CN108699584A

CN108699584A - 用于检测微生物的具有两个层的培养基

Info

Publication number: CN108699584A
Application number: CN201680081262.2A
Authority: CN
Inventors: 寺村哉; 岩崎美穂子; 曽田浩二朗
Original assignee: JNC Corp
Current assignee: JNC Corp
Priority date: 2016-02-09
Filing date: 2016-10-03
Publication date: 2018-10-23
Also published as: US20190048389A1; JP2017139981A; WO2017138046A1; EP3414336A1

Abstract

本发明提供一种方法以及用于其的酶底物培养基，在所述方法中即使可分解由微生物的酶分解的酶底物的酶固有地存在于分析物中，仍可抑制培养基自身的染色，且可高精确性地检测到呈染色菌落状的目标微生物。用于检测微生物的培养基包含：第一层，其中含有胶凝剂和酶底物；以及第二层，其中含有胶凝剂而不含酶底物，所述第二层邻接地层压到第一层，其中酶底物是能够释放染料化合物的化合物。

Description

用于检测微生物的具有两个层的培养基

技术领域

本发明涉及一种用于检测呈彩色或荧光菌落状的微生物的培养基。

背景技术

在检测特定微生物时，通常使用适合于目标微生物的选择性介质，例如含有选择性试剂(例如抗生素和界面活性剂)的培养基、调节到特定pH值的培养基以及调节到特定葡萄糖浓度的培养基。

另外，还利用一种方法(酶底物方法)，其中将待由目标微生物所特定拥有的酶分解的底物化合物并入到培养基中，且培养基上生长的目标微生物经检测呈菌落状，所述菌落在接受利用酶分解中由从底物中释放的染料化合物染色。用于这种方法中的培养基称为“酶底物培养基”，且在结合了彩色或荧光染料化合物的各种底物化合物上已取得了进展，且已提出了有关于用于食物和饮品或临床领域中的广泛范围的菌株的酶底物培养基的提议(专利文献第1号等等)。

并入到酶底物培养基中的酶底物由目标微生物中所拥有的酶分解。然而，在若干情况下，可分解酶底物培养基中的酶底物的酶甚至包含于发酵食物(例如奶酪)的分析物和含有大量组织(例如生肉)的分析物中。无论是否存在目标微生物，当提供此类分析物作为测试样品时，酶底物被分析物中固有存在的酶分解，且培养基由染料化合物整体地染色。因此，出现难以辨别目标微生物的菌落的问题。

举例来说，已知大肠杆菌(Coliform bacilli)特定拥有β半乳糖苷酶(β-galactosidase)，且当通过酶底物方法来检测大肠杆菌时，这种培养基用作含有酶底物的培养基，所述酶底物可通过由β半乳糖苷酶分解来释放染料化合物，例如5-溴-4-氯-3-吲哚酚-β-D-哌喃半乳糖苷(5-bromo-4-chloro-3-indoxlyl-β-D-galactopyranoside；X-GAL)。然而，当尝试通过使用酶底物培养基从发酵食物分析物(例如奶酪)中检测大肠杆菌时，存在固有地存在于分析物中且衍生于乳杆菌(Lactobacilli)的大量β-半乳糖苷酶，且因此其中提供分析物作为样品的培养基中的酶底物分解，且培养基由染料化合物整体地染色。因此，辨别大肠杆菌的染色菌落变得困难。

近年来，在各种薄片形简单培养基等等上已取得进展以便实现快速培养测试，其中培养基在存储期间处于干态，但在将分析物应用作为样品时胶凝剂通过分析物中含有的水分溶胀(专利文献第2号到专利文献第5号等等)。在使用简单培养基的情况下，固有存在于分析物中的酶易于穿透到培养基中。因此，相较于在使用普通琼脂介质(ordinal agarmedium)时的情况，酶底物方法中的问题变得更显著。

引用列表

专利文献

专利文献第1号：JP 2002-537852 A。

专利文献第2号：WO 97/24432 A。

专利文献第3号：JP H10-501129 A。

专利文献第4号：JP H9-19282 A。

专利文献第5号：JP 2015-204845 A。

发明内容

技术问题

鉴于这种情形，本发明涵盖提供一种方法及用于其的酶底物培养基，在所述方法中即使可分解由微生物的酶分解的酶底物的酶固有地存在于分析物中，仍可抑制培养基自身的染色，且因此，可高精确性地检测到呈染色菌落状的目标微生物。

问题的解决方案

为解决如上文所描述的问题，本发明人已孜孜不倦地持续进行研究。因此，本发明人已发现可通过将不含酶底物的培养基层压到酶底物培养基上来防止固有存在于待提供作为样品的分析物中的酶与酶底物接触，且因此，可抑制培养基自身的染色，且已完成本发明。

更具体地说，本发明包含下文描述的条目。

条目1.一种用于检测微生物的培养基，包含：

第一层，其中含有胶凝剂和酶底物，以及

第二层，其中含有胶凝剂而不含酶底物，所述第二层邻接地层压到第一层，

其中酶底物是可释放染料化合物的化合物。

此处，作为本发明的条目1，以下方面是优选的。

条目1-1.根据条目1的培养基，其中第二层抑制或阻碍分析物中的酶与第一层中存在的酶底物实体接触。

条目1-2.根据条目1的培养基，其中酶底物是可释放吲哚酚类染料化合物的酶底物，所述吲哚酚类染料化合物例如5-溴-4-氯-3-吲哚酚-β-D-哌喃半乳糖苷，或可释放荧光化合物的酶底物，所述荧光化合物例如4-甲基伞形酮基-β-D-哌喃半乳糖苷(4-methylumbelliferyl-β-D-galactopyranoside)。

条目2.根据条目1的培养基，其中胶凝剂含有选自以下各者的群组中的一种类型或两种或大于两种类型：琼脂(agar)、瓜尔豆胶(guar gum)、三仙胶(xanthan gum)、刺槐豆胶(locust bean gum)、结冷胶(gellan gum)、聚乙烯醇(polyvinyl alcohol)、烷基纤维素(alkylcellulose)、羧烷基纤维素(carboxyalkylcellulose)以及羟烷基纤维素(hydroxyalkylcellulose)。

条目3.一种用于检测微生物的材料，包含：

根据条目1或2的培养基，以及

第三层，其中含有多孔材料，所述第三层邻接地层压到第二层与邻近第一层的一侧相对的一侧上。

条目4.一种用于检测微生物的方法，包含将分析物接种到根据条目1或2的培养基中的第二层中的步骤、培养分析物中含有的微生物的步骤以及检测微生物的染色菌落的步骤。

其中酶底物是待通过微生物的酶分解的底物。

条目5.一种用于抑制培养基的染色的方法，包含将分析物接种到根据条目1或2的培养基中的第二层中的步骤以及培养分析物中含有的微生物的步骤，

其中酶底物是待通过所述微生物的酶以及所述分析物中含有的酶分解的底物。

本发明的有利效果

如果使用根据本发明的培养基，那么即使可分解待由微生物的酶分解的酶底物的酶固有地存在于分析物中，仍可抑制培养基自身的染色，且因此可高精确性地检测到呈染色菌落状的目标微生物。具体来说，当在用于实现目标微生物的快速且简单检测之前将介质制备成处于干态的简单培养基形式时，根据本发明的培养基是有用的。

附图说明

[图1]图1是示出比较例1和实例1中的培养基上的菌落(产酸克雷伯氏菌(K.oxytoca))的照片。

[图2]图2是示出比较例1和实例1中的培养基上的菌落(大肠杆菌(E.coli))的照片。

具体实施方式

根据本发明的培养基的特征是具有第一层和第二层。

另外，在第一层中，含有胶凝剂和酶底物。另一方面，在第二层中，含有胶凝剂而不含有酶底物。

第二层邻接地层压到第一层。此处，“层压”是指第二层至少部分地覆盖第一层，这是足够的，但第二层完全覆盖第一层，这是优选的。第一层与第二层邻接地层压到彼此。因此，当如后续所提及的根据本发明的方法中从第二层的一侧提供分析物作为样品时，第二层防止(抑制或阻碍)分析物中的酶与第一层中含有的酶底物接触，且可抑制培养基自身的染色。因此，其结果是，可清楚地辨别呈染色菌落状的目标微生物。另外，“分析物中的酶”和“分析物中含有的酶”在本文中是指分析物固有地拥有的酶，其区别于目标微生物的酶。

本发明中的胶凝剂是指通过水分来引起溶胀和胶凝的物质，且发挥基质作用以用于使培养基定形。更具体地说，根据本发明的培养基通常是固体(包含凝胶形式)。

胶凝剂通常是聚合化合物且可以是一般用于固体介质以培养微生物的物质，例如粘度改进多糖和吸收性聚合物。其具体实例包含琼脂、瓜尔豆胶、三仙胶、刺槐豆胶、结冷胶、聚乙烯醇、烷基纤维素(例如甲基纤维素和乙基纤维素)、羧烷基纤维素(例如羧甲基纤维素(carboxymethylcellulose)和羧乙基纤维素(carboxyethylcellulose))以及羟烷基纤维素(例如羟甲基纤维素(hydroxymethylcellulose)和羟乙基纤维素(hydroxyethylcellulose))，且可使用由其一种类型或两种或大于两种类型的组合中的混合物。另外，对于聚合物化合物的量值(平均分子量、聚合度等等)，当化合物用于固体培养基以用于培养微生物时，化合物在大体范围中。举例来说，可使用重量平均分子量优选是5,000到200,000以及皂化度(degree of saponification)优选是75％到99％且更优选是85％到90％的聚乙烯醇。

另外，待并入到第一层和第二层中的胶凝剂的种类可相同或不同。然而，从两层之间的相容性(亲和力)的视角看，相同种类的胶凝剂是优选的。

当胶凝剂用于固体培养基以用于培养微生物时，可将使用期间(在微生物的生长期间，相同应应用在下文中)的第一层和第二层中的胶凝剂的浓度调节到大体范围。举例来说，当重量平均分子量是5,000到200,000且皂化度是75％到99％的聚乙烯醇用于其时，使用期间的浓度优选是140克/升到300克/升，且更优选160克/升到260克/升。另外，例如当使用重量平均分子量是10,000到1,000,000的琼脂时，使用期间的浓度优选是5克/升到30克/升，且更优选10克/升到20克/升。培养基可通过将含量调节到此类程度来容易地操控和定形。

在使用期间，第一层和第二层中的胶凝剂的浓度可相同或不同。然而，从两个层之间的相容性(亲和力)的视角看，浓度优选是在相同或近似范围中。

第二层中的胶凝剂的量不受特定限制，只要应用防止待作为样品提供到培养基的分析物中的酶与第一层中含有的酶底物接触的量即可。举例来说，在使用重量平均分子量是5,000到200,000且皂化度是75％到99％的聚乙烯醇时，第二层中的胶凝剂的量优选是0.5克/平方米到5克/平方米，且更优选0.5克/平方米到2克/平方米。另外，例如，在使用重量平均分子量是10,000到1,000,000的琼脂时，第二层中的胶凝剂的量优选是15克/平方米到75克/平方米，且更优选15克/平方米到30克/平方米。

另外，在使用期间第二层的厚度不受特定限制，只要应用可防止待作为样品提供到培养基的分析物中的酶与第一层中含有的酶底物接触的厚度即可。举例来说，在使用期间，如后续所提及的薄片形干燥简单培养基的厚度优选是0.001毫米到0.1毫米，且更优选0.01毫米到0.1毫米，且呈琼脂介质形式的厚度优选是0.1毫米到5毫米，且更优选0.5毫米到2毫米。

本发明中的酶底物是在获得底物的分解产物中可释放染料化合物的化合物。

此处，染料化合物可以是可见光下的彩色化合物和发射彩色荧光的化合物中的任何一种。可释放在可见光下呈彩色化合物的化合物中的官能团的具体实例包含5-溴-4-氯-3-吲哚酚(5-bromo-4-chloro-3-indoxyl)基团，且将释放的5-溴-4-氯-3-吲哚氧化缩合成5，5′-二溴-4，4′-二氯-靛蓝(5，5′-dibromo-4，4′-dichloro-indigo)以显示蓝色。可释放呈发射彩色荧光的化合物形式的化合物中的官能团的具体实例包含4-甲基伞形酮基(4-methylumbelliferyl)，且释放的4-甲基伞形酮(4-methylumbelliferone)在紫外光辐照下发射荧光。

另外，本发明中的酶底物通常是待由目标微生物的酶分解的底物，期望通过使用培养基来检测所述目标微生物。在酶底物中，染料化合物通常通过利用酶的断裂位点来与识别位点键合。第一层中含有的酶底物由酶分解。因此，释放染料化合物，且检测到生长的目标微生物呈彩色菌落或由荧光染色的菌落状。因此，在培养基上可易于辨别此类菌落。

另外，本发明中的酶底物可以是待由分析物中含有的酶分解的底物，所述分析物作为样品提供到培养基。如上文所提及，在根据本发明的培养基中，第一层中含有酶底物，而第二层中不含酶底物，且第二层抑制分析物中的酶与第一层中含有的酶底物接触。因此，即使在可分解酶底物的酶包含于分析物中时，培养基自身未染色，且可清楚地辨别目标微生物的染色菌落。

酶底物的具体实例包含在目标微生物是大肠杆菌的情况下的5-溴-4-氯-3-吲哚酚-β-D-哌喃半乳糖苷(X-GAL)和5-溴-4-氯-3-吲哚酚-β-D-葡糖醛酸、在金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aurei)的情况下的5-溴-4-氯-3-吲哚酚-磷酸(X-phos)、在肠球菌(Enterococcus)的情况下的5-溴-4-氯-3-吲哚酚-β-D-吡喃葡萄糖苷(X-GLUC)以及在真菌(Fungi)的情况下的5-溴-4-氯-3-吲哚酚-乙酸和5-溴-4-氯-3-吲哚酚-丁酸，且可分别地优选地使用以上所有。

在使用期间，第一层中的此类酶底物的浓度仅需要调节到大体范围，其中酶底物用于检测微生物的固体培养基中。举例来说，在使用期间其浓度优选是0.01克/升到1.0克/升，且更优选0.2克/升到0.6克/升。

在根据本发明的培养基中的每一个的第一层和第二层中，除上述成分以外，可任意地含有选择性物质、抗菌物质、营养成分、无机盐、糖、粘度改进剂、pH调节剂等等。另外，除存在或不存在显色酶底物之外，第一层和第二层中的组成物可相同或不同。

选择性物质的具体实例包含抗生素和界面活性剂，例如十二烷基硫酸钠(sodiumdodecyl sulfate，SDS)、吐温(Tween)80以及胆汁盐(bile salt)，例如胆酸钠(sodiumcholate)。具体来说，从修饰分析物中含有的酶或抑制革兰氏阳性细菌(Gram-positivebacteria)的生长的视角看，将界面活性剂并入到第二层中是合理的。

抗菌物质的具体实例包含聚离胺酸(polylysine)、硫酸鱼精蛋白(protaminesulfate)、甘胺酸(glycine)以及山梨酸(sorbic acid)。

作为营养成分，例如蛋白胨(peptone)、动物肉提取物、酵母提取物或鱼肉提取物是优选的。

无机盐的具体实例包含无机酸金属盐(例如氯化钠和硫代硫酸钠)和有机酸金属盐(例如丙酮酸钠(sodium pyruvate)、柠檬酸铁铵(ferric ammonium citrate)以及柠檬酸钠(sodium citrate))。

糖的具体实例包含葡萄糖：乳糖、蔗糖、木糖、纤维二糖(cellobiose)以及麦芽糖(maltose)。

粘度改进剂的具体实例包含淀粉及其衍生物、玻糖醛酸(hyaluronic acid)、丙烯酸衍生物、聚醚以及胶原蛋白(collagen)。

pH调节剂的具体实例包含碳酸钠和碳酸氢钠(sodium hydrogencarbonate)。

在根据本发明的培养基中，从目标微生物的生长的视角看，在使用期间pH值优选是6.0到8.0，且更优选6.5到7.5。

根据本发明的培养基的形式不受特定限制，且除将培养基浇注到皮氏培养皿(petri dish)或类似物中且在其中固化的形式以外，培养基可制备成薄片形简单干燥培养基或类似物。

薄片形干燥简单培养基的具体实例包含具有通过层压含有多孔材料的层和含有胶凝剂的层所形成的配置且包含所述层的薄片形培养基，如WO 97/24432 A中所描述。在上述情况下，用于检测微生物的材料仅需要通过以下来形成：将含有胶凝剂的层应用作为根据本发明的培养基，且将含有多孔材料的层应用作为在根据本发明的培养基中与邻接第一层的一侧相对的一侧上邻接第二层的第三层，且包含上述层。更具体地说，用于检测与本发明相关的微生物的材料包含按以下次序邻接层压的第一层、第二层以及第三层的配置。当材料如后续所提及用于根据本发明的方法时，可从第三层的侧部添加分析物，且接着将分析物作为样品提供到第二层的侧部。

第三层中含有的多孔材料的具体实例包含各自由合成纤维、半合成纤维、天然纤维以及无机纤维形成的针织物或编织物、非编织物、多孔膜和海绵。还可使用多孔陶瓷。合成纤维的具体实例包含耐纶、聚丙烯腈、聚乙烯醇、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物(ethylene-vinyl acetate copolymer)、可进行亲水性处理的聚酯、可进行亲水性处理的聚烯烃以及聚胺酯。半合成纤维的具体实例包含人造纤维。作为天然纤维，毛绒纤维、丝纤维、棉纤维、纤维素纤维、纸浆纤维等等是优选的。

具体来说，容易调整单位重量或透气性的针织物或编织物、非编织物等等是优选的，且通过熔喷制造方法(根据所述熔喷制造方法可相对容易地获得细小纤维)制备的耐纶熔喷非编织物或由可分离纤维制成的超细纤维非编织物是更优选的。

另外，多孔材料的单位重量优选的是50克/平方米到90克/平方米，且更优选的是55克/平方米到80克/平方米。如果单位重量在上文范围内，那么可充分容易地确保微生物培养材料中的水分保持能力，无液体样品(分析物)从第三层中溢出，且可充分地整合第三层和第二层。

另外，多孔材料的通气性优选的是7厘米/秒到24厘米/秒(70升/(平方米·秒)到240升/(平方米·秒))，更优选的是8厘米/秒到20厘米/秒，且又另外优选的是10厘米/秒到18厘米/秒。如果透气性在上文范围内，那么在将液体样品(分析物)添加到其中时，水分易于均匀地分散到第二层和第一层中，且易于均匀地培养微生物。另外，当第二层和第一层中含有的胶凝剂溶解并溶胀时，易于充分地确保固定特性。另外，通过JIS L1096 8.26中指定的弗雷泽型方法(Frazier Type Method)来测量透气性。

根据本发明的培养基可优选地用于检测分析物中的微生物的方法中。此类方法包含将分析物接种到培养基的第二层中的步骤、培养分析物中含有的微生物的步骤以及检测根据本发明的微生物的染色菌落的步骤。此处，根据本发明的培养基的第一层中含有的酶底物是待由目标微生物的酶分解的底物。培养步骤中的条件不受特定限制，但在35℃±2℃下24小时到48小时是优选的。

根据本发明的培养基遏制培养基自身的染色，且将目标微生物的生长菌落染色，且因此可高精确性地检测到呈染色菌落状的目标微生物。

因此，如果从另一方面理解根据本发明的培养基，那么根据本发明的培养基可优选地用于抑制培养基的染色的方法中。此类方法包含将分析物接种到培养基的第二层中的步骤、培养分析物中含有的微生物的步骤以及检测根据本发明的微生物的染色菌落的步骤。此处，根据本发明的培养基的第一层中含有的酶底物是待由目标微生物的酶和分析物中含有的酶两者分解的底物。另外，目标微生物的酶和分析物中含有的酶可相同或不同。

表1显示目标微生物、目标微生物中保留的酶、酶底物以及含有可分解酶底物的酶的分析物的实例。然而，根据本发明的方法可应用的组合并不限于此。

[表1]

表1

*X表示5-溴-4-氯-3-吲哚酚是蓝色染料基团，4-甲基伞形酮基(4MU)是荧光染料基团等等。

待应用到根据本发明的培养基的分析物的具体实例包含易腐性食物例如肉、鱼以及贝类，蔬菜和水果，加工食品和饮品，例如奶酪、乳酸菌饮品以及发酵食物，并且还包含临床分析物，例如大便、饮用水、淡水、海水以及烹饪场所、医院等等中的擦拭分析物。另外，通过预培育胰酶大豆肉汤(Trypto-Soy Broth)等等中的分析物来制备的培养物流体和通过进一步培养用于培养微生物细胞的培养基中的培养物流体来制备的培养物流体也可用作分析物。

实例

接下来，将借助于实例更详细地描述本发明。本发明不受实例限制。

测试实例1

(1)制备培养基

将通过将表2中显示的调配物处的每1平方米中的每一成分添加到0.5升纯化水和利用无水碳酸钠将pH值调节到7.0以及在95℃下加热并溶解所得混合物1分钟所得到的产物总量均匀地涂覆到尺寸是1米×1米的20微米厚的聚酯膜上，且在65℃下彻底地干燥所得材料。在比较例1中，将所得产物用作培养基。相对于培养基(实例1和实例2)，将通过将表3中显示的调配物处的每1平方米中的每一成分添加到0.5升纯化水和在95℃下加热且溶解所得混合物1分钟所得到的产物总量均匀地进一步涂覆到其上，且在65℃下彻底地干燥所得材料。对于实例1和实例2以及比较例中的所有培养基，接着将耐纶熔喷非编织物(90克/平方米)层压到涂覆产物的一侧上。另外，将尺寸是70毫米×80毫米的100微米厚的聚酯膜粘合到非编织物上，且将所得材料分别地切割成45毫米正方形碎片以制备薄片形简单培养基。参考WO 97/24432 A应用用于制造薄片形简单培养基的详细方法。

[表2]

表2：第一层中的调配物(克/平方米)

蛋白胨	5
		酵母提取物	3
胆汁盐	1
		磷酸二钾	0.25
硝酸钾	0.5
		丙酮酸钠	0.5
吐温80	0.2
		X-GAL	0.3
鲑鱼葡萄糖苷酸(Salmon-glucuronide)	0.3
		聚乙烯醇*	120

*可乐丽波瓦尔(Kuraray Poval)217，重量平均分子量：5,000到200,000，皂化度：87％到89％(由可乐丽株式会社(Kuraray Co.，Ltd)制造)

[表3]

表3：第二层中的调配物(克/平方米)

	比较例1	实例1	实例2
				聚乙烯醇*	(无层压)	1	2

*可乐丽波瓦尔217，重量平均分子量：5,000到200,000，皂化度：87％到89％(由可乐丽株式会社制造)

(2)菌株样品提供

将通过各自在胰酶大豆琼脂介质上培养24小时的产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)JCM 1665和大肠杆菌NBRC 102203得到的产物用作样品细菌。使用无菌棉签将每一样品菌株悬浮于无菌生理盐水中以成为对应于麦克法兰比浊法1号的浓度(约3.0×10⁸菌落数/毫升(CFU/mL))，并用作细菌储备液。接着，通过使用无菌生理盐水以10倍级反复地稀释每一细菌储备液来制备10^-6菌落数/毫升的溶液。单独地，通过将20克切达(Cheddar)奶酪与90毫升无菌生理盐水混合来制备乳白色液体，并对所得混合物应用消化处理。另外，切达奶酪的量是通常进行的测试中的量的两倍。接着，将1毫升稀释的10^-6菌落数/毫升样品细菌添加到其中，并将所得混合物用作测试样品。接着，从其剥离100微米厚的聚酯膜，并将1毫升的测试样品各自接种到实例中1、实例2以及比较例1中的培养基中，并且接着在35℃下培养所得材料24小时。接着，观察培养基的染色状态和样品细菌的菌落。

结果显示于表4以及图1到图2中。

[表4]

表4：测试实例1的结果

在比较例1中的培养基中，X-GAL由衍生于切达奶酪的酶分解，且培养基完全染色。因此，应生长呈蓝色或深蓝色菌落的样品细菌完全不能辨别(图1中的左方和图2中的左方)。相比之下，在实例1中，培养基自身未染色，且通过生长样品细菌形成的蓝色菌落能够辨别(图1中的右方和图2中的右方)。即使在实例2中，第二层中的胶凝剂的量提高到双倍，仍获得类似结果。

在本测试实例中，虽然由于测试样品是从第二层的侧部接种到培养基中，因此在提供第一层作为样品时未使得样品细菌(目标微生物)与第一层进行直接接触，但是目标微生物分解第一层中的酶底物以形成蓝色菌落，且第一层实现酶底物培养基的功能，其结果不可从目前为止已获得的发现中预测到。

测试实例2

(1)制备培养基

作为第一层，X-GAL琼脂介质(由日水制药株式会社(Nissui PharmaceuticalCo.，Ltd)制造)是根据随附文献制备，且所得材料在90毫米直径的无菌塑料皮氏培养皿上配制且以约5毫米的厚度固化。作为第二层，根据本发明(实例3到实例8)的培养基通过以下来制备：层压利用普通方法制备的营养琼脂(营养琼脂介质，由日本默克公司(Merck Ltd.，Japan)制造)或通过以15克/升溶解制备的琼脂，且在以1毫米、2毫米或5毫米的厚度预先制备的第一层上对所得产物进行灭菌。另外，制备其上未层压第二层的培养基作为比较例2。

(2)菌株样品提供

通过以类似于测试实例1的方式将大肠杆菌的细菌储备液与乳白色的切达奶酪液体混合来制备测试样品。将测试样品从第二层的一侧各自涂抹500微升到实例3到实例8以及比较例2中的培养基上。使测试样品完全地吸收到培养基中，并且接着在35℃下培养所得材料24小时，且接着观察培养基的染色状态和样品细菌的菌落。

结果显示于表5中。

[表5]

表5：测试实例2的结果

在比较例2中的培养基中，X-GAL由衍生于切达奶酪的酶分解，且培养基完全染色。因此，应生长呈蓝色菌落状的测试细菌完全不能辨别。相比之下，在实例3到实例8的培养基中，不论第二层中是否所含有营养成分，培养基自身未染色，且通过生长的样品细菌形成的蓝色菌落能够清楚地辨别。即使第二层的厚度调节到5毫米，但目标微生物分解第一层中的酶底物且形成蓝色菌落，且第一层实现酶底物培养基的功能，其结果不可从目前为止已获得的发现中预测到。

工业实用性

本发明提供一种培养基，其中即使可分解待由微生物的酶分解的酶底物的酶固有地存在于分析物中，也可抑制培养基自身的染色。接着，本发明还提供一种用于通过使用根据本发明的培养基来高精确性地检测呈染色菌落状的目标微生物的方法，且因此本发明是有用的。另外，在本发明中，以使用前呈干态的简单培养基形式来特别地呈现效果，且因此实现快速且简单地检测目标微生物，且因此本发明是有用的。

Claims

1.一种培养基，用于检测微生物，包括：

第一层，含有胶凝剂以及酶底物，以及

第二层，含有胶凝剂而不含所述酶底物，所述第二层邻接地层压到所述第一层，

其中所述酶底物是能够释放染料化合物的化合物。

2.根据权利要求1所述的培养基，其中所述胶凝剂包括选自以下各者的群组中的一种类型或两种或大于两种类型：琼脂、瓜尔豆胶、三仙胶、刺槐豆胶、结冷胶、聚乙烯醇、烷基纤维素、羧烷基纤维素以及羟烷基纤维素。

3.一种用于检测微生物的材料，包括：

根据权利要求1或2所述的培养基，以及

第三层，含有多孔材料，所述第三层邻接地层压到所述第二层与邻近所述第一层的一侧相对的一侧上。

4.一种用于检测微生物的方法，包括：

将分析物接种到根据权利要求1或2所述的培养基中的所述第二层中的步骤，

培养所述分析物中含有的所述微生物的步骤，以及

检测所述微生物的染色菌落的步骤，

其中所述酶底物是待由所述微生物的酶分解的底物。

5.一种用于抑制培养基染色的方法，包括：

将分析物接种到根据权利要求1或2所述的培养基中的所述第二层中的步骤，以及

培养所述分析物中含有的所述微生物的步骤，

其中所述酶底物是待由所述微生物的酶以及所述分析物中含有的酶分解的底物。