CN1477397A - 一种微生物体分选检测方法及专用装置与试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种微生物体分选检测方法及专用装置与试剂盒。其特征在于将细胞、细菌等颗粒性微生物体，用抗体或其标记物等生物活性分子标记，通过细胞自动分选涂片装置，将被检测物从复杂的样品混合液中分选、分离、纯化、富集并固着在载玻片的特定区域，用荧光、酶催化反应、胶体金沉积和、细胞及微生物染色等显示技术观察检测分析结果。该方法快速灵敏、操作简便、高效、成本低，使用方便、适合对不同细胞、细菌、真菌、衣原体、支原体、立克次氏体、螺旋体、原虫、病毒等微生物体的富集、分选、检测和分析，可广泛地用于生物学、医药学、预防医学、动植物学、农牧业、食品与卫生、能源与化工、环境监测以及医学诊断与检测等领域。

Description

一种微生物体分选检测方法及专用装置与试剂盒

本发明涉及一种微生物体分选检测方法及专用装置与试剂盒。该技术快速、灵敏、操作简便、成本低，使用方便，适合对不同细胞、细菌、真菌、衣原体、支原体、立克次氏体、螺旋体、原虫、病毒等微生物体的分选、检测和分析，可广泛地用于生物学、医药学、预防医学、动植物学、农牧业、食品与卫生、能源与化工、环境监测以及医学诊断与检测等领域。

固相吸附、分离、纯化和分选技术在水源、生物材料、生物体液(如血液、血清、血浆、脑脊液、泪液、汗液、痰液、消化液、精液、分泌液、组织液、渗出液、呕吐物)和排泄物(如尿液、粪便)等不同来源样品中的细胞和微生物等颗粒性成分的分离、纯化和检测分析等方面已被广为应用。

生物固相化技术主要是利用不溶的固相基质材料，通过表面吸附或结合以捕获液相被检测物中的靶分子或靶颗粒物，借助重力、压力、离心、过滤、磁力、流体等，经过一步或多步操作很方便的将不结合的分子和颗粒物(液相、游离相或流动相)与结合的分子和颗粒物(固相)分离，以便获得纯的目的分子和颗粒物，或将目的分子和颗粒物从复杂的样品混合物或悬液中分离出来，用于进一步的检测、分析和研究。

不同的微生物体具有不同的生物学特性并呈现出不同的标志分子，如细胞表面的CD分子，微生物的鞭毛抗原等，并因此而表现为对不同的生物活性分子具有不同的结合特性。依据这一特性可以将各种微生物体区分为不同的种属、类和亚类、型和亚型、群和亚群等，并可进一步用于微生物体的分离、纯化、分选和富集等。从复杂的样品混合物或悬液中分离、纯化与富集微生物体等颗粒物，用于进一步检测、分析和研究是生物、医学等领域中重要的技术手段。但现有技术手段大多功能单一、操作烦杂、纯度差、效率低。流式细胞分析技术是微生物体等颗粒物最重要的分析、分选检测技术，它虽然解决了存在的上述问题，但流式细胞仪价格昂贵、费用高，限制了该技术在基层医疗卫生和科研机构的推广使用，此外，由于流式细胞仪的体积较大，对操作环境要求较高，不便携带和进行野外操作。与此同时发展起来的磁分选技术与装置虽然结构简单，小巧紧凑，价格低廉，但只具有分离和分选功能，而不具有分析和检测功能。

为解决上述问题，本发明把微生物体与生物分子的专一结合特性同吸附、分离、纯化、分选和富集等固相技术相结合，使微生物体在细胞自动分选涂片装置中自动分选并附着在各种不同的载玻片上或同一载玻片的不同固着区，以实现对微生物体的自动分选、分离和纯化；把生物分子的标记以及免疫检测等技术与生物染色等微生物体的形态与结构观察等分析技术相结合，并使之有机地融为一体，用于微生物体等各种颗粒物的自动分离、分选、纯化、富集和检测分析，具有样品量少、操作简便、快速高效、成本低、携带方便、易于普及推广，可适宜野外操作等特点。

本发明的主要技术特征是，将细胞、细菌等颗粒性微生物体，用抗体或其标记物等生物活性分子标记，通过细胞自动分选涂片装置，将被检测物从复杂的样品混合液中分离、纯化、分选、富集并固着在载玻片的特定区域，用荧光、酶催化反应和胶体金沉积和组织、细胞及微生物染色等显示技术观察检测分析结果，运用本发明提供的技术方法、专用装置和试剂可使对各种颗粒性微生物体的检测、分析更加简便、快速、高效，同时大大降低检测分析成本。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案其基本特征在于：样品中微生物体的分选检测方法，至少包括下述基本步骤；

①样品制备：将可能含有微生物体的样品用样品液，如PBS，Hanks，HEPES或培养液等，进行稀释、分散、分离或悬浮、抗凝等处理，配合离心、过滤、浓缩、去除残渣等操作；

②样品处理：把不同的生物活性分子与样品混合，使之能与微生物体的不同生物学标志分子相互作用并特异性地结合在微生物体上，借助细胞自动分选涂片装置，将被结合的微生物体固着在各种不同的载玻片上或同一载玻片的不同固着区，最终实现对各种类别微生物体的自动分选；生物活性分子结合的标志分子可以是细胞或细菌等微生物体表面或胞浆中的酶类、转录调控因子、信号传导蛋白、激素受体等蛋白分子或核酸分子；也可以是蛋白分子或核酸分子上的糖基；或者是标记生物活性分子的指示分子等；在实施中至少可用下述方法和/或物质中的一种，实现对样品的直接或间接处理：

a.能与微生物体标志分子特异结合的蛋白分子与多肽、糖、寡糖和多糖、核酸和寡核苷酸、脂和类脂、抗原和半抗原、抗体和抗抗体、药物、凝集素以及细胞因子、生长因子、激素、细胞外基质及其活性片段等各种生物活性分子；

b.生物活性分子的荧光素、生物素、同位素、酶类、半抗原、胶体金、稀土离子及其螯合剂等指示分子或其衍生物的标记物；

c.偶联或固着在磁珠表面的各种生物活性分子；磁珠可以是任何可加工成型的、透光的、不透光的或反光的，有荧光或无荧光的，硬质或软质、有机或无机、单体或复合材料，经加工而成的、不同外观形状，大小均一的空心体、多孔或实心体的固相微粒；经处理其表面可获得具有不同活性基团组成的连接分子层，借助这些活性基团可进一步与不同的来源的活性分子偶联，使之固定在磁珠表面；

③标记：在本发明中所述的标记可以是下述方法中的一种或多种，通过一步或多步反应标记微生物体，其中至少有一种成分为磁珠标记物；a.用指示分子标记生物活性分子(也称生物探针的标记，如用荧光素标记生物素和抗体等)；b.用生物活性分子(如抗体，生物素等)或其标记物(如抗体和荧光抗体)结合微生物体等颗粒性物质，使之被标记(也称直接标记)；c.用指示分子的不同标记物(如荧光抗抗体、酶标记亲合素等)标记生物活性分子(也称间接标记)；d.用能与指示分子结合的生物活性分子(如抗荧光素抗体，抗生物素抗体、链亲合素等)结合指示分子；e.双重标记：用磁珠、荧光素等不同的指示分子标记的生物活性分子结合指示分子，如磁珠标记的抗荧光素抗体结合或标记特异性抗体的荧光素标记物；f.双标记和多标记：用两种或两种以上的不同的指示分子标记的不同的生物活性分子同时结合同一微生物体上的不同生物分子；

④样品分选：将反应混合液加入细胞自动分选涂片装置的样品池中，微生物体依据其自身生物学特性的不同，与生物活性分子或其标记物结合，经进液口流经载玻片的表面的涂片小室，由于磁场的作用被吸附并固着在载玻片上，未被磁珠标记的微生物体，随液体经出液口流出；

⑤漂洗液漂洗；漂洗液流经涂片小室，将残留的和非特异性附着的细胞冲走；

⑥染色；根据微生物体的生物学特性加入相应的细胞染色液；或取出载玻片进行固定、染色、脱色或去除残留溶液等；

⑦观察标记分子或染色结果：目测或显微镜观察载玻片细胞固着区有无细胞等微生物体以及其形态与结构特征。

2.本发明的特征还在于：检测样品中微生物体的方法可包括下述基本步骤；

①样品制备：将可能含有微生物体的样品用样品液，进行稀释、分散、分离或悬浮等处理，配合离心、过滤等操作，浓缩或去除残渣等；

②样品分选：将制备的样品加入样品池中，经进液口流经涂片小室，微生物体依据其自身生物学特性的不同，与载玻片固着区表面的生物活性分子结合，并固着在载玻片上，未被固着的微生物体，随液体经出液口流出；

③漂洗液漂洗；漂洗液将残留的和非特异性附着的细胞冲走；

④染色；取出载玻片或在细胞自动分选涂片装置中对固着细胞进行固定、染色、脱色；

⑤观察染色结果。目测或显微镜观察载玻片细胞固着区有无细胞等微生物体以及其形态与结构特征。

3.本发明的特征还在于：检测样品中微生物体的方法包括下述基本步骤：

①样品制备：将可能含有微生物体的样品用样品液，进行抗凝、稀释、分散、分离或悬浮等处理，配合离心、过滤、浓缩或去除残渣等操作；

②样品处理：把样品与生物活性分子等混合并反应，使样品中的微生物体与之形成复合物或结合物；其中的生物活性分子也可以是荧光素、酶等指示分子的标记物；微生物体依据其自身生物学特性的不同，与不同的生物活性分子结合；

③样品分选：将处理的样品加入样品池中，经进液口流经载玻片表面的涂片小室，微生物体表面结合的生物活性分子与载玻片固着区表面的生物活性分子相互作用，并与对应的活性分子结合，固着在载玻片上，未被固着的微生物体，随液体经出液口流出；

④漂洗液漂洗；漂洗液将残留的和非特异性附着的细胞冲走；

⑤染色；取出载玻片或在细胞自动分选涂片装置中对固着细胞进行固定、染色、脱色；

⑥观察染色结果。目测或显微镜观察载玻片细胞固着区有无细胞等微生物体以及其形态与结构特征。

4.本发明的特征还在于：微生物体可以是各种来源的细胞、细菌、真菌、病毒、衣原体、支原体、螺旋体、原虫等以及经感染、转化或转染的细菌、细胞等当中的任何一种。

5.本发明的特征还在于：生物活性分子可以是抗原、半抗原、抗体、抗抗体、凝集素以及细胞因子、生长因子、激素、细胞外基质及其活性片段等。活性分子可以被指示分子直接标记或被指示分子标记的对应结合物间接标记。

6.本发明的特征还在于：载玻片是指可装入细胞自动分选涂片装置中，具有任何外观形状和结构，透光或不透光的、磁性和非磁性、硬质和软质、有机和无机、单体或复合材料等材质的、可给微生物体的附着、染色以及结果观察等提供支撑基质的各种规格的载玻片；经处理其表面可同时固着活性分子或生物大分子；在同一张载玻片上同时固着多种活性分子或生物大分子时，可将载玻片分为不同的固着区。

7.本发明的特征还在于：细胞自动分选涂片装置是由样品池、微流管、进液口、出液口、密封圈、载片台、载片夹、冲洗液容器、废液收集器、箱体等基本结构和组件与微流控系统、微操作系统和微处理器或计算机等分别或共同组成的手动自动、半自动或简易装置；载片台与载玻片配合可形成涂片小室，将微生物体依据其某些生物学特性固着在载玻片上或载玻片的不同区域；一台装置可有一个或多个载片台和载片夹。

8.本发明的特征还在于：涂片小室是由细胞自动分选涂片装置的进液口、出液口、密封圈、载片夹与载玻片之间形成的，一种能使液体在载玻片的表面呈极薄的膜状液流的微隙结构。

9.本发明的特征还在于：在载片夹上可以放置永磁、顺磁或电磁等不同磁性材料或装置；以便在涂片小室的载玻片侧形成一定强度的磁场。

10.本发明的特征还在于：试剂盒至少装有一种生物活性分子或其标记物，并与下述成分分别或共同组成不同的试剂盒：

①至少有一管为样品液，用于样品的制备，如抗凝、稀释、重悬、过滤、离心等；

②至少有一张载玻片；

③至少有一种含指示分子的标记试剂，如荧光素、生物素、酶、半抗原等；

④至少有一管洗涤液或其浓缩液，如PBS，Hanks，HEPES，细胞培养液；

⑤在指示分子为酶类时，至少有一种显色底物或发光底物，如DAB过氧化氢/脲、鲁米诺，甲基伞形酮磷酸酯，ATP等；

⑥至少有一管装有表面具有化学活性基团或包被了生物活性分子的磁珠；

⑦至少有一管为微生物体染色液；如吉姆萨染液、瑞氏染液、革兰氏染液，HE染液等；

⑧至少配备一台简易细胞自动分选涂片装置。

本发明具有以下优点：1.快捷灵敏效率高，由于载玻片与涂片装置间形成的微间隙非常小，使涂片小室的容积也非常小，因此只需要很少量的液体就可以在载玻片表面形成层流，促使溶液中的细胞等颗粒物与载玻片的接触，增加与载玻片固着区生物活性分子的相互作用，提高微生物体的附着率；一台细胞自动分选涂片装置可设置多个，甚至几十个载片台同时操作，而每次操作仅需数分钟；2.需样量少、节省试剂；由于涂片小室的容积非常小，因此不需要太多的样品，同时染色液、显色液和洗液等的用量也大大减少，节省试剂，降低使用成本；3.价格低廉、成本低，由于细胞自动分选涂片装置结构简单，易于加工制造，因此生产成本低，市场销售价格也随之降低，有益于市场推广；4.配套装置结构小巧，轻便紧凑、便于携带，细胞自动分选涂片装置体积小，重量轻，不需要特殊的工作环境和支撑条件，易于流动和野外操作；5.操作简便，易学易会，本项发明把烦杂的操作交给仪器来完成，使用者只需要采集样品和添加试剂，取放载玻片等简单操作；6.多种功能自由组合，运用本项技术使用者可以完成微生物体的标记，分选，分离、纯化、涂片、固定、染色等全部实验操作；亦可根据需要选取不同的功能自由组合与选配，简单可靠。

下面结合附图对本发明做进一步的说明：

图1.细胞自动分选涂片装置基本结构示意图

图中细胞自动分选涂片装置由箱体1.样品池2、微流管3、进液口4、出液口5、密封圈6、载片台7、载玻片8、载片夹9、冲洗液瓶10、废液收集器11等基本结构和组件组成；密封圈6镶嵌在载片台7上并略高于其平面，将载玻片装于载片夹上与载片台对合，由于密封圈的作用使载玻片与载片台两平面之间形成一种密闭的微隙结构-涂片小室；样品池2中的样品混合液经微流管3由进液口4进入涂片小室。在此基础上增加微流控和微操作系统以及微处理器或外设计算机，可实现本装置的自动和半自动操作。

图2.载玻片的分区与外观结构示意图

图中载玻片8和分为a-j等不同结合功能区的固着区13和登记被检样品的编码区14。实施中，细胞等微生物体依据其表面分子特性的不同，分别吸附或固着在不同的固着区。

图3.涂片小室结构示意图

图中微流管3、进液口4、出液口5、密封圈6、载片台7、载玻片8、载片夹9，磁铁片12，涂片小室15，磁珠标记的样品细胞16；密封圈6镶嵌在载片台7上并略高于其平面，使载玻片8与载片台7两平面之间形成一种密闭的微隙结构一涂片小室15，微流管3借助进液口4、出液口5与之相通；样品池2中的样品混合液经微流管3由进液口4进入涂片小室；经处理的样品液经微流管3由进液口4进入涂片小室，立即在载玻片8表面形成一极薄的、可流动的液膜，使细胞等微生物体在载玻片8的表面几乎以细胞单层流过。在载片夹上有一与载玻片平行的磁铁片12，可吸引磁珠标记的细胞16，并使细胞附着在载玻片的固着区；加入漂洗液将残留的和非特异性吸附微生物体冲走，只留下被标记的微生物体特异性的附着在载玻片的固着区。

下面结合实施例对本发明做更进一步的说明。实施例I：微生物体分选检测分析方法在结核病诊断中的应用

结核是唯一一种未能得到全面控制的人类传染病。由于流动人口的增加，耐药菌株的产生和治疗的不及时、不彻底等原因，使的近些年的发病率又有回升。在结核的防治中，痰涂片抗酸染色是检查活动性肺结核，控制传染源最有效的手段之一，但是灵敏度低和假阴性率较高，运用本技术发明可以大大提高其阳性率提高诊断的准确性，在实施中的具体操作步骤如下：

①取患者痰液加入适量磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.2)稀释、混悬；

②加入5-10ul磁珠标记的抗结核杆菌特异抗体，置室温反应5-15分钟；

③将反应混合液加入装有载玻片的细胞自动分选涂片装置中的样品池；

④待反应混合液全部进入微流管后，加入2-5ml漂洗液冲洗；

⑤加入50-200ul染色液，固定、染色；

⑥漂洗去除残留染色液，置显微镜下观察染色结果。实施例II：微生物体分选检测分析方法在血液细胞检测中的应用

①5-10ul磁珠标记的抗CD分子抗体，用磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.2，含NBS 0.5％)适量稀释；

②取抗凝血100-200ul，加入稀释的抗CD分子抗体磁珠混合，置室温反应10-30分钟；

③将反应混合液加入样品池；

④待反应混合液全部进入微流管后，加入2-5ml漂洗液冲洗；

⑤加入50-200ul染色液，固定、染色；

⑥漂洗去除残留染色液，置显微镜下观察染色结果。实施例III：微生物体分选检测分析方法在血液脱落肿瘤细胞检测中的应用

细胞转移是恶性肿瘤的主要致死因素，因此淋巴结转移和原发肿瘤大小被作为判断预后和制定治疗方案的主要参考指标。然而，仍有相当数量经常规检查没有发现任何转移迹象的患者于术后出现复发和转移，说明单靠原发肿瘤大小和淋巴结转移状况来评估患者的预后，将影响对相当数量患者的正确判断。肿瘤细胞的远处转移，主要是通过血液，因此，观察和监测血液脱落肿瘤细胞的有无和数量，对治疗方案的制定至关重要。但是由于血液中脱落或转移的肿瘤细胞数量非常低(10⁵以下)难以观察，限制了该检查在临床治疗中的应用，故在此项检查中对血液中脱落转移的肿瘤细胞的富集极为关键，而运用本项技术发明，可以大大提高阳性率检出率，提高诊断的准确性，促进本项检查在肿瘤临床治疗中的应用。在实施中的具体操作步骤如下：

①取患者抗凝血10-20ml梯度密度离心，收集单个核细胞重悬于PBS(pH7.2，含0.5-2％NBS或FBS)中，加入5-10ul荧光素标记的抗肿瘤细胞的特异性抗体(如抗CEA，抗AFP，抗细胞角蛋白-CK、抗膜上皮抗原-EMA、抗表皮糖蛋白-EPG等)混合，置室温反应10-30分钟；对细胞内抗原的抗体标记，在反应前应先用通透剂或固定液处理，以便使抗体能透过细胞膜与膜内的抗原结合。

②离心，PBS漂洗沉淀数次；重悬于适量PBS液中。

③加入5-10ul磁珠标记的抗荧光素抗体混合，置室温反应10-30分钟；

④将反应混合液加入样品池；

⑤待反应混合液全部进入微流管后，在样品池中加入2-5ml漂洗液冲洗；

⑥置荧光显微镜下观察荧光染色结果。实施例IV：微生物体分选检测分析方法在肠道脱落肿瘤细胞检测中的应用

①患者粪便10克，加10ml PBS缓冲液混匀，40-80目不锈钢筛网过滤；

②清液1500rpm离心10min，沉渣部分加1ml PBS重悬，移入1.5ml离心管中离心，10000rpm，1min收集沉渣；加入0.5ml PBS缓冲液重悬细胞；

③加入5-20ul抗肠癌细胞单抗-HRP标记物，混匀，RT放置10-30min；

④1500rpm离心10min，重复1-3次，加入0.5ml PBS缓冲液，重悬细胞；

⑤加入5-10ul羊抗小鼠Ig或抗HRP磁珠抗体，混匀，RT放置10-3min；

⑥将反应混合液加入样品池；

⑦待反应混合液全部进入微流管后，在样品池中加入2-5ml漂洗液冲洗；

⑧加入DAB底物液，室温反应2-15分钟，冲洗；HE复染，冲洗；

⑨取出载玻片显微镜下观察染色结果。实施例V：微生物体分选检测分析方法在粪便幽门螺杆菌检测中的应用

①患者粪便5-10克，加5-10ml PBS缓冲液混匀，40-80目不锈钢筛网过滤；

②清液1500rpm离心10min，沉渣部分加1ml PBS重悬，移入1.5ml离心管中离心，10000rpm，1min收集沉渣；加入0.5ml PBS缓冲液重悬细胞；

③加入5-20ul抗不同幽门螺杆菌及其变异体抗原的抗体-FITC标记物(小鼠来源)，混匀，RT放置10-30min；

④1500rpm离心10min，重复1-3次，加入0.5ml PBS缓冲液，重悬细胞；

⑤加入5-10ul羊抗小鼠Ig或抗FITC磁珠抗体，混匀，RT放置10-30min；

⑥将反应混合液加入样品池；

⑦待反应混合液全部进入微流管后，在样品池中加入2-5ml漂洗液冲洗；

⑧取出载玻片显微镜下观察荧光染色结果。

上述实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的适用范围与领域。实施例中未注明具体实验条件和实验方法及其组合形式的，可参照相关实验技术手册或文献资料，以及制造厂商所建议的条件实施或进行。本发明在此将《生物分子固定化技术及应用》(蒋中华，1998年，化学出版社)，细胞和分子免疫学(金伯泉，2001年，科学出版社)及《细胞实验指南》(斯佩克特，黄培堂译，2001年，科学出版社)引为主要参考文献。

本发明涉及一种细胞、细菌等微生物体的分选检测方法和专用装置及试剂盒。该方法快速、灵敏、高效，操作简便、成本低，适合不同样品细胞的快速分离、分选、富集与分析检测，可广泛地用于生物学、医药学、预防医学、动植物学、农牧业、食品与卫生、能源与化工、环境监测以及医学诊断与检测等领域。

Claims (10)

1.一种检测样品中微生物体的方法，它至少包括下述基本步骤：

①样品制备：将可能含有被检微生物体的样品用样品液进行稀释、分离、或悬浮等处理；

②样品处理：把不同的生物活性分子与样品混合，使之与微生物体的不同标志分子相互作用并特异性地结合在微生物体上；借助细胞自动分选涂片装置，将被结合的微生物体固着在各种不同的载玻片上或同一载玻片的不同固着区，最终实现对各种类别微生物体的自动分选；对样品的处理可以是下述方法和/或物质中的任何一种：

a.能与微生物体特异结合的各种生物活性分子；

b.生物活性分子的荧光素、生物素、同位素、酶类、半抗原、胶体金、稀土离子及其螯合剂等指示分子或其衍生物的标记物；

c.偶联或固着在磁珠表面的各种生物活性分子；磁珠可以是任何可加工成型的、透光的、不透光的或反光的，有荧光或无荧光的，硬质或软质、有机或无机、单体或复合材料，经加工而成的、不同外观形状，大小均一的空心体、多孔或实心体的固相微粒；经处理其表面可获得具有不同活性基团组成的连接分子层，借助这些活性基团可进一步与不同来源的活性分子偶联，使之固定在磁珠表面。

③标记：微生物体的标记可以是下述方法中的一种或多种，通过一步或多步反应标记微生物体，其中至少有一种为磁珠标记物：a.用指示分子标记生物活性分子；b.用生物活性分子或其标记物结合微生物体等颗粒性物质，使之被标记；c.用指示分子的不同标记物标记生物活性分子；d.用生物活性分子结合指示分子；e.双重标记：用磁珠、荧光素等不同的指示分子标记的生物活性分子结合指示分子；f.双标记和多标记：用两种或两种以上的不同的指示分子标记的不同的生物活性分子同时结合同一微生物体上的不同生物分子。

④样品分选：将反应液加入细胞自动分选涂片装置的样品池中，依据标记特性的不同进行微生物体的分选、分离与涂片；

⑤漂洗液漂洗；

⑥染色；

⑦观察标记分子或染色结果。

2.一种检测样品中微生物体的方法，它至少包括下述基本步骤：

①样品制备：将可能含有被检微生物体的样品用样品液进行处理；

②样品分选：加入细胞自动分选涂片装置的样品池中进行分选、分离与涂片；

③漂洗液漂洗；

④染色；

⑤观察染色结果。

3.一种检测样品中微生物体的方法，它至少包括下述基本步骤；

①样品制备：将可能含有被检微生物体的样品用样品液进行处理；

②样品处理：把样品与生物活性分子或其标记物混合并反应，使之与微生物体形成复合物或结合物；

③样品分选：把反应液加入细胞自动分选涂片装置的样品池中，分选、分离与涂片；

④漂洗液漂洗；

⑤染色；

⑥观察标记分子或染色结果。

4.根据权利要求1或2或3所述的微生物体，可以是各种来源的细胞和细菌、真菌、病毒等微生物以及经感染、转化或转染的细菌、真菌、细胞等当中的任何一种；

5.根据权利要求1或2或3所述的生物活性分子，可以是抗原、半抗原、抗体、抗抗体、凝集素以及细胞因子、生长因子、激素、细胞外基质及其活性片段等；活性分子可以被指示分子直接标记或被指示分子标记的对应结合物间接标记。

6.根据权利要求1或2或3所述的载玻片，是指可装入细胞自动分选涂片装置中，具有任何外观形状和结构，透光或不透光的、磁性和非磁性、硬质和软质、有机和无机、单体或复合材料等材质的、可给微生物体的附着、染色以及结果观察等提供支撑基质的各种规格的载玻片；经处理其表面可同时固着活性分子或生物大分子；固着多种活性分子或生物大分子时，可将载玻片分为不同的固着区。

7.一种权利要求1或2或3所述的检测样品中微生物体的方法的专用细胞自动分选涂片装置，由样品池、微流管、进液口、出液口、密封圈、载片台、载片夹、冲洗液容器、废液收集器、箱体等基本结构和组件与微流控系统、微操作系统和微处理器或计算机等分别或共同组成的手动、自动、半自动或简易装置；载片台与载玻片配合形成涂片小室，可将微生物体依据其某些生物学特性固着在不同的载玻片上或载玻片的不同区域。

8.根据权利要求8所述的涂片小室，由细胞自动分选涂片装置的进液口、出液口、密封圈、载片台与载玻片之间形成的、可以使液体在载玻片的表面呈极薄的膜状液流的微隙结构。

9.根据权利要求1或7或8所述的细胞自动分选涂片装置，在载片夹上可以放置永磁、顺磁或电磁等不同磁性材料或装置；以便在涂片小室的载玻片侧形成一定强度的磁场。

10.一种权利要求1或2或3所述的检测样品中微生物体的方法的专用试剂盒，至少装有一种生物活性分子或其标记物，并与下述成分分别或共同组成不同的试剂盒：

①至少有一管为样品液，用于样品的制备；

②至少有一张载玻片；

③至少有一种含指示分子的标记试剂；

④至少有一管洗涤液或其浓缩液；

⑤在指示分子为酶类时，至少有一种显色底物或发光底物；

⑥至少有一管装有表面具有化学活性基团或包被某种生物活性分子的磁珠；

⑦至少有一管为微生物体染色液；

⑧至少有一台简易细胞自动分选涂片装置。

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