CN104487563B - 在培养基上分离微生物的方法及相关装置 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及从可能被至少一种微生物污染的样品中分离所述至少一种微生物的方法，所述方法包括下述步骤：(a)提供用于分离微生物的装置，所述装置包含：不透水的底层、营养层、分离层和保护性顶层，所述营养层放置在所述底层上并且包含脱水的培养基，所述分离层是营养层中包括的成分可透过的，能够将细菌保留在其表面上，并且覆盖全部或部分营养层；(b)将预定体积的样品沉积在所述分离层上；(c)通过用分离工具耗尽或者分层所述样品而分离所述微生物；(d)将所述装置在允许所述微生物生长的预定温度温育预定时间，所述方法还包括至少一个在步骤b)和/或c)和/或d)之前或同时用预定体积液体再水化培养基的步骤，优选在步骤b)和/或c)之前或同时。

Description

在培养基上分离微生物的方法及相关装置
本发明一般地涉及微生物学分析领域。更具体地，本发明涉及分离至少一种得自污染样品的微生物的方法。
从待分析样品或微生物悬液开始在凝胶培养基上分离微生物通常是许多微生物学分析方法中不可或缺的步骤。这个步骤尤其用于进行鉴定、验证样品的微生物纯度或者通过计数由此获得的分离的菌落进行细菌计数。
分离技术的目的是在凝胶营养培养基上获得可以直接使用的菌落(CDU)，用于鉴定及确定对抗生素的敏感性。它们是本领域技术人员熟知的，划线技术是参考技术。后者包括通过以相等的每单位经过面积概率在表面上划线而沉积接种物。在工具经过时，分布的局部密度大约指数性降低。因此，从单一接种物制备一些涂布带，所述带之间有或没有重叠，以获得合适的分布效果及在下一个涂布区段细菌的稀释。在涂布结束时，细胞彼此充分分离，由此以CDU形式生长的微生物(可见的菌落或微菌落)没有迭生，即使是部分迭生。这种技术也可以通过旋转平板单一连续螺旋接种而进行，或者通过由装置驱动的磁珠进行，产生不重叠或者任选地部分重叠的连续接种。
另一种广泛使用的技术包括通过在表面上涂布而在一皿胶化的培养基上分离。在这种情况中，将低细胞密度的细胞混合物涂布在直径9cm的培养皿中的凝胶表面上，所述混合物使得可以对30-300个细胞进行培养，每个细胞生长成分离的菌落。当少于30个细胞与营养凝胶接触时，统计学问题影响计数准确度。
当计数的数量超过300个细胞时，由于菌落表面的重叠产生计数误差。涂布通常通过一种包括例如与凝胶接触的线性部分的工具实现，或者使用以无序运动在表面上随机滚动的直径为几毫米的珠实现。这种技术仅适合轻微污染或者稀释的样品，因为由于生长，高细胞数增加菌落的汇合概率。
还可以在培养皿上通过深度接种进行分离。初始样品稀释若干次以充分降低微生物群体数量及获得分离的菌落。然后将小体积的每种稀释样品与液体凝胶混合，通常是过度冷却到大约45℃的琼脂。立即将混合物倒入培养皿中，胶凝及温育后，每个细胞被固定并形成菌落。
由于装置的发展一些手工方法已自动化。例如在文献EP-0 242 114的情况中就是如此，其描述了用于用样品接种培养基的设备和方法。所述方法包括从一个接种物进行若干区段涂布。这些区段呈圆弧形并且通过4个不同涂布头进行。通过后续区段的部分重叠获得样品稀释的效果。该文献中描述的方法事实上非常类似于手工分离的参考方法。
最近，已开发了新分离方法，通过使用如文献WO-A-2005071055中描述的优化的涂布器而改良细菌耗尽(épuisement)。这尤其适用于申请人以P REVITM Isola出售的自动化装置中采用的接种方法。
但是，这些分离技术仅在凝胶培养基上有效。
在临床诊断和食品工业微生物控制领域、药品或化妆品工业领域，自19世纪末开始，在培养皿中的凝胶培养基(最经常是琼脂)构成了检测和鉴定病原体微生物的不可或缺的工具。
但是，已开发了非常多的替代培养皿的产品。对于这些产品，再水化在原位进行，即直接在用于接种和用于温育的空间中。其中之一，包含可再水化营养素的petrifilmTM系统，被非常广泛地使用。Nissui Pharmaceutical公司开发的另一种系统Compact Dry也包括脱水培养基。这些培养基的优点是它们比即用琼脂培养基保存更长时间。像petrifilmTM，它们也可以非常紧凑，因此使用的温育空间小。可用于培养的表面有限，每细胞可利用的营养素浓度适合产生比在传统凝胶培养基上产生的直径小的菌落，并且由于所用凝胶的低硬度或者细菌的高扩散系数而导致菌落形态也可以被改变。
无论如何，只能通过在再水化期间形成的凝胶在这些培养基上分离菌落，并且因此从具有低污染水平或者经历一系列稀释的初始样品分离。要沉积在培养基上的终浓度必须是300CFU/ml以下(CFU：菌落形成单位)，这些常规数据取决于菌落大小。
另外，这些培养基不能禁得起耗尽分离工具的机械应力而不受磨损。因此，这些可以直接原位(即在用于接种和保温的空间)再水化的培养基的主要问题之一是它们与手工或自动化机械分离微生物不相容。当初始样品被重污染时(超过300CFU/ml)，它们需要进行一系列稀释，这意味着取更大样品，浪费时间及消耗大量试剂(培养基、稀释剂试管等)、产生大体积废物(高压灭菌、处理成本)。另外，如果进行大量稀释，有通过稀释作用丢失靶病原体微生物的风险，如果所述靶病原体微生物相对于总微生物群以少量存在。
从所考虑的现有技术可以明了，还没有在原位可以再水化的培养基上从待分析样品或细菌悬液开始进行的简便分离方法，以允许获得分离的菌落。
因此，本发明的第一个目的是提供分离微生物的方法及相关装置，其提供比现有技术的方法和装置更好的性能及应用更简便。
本发明的第二个目的是提供分离微生物的装置和方法，其可以在微生物分离之前或与其同时直接在用于接种和保温的空间中可再水化或者再水化的培养基上使用。
本发明的第三个目的是提供从具有高初始微生物浓度的样品分离微生物的方法。
本发明的第四个目的是提供分离方法，其也与微生物计数相容。
本发明的第五个目的是提供与生色培养基的使用相容的分离装置和方法。
其中，这些目的由本发明实现，本发明提出一种用于从可能被至少一种微生物污染的样品分离所述至少一种微生物的方法，所述方法包括如下步骤：
(a)提供用于分离微生物的装置，所述装置包含：
○不透水的底层，
○设置在底层上的营养层，包含脱水的培养基，
○分离层，其是营养层中包含的成分可透过的，能够将细菌保留在其表面上，并且覆盖全部或部分营养层，
○保护性顶层；
(b)将限定体积的样品沉积在所述分离层上；
(c)通过用分离工具耗尽或者涂布所述样品而分离所述微生物；
(d)将所述装置在允许所述微生物生长的预定温度温育预定时间，
所述方法还包括至少一个在步骤b)和/或c)和/或d)之前或同时用预定体积液体再水化培养基的步骤，优选在步骤b)和/或c)之前或同时。
根据优选的实施方案，步骤a)中提到的装置通过包括如下步骤的方法获得：
-将所述预定体积液体倒在不透水层上，
-在营养层上设置分离层，将其整体放置在已事先接受所述预定体积液体的不透水层上，以使所述脱水培养基瞬间均匀再水化，及
-然后将保护性顶层放在上面。
换句话说，有利地，所述装置通过依次叠加下述层而获得：1)不透水层(优选已接受所述预定体积液体)，2)营养层，3)分离层，及4)保护性顶层，至少营养层2)和分离层3)是彼此机械独立的，由此它们可以容易地被分离。这尤其提供了上述两层的每一层均可以单独出售和/或储存的优势。它们可以然后被用户容易地叠加。优选地，所有层均彼此机械独立，从而它们可以容易地彼此分离。
“彼此机械独立的层”是指未通过至少一种结合手段连接在一起的层，特别地，所述结合手段可以是：
-物理性质的，例如一或多个夹子，或者
-化学性质的，如胶，在溶剂作用下使两层的一些或全部融化，产生复合/杂合层(也称为“粘结层”)，或者凝胶或胶凝剂，其至少部分置于所述层之间(即至少部分在所述层之间的界面)。
除了上述优势(单独出售和/或储存营养层和分离层)，申请人发现与所有预期相反，省略形成营养层和分离层之间的界面的结合手段使得可以通过降低这两层之间的距离而获得沉积在分离层上的微生物的更好的生长和/或存活。事实上，这种结合手段的性质是其减缓了营养素从再水化的营养层向存在于分离层上的微生物的传递，由此降低了这些微生物的生长和/或存活机会。
样品是指通过通常称为取样的消减行为从实体分离的少部分或少量，用于分析目的。
样品可以是生物学、人、动物、蔬菜或环境来源的。其可以涉及工业方法过程中的产品或者终产品，例如食品。其因此可以对应生物学液体(全血、血清、血浆、尿、脑脊液、器官分泌物)的样品、组织样品或分离的细胞样品。其可以是工业来源的，即根据非穷举列表，空气样品、水样品(从处理或制造过程中的表面、块或产品取样)，食品来源的产品。在食品来源的样品中，非穷举地，有来自乳制品(酸奶、奶酪等)、肉、鱼、蛋、水果、蔬菜、水、饮料(牛奶、果汁、苏打水等)及终产品的组分或辅助产品的样品。食品样品可以最终从用于动物的饲料获得，如特别是作为动物饲料的食物。在分析之前，这个样品可以经历制备，如通过本领域技术人员已知的方法富集、提取、浓缩、纯化。根据优选的实施方案，沉积在培养基上的样品体积在10和1000μl之间。
就本发明而言，术语微生物包括革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌、酵母、霉菌、变形虫，及更一般地，肉眼不可见的单细胞生物，其可以在实验室中操作和繁殖。
根据本发明优选的实施方案，所述微生物是革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌，或者酵母。
革兰氏阳性细菌有下述属的细菌：肠球菌(Enterococcus)、链球菌(Streptococcus)、乳杆菌(Lactobacillus)、双歧杆菌(Bifidobacterium)、葡萄球菌(Staphylococcus)、芽孢杆菌(Bacillus)、李斯特氏菌(Listeria)、梭菌(Clostridium)、分枝杆菌(Mycobacteria)、诺卡氏菌(Nocardia)、棒杆菌(Corynebacteria)、微球菌(Micrococcus)和异常球菌(Deinococcus)。
酵母有下述属的酵母：假丝酵母(Candida)、隐球酵母(Cryptococcus)、糖酵母(Saccharomyces)和丝孢酵母(Trichosporon)。
霉菌有下述属的霉菌：曲霉(Aspergillus)、青霉(Penicillium)、枝孢菌(Cladosporium)。
本发明还涉及培养微生物的装置，包括：
○不透水的底层；
○设置在底层上的营养层，包括脱水培养基；
○分离层，其是营养层中包含的成分可透过的，能够将细菌保留在其表面上，并且覆盖全部或部分营养层；
○保护性顶层。
优选地，如已经提及的，营养层和分离层是彼此机械独立的。
就本发明而言，营养层包含含有脱水培养基的支持物。所述支持物可以基于各种具有非常强保水能力的吸附化合物，如人造丝、棉、天然的或化学修饰的纤维素纤维如羧甲基纤维素、吸收性或超吸收性化学聚合物如聚丙烯酸盐、丙烯酸/丙烯酰胺共聚物。这种支持物可以用液体形式的培养基浸渍然后脱水，即具有与微生物生长不相容的Aw(水活性)。或者，其用粉末形式的培养基或其组分覆盖或者干式浸渍。或者，对液体浸渍经脱水后，可根据上述手段通过加入粉末进行补充。
培养基是指包含微生物存活和/或生长所需的所有成分的介质。在实践中，本领域技术人员会根据本领域技术人员熟知的并且在其能力内的标准根据靶微生物选择培养基。.
本发明的营养层可以含有任选的添加剂，例如：胨、一或多种生长因子、碳水化合物、一或多种选择剂、缓冲液、染料、一或多种胶凝剂、水凝胶、粘性剂等。
优选地，培养基含有很少或者不含冷胶凝剂，例如琼脂、琼脂糖、泊洛沙姆、瓜尔胶、黄原胶等。通常，营养层可以另外含有底物，使得可以基于可检测信号直接或间接检测靶微生物的酶学或代谢活性。对于直接检测，这个底物可以与用作荧光或生色标记的部分结合。对于间接检测，本发明的营养层可以另外包含pH指示剂，其对由于底物消耗诱导的pH变化敏感并揭示靶微生物的生长。所述pH指示剂可以是生色团或者荧光团。生色团的例子有中性红、苯胺蓝、溴甲酚蓝。荧光团包括例如4-甲基伞形酮、羟基香豆素衍生物或者试卤灵衍生物。因此，优选用于进行本发明方法的PC-PLC荧光底物对应4-甲基-伞形酮-胆碱磷酸(4MU-CP)。
根据本发明优选的实施方案，在用脱水培养基干式浸渍营养层之后，后者经历压延操作。通过所产生的压力和加热的温度，压延使得脱水培养基保留在营养层中并稳定保持一段时间，保证营养素保留在营养层中。还可以获得营养层的非常平滑和平坦的表面。这对于当分离层置于营养层之上时保证营养层和分离层之间良好结合是特别有利的。除了加速营养层相对于未压延营养层的再水化之外，压延使得组成营养层的纤维压缩。这种压缩与营养层内存在的脱水培养基组合，使其毛细能力大大增加，导致其几乎瞬间再水化并且产生置于其上的分离层的吸入现象。分离层然后相对于营养层变平(同时与其机械独立)，由此保证两层之间没有空隙，因此保证在分离层完整表面上的最佳微生物生长和/或存活。因此，在分离层和营养层之间无需借助于结合手段(例如粘合层)。这表现了显著优势，因为所述结合手段减慢了营养素从再水化的营养层向分离层上存在的微生物的传递，由此降低这些微生物的生长和/或存活机会。
如上所述，分离营养层和分离层，由此使得两层单独出售和/或储存的可能性，代表了真正的工业的额外收获。这种技术效果然后使得营养层和分离层被彼此独立考虑，包括从商业和/或物流(储存)立场出发。这表现了对于用户的显著优势，用户能够随意组合具有不同性质的营养层和分离层，适合于待检测的微生物。
分离层是指这样的层，其主要成分是通过其性质、大小及其立体安排将微生物保持在其表面上同时能透过位于分离层之下的营养层中包含的成分的材料。
分离层可以基于一或多种材料或这些材料的衍生物，如胶乳、聚四氟乙烯、聚偏氟乙烯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚酰胺、聚砜、聚醚砜、纤维素、纤维素混合物和硝基纤维素。有利地，分离层是多孔的，优选其是可透过营养层中包含的成分的多孔膜，能够将微生物保留在其表面上，并且覆盖营养层的全部或部分。申请人发现目前市售的用于水(及一般地液体)微孔过滤的膜通常具有用作分离层所需的性质。它们使得可以获得对操作过程中的撕裂非常好的抗性，受控的孔隙度，非常平滑的特征，厚度小并且大多数时间是高度亲水的。它们的颜色通常是白色，使得可以优化区分在其表面上的染色的菌落。申请人令人惊奇地发现，将这些过滤膜不用于“传统”过滤液体的功能(就像用于水或一般地用于液体的过滤)而是作为平滑和强力的支持物用于在其表面上分离测试样品，特别适合实施本发明。考虑到过滤膜的过滤能力和亲水性，它们被利用以允许和优化营养层中存在的液体营养素向分离层的传递(在其再水化之后)，同时防止接种在分离层表面上的细菌、酵母和霉菌向相反方向迁移。
为本申请目的，上述过滤膜被称为“过滤膜”或“微孔过滤膜”或“滤膜”，这些表达是同义的。这些过滤膜包括在多孔膜范畴内。
在本发明的一个实施方案中，分离层是活性的。因此其可以含有是细菌受体的特异性位点，如抗体或抗体片段、噬菌体或噬菌体片段、适体或任何特异性配体，其可以共价固定或者通过类似的生化元件间接固定，至少其中之一是共价固定的，例如使用链霉抗生物素蛋白和生物素的系统。
或者，分离层是活性的，含有抑制或破坏细菌的化合物，如噬菌体、抗细菌肽、抗生素，其可以固定在或者可以不固定在分离层之中或之上。所述化合物可以共价固定或者通过相关生化元件间接固定。另外，在本发明另一个实施方案中，分离层是活性的，含有刺激或加速微生物生长的成分。作为一个实例，粘性物质如聚乙二醇被设置在分离层上。
分离可以在分离层的部分或全部上进行，限定用于分离的有用表面。
分离层包括允许来自营养培养基的成分及选择试剂或反应试剂传递的表面。
有利地，分离层包含直径在0.01和0.8μm之间、优选在0.2μm和0.6μm之间的孔，以将细菌、酵母和霉菌保留在其表面上。根据特定实施方案，分离层包含直径在0.25μm和0.6μm之间、例如在0.3μm和0.6μm之间或者在0.4μm和0.6μm之间的孔。
或者，其可以是不具有可测量的孔的层，如透析膜，可透水和化合物的纤维素膜并且由其保留具有超过阈值的分子大小的化合物的能力定义。有利地，所述膜允许保留分子量大于500000道尔顿(或者在5000和500000道尔顿之间)的化学分子。
有利地，分离层包括限定区，使得其可以帮助分离微生物。所述限定区也可以降低生长时间，因此更快获得结果。
在一个实施方案中，分离层具有疏水和/或亲水单元，用于为细菌的生长进行空间划界。亲水单元的大小在10和500μm之间，优选在300和500μm之间，即直径大于眼睛的分辨力。届时便是经典微生物学及目测观察的问题。
在另一个实施方案中，分离层含有纳米结构单元，不适合微生物生长，划界允许微生物生长的限定区。
疏水单元以表面图案形式设置，所述图案是规则或不规则网格，规则或不规则六边形组装或者两种图案的混合物，或者任选其他形式。
制备这种疏水单元的想要的材料包括蜡、疏水墨水、环氧树脂、硅油、硅蜡、聚苯乙烯树脂、氧化铝、聚氟乙烯等。
分离层覆盖营养层的全部或部分。分离层位于营养层之上，部分覆盖所述营养层以允许培养基被液体再水化。在一个优选实施方案中，营养层可以由分离层完全覆盖。
所述装置可以含有至少一个与营养层接触的再水化工具，如附着于所述装置或者包括在所述装置中的贮存器和/或通道，以允许使得营养层底部或侧部、优选其底部再水化。
用于分离的有用表面可以由不允许微生物生长的区围绕。其可以是由不可渗透的材料制成的区或疏水区。有利地，可以构造所述区指导手工使用。
“分离工具”应理解是指通过在培养基上移动而沉积样品以允许微生物与培养基接触的工具。随着样品和/或分离工具之间发生摩擦样品耗尽，要分离的细胞被沉积，由此生长后，可以获得分离的菌落。
分离工具具有与所述培养基接触的一或多个表面。这种工具可以通常手工使用，例如环、铂金环、移液器、研磨棍、包含末端球的棍、拭子等。其也可以是珠。
有利地，本发明方法可以通过自动化系统执行。特别合适的系统是如在专利申请WO-A-2005071055中保护的并由申请人上市的PREVITM Isola系统。
根据本发明，培养基用预定体积的液体再水化。
合适体积的液体在培养基中传送。实践中，本领域技术人员能根据液体粘度、营养层直径选择合适的液体体积，以再水化培养基并且使微生物生长。再水化步骤在步骤b)和/或c)和/或d)之前或与其同时进行，优选在步骤b)和/或c)之前或与其同时进行。在一个特定实施方案中，液体用移液器手动添加或者自动添加。在另一个实施方案中，液体包含在至少一个集成在装置中的贮存器中和/或通道中，以允许营养层再水化。液体然后通过简单压迫贮存器在营养层中扩散。经过底部和/或侧部优选经过底部再水化的优势是其使得均匀水化整个营养层。这个实施方案显著防止营养层的营养素被液体带走到装置底部。
根据本发明一个实施方案，用于使培养基复原的液体是水性溶液。根据一个特定实施方案，所述液体含有具有脂质包膜的微粒，优选地所述液体含有红细胞。
液体也可以是缓冲液或者含有培养基补充物如抗生素或底物的溶液。
根据本发明，所述装置在营养层和分离层的任一侧包含：
不透水的底层，
保护性顶层。
所述顶层可以是半透明或透明的，由此菌落透过此层可见。优选地，保护性顶层通过隔离工具与菌落隔离。隔离工具可以是侧壁或使得顶层不与菌落接触的任何其它工具。
有利地，所述顶层能够搁在分离层不允许微生物生长的部分如外围区或疏水单元上。
所述顶层的一侧可以通过任意手段例如粘合剂或机械手段附着于装置的其它层上。
其还使得可以在温育期间防止污染。其是细菌不透性的并且限制水蒸气损失。事实上，所述装置在允许微生物生长的预定温度温育预定时间，不依赖于环境湿度条件。因此，选择顶层的性质以允许微生物生长的气体交换，同时允许局部水化。底层是不透水的。优选地，底层是刚性的，使得能用手更好抓住装置。其从诸如聚酯、聚丙烯、聚苯乙烯的化合物制成。优选地，其从纤维素制成。其可以是纸板或纸，组合不透水的膜。其可以含有热成型通道，用于合适的营养层再水化。
有利地，装置的各层是由可循环材料制备。
根据本发明的特定实施方案，底层和/或营养层和/或分离层是半透明或透明的。
根据本发明的特定实施方案，所述装置也包含识别码如条形码或RFID标签。
本发明的装置可以是常规形状，即圆形。不过，其可以是不同形状，特别是方形或者矩形。根据另一种变体，各层可以是不同形状。因此，例如，顶层、底层和营养层可以是方形，分离层和/或用于分离的表面可以是圆形。各层可以是不同颜色，帮助辨别疑似的细菌。
本发明还涉及本发明装置的应用。
参照附图阅读说明书会更好地理解本发明、其功能、其应用及其优势，其中：
-图1A和1B是本发明装置示意图。装置10包含不透水底层14、营养层12(设置在底层上，包含脱水培养基)、分离层20(可透过营养层中包含的成分、能将细菌保留在其表面上并且覆盖全部或部分营养层)、保护性顶层15。这个装置还包含亲水/疏水区13、贮存器19和通道18，允许营养层底部或侧部再水化。
所述装置可以具有单独的装置16，使得顶层15不与菌落接触。
-图2A是本发明装置的照片，其具有25cm2有用分离面积；
-图2B示出所述装置中心部分的放大的图片。所述装置用浓度为108CFU/ml的大肠杆菌(Esherichia coli)样品接种。
-图3作为一个实例，示出在UriSelectTM4培养基存在下用肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)菌株接种的培养皿的内容物，分离层包括Macherey Nagel硝酸纤维素过滤膜。
-图4作为一个实例，示出在UriSelectTM4培养基存在下用肺炎克雷伯氏菌菌株接种的培养皿的内容物，分离层包括Sartorius硝酸过滤膜。
-图5作为一个实例，示出在UriSelectTM4培养基存在下用肺炎克雷伯氏菌菌株接种的培养皿的内容物，分离层包括醋酸纤维素过滤膜。
-图6作为一个实例，示出在UriSelectTM4培养基存在下用肺炎克雷伯氏菌菌株接种的培养皿的内容物，分离层包括聚酯过滤膜。
-图7作为一个实例，示出在UriSelectTM4培养基存在下用大肠杆菌菌株接种的培养皿的内容物，分离层包括Macherey Nagel硝酸纤维素过滤膜。
-图8作为一个实例，示出在UriSelectTM4培养基存在下用大肠杆菌菌株接种的培养皿的内容物，分离层包括聚酯过滤膜。
-图9作为一个实例，示出在UriSelectTM4培养基存在下用大肠杆菌菌株接种的培养皿的内容物，分离层包括醋酸纤维素过滤膜。
-图10作为一个实例，示出在UriSelectTM4培养基存在下用大肠杆菌菌株接种的培养皿的内容物，分离层包括聚酯过滤膜。
-图11作为一个实例，示出在大肠杆菌菌株样品存在下，在UriSelectTM4琼脂培养基存在下及在浸渍在营养层上的脱水UriSelectTM4培养基存在下的4个培养皿的内容物，所述营养层包含Glatfelter型无纺支持物，Airlaid 150g/m2。
-图12作为一个实例，示出在阴沟肠杆菌菌株样品存在下，在UriSelectTM4琼脂培养基存在下及在浸渍在营养层中的脱水UriSelectTM4培养基存在下的4个培养皿的内容物，所述营养层包含Glatfelter型无纺支持物，Airlaid 150g/m2。
-图13作为一个实例，示出图16的细节，显示出两个培养皿的内容物。
-图14作为一个实例，示出在Clostridium freundii菌株样品存在下及在分离层如醋酸纤维素过滤膜存在下，在营养层中浸渍的UriSelectTM4培养基存在下的4个培养皿的内容物，所述营养层包含Glatfelter型无纺支持物，Airlaid 150g/m2。
-图15作为一个实例，示出在粪肠球菌(Enterococcus faecalis)样品存在下，包含营养层的培养皿的内容物，所述营养层含有用Chrom ID CPS ID3型琼脂培养基浸渍的无纺支持物。
-图16示出包含营养层的培养皿的内容物，所述营养层含有用Chrom ID CPS3型脱水并且不含琼脂的培养基浸渍的Airlaid MH 100137型无纺支持物。
-图17作为一个实例，示出在分离层如聚酯过滤膜和阴沟肠杆菌(Enterococcuscloacae)样品存在下，在Chrom ID CPS ID3琼脂培养基型培养基及包含无纺支持物的营养层存在下培养皿的内容物，所述无纺支持物用ChromID CPS3型脱水并且不含琼脂的培养基浸渍。
-图18示出在分离层如聚酯膜存在下，营养层的细节，所述营养层包含用不含琼脂的Chrom ID CPS ID3型培养基浸渍的Airlaid MH 100137型无纺支持物。
-图19示出图18的支持物的另一个实例。
实施例
实施例1：在Petrifilm再水化培养基上从重污染溶液获得分离的菌落
从校准为108CFU/ml理论细菌负荷的溶液，1000μl加载不同浓度大肠杆菌的溶液沉积在底层膜的中心，所述溶液通过连续10倍稀释而获得。的顶层膜下降到样品上。塑料扩散器凹面向下放置在测定的中心。通过在塑料扩散器中心轻轻加压使样品均匀分布。接种物由此在凝胶形成之前分布在整个生长区。
表1：
结果显示6次稀释是获得分离的和可用的菌落所必须的。
实施例2：根据本发明在再水化的培养基上从重污染溶液获得分离的菌落
从用于接种的校准为108CFU/ml理论细菌负荷的相同溶液出发，在本发明装置上通过"刻度盘(cadrans)"方法进行机械接种，使得在装置的有限面积(25cm2)上获得分离的菌落。
因此，本发明的装置用10μl(一环的含量)校准为108CFU/ml理论细菌负荷的加载大肠杆菌的溶液接种，并且沉积在所述装置分离表面的第1个刻度盘21上，所述装置的有用分离面积是25cm2。第二个刻度盘22用新环接种，从刻度盘21开始划一些线。第三个刻度盘23与第二个类似接种，不换接种环。第4个刻度盘24用不是从刻度盘22开始的划线接种。
所述装置是用具有疏水/亲水单元28的分离层形成的，在其上进行分离。所述疏水/亲水单元使得能通过空间划界微生物生长而改良特别是在小面积(25cm2)上的分离。
层25含有再水化培养基。底层26是不透水的及半透明的顶层27密封装置。
图2a和2b示出，在本发明装置上的机械分离允许形成分离的菌落。因此可以用单个装置无需事先稀释而进行分离。
实施例3:在设置在用脱水的营养培养基浸渍的无纺支持物组成的营养层上的过 滤膜型分离层上获得分离的菌落
这个实施例的目的是比较在位于琼脂培养基上或者用脱水培养基浸渍的营养层上的多孔和/或过滤膜(优选过滤膜)上发生的菌落的形态类型和生长时间。
得自接种在这些多孔和/或过滤膜上的不同细菌菌种的菌落的大小和颜色由操作员评估。
3.1材料
下述实验特别涉及大肠杆菌、Clostridium freundii、粪肠球菌、肺炎克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌的菌株。
用于本实施例测试的分离层包括：
-聚酯过滤膜(Macherey Nagel Polyester)，其包含直径为0.2μm、0.4μm、1μm和5μm的孔(商标：PE)，
-硝酸纤维素过滤膜(Macherey Nagel Polyester)，其包含直径为0.2μm、0.4μm、1μm和5μm的孔(商标：NC)，
-醋酸纤维素过滤膜(Macherey Nagel Polyester)，其包含直径为0.2μm、0.4μm、1μm和5μm的孔(商标：CA)，
-纤维素混合酯的过滤膜(Macherey Nagel Polyester)，其包含直径为0.2μm、0.4μm、1μm和5μm的孔(商标：CM)，
-硝酸纤维素过滤膜(Sartorius stedim Biotech)，其包含直径为0.45μm的孔。
为本实验目的，使用下述无纺支持物：
-Glatfelter，Airlaid 100g/m2，
-Glatfelter，Airlaid concert 150g/m2，
-PDI supports，60g/m2。
在本实验中用于浸渍无纺支持物的培养基是无琼脂的Trypcase大豆肉汤(TSB-D)、4型培养基(商标：BioRad)或者Chrom ID CPS 3型培养基。
用于本实验的琼脂培养基如下：4(商标：BioRad)和Chrom ID CPS 3。
3.2实验方案
首先，在4型琼脂培养基上测试各种过滤膜(参考下节3.3.1)。
其次，将4琼脂培养基用如上所述的用培养基浸渍的各种无纺支持物置换(参考下节3.3.2)。
在进行分析时，用培养基浸渍的无纺支持物用预定体积的无菌水和细菌接种物再水化。用培养基浸渍的无纺支持物的再水化所需的无菌水的体积/量根据无纺支持物的性质及大小而变化。这个信息可以由本领域技术人员基于其一般知识和常规试验(如果需要)容易地确定。
过滤膜和浸渍的无纺支持物或者过滤膜和琼脂培养基的组装体在37℃温育。首先在温育24小时后，其次在总温育时间48小时后目测读数结果，用于确定多孔和/或过滤膜的表面上的菌落的形态类型及分离质量。
3.3结果
3.3.1在琼脂培养基存在下，在不同类型过滤膜上分离各种微生物
图3、4、5和6显示在温育24小时后，在UriSelectTM4琼脂培养基存在下肺炎克雷伯氏菌菌株的分离。
更精确地，图3的过滤膜是硝酸纤维素过滤膜(Macherey Nagel)。
图4的过滤膜是Sartorius硝酸纤维素过滤膜(Sartorius)。
图5的过滤膜是醋酸纤维素过滤膜。
图6的过滤膜是聚酯过滤膜。
在图3、4、5和6中，注意到可直接使用的(CDU)充分个体化的菌落的存在。
图7、8、9和10显示在温育24小时后，在UriSelectTM4琼脂培养基存在下大肠杆菌的存在。
更精确地，图7的过滤膜是Macherey Nagel硝酸纤维素过滤膜。
图8的过滤膜是聚酯过滤膜。
图9的过滤膜是醋酸纤维素过滤膜。
图10的过滤膜是聚酯过滤膜。
在图7、8、9和10中，注意到可直接使用的(CDU)充分个体化的菌落的存在。细菌生长是最佳的，获得的菌落的形态类型和生长符合直接在琼脂培养基上微生物生长的预期。在多孔和/或过滤膜上进行的分离产生传统地用直接在琼脂培养基上进行的分离所获得的菌落形态类型和分离质量。
3.3.2沉积在用脱水培养基浸渍的无纺支持物上的过滤膜上微生物的分离和计数
本实验将浸渍的无纺支持物与脱水培养基接触。当分析进行时，无纺支持物用水浸渍以再水化所述培养基。
如图11所示，所用浸渍支持物是Glatfelter型，Airlaid 150g/m2。其用UriSelectTM4脱水培养基浸渍。
图11所示的培养皿的内容物提供了大肠杆菌生长及存在可直接使用的(CDU)充分个体化的菌落的证据。
图12示出在阴沟肠杆菌存在下的类似结果。
图13示出在UriSelectTM4型琼脂培养基存在下与图11和12类似的结果。
类似结果也可以在图14所示培养皿的内容物见到，其是在醋酸纤维素过滤膜存在下在Glatfelter型，在Airlaid 150g/m2无纺支持物中干式浸渍的UriSelectTM4培养基存在下获得的。
3.3.3用脱水的Chrom ID CPS ID3型培养基浸渍
本实验涉及粪肠球菌样品，其是在Chrom ID CPS ID3琼脂培养基(参见图15)存在下，以及在聚酯过滤膜存在下在无纺支持物中浸渍的不含琼脂的脱水Chrom ID CPS3培养基存在下(参见图16)。
另一个实验涉及阴沟肠杆菌样品，其是在Chrom ID CPS ID3型琼脂培养基存在下，以及在聚酯过滤膜存在下用不含琼脂的脱水的Chrom ID CPS3型浸渍的培养基存在下(参见图17)。在图17中，注意到存在可直接使用的(CDU)充分个体化的菌落。
图18和19示出在聚酯过滤膜存在下在Airlaid MH 100 137无纺支持物上浸渍的不含琼脂的Chrom ID CPS ID3培养基的实验结果。
如图18和19所示，注意到存在可直接使用的(CDU)充分个体化的菌落。尽管分离是在位于脱水培养基上而非琼脂培养基上的过滤膜上进行的，但这不影响细菌生长，所述细菌生长被证明是最佳的。另外，获得的菌落形态类型与在位于琼脂培养基上的多孔和/或过滤膜上分离获得的类似。
3.4结论
实施例3相关实验结果表明，可以在过滤膜型分离层上分离微生物。应注意这些过滤膜不是用于它们的主要用途即过滤液体，而是用于分离可能大量负荷微生物的样品，这需要它们具有与琼脂培养基上所获得的相同的表面质量。另外，分离不产生过滤膜的形变，其保持得就像粘合在下面的营养层(营养支持物)上，无需过滤膜与营养层之间的任何物理或化学粘合。当我们通过细菌菌落排列检查分离途径的完整性和持续性时，证实了过滤膜与营养层在分离后的紧密距离。
除了多孔和/或过滤膜与微生物分离操作的相容性，申请人还证明过滤膜型分离层和用脱水培养基浸渍的无纺支持物型营养层的叠放允许分离层上的微生物的最佳生长，如所获得的细菌菌落的形态类型所证明的。
看起来还有，用脱水培养基浸渍的无纺支持物代表了在含有琼脂的琼脂(gelose)培养基存在下培养微生物的有效替代。事实上，营养层允许位于分离层上的微生物交换营养素，以允许微生物生长。因此，设置在用脱水培养基浸渍的营养层之上的分离层的存在使得可以在分离层表面上获得分离的微生物菌落。过滤膜的孔隙度允许微生物保留在其表面上及营养支持物中存在的溶解的营养素转移到过滤膜表面。实施例3清楚表明这种转移是最佳的，因为没有观察到特别是由菌落大小降低提示的生长延迟。在过滤膜与营养层之间不存在粘合手段或粘合剂时再次注意到这种转移是最佳的。
通常，营养层和过滤膜之间的营养素和水的交换允许微生物最佳生长。浸渍的培养基是可再水化的，或者可以在微生物分离之前一段短时间或与之同时被再水化。
实施例3明显证实本发明装置与分离和微生物生长相容。

Claims (21)

1.从可能被至少一种微生物污染的样品中分离所述至少一种微生物的方法，所述方法包括下述步骤：
(a)提供用于分离微生物的装置，所述装置包含：
○不透水的底层，
○设置在所述底层上的营养层，包含脱水的培养基，
○分离层，其是营养层中所包含的成分可透过的，能够将细菌保留在其表面上，并且覆盖全部或部分营养层，
○保护性顶层；
(b)将限定体积的样品沉积在所述分离层上；
(c)通过用分离工具耗尽或者涂布所述样品而分离所述微生物；
(d)将所述装置在允许所述微生物生长的预定温度温育预定时间，
所述方法还包括至少一个在步骤b)和/或c)和/或d)之前或同时用预定体积液体再水化培养基的步骤。
2.权利要求1的方法，其中在步骤b)和/或c)之前或同时用预定体积液体再水化培养基。
3.权利要求1的方法，其中所述分离层具有亲水性和/或疏水性单元。
4.权利要求1-3之一的方法，其中所述装置还包含识别码。
5.权利要求1-3之一的方法，其中所述装置还包含条形码或RFID标签。
6.权利要求1-3之一的方法，其中用于再水化培养基的液体是水性溶液和/或含有具有脂质包膜的微粒的液体。
7.权利要求1-3之一的方法，其中至少所述营养层和所述分离层在所述装置内是彼此机械独立的。
8.权利要求1-3之一的方法，其中所述营养层包含含有脱水培养基的支持物，所述营养层通过用脱水培养基浸渍所述支持物，然后压延而获得。
9.权利要求8的方法，其中所述浸渍是干式浸渍。
10.权利要求8的方法，其中所述支持物是无纺支持物。
11.用于微生物培养的装置，包含：
○不透水的底层；
○设置在所述底层上的营养层，包含脱水培养基；
○分离层，其是营养层中包含的成分可透过的，能够将细菌保留在其表面上，并且覆盖全部或部分营养层；
○保护性顶层；和
○至少一个与所述装置集成的贮存器，以允许营养层再水化，
其中至少所述营养层和所述分离层是彼此机械独立的。
12.权利要求11的装置，所述装置还包含至少一个与所述装置集成通道，以允许营养层再水化。
13.权利要求11或12的装置，其中所述分离层是多孔膜。
14.权利要求11或12的装置，其中所述分离层是用于液体微孔过滤的膜。
15.权利要求11或12的装置，其中所述分离层含有亲水性和/或疏水性单元。
16.权利要求11或12的装置，其中所述营养层包含含有脱水培养基的支持物，所述营养层通过用脱水培养基浸渍所述支持物，然后压延而获得。
17.权利要求16的装置，其中所述浸渍是干式浸渍。
18.权利要求16的装置，其中所述支持物是无纺支持物。
19.权利要求11-18之一的装置用于分离至少一种微生物的用途。
20.获得权利要求11-18之一的装置的方法，所述方法包括下述步骤：
-将预定体积的液体倒在所述不透水层上，
-在所述营养层上设置所述分离层，将其整体放置在已事先接受所述预定体积液体的不透水层上，以使所述脱水培养基瞬间均匀再水化，及
-然后将保护性顶层放在上面。
21.可由权利要求20的方法获得的装置。
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