] De modo vantajoso, a camada de isolamento compreende áreas confinadas que tornam possível facilitar o isolamento dos microorganismos. As mesmas também podem tornar possível reduzir o tempo de crescimento e, portanto, obter o resultado mais rapidamente.

[0049] Em uma modalidade, a camada de isolamento tem unidades hidrofóbicas e/ou hidrofílicas que delimitam espacialmente o cres-cimento das bactérias. O tamanho da unidade hidrofílica está entre 10 e 500 pm, de preferência entre 300 e 500 pm, a saber um diâmetro maior que a poder de resolução do olho. Quando é uma questão de microbiologia clássica e, portanto, observação visual.

[0050] Em outra modalidade, a camada de isolamento contém unidades nanoestruturadas, incompatíveis com crescimento microbiano, áreas de delimitação confinadas que permitem o crescimento do micro-organismo.

[0051] As unidades hidrofóbicas estão dispostas na forma de um padrão de superfície que é uma grade regular ou irregular, uma montagem de hexágonos regulares ou irregulares ou de acordo com uma mistura dos dois padrões ou opcionalmente de outras formas.

[0052] Os materiais desejáveis para fazer essa unidade hidrofóbi- ca incluem cera, tinta hidrofóbica, resinas epóxi, óleo de silicone, cera de silicone, resina de poliestireno, alumina, polifluoretileno, etc..

[0053] A camada de isolamento cobre toda ou uma porção da camada de nutrientes. A camada de isolamento é posicionada na camada de nutrientes, o que cobre parcialmente a mesma a fim de permitir a reidratação do meio por um líquido. Em uma modalidade preferencial, a camada de nutrientes pode ser coberta pela camada de isolamento completamente.

[0054] O dispositivo pode conter pelo menos um meio de reidratação em contato com a camada de nutrientes, tal como um reservatório anexado ao dispositivo ou incluído no último e/ou canais que permitam a reidratação da parte de fundo ou da parte lateral da camada de nutrientes, de preferência da parte de fundo da última.

[0055] A superfície útil para isolamento pode ser circundada por uma área que não permita desenvolvimento microbiano. A mesma deve ser uma área feita de um material impermeável ou uma área hidrofóbica. De modo vantajoso, a dita área pode se estruturada por uso de guia manual.

[0056] "Meio de isolamento" é para ser entendido como um meio que permite que os micro-organismos sejam postos em contato com o meio de cultura pela movimentação sobre o último a fim de depositar a amostra. Conforme a amostra se torna empobrecida à medida que acontece atrito entre a amostra e/ou o meio de isolamento e a camada de isolamento, as células isoladas são depositadas, de modo que após o crescimento, as colônias isoladas possam ser obtidas.

[0057] O meio de isolamento tem uma ou mais superfície(s) de contato com o dito meio de cultura. Tal meio pode ser usado manualmente, por exemplo, uma alça, uma alça de platina, uma pipeta, uma haste de terra, uma haste que compreende uma bola terminal, uma zaragatoa. O mesmo também pode ser rebordo.

[0058] De modo vantajoso, o método de acordo com a invenção pode ser implantado por meio de um sistema automatizado. Um sistema particularmente adequado é o sistema PREVI™ Isola, tal que é protegido no pedido de patente WO-A-2005071055 e comercializado pela requerente.

[0059] De acordo com a invenção, o meio de cultura é reidratado com um volume predeterminado de líquido.

[0060] Um volume adequado de líquido é propagado no meio de cultura. Na prática, uma pessoa versada na técnica selecionará o volume apropriado de líquido conforme uma função da viscosidade do líquido, o diâmetro da camada de nutrientes, a fim de reidratar o meio e permitir o crescimento dos micro-organismos. A etapa de reidratação acontece antes ou ao mesmo tempo que a etapa b) e/ou c) e/ou d), de preferência antes ou ao mesmo tempo que a etapa b) e/ou c). Em uma modalidade particular, o líquido é adicionado manualmente com o uso de uma pipeta ou automaticamente. Em outra modalidade, o líquido é contido em pelo menos um reservatório integrado ao dispositivo e/ou canais que permitem a reidratação da camada de nutrientes. O líquido, então, se distribui na camada de nutrientes pela simples pressão do reservatório. Uma vantagem da reidratação através da parte de fundo e/ou lateral, de preferência através da parte de fundo, é que permite hidratação uniforme da camada inteira de nutrientes. Essa modalidade previne notavelmente que os nutrientes da camada de nutrientes sejam arrastados pelo líquido para a parte de fundo do dispositivo.

[0061] De acordo com uma modalidade da invenção, o líquido usado para reconstituir o meio de cultura é uma solução aquosa. De acordo com uma modalidade particular, o líquido contém micropartícu- las com envelopes de lipídio e, de preferência, o líquido contém células de glóbulos vermelhos.

[0062] O líquido também pode ser um tampão ou uma solução que contém suplementos do meio de cultura, tais como antibióticos ou substratos.

[0063] De acordo com a invenção, o dispositivo compreende em um dos lados da camada de nutrientes e da camada de isolamento uma camada de fundo impermeável à água uma camada de topo protetora.

[0064] A camada de topo pode ser translúcida ou transparente de modo que as colônias são visíveis através dessa camada. De preferência, a camada de topo protetora está separada das colônias por um meio de separação. O meio de separação pode ser uma parede lateral ou qualquer outro meio que permita que a camada de topo não esteja em contato com as colônias.

[0065] De modo vantajoso, a camada de topo estará com capacidade para ficar nas partes da camada de isolamento que não permitem desenvolvimento microbiano, tais como as áreas periféricas ou as unidades hidrofóbicas.

[0066] A camada de topo pode ser fixada por um dos lados às outras camadas do dispositivo por quaisquer meios, a saber, por exemplo, um meio adesivo ou mecânico.

[0067] A mesma também torna possível prevenir contaminação durante incubação. É impermeável a bactérias e limita a perda de vapor de água. Na verdade, o dispositivo é incubado por um tempo predeterminado e a uma temperatura predeterminada que permite o crescimento dos micro-organismos independentemente das condições de umidade ambientes. Assim, a natureza da camada de topo é selecionada para que permita as trocas gasosas necessárias ao crescimento dos micro-organismos embora permita hidratação local. A camada de fundo é impermeável à água. De preferência, essa camada de fundo é rígida, o que permite melhor pegada do dispositivo pela mão. A mes ma é fabricada a partir de compostos tais como poliéster, polipropile- nos, poliestireno. De preferência, a mesma é fabricada a parti de celulose. A mesma pode ser de papelão ou papel combinado com uma película impermeável à água. A mesma pode conter canais termoforma- dos que servirão para reidratação apropriada da camada de nutriente.

[0068] De modo vantajoso, as várias camadas do dispositivo são feitas de materiais recicláveis.

[0069] De acordo com uma modalidade particular da invenção, a camada de fundo e/ou a camada de nutrientes e/ou a camada de isolamento é/são translúcida(s) ou transparente(s).

[0070] De acordo com uma modalidade particular da invenção, o dispositivo também compreende um código de identificação tal como códigos de barras ou etiquetas RFID.

[0071] Um dispositivo, de acordo com a invenção, pode ser de formato convencional, a saber de formato arredondado. O mesmo pode, contudo, ser de um formato diferente e notavelmente de formato quadrado ou retangular. De acordo com outra variante, as várias camadas podem ser de formatos diferentes. Assim, por exemplo, a camada de topo, fundo e de nutrientes pode ser de formato quadrado e a camada de isolamento e/ou superfície útil para isolamento de formato arredondado. As várias camadas podem ser de cores diferentes, o que facilita a discriminação das bactérias suspeitas.

[0072] A invenção também se refere ao uso de um dispositivo, de acordo com a invenção.

[0073] A invenção, a funcionalidade da mesma, as aplicações da mesma assim como as vantagens da mesma serão melhor entendidas com a leitura da presente descrição, em referência às figuras, nas quais: - As Figuras 1A e 1B são representações esquemáticas do dispositivo, de acordo com a invenção. O dispositivo 10 compreende uma camada de fundo impermeável à água 14, uma camada de nutrientes 12, disposta na camada de fundo, que compreende um meio de cultura desidratado, uma camada de isolamento 20 permeável aos elementos compreendidos na camada de nutrientes, com capacidade para reter as bactérias na própria superfície e cobrir toda ou uma porção da camada de nutrientes, uma camada de topo protetora 15. O dispositivo também compreende áreas hidrofílicas/hidrofóbicas 13, um reservatório 19 e canais 18 que permitem a reidratação da parte de fundo ou da parte lateral da camada de nutrientes. O dispositivo pode ter meios de separação 16 que permitem que a camada de topo 15 não esteja em contato com as colônias. - A Figura 2A é uma fotografia do dispositivo, de acordo com a invenção, que tem uma área de isolamento útil de 25 cm2; - A Figura 2B mostra uma ampliação da porção central do dispositivo. O dispositivo foi semeado com uma amostra de Escherichia colia uma concentração de 108 CFU/ml. - A Figura 3 mostra os conteúdos de uma placa de Petri semeada com uma variedade de Klebsiella pneumoniae na presença de um meio de cultura UriSelect™ 4 com uma camada de isolamento que consiste em uma membrana filtrante de nitrato de celulose Mache- rey Nagel, como um exemplo; - A Figura 4 mostra os conteúdos de uma placa de Petri semeada com uma variedade de Klebsiella pneumoniae na presença de um meio de cultura UriSelect™ 4 com uma camada de isolamento que consiste em uma membrana filtrante de nitrato Sartorius, como um exemplo; - A Figura 5 mostra os conteúdos de uma placa de Petri semeada com uma variedade de Klebsiella pneumoniae na presença de um meio de cultura UriSelect™ 4 com uma camada de isolamento que consiste em uma membrana filtrante de acetato de celulose, como um exemplo; - A Figura 6 mostra os conteúdos de uma placa de Petri semeada com uma variedade de Klebsiella pneumoniae na presença de um meio de cultura UriSelect™ 4 com uma camada de isolamento que consiste em uma membrana filtrante de poliéster; - A Figura 7 mostra os conteúdos de uma placa de Petri semeada com uma variedade de Escherichia coli na presença de um meio de cultura UriSelect™ 4 com uma camada de isolamento que consiste em uma membrana filtrante de nitrato de celulose Macherey Nagel, como um exemplo; - A Figura 8 mostra os conteúdos de uma placa de Petri semeada com uma variedade de Escherichia coli na presença de um meio de cultura UriSelect™ 4 com uma camada de isolamento que consiste em uma membrana filtrante de poliéster, como um exemplo; - A Figura 9 mostra os conteúdos de uma placa de Petri semeada com uma variedade de Escherichia coli na presença de um meio de cultura UriSelect™ 4 com uma camada de isolamento que consiste em uma membrana filtrante de acetato de celulose, como um exemplo; - A Figura 10 mostra os conteúdos de uma placa de Petri semeada com uma variedade de Escherichia coli na presença de um meio de cultura UriSelect™ 4 com uma camada de isolamento que consiste em uma membrana filtrante de poliéster, como um exemplo; - A Figura 11 mostra os conteúdos de quatro placas de Petri na presença de um meio de cultura de ágar UriSelect™ 4 e de um meio de cultura desidratado UriSelect™ 4 impregnado em uma camada de nutrientes que compreende um suporte não tecido do tipo Glat- felter, Airlaid 150 g/m2 na presença de uma amostra de uma variedade de Escherichia coli, como um exemplo; - A Figura 12 mostra os conteúdos de quatro placas de Pe- tri na presença de um meio de cultura de ágar UriSelect™ 4, de um meio de cultura desidratado UriSelect™ 4 impregnado em uma cama-da de nutrientes que compreende um suporte não tecido do tipo Glat- felter, Airlaid 150 g/m2 na presença de uma amostra de uma variedade de Enterobacter cloacae, como um exemplo; - A Figura 13 mostra detalhes da Figura 16, que mostra os conteúdos de duas placas de Petri, como um exemplo; - A Figura 14 mostra os conteúdos de quatro placas de Petri na presença de um meio de cultura impregnado UriSelect™ 4 em uma camada de nutrientes que compreende um suporte não tecido do tipo Glatfelter, Airlaid 150 g/m2 na presença de uma camada de isolamento tal como uma membrana filtrante de acetato de celulose e na presença de uma amostra de uma variedade de Clostridium freundii, como um exemplo; - A Figura 15 mostra os conteúdos de uma placa de Petri que compreende uma camada de nutrientes que contém um suporte não tecido impregnado com um meio de cultura de ágar do tipo Chrom ID CPS ID3 na presença de uma amostra de Enterococcus faecalis, como um exemplo; - A Figura 16 mostra os conteúdos de uma placa de Petri que compreende uma camada de nutrientes que contém um suporte não tecido do tipo Airlaid MH 100 137 impregnado com um meio de cultura do tipo Chrom ID CPS3, desidratado e sem ágar; - A Figura 17 mostra os conteúdos de uma placa de Petri na presença de um meio de cultura do tipo meio de ágar Chrom ID CPS ID3 e de uma camada de nutrientes que compreende um suporte não tecido impregnado com um meio do tipo ChromID CPS3, desidratado e sem ágar, na presença de uma camada de isolamento tal como uma membrana filtrante de poliéster e uma amostra de uma variedade de Enterobacter cloacae, como um exemplo; - A Figura 18 mostra detalhes de uma camada de nutrientes que compreende um suporte não tecido do tipo Airlaid MH 100 137 impregnado com um meio de cultura do tipo Chrom ID CPS ID3 sem ágar e na presença de uma camada de isolamento tal como uma membrana de poliéster; - A Figura 19 mostra outro exemplo do suporte de acordo com a Figura 18.

EXEMPLOS EXEMPLO 1: OBTENÇÃO DE COLÔNIAS ISOLADAS DE UMA SOLUÇÃO ALTAMENTE CONTAMINADA EM UM MEIO REIDRATADO DE PETRIFILM

[0074] A partir de uma solução calibrada a uma carga hipotética de bactérias de 108 CFU/ml, 1.000 pl de soluções carregadas com Escherichia coli a diferentes concentrações obtidas por sucessivas diluições por um fator de 10 são depositadas no centro da película de fundo de Petrifilm®. Uma película de topo de Petrifilm® é abaixada na amostra. Um difusor plástico, com a face côncava voltada para baixo, é colocado no centro do ensaio de Petrifilm®. A amostra é distribuída de modo uniforme por meio de uma pressão leve no centro do difusor plástico. O inoculo é assim distribuído sobre toda a área de crescimento antes que o gel se forme. TABELA 1:

[0075] Os resultados mostram que seis diluições são necessárias a fim de obter colônias isoladas e usáveis.

EXEMPLO 2: OBTENÇÃO DE COLÔNIAS ISOLADAS A PARTIR DE UMA SOLUÇÃO ALTAMENTE CONTAMINADA EM UM MEIO REI- DRATADO DE ACORDO COM A PRESENTE INVENÇÃO

[0076] A começar pela mesma solução calibrada a uma carga hipotética de bactérias de 108 CFU/ml usada para inoculação da Petri- film®, a inoculação mecânica pelo método de "quadrante" é executada no dispositivo, de acordo com a invenção, o que permite que colônias isoladas sejam obtidas em uma área limitada (25 cm2) do dispositivo.

[0077] Assim, o dispositivo, de acordo com a invenção, foi semeado com 10 pl (conteúdos de uma alça) de uma solução calibrada a uma carga hipotética de bactérias de 108 CFU/ml carregada com Escherichia coli e depositado no primeiro quadrante 21 da superfície de isolamento do dispositivo cuja área de isolamento útil é 25 cm2. O segundo quadrante 22 é semeado com uma nova alça, que traça vários riscados que começam a partir do quadrante 21. O terceiro quadrante 23 é semeado como o segundo sem mudar a alça. O quarto quadrante 24 é semeado com riscados não traçados a partir do quadrante 22.

[0078] O dispositivo é formado por uma camada de isolamento com unidades hidrofóbicas/hidrofílicas 28 nas quais o isolamento é realizado. As unidades hidrofóbicas/hidrofílicas tornam possível aumentar o isolamento, notavelmente em uma área pequena (25 cm2) pela delimitação espacial do crescimento dos micro-organismos.

[0079] Uma camada que contém o meio reidratado de cultura 25. Uma camada de fundo impermeável à água 26 e uma translúcida camada de topo que veda o dispositivo 27.

[0080] As Figuras 2a e 2b mostram que o isolamento mecânico no dispositivo, de acordo com a invenção, permite a formação de colônias isoladas. O isolamento é, assim, possível com o uso de um dispositivo único sem diluição anterior.

EXEMPLO 3: OBTENÇÃO DE COLÔNIAS ISOLADAS EM UMA CAMADA DE ISOLAMENTO DO TIPO MEMBRANA FILTRANTE, DISPOSTAS EM UMA CAMADA DE NUTRIENTES QUE CONSISTE EM UM SUPORTE NÃO TECIDO IMPREGNADO COM UM MEIO DE NUTRIENTES DESIDRATADO

[0081] O objetivo desse exemplo é comparar os morfotipos e o tempo de crescimento de colônias que se desenvolvem em uma membrana porosa e/ou filtrante (de preferência filtrante) posicionada em um meio de cultura de ágar ou em uma camada de nutrientes impregnada com meio de cultura desidratado.

[0082] O tamanho e a cor das colônias obtidas a partir de diferentes espécies bacterianas semeadas nessas membranas porosa e/ou filtrante são avaliados pelo operador.

3.1 MATERIAIS

[0083] Os experimentos descritos abaixo se referem notavelmente a variedades de Escherichia coli, Clostridium freundii, Enterococcus faecalis, Klebsiella pneumoniae e Enterobacter cloacae.

[0084] As camadas de isolamento testadas para o presente exemplo compreendem: - uma membrana filtrante de poliéster (Macherey Nagel Po- liester) que compreende poros com um diâmetro de 0,2 pm, 0,4 pm, 1 pm e 5 pm (referência comercial: PORAFIL® PE), - uma membrana filtrante de nitrato de celulose (Macherey Nagel Poliester) que compreende poros com um diâmetro de 0,2 pm, 0,4 pm, 1 pm e 5 pm (referência comercial: PORAFIL® NC), - uma membrana filtrante de acetato de celulose (Macherey Nagel Poliester) que compreende poros com um diâmetro de 0,2 pm, 0,4 pm, 1 pm e 5 pm (referência comercial: PORAFIL® CA), - uma membrana filtrante de ésteres misturados a celulose (Poliester Macherey Nagel) que compreende poros com um diâmetro de 0,2 pm, 0,4 pm, 1 pm e 5 pm (referência comercial: PORAFIL® CM), stedim Biotech) que compreende poros com um diâmetro de 0,45 pm.

[0085] Para os propósitos dos presentes experimentos, os seguintes suportes não tecidos são usados: - Glatfelter, Airiaid 100 g/m2, - combinação de Glatfelter, Airiaid 150 g/m2, - suportes PDI 60 g/m2.

[0086] Os meios de cultura usados para impregnar o suporte não tecido nos presentes experimentos são: um caldo tripticase de soja (TSB-D), um meio de cultura do tipo UriSelect® 4 (referência comercial: BioRad), ou um meio de cultura do tipo Chrom ID CPS 3 sem ágar.

[0087] Os meios de cultura de ágar usados nos presentes experimentos são os seguintes: UriSelect®4 (referência comercial: BioRad) e Chrom ID CPS 3.

3.2 PROTOCOLO EXPERIMENTAL

[0088] Em primeiro lugar, as várias membranas filtrantes são testadas em um meio de ágar do tipo UriSelect® 4 (consulte seção 3.3.1 abaixo).

[0089] Em segundo lugar, o meio de cultura de ágar UriSelect® 4 é substituído pelos vários suportes não tecidos impregnados com um meio de cultura mencionado acima (consulte seção 3.3.2 abaixo).

[0090] Os suportes não tecidos, impregnados com o meio de cultura, são reidratados com o uso de um volume predeterminado de água esterilizada e um inóculo bacteriano no momento de realizar a análise. O volume/quantidade de água esterilizada necessária para reidratação do suporte não tecido, impregnado com o meio de cultura, varia conforme uma função da natureza do suporte não tecido e do tamanho da última. Essa informação pode ser facilmente determinada por uma pessoa versada na técnica com base no conhecimento general do mesmo e testes de rotina caso necessário. do não tecido ou membrana filtrante e meio de ágar é incubada a uma temperatura de 37°C. A leitura visual dos resultados para determinar o morfotipo das colônias e a qualidade de isolamento na superfície da membrana porosa e/ou filtrante é executada primeiramente após um tempo de incubação de 24h e, então, pela segunda vez, após um tempo total de incubação de 48h.

[0091] A montagem da membrana filtrante e do suporte impregna

3.3 RESULTADOS 3.3.1 ISOLAMENTO DE VÁRIOS MICRO-ORGANISMOS EM DIFERENTES TIPOS DE MEMBRANAS FILTRANTES, NA PRESENÇA DE UM MEIO DE CULTURA DE ÁGAR

[0092] As Figuras 3, 4, 5 e 6 mostram o isolamento de uma variedade de Klebsiella pneumoniae na presença de um meio de cultura de ágar UriSelect™ 4, após um tempo de incubação de 24h.

[0093] Mais precisamente, a membrana filtrante na Figura 3 é de nitrato de celulose (Macherey Nagel).

[0094] A membrana filtrante na Figura 4 é de nitrato de celulose Sartorius (Sartorius).

[0095] A membrana filtrante na Figura 5 é de acetato de celulose.

[0096] A membrana filtrante na Figura 6 é de poliéster.

[0097] Nessas Figuras 3, 4, 5 e 6, a presença de colônias bem individualizadas que são diretamente usáveis (CDU) é verificada.

[0098] As Figuras 7, 8, 9 e 10 mostram a presença de Escherichia coli na presença de um meio de cultura de ágar UriSelect™ 4, após um tempo de incubação de 24h.

[0099] Mais precisamente, a membrana filtrante na Figura 7 é de nitrato de celulose Macherey Nagel.

[00100] A membrana filtrante na Figura 8 é de poliéster.

[00101] A membrana filtrante na Figura 9 é de acetato de celulose.

[00102] A membrana filtrante na Figura 10 é de poliéster.

[00103] Nessas Figuras 7, 8, 9 e 10, a presença de colônias bem individualizadas que são diretamente usáveis (CDU) é verificada. O crescimento bacteriano é ideal, os morfotipos e crescimento das colônias obtidas cumprem com o que é esperado do crescimento microbiano diretamente em meio de ágar. O isolamento realizado em uma membrana porosa e/ou filtrante leva a morfotipos de colônias e uma qualidade de isolamento que são obtidos convencionalmente com isolamento executado diretamente no meio de ágar.

3.3.2 ISOLAMENTO E CONTA/COUNTAGEM DE MICRO- ORGANISMOS EM MEMBRANAS FILTRANTES DEPOSITADAS EM SUPORTES NÃO TECIDOS IMPREGNADOS COM UM MEIO DE CULTURA DESIDRATADO

[00104] Os presentes experimentos fazem um suporte impregnado não tecido entrar em contato com um meio de cultura desidratado. Embora a análise seja executada, o suporte não tecido é impregnado com água a fim de reidratar o meio de cultura.

[00105] Conforme mostrado na Figura 11, o suporte de impregnação usado é do tipo Glatfelter, Airlaid 150 g/m2. O último é impregnado com meio de cultura desidratado UriSelect™ 4.

[00106] Os conteúdos das placas de Petri mostrados na Figura 11 fornecem evidência do crescimento das bactérias Escherichia coli e a presença de colônias bem individualizadas que são diretamente usáveis (CDU).

[00107] A Figura 12 mostra resultados similares na presença de bactérias Enterobacter cloacae.

[00108] A Figura 13 mostra resultados similares àqueles nas Figuras 11 e 12, na presença de um meio de ágar do tipo UriSelect™ 4.

[00109] Resultados similares também podem ser vistos para os conteúdos das placas de Petri mostrados na Figura 14 na presença de um meio de cultura impregnado UriSelect™ 4 seco em um suporte não tecido do tipo Glatfelter, Airlaid 150 g/m2 na presença de uma mem- brana filtrante de acetato de celulose.

3.3.3 IMPREGNAÇÃO COM UM MEIO DE CULTURA DO TIPO CHROM ID CPS ID3 DESIDRATADO

[00110] Os presentes experimentos referem-se a uma amostra de Enterococcus faecalis na presença de um meio de cultura de ágar Chrom ID CPS ID3 (consulte a Figura 15) e um meio desidratado sem ágar Chrom ID CPS3 impregnado no suporte não tecido na presença de uma membrana filtrante de poliéster (consulte a Figura 16).

[00111] Outro experimento se refere a uma amostra de Enterobac- ter cloacae na presença de um meio de cultura de ágar do tipo Chrom ID CPS ID3 e um meio de cultura impregnado com o tipo desidratado Chrom ID CPS3 sem ágar na presença de uma membrana filtrante de poliéster (consulte a Figura 17). Na Figura 17, a presença de colônias bem individualizadas que são diretamente usáveis (CDU) é verificada.

[00112] As Figuras 18 e 19 mostram os resultados de um experimento que traz um meio de cultura sem ágar Chrom ID CPS ID3 impregnado em um suporte não tecido Airiaid MH 100 137 na presença de uma membrana filtrante de poliéster.

[00113] Conforme mostrado nas Figuras 18 e 19, a presença de colônias bem individualizadas que são diretamente usáveis (CDU) é verificada. Embora o isolamento seja executado em membranas filtrantes posicionadas em meios de cultura desidratados - e não em meios de ágar - isso não afetou o crescimento bacteriano, que provou ser ideal. Além disso, os morfotipos das colônias obtidas são similares àqueles obtidos com o isolamento em membranas porosa e/ou filtrante posicionadas em meio de ágar.

3.4 CONCLUSÕES

[00114] Os resultados dos experimentos que se referem ao exemplo 3 indicam que é possível realizar isolamentos de micro-organismos um uma camada de isolamento de um tipo membrana filtrante. Deve- se observar que essas membranas filtrantes não são usadas para a ação de filtração de líquido, que é o uso primário da mesma, mas para executar isolamento de uma amostra que pode ser pesadamente carregada com micro-organismos, o que requer que as mesmas tenham as mesmas qualidades de superfície que aquelas que são obtidas em meios de ágar. Além disso, o isolamento não gera deformações de uma membrana filtrante, em que a última permanece como se estivesse colada à camada de nutrientes subjacente (suporte de nutrientes) sem exigir qualquer união física ou química entre a membrana filtrante e a camada de nutrientes. Essa proximidade íntima da membrana filtrante com a camada de nutrientes após o isolamento é verificada quando examinamos a integridade e continuidade da trajetória do isolamento através da disposição das colônias bacterianas.

[00115] Apesar da compatibilidade das membranas porosa e/ou filtrante com a operação de isolamento microbiano, a requerente demonstrou que a superposição da camada de isolamento de um tipo membrana filtrante e a camada de nutrientes do tipo suporte não tecido impregnados com meio de cultura desidratado permite o crescimento ideal dos micro-organismos na camada de isolamento, conforme evidenciado pelos morfotipos das colônias bacterianas obtidas.

[00116] Também parece que o suporte não tecido impregnado com um meio de cultura desidratado representa uma alternativa válida para fazer a cultura de micro-organismos na presença de um meio de cultura de gelose que contém ágar. Na verdade, a camada de nutrientes permite trocas de nutrientes com os micro-organismos localizados na camada de isolamento a fim de permitir crescimento microbiano de qualidade. Assim, a presença de uma camada de isolamento disposta acima de uma camada de nutrientes impregnada com um meio de cultura desidratado torna possível obter colônias isoladas de microorganismos na superfície da camada de isolamento. A porosidade da membrana de filtração permite a retenção dos micro-organismos na própria superfície e a transferência dos nutrientes dissolvidos presentes no suporte de nutrientes para a superfície da membrana de filtração. O exemplo 3 claramente demonstra que tais transferências são ideais visto que nenhum atrase de crescimento sugerido notavelmente por um tamanho reduzido das colônias foi observado. Deve ser observado mais uma vez que essa transferência é ideal na ausência de meios de união ou ligação entre a membrana de filtração e a camada de nutriente.

[00117] Em geral, as trocas de nutrientes e de água entre a camada de nutrientes e a membrana filtrante permitem um crescimento microbiano ideal. O meio de cultura impregnável é reidratável ou pode ser reidratado pouco tempo antes ou ao mesmo tempo em que o isolamento microbiano.

[00118] O Exemplo 3 notavelmente demonstra que o dispositivo, de acordo com a invenção, é compatível com o isolamento e o crescimento microbiano.

Claims

1. Método para isolar um micro-organismo de uma amostra que pode estar contaminada com o referido micro-organismo, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: (a) fornecer um dispositivo para isolamento de micro- organismos que compreende o uma camada de fundo impermeável à água, o uma camada de nutrientes, disposta na camada de fundo, que compreende um suporte contendo um meio de cultura desidratado, a referida camada de nutrientes sendo obtida por impregnação, preferencial mente seca, do referido suporte com o meio de cultura desidratado, e depois calandragem, o uma camada de isolamento permeável aos elementos compreendidos na camada de nutrientes, com capacidade para reter as bactérias na própria superfície e cobrir toda ou uma porção da camada de nutriente, o uma camada de topo protetora, (b) depositar um volume definido da amostra na camada de isolamento, (c) isolar os micro-organismos pela exaustão ou pelo revestimento da amostra com o uso de meios de isolamento, (d) incubar o dispositivo por um tempo predeterminado e a uma temperatura predeterminada que permita o crescimento dos micro-organismos, sendo que o dito método também compreende uma etapa de reidratação do meio de cultura com um volume predeterminado de líquido antes ou ao mesmo tempo que a etapa (b) e/ou (c) e/ou (d), de preferência antes ou ao mesmo tempo que a etapa (b) e/ou (c).

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a camada de isolamento tem unidades hidrofílicas e/ou hidrofóbicas.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o dispositivo também compreende um código de identificação tal como códigos de barras ou etiquetas de identificação por radiofrequência (radio frequency identification - RFID).

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o líquido usado para reidratar o meio de cultura é uma solução aquosa e/ou um líquido que contém micropartículas com envelopes de lipídio.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a camada de nutrientes e a camada de isolamento são mecanicamente independentes entre si dentro do referido dispositivo.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o referido suporte é um suporte não tecido.

7. Dispositivo para cultura de micro-organismos, caracterizado pelo fato de que compreende: o uma camada de fundo impermeável à água, o uma camada de nutrientes, disposta na camada de fundo, que compreende um suporte contendo um meio de cultura desidratado, a referida camada de nutrientes sendo obtida por impregnação, preferencial mente seca, do referido suporte com o meio de cultura desidratado, e depois calandragem, o uma camada de isolamento permeável aos elementos compreendidos na camada de nutrientes, com capacidade para reter as bactérias na própria superfície e cobrir toda ou uma porção da camada de nutriente, o uma camada de topo protetora, em que a camada de nutrientes e a camada de isolamento são mecanicamente independentes entre si.

8. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que compreende um reservatório integrado ao dispositivo e/ou canais que permitem a reidratação da camada de nutrientes.

9. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que a camada de isolamento é uma membrana porosa, de preferência uma membrana para microfiltração de um líquido.

10. Dispositivo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizado pelo fato de que a camada de isolamento contém unidades hidrofóbicas e/ou hidrofílicas.

11. Dispositivo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 10, caracterizado pelo fato de que o referido suporte é um suporte não tecido.

12. Uso de um dispositivo, como definido em qualquer uma das reivindicações 7 a 11, caracterizado pelo fato de que é para o isolamento de um micro-organismo.