JPH11500223A

JPH11500223A - 三次元比色分析集成体

Info

Publication number: JPH11500223A
Application number: JP8525121A
Authority: JP
Inventors: デボラーチャリーク; アンケライカート
Original assignee: THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CARIFORNIA
Current assignee: THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CARIFORNIA
Priority date: 1995-02-13
Filing date: 1996-02-13
Publication date: 1999-01-06
Also published as: KR19980702179A; WO1996025665A1; EA199700100A1; EA000409B1; CA2211972A1; EP1460423A1; EP0809803A4; EP0809803A1; US6183772B1; AU4982196A; AU714839B2

Abstract

(57)【要約】一例ではインフルエンザウイルスである、被検物に暴露した場合に青色から赤色に変化する新規三次元高分子集成体を用いた直接検定が記載されている。集成体は典型的には懸濁液中に保持されうるリポソームの形であり、色の変化では大きな強度を示す。それらの製造方法も記載されている。

Description

【発明の詳細な説明】三次元比色分析集成体本出願は、１９９４年８月１１日に出願された米国特許願第０８／２８９，３８４号、及び１９９４年１０月２４日に出願された同第０８／３２８，２３７号の部分継続出願であり、これらの出願は共に１９９３年１１月３０日に出願された米国特許願第０８／１５９，９２７号の部分継続出願であり、この出願は１９９２年１１月２５日に出願された米国特許願第０７／９８２，１８９号、及び１９９２年１１月１３日に出願された同第０７／９７６，６９７号の部分継続出願であり、これらの出願は共に１９９０年１１月２６日に出願された米国特許願第０７／６１７，９８８号と関連している。本発明は、ローレンス・バークレー(Lawrence Berkeley)研究所の事業のために米国のエネルギー省及びカリフォルニア大学間の契約書第ＤＥ−ＡＣ０３−７６ＳＦ０００９８号のもとに政府の援助を得た。政府が本発明の権利を有する。発明の背景本発明は、三次元高分子集合体においてその表面への被検物の選択的結合に応答しておこる色の変化を用いる被検物の直接検出法に関する。分析化学ヘマトクリット値のような医学的パラメータを決定するのに長年分析化学技術が用いられてきた。それら自身の正当性は有用であるが、分析化学法には限界があるか、又は評価の価値がある多くの生物学的パラメータに実際には適用できない。高価で面倒なガスクロマトグラフィー法を使用しなければ、そのような方法を実施するのに一般的には多量の被検物を必要とする。定量的結果に限界があったり入手できなかったりすることがしばしばである。しかしながら、クレアチニン検定のような基本的な化学試験にはそのような技術が用いられてきた。微生物学的及び病理学的方法医学−生物学系の分析の別の方法は、種々の細胞染色及び古典的な病理学的方法を用いた直接的微視的観察である。これらの方法の性能を増大させるために、培養、コロニーの特性決定、及び代謝及び栄養物の限界の観察のような微生物学的技術が十分に開発された。多くの医療科学はこの基本的な分析技術の在庫を用いて発展してきた。培養及び直接的組織観察技術は、長年医学的検出法を支持するものとして役立ってきたが、かなり限界がある。疾患状態の発生及び原因となる病原体の同定を決定するための患者の組織の病理学的分析は、一般的には観血的方法を必要とする。他方、種々の体液又はその他の試料からの病原体の培養は、多くの時間を必要とし、かつ高価である。免疫学的検定薬剤の飛躍的な進歩は、免疫学的検定技術の発展とともに起こった。これらの方法においては、関心のある目標又は標的物に特異的に結合する抗体が開発される。それらの開発及び製造は共に高価であるけれども、動物から得られる抗体は、以前は研究及び特に臨床の立場の両方において事実上評価できなかった多くの被検物の非常に正確な分析を可能にした。免疫学的検定における重要な技術の進歩は、単一クローン抗体の開発である。動物を被検物にさらして抗体全体を採取する代わりに、この技術においては敏感な動物の単一の脾臓細胞が不滅で何倍にも増大する。次いで得られた細胞株を培養して非常に特異的で純粋な抗体生成物を生じさせる。抗体自体は小さな分子であるため、結合結果が検出されうるような方法で標識をつけなければならない。これは、染料、蛍光、放射性又はその他の標識によりなしうる。逆に、公知の量の標識の付いた被検物及び分析される物質間に結合の阻害が生ずる場合には、信号の減少が試験被検物の存在を示すであろう。抗体粒子の接着が十分な量及び密度の場合には、沈殿物の形成も被検物の存在を信号で示すのに役立ちうる。近年、研究及び医療の社会は、生物学的物質を検出及び定量するのに免疫学的検定技術を重く信頼するようになった。多くの面で成功しているが、免疫学的検定法が間接的であること並びにそれらの抗体物質依存性が種々の複雑な状態、問題及び検定の限界を生ずる。簡単に言えば、抗体の開発及び製造は高価であり、これらの分子は環境の変化に敏感である。又、抗体が製造されうる物質のみがこれらの系により検出されうる。ラングミュア‐ブロジェットフィルム検定十分定義された、準二次元配列の分子を表面にコーティングするのに、スウォーレン(Swalen)らにより記載されたような分子自己集合体(Langmuir,Vol.3,page 932,1987)並びにラングミュア‐ブロジェット(ＬＢ)付着(Roberts,Ed.Langmuir -Blodgett Films,Wiley,New York,1966)の技術が使用された。この新しい進歩の最初の使用は、湿潤(Whitesides,et al.,Langmuir,Vol.6,page 87,1990)及び摩擦(Novotny,et al.,Langmuir,Vol.5,page 485,1989)のような物質科学への適用であった。これらの二分子層フィルムは又、分析反応のための固定化支持体として使用される。ＬＢフィルムを基材とするバイオセンサーは、グルコース(Okahara,et al .,Thin Solid Films,Vol.180,p.65,1989)及び尿素(Arisawa,et al.,Thin Solid Films,Vol.210,p.443,1992)のような診断上有意な分子を検出しうる。これらの場合には、試験結果の読み出しを改良するために、あるいは試験方法の検出能力を簡単化及び改良するために古典的な分析化学系がフィルム上に固定される。受容体−リガンド相互作用の検出は、一般的には酵素を結合した免疫吸着剤及び放射性標識したリガンド検定のような間接的検定により成される。生物工学的官能化フィルムは界面における分子認識の素晴らしい例を導くけれども、本発明が出現するまでは、分子認識の事実を測定しうる信号に変換する問題が困難なことのままであった。バイオセンサーデバイスの場合には、検出は一般的にはＬＢフィルムを光学繊維(Beswick,Journal Colloid Interface Science,Vol.124,p.146,1988)、水晶発振器(Furuki,et al.,Thin Solid Films,Vol.210,p.471,1992)、又は電極表面(Mi yasaka,et al.,Chemical Letters,p.627,1990)のような第二のデバイスにカップリングさせることにより実施される。ある種の被検物結合フィルムは、蛍光又はその消光状態が結合結果を示す蛍光標識を提供する(Beswick,Journal Colloid Interface Science,Vol.124,p.146,1 988)。場合によっては、これらの検出物質は、支持体二分子脂質層の表面に包埋されている(Tieke,Advanced Materials,Vol.3,p.532,1991)。ポリジアセチレンフィルムは、温度の上昇又はpHの変化に伴って、共役主鎖のコンホメーション変化により青色から赤色に色が変化することが知られている(M ing,et al.,Langmuir,Vol.8,p.594,1992;Chance,et al.,Journal of Chemistry and Physics,Vol.71,p.206,1979;Shibutag,Thin Solid Films,Vol.179,p.433,1 989;Kaneko,et al.,Thin Solid Films,Vol.210,p.548,1992)。官能化リポソームインフルエンザウイルス及び細胞表面間の相互作用を研究するためのモデル系として、シアル酸残基を表す非重合リポソームが広く使用されてきた(Ott,et al .,European Journal of Pharmacological Science,Vol.6,p.333,1994)。これらのリポソームは典型的にはコレステロール及び卵ホスファチジルコリンのような脂質物質からできている(Kingery-Wood,et al.,Journal of the American Chemi cal Society,Vol.114,p.7303,1992)。本出願のもとになっている米国特許出願の基礎となる出版物には、重合により製造される治療力のある想像上のリポソームが記載されている。物質が十分に赤色になり、重合が完了したことを示すまで重合を進めるのがこの分野では標準である。これは前述の出版物において使用されている方法である。結合結果の検出においてこの特徴を利用することが本研究社会の目的であるが、研究者はまだこの現象を実用に用いる方法をこれから開発しなければならない。発明の一般的な記載本発明によれば、小さな分子、病原体、細菌、膜受容体及び薬物のような被検物が本発明の三次元高分子集成体に結合したときにおこる色の変化を観察することにより、被検物を直接検出することが可能である。この技術的な進歩は、本発明者による以前の二次元の単分子層フィルムの場合より色の強度が劇的に改良されるという、劇的な改良を示す。更に、本発明は、試験系が流体中に懸濁されうるか又は種々の支持体に結合されうるときに生ずる多くの利点を有する。被検物が特異的に三次元高分子集成体に結合したときに結合結果を直接検出することにより、生物分子の存在を検定することが本発明の目的である。本発明の検定系を用いた、ウイルス、細菌、寄生生物、及びその他の病原体、及び薬物、ホルモン、細胞壁フラグメント、膜フラグメント、膜受容体、酵素、及びその他の生物学的関連物質の直接検出を提供することが本発明の更なる目的である。あらゆる表面又は結合サイトとそれらの天然生物活性リガンドとの間の天然の結合結果の競争的阻害を観察することにより、薬物の開発及び改良を提供することが本発明の別の目的である。結合が観察され、特定の高分子構造物を分離することにより、関連リポソームと関連リガンドが相互に分離したときに、物質のライブラリーを試験する手段を提供することが本発明の更に別の目的である。本発明の検定手段及び方法は、新規三次元高分子集成体系を用いた、受容体− リガンド相互作用の直接比色検出を提供する。これらの独創的な集成体を製造する本発明の方法を用いれば、リガンド又はその誘導体は、重合過程中に結合アーム、又は直接導入することによりリガンドを高分子結合させて高分子化される。本発明のこれらの面の一部は、本発明において参考として導入されている本発明者の近年出版された論文に記載されている(Reichert,et al.,J.Am.Chem.Soc.,Vo l.117,p.829,1995)。導入されたリガンドに結合する被検物の存在は、高分子集成体のスペクトルの特徴の変化を観察することにより検出しうる。このようにして高分子−リガンド集成体は、単一の分子集成体内に、分子認識サイト及び検出サイトをすべて包み込む。本発明の一実施態様においては、有彩ポリジアセチレンリポソームを製造し、液体中に入れる。試料を添加する。色の変化が被検物の存在を示し、色の強度により被検物の濃度を定量しうる。本発明のリポソームの一実施態様においては、本発明者は、細胞膜の組織及び官能性に類似した重合性リポソームを調製し、それを単純な比色センサーとして用いた。リポソームは、インフルエンザウイルス粒子と特異的に結合するように設計され、更に、可視的に色が変化することにより結合結果を示す。基本的には、これらの分子集成体は、細胞表面分子認識並びに信号変換を模倣する。リポソームに分子認識及び検出機能の両方を付与するためには、本発明者は公知のリガンド−受容体相互作用とポリジアセチレンの独特な光学的性質を組み合わせた。二重結合と三重結合が交互にある共役主鎖が可視スペクトルにおいて強い吸収を生じさせる。単結晶又はラングミュア‐ブロジェットフィルムにおいては、これらの物質は、熱、機械的応力、pH、及び溶媒を含む種々の環境変化により青色から赤色に変化することが知られている。本発明の一実施態様においては、本発明者は、インフルエンザウイルスと官能化ポリジアセチレンリポソームの特異的結合が類似した色の変化を生ずることを示した。以前の研究において、本発明者は官能化二次元ポリジアセチレンラングミュア‐ブロジェットフィルムの場合に同様な効果が得られることを示した(Cha rych,et al.,Science,Vol.261,p.585,1993)。インフルエンザウイルス粒子は、血球凝集素（ＨＡ）レクチンが固定されている脂質二分子層により包囲される。ＨＡは、細胞表面糖タンパク質及び糖脂質上でシアル酸の末端α‐グリコシドと結合し、ウイルスによる細胞感染を開始する。本出願の先行技術のセクションで記載したように、インフルエンザウイルス及び細胞表面間の相互作用の研究には、シアル酸残基を示すリポソームがモデル系として広く使用されてきた。しかしながら、本発明の重合したリポソームは、この特異的相互作用の直接的視覚化を許容する分子からなる。本発明の利点分析化学技術直接検出を許容する本発明の出現前には、分析化学技術が唯一の検定系である。不幸なことに、分析化学は多くの生物学的な系の検定への適用に限界がある。高価で面倒なガスクロマトグラフィー法を使用しなければ、多量の被検物を必要とする。そのような方法の定量の結果は限界があるか、入手できないことがしばしばである。しかしながら、そのような技術はヘマトクリット値の分析、及びクレアチニンの検定のような試験には用いられてきた。分析化学方法では、調製及び分析工程中に被検物の特徴が破壊するために、及び試料中に存在する被検物が典型的には少量であるために、多くの生物学的分子が実質的には利用できない。このため、生物科学においては免疫学的検定の出現は革命的であった。免疫学的検定多くの少量の生物学的分子は、それらの特異的な特徴を失わずにいられないような環境の過酷な限界のために直接法で検定することは困難であることが知られている。とりわけこれらの理由のために、これらの種類の物質を検定するのに免疫学的検定が非常にたよられてきた。多くの点で成功したけれども、免疫学的検定法は間接的であるため種々の障害物、面倒なこと、問題、及び検定の限界を生じている。抗体が各々の目標物のために開発及び製造される要件が、設計者の薬物の開発及び選別のような用途における免疫学的検定法の有効性を制限する。皮肉にも、生物学的環境の一部における試験を許容するのに、大きな糖タンパク質抗体はしばしば小さな試験パラメータの環境の外で劣化に非常に敏感である。したがって、抗体があまりに敏感であることがこれらの検定系に利用できる環境上の試験範囲を限定する。免疫学的検定系のわずかな欠点は、インフルエンザウイルスのような病原体が迅速に進化するときに生ずる。そのような有機体においては、特にウイルスの場合、免疫反応に役立つ外部被膜が抗体認識要素内でしばしば変化する。したがって、インフルエンザ株に対する十分な褐色免疫応答にもかかわらず、数カ月以内に個体は再び流感にかかるが、外部被膜を有する病原体からの応答は修正されるので免疫学的に犠牲者の記憶細胞により認識できない。これが、個体が毎年流感にかかりうる理由である。本発明の独特な特性本発明は、免疫学的検定及び生物学的被検物を直接的に検出する分析化学技術より素晴らしい利点を有する。免疫グロブリンとの結合を必要とする検定とは異なり、本発明の一実施態様においては、病原体上のホスト結合サイトが認識機能に利用される。一般的には病原体表面上の免疫学的には近づきがたい谷部内のこのサイトは、時間が経過しても高度に遺伝学的に保存される。このサイトの微細な変化は、その感染を保持するためには病原体には必要である。その結果、本発明の単一の検定系は、その多くが非常に新しく進化するインフルエンザ株の装いに効果的な検定を提供するであろう。本発明の一実施態様により達成目標とされる遺伝学的に保存されるホスト認識サイトには多くの利点がある。患者の流感への暴露の決定は明確であるが、特定の株には限定されない。本発明の利点は又、臨床医が単一の検定を信頼しうるので、多くの免疫学的試験の必要性を回避する。更に、新たに進化しても、特性決定していない流感の株が確認され、正しくない否定的な試験が回避される。免疫学的検定の類似した限界は、マラリア寄生虫のようなよく確立された病原体でおこる。これらの有機体においては、免疫応答を許容する生命循環相が、時間が経過しても非常に限界があり免疫応答を回避するか、抗体反応を回避するようにホスト細胞内でおこるようにつくられている。本発明は、病原体を確認するために遺伝学的に保守的なホスト結合サイトを利用する。比較的大きな寄生生物においても、ホスト結合サイトは、病原体が発生している間中時間が経過しても一定に保持される傾向がある。更に、寄生生物は通常多くの多様な生命段階で体に存在する。よく確立された寄生生物においては、免疫接近サイトは段階ごとにしばしばかなり変化し、有利な点は、ホスト有機体が寄生生物の侵害を回避するために十分迅速な免疫学的な応答を有し得ない点である。本発明の一般的な利点本発明は、先行技術の直接化学的及び免疫学的検定系の両方より劇的に進歩したことを示し、本発明以前にはこれらの分析技術の方法の一方でしか得られた利点を成就する。免疫学的検定技術の出現が医学及び研究の分析的能力に大きな革命をもたらしたにもかかわらず、本発明は分析技術の大きな進歩を示す。本発明は、単一の系において免疫学的検定及び化学的分析の両方の利点を許容する。本発明は、分析化学の系に固有の多くの利点と共に、分析化学の方法の直接的検定の利点を有する。本発明の検定技術は又、免疫学的検定の試験の実際の環境範囲以上の環境範囲を有する。このことは、多くの有利な環境パラメータにおける種々の分析の積み重ねを許容する。更に、本発明は、以前には分析化学技術では入手できなかった、非常に狭い環境範囲でもおこる厳密な直接的分析を許容する。本発明の色の変化の指示計の速度と単純さはその特徴の利点である。目標物質本発明の独特な利点の一は、本発明の技術を用いて分析しやすい広範囲の目標物質、結合結果、及び生物化学的反応である。これらの物質の多くは、以前には直接的で実際的な検定では検出できなかった。本発明は、免疫グロブリンの発生又は間接的分析のように複雑ではなく、免疫学的検定系の多くの利点を許容する。一般的には、本発明は分析前の精製工程を必要としない。本発明のこの特徴は、検出高分子集成体に添加されたリガンドの特異性が高いためである。更に、本発明の直接的検定系は、現在入手しうる間接的な系に固有の、高価で、複雑で、不正確な点を回避する。敏感な被検物−温和な試験条件本発明の高分子集成体は、安定であるか、又は限られた生体外又は環境の範囲の条件を特徴とする適する結合を有するリガンド及び被検物を使用しうる。生体外の範囲の条件では、本発明はこの狭い範囲の条件にあう範囲内でさえ厳しい限界内で有用である。このことは、例えば、敏感な生物化学物質及び生化学分子の三次元コンホメーションが試験中保持されることを許容する。本発明は、注意深く制限された条件でも十分機能する。したがって、pH、食塩水、及び温度のような条件を、分析の精度又は感度を妨げることなくフィードバック制御、滴定及びその他の技術により注意深く制御しうる。本発明のこの幅広い実験範囲という利点のために、完全な細胞又は敏感な遺伝子(subcellular)含有物が、それらの構造の完全な状態を乱すことなく検定されうる。本発明の集成体が表面に結合したときの色の変化は、例えば組織試料中における被検物の位置を正確に示すであろう。マラリア感染の種々の段階のような、微妙な細胞の発達段階を本発明により追跡しうる。更に、種々の因子間の関連性を、本発明の方法を用い相互作用中でも試験又は追跡しうる。弱い結合の被検物−多価本発明の高分子に結合したリガンドの多価の特徴は、天然の多価被検物の場合に結合能力を高める。多価は又、試験前の限られた原子価の被検物に本発明の利点を有するように提供されうる。本発明の多価を利用すると、特異的であるが、弱い相互作用が何倍にも増幅される。十分な長さと適合性を有する構造リンカーは、それらがコンホメーション的に曲面上で分離されているときでも被検物上に複数のサイトの結合を許容するのを助ける。これらの特徴の結果、本発明は、以前には検定の評価に相応しくなかった多くのリガンドを検出しうる。被検物の存在を効果的に示す主な基準は、高分子集成体の表面が必要なスペクトル変化を生じさせるように十分摂動するということである。被検物が固定化粒子に結合すると、小さな領域内に被検物を濃縮させ、更に小さな被検物にも比較的大きい領域上に三次元の面を提供するので、この目的にかなうであろう。本発明においては、多価の試験目標物を検出するのに大きな可撓性を許容する多くの種類のリガンドが使用されうる。リガンドの選択は、試験系を適合させるように結合及び立体的因子を妥協させることよりむしろ、最も有利な結合及び立体的特徴に基づく。したがって、最も有利なリガンドは、疎水性及び親水性、寸法、結合サイトの位置、及び衝突親和性のような因子に基づいて選択されうる。本発明に使用しうるリガンドには、炭水化物、ペプチド、ヌクレオチド、複素環式化合物、及びその他の有機分子が含まれる。魅力的な分析本発明の検定系の厳しくて顕著な利点は、先行技術の方法の限界のために以前には成就できなかった物質の検出及び定量評価を許容する。本発明の構築物及び方法は、抗体を開発できないような非常に小さな生物学的分子又はその他の分子を検定しうる。これらの目標物質には、極少量存在する有機溶媒又は汚染物質が含まれる。法医学及び臨床医学の両方において薬物の選別のために本発明者により成就された進歩より入手できた特別な機会がある。本発明に適用される阻害技術は小さな寸法、又は小さな数又は原子価が１価の物質の試験を許容しうる。本出願人は仮説に縛られないけれども、本発明者は、本発明により成就された予期せぬスペクトル信号が、結合の結果としておこる高分子集成体の物理的摂動のためであると仮定している。ウイルス及び細胞膜フラグメントのような多価物質が本発明の方法を用いて非常に容易に検出されうる場合がそうである。したがって、多価物質は一般的には本発明の系において特に強い応答を誘導する。これは、構造の物理的再配置を引き起こす結合の結果、脂質二分子層に導入されたコンホメーション変化のためかもしれない。出願人の理論が有効であれば、小さな、１価の被検物物質のキャリヤーへの予備結合は、そのような場合に本発明の有効性を増大させるのに有利であることがわかる。例えば、被検物はポリマー又はリポソームの表面に結合するであろう。このことは、本発明の高分子集成体表面において特定の点に結合することを濃縮し、接触した各点におけるスペクトルの変化を増大させる。更に、被検物が結合するリポソームの曲面が、脂質二分子表面から離れた周囲に結合した被検物を引っ張り、リポソーム上の中心に位置する被検物を脂質二分子表面に押しつけるのに役立つであろう。次いでこの予備結合工程は二分子層表面上のねじれ、摂動及び信号の発生を増大させるであろう。信号の観察目標物質の存在の有無を検出するのに二分子層への種々のスペクトル変化を使用しうる。シンチレーターのような、当業者に公知のスペクトル信号を増大させる手段もまた、少量の被検物が存在する場合には使用しうる。信号が経験に基づく性質であるため、本発明の検定系の読み出しをオートメーション化するのに多くの機会がある。本発明の特別な一実施態様においては、試験技術者による視覚的な観察により青ピンク色シフトが簡単に観察されうる。観察が簡単であるため、この作業は、家庭の使用者のような訓練をうけていない観察者により容易になしうる。あるいは、当業者に公知のスペクトル試験装置は、特別な照明光の波長に対する光学密度を含む単純な視覚的観察の限界を越えるスペクトルの性質の変化を決定するのに使用しうる。本発明の集成体は又、それらを多くの固定化物質の一に結合させることにより検定において最適化しうる。例えば、セフェデックスビーズへの結合は、検定中に可能な流動及び洗浄を許容する。本発明の集成体は、多分電気的勾配で、被検物が拡散するゲル中に包埋されうる。図面の簡単な説明図１は、二官能性分子及びペンタコサジイン酸を示す。図２は、被検物を導入する前後の本発明のリポソームの懸濁液を示すカラー写真である。発明の詳細な説明本発明の三次元高分子集成体は、色の変化により幅広い被検物の存在の直接的検出を許容する。結果は訓練をうけていない観察者が読むことができ、試験は周囲条件下で実施しうる。非常に温和な試験条件が可能であり、そのため自然の状態に近い小さな生物分子の検出が可能であり、相互作用に関する情報を提供し、被検物の変性又は分解の危険を回避する。本発明の高分子集成体は、その表面が配向及び検出頭部基の両方を含むリポソーム又は細管のような三次元構造物からなる。検出頭部基は、線状構造のリンカーの一方の端部に結合している、被検物に対して特異性のリガンドからなる。一方、このリンカーはもう一方の端部が高分子集成体に結合している。高分子集成体の表面には又、脂質秩序頭部基が供給されている。図１は、本発明の一実施態様の模式図である。受容体結合リガンド（１）がスペーサ分子（３）の一方の末端に結合しているのが示されている。そしてスペーサ分子（３）のもう一方の末端は、重合して有彩検出要素（５）となるいくつかのモノマーの一に結合している。そしてこれらの物質は重合がおこる間振盪させ、リポソーム又は細管のような高分子構造物を形成させる。脂質秩序基脂質は、被検物の結合が検出しうる色の変化を生ずるように三次元高分子集成体の構造を設計する点で重要であると思われる。出願人は、秩序基の構造効果が、色の安定性及び重合を容易にするために三次元高分子集成体の物理的構造を適度に安定化するのに役立つと仮定する。又、被検物の分子認識リガンド基への結合が十分な立体的摂動又は構造の歪を引き起こして色が変化する。安定性及び相対的な剛性は、二分子層表面を一つにして、一つの領域における立体的変化が全体として集成体の表面における大きな効果のきっかけとなるように脂質を設計することにより生じるかもしれない。結合の結果、スペクトル変化が観察されるとは限らない。変化が、ポリマー主鎖の有効共役長を変化させる結合により誘導される応力によることが最もありそうである。本発明の三次元構造物は、熱のような多くの環境パラメータに対して非常に色が敏感であり、これらの因子は又観察された現象の一成分かもしれない。しかしながら、出願人は、単に本発明を説明するための試みである前述の仮説のいずれにも束縛されない。以前の研究では、ポリジアセチレンにおける色の変化は、ポリジアセチレン主鎖の有効共役長の変化より生じ、ポリマー主鎖の電子構造の効果的な検定法は側鎖のコンホメーションと強く関連していることが示唆された。本発明者は、この点に関して、特定のウイルス−リポソーム相互作用が側鎖のコンホメーションを変えて、酵素主鎖の有効共役長を減少させるのに役立つと推測しうる。実際に、理論計算から、ポリマー主鎖のＣ−Ｃ結合のまわりで非常にわずかにπ電子非局在化が減少することを示唆する。本発明において頭部基として使用するための物質には以下のものが含まれる。 −ＣＨ₂ＯＨ、−ＣＨ₂ＯＣＯＮＨＰｈ、−ＣＨ₂ＯＣＯＮＨＥｔ、−ＣＨ₂ＣＨ（Ｅｔ）ＯＣＯＮＨＰｈ、−（ＣＨ₂）₉ＯＨ、−ＣＨ₂ＯＣＯＰｈ、−ＣＨ₂ＯＣＯＮＨＭｅ、−ＣＨ₂ＯＴｓ、−ＣＨ（ＯＨ）Ｍｅ、 −ＣＨ₂ＯＣＯＲ₂（式中、Ｒ₂はn-Ｃ₅Ｈ₁₁、n-Ｃ₇Ｈ₁₅、n-Ｃ₉Ｈ₁₉、n-Ｃ₁₁Ｈ₂₃ 、n-Ｃ₁₃Ｈ₂₇、n-Ｃ₁₅Ｈ₃₁、n-Ｃ₁₇Ｈ₃₅、Ｐｈ、ＰｈＯ、又はo-(ＨＯ₂Ｃ)Ｃ₆ Ｈ₄である）、 −ＯＳＯ₂Ｒ₂（式中、Ｒ₂はＰｈ、p-ＭｅＣ₆Ｈ₄、p-ＦＣ₆Ｈ₄、p-ＣｌＣ₆Ｈ₄ 、p-ＢｒＣ₆Ｈ₄、p-ＭｅＯＣ₆Ｈ₄、m-ＣＦ₃Ｃ₆Ｈ₄、2-Ｃ₁₀Ｈ₇、又はＭｅである）、 −ＣＯ₂Ｍ（式中、ＭはＫ、ＨＮａ、又はＢａ／２である）。本発明において頭部基として使用しうる好ましい物質は以下のものである。 −ＣＨ₂ＯＣＯＮＨＲ₂又は−ＣＨ₂ＣＯＮＨＲ₂（式中、Ｒ₂はＥｔ、n-Ｂｕ、n -Ｃ₆Ｈ₁₃、n-Ｃ₈Ｈ₁₇、n-Ｃ₁₂Ｈ₂₅、シクロ- Ｃ₆Ｈ₁₁、Ｐｈ、p-ＭｅＣ₆Ｈ₄、m- ＭｅＣ₆Ｈ₄、o-ＣｌＣ₆Ｈ₄、m-ＣｌＣ₆Ｈ₄、p-ＣｌＣ₆Ｈ₄、o-ＭｅＯＣ₆Ｈ₄、3- チエニル、Ｍｅ、Ｅｔ、Ｐｈ、l-Ｃ₁₀Ｈ₇、Ｅｔ、Ｐｈ、ＥｔＯＣＯＣＨ₂、ＢｕＯＣＯＣＨ₂、Ｍｅ、Ｅｔ、i-Ｐｒ、n-Ｃ₆Ｈ₁₃、ＥｔＯＣＯＣＨ₂、ＢｕＯＣＯＣＨ₂、Ｐｈ、2,4(ＮＯ₂)₂Ｃ₆Ｈ₃ＯＣＨ₂、又はＣＨ₂ＣＨ₂ＯＨである）。最も好ましい頭部基は−ＣＨ₂ＣＯＸ（式中、ＸはＯＨ、ＭｅＯ又はそのいずれかの塩）から選択される。リガンド基本発明のリガンド基は幅広い種類の物質でありうる。主な基準は、リガンドが選択した被検物に対して親和性を有するということである。ある種の物質が検定されるとき、リガンドの範囲は幅広い。適するリガンドには、ペプチド、炭水化物、核酸又は受容体と結合するいずれかの有機分子が含まれる。例えば、すべてのインフルエンザ株はホスト受容体分子に結合するサイトを分担する。したがって、この分子は、まだ特性決定されていないインフルエンザ株を含むあらゆるインフルエンザ株を選別するのに首尾よく使用されうる。リガンドは又、被検物に対する競争バインダーとして機能するときに本発明において使用されうる。例えば、病原体は、受容体分子が存在する試験物質と共に導入される。この分子がない場合には、病原体は三次元高分子構造物と結合して色を生ずるであろう。病原体表面が試験物質中に導入されている受容体分子と結合する程度だけ、結合は減少するであろう。このようにして、受容体分子の存在が検出され、定量されうる。受容体結合分子以下の実施例に記載されている好ましい一実施態様におけるシアル酸誘導体の使用はこの性能における受容体結合分子の使用例である。受容体結合分子は、病原体が感染の前兆として結合するホスト細胞の表面にある物質である。本発明におけるリガンド基においてこれらの分子を選択することはその他の受容体分子よりずっと有利である。これらの分子の認識サイトは、生存するのに明らかに重要であるため、病原体中に非常に遺伝学的に保存される傾向がある。したがって、同一の病原体の異なる株は、そのような分子が本発明のリガンド基として選択される場合には、誤った否定のものを一般的には生成しないであろう。又、受容体分子は、同一被検物の抗体より、小さく、複雑でなく、しばしば疎水性でない傾向がある。多くの受容体分子が、多くの病原体のために認識、確認、単離、及び合成されている。種々の分析及び処理系において使用するのに多くが改良されている。研究におけるこの傾向の例は、本発明の以下の実施例で使用されているシアル酸誘導体である。多くの病原体の受容体の例が表３として本出願に提供されている。これらは全て、多くの更に別のものと共に本発明の方法により利用しうる。脂質重合基多くの異なる重合基が脂質に導入され、単分子層重合において効果的であることが示されている。そのような部分には、アセチレン、ジアセチレン、アルケン、チオフェン、イミド、アクリルアミド、メタクリレート、ビニルエーテル、無水マレイン酸、ウレタン、アリルアミン、シロキサン又はビニルピリジニウム等が含まれる。これらの基を含む脂質はホモポリマー又は混合したポリマーを生成しうる。本発明において使用するのに好ましい基は、重合した形、すなわちポリジアセチレンが独特な光学的性質を示すのでジアセチレンである。しかしながら、その他の重合基も、結合したときに性質が観察しうる変化を示す場合には使用しうる。集成体の形本発明の三次元集成体は多くの形で製造されうる。製造されうる最も重要な形の一はリポソームである。本発明の集成体を特別な形に製造するいくつかの方法が本出願の実施例のセクションに十分に示されている。本発明のリポソームは、多くの種々の寸法及び種類に形成しうる。例えば、単純な二分子層構造物としてリポソームを形成することが可能である。更に、タマネギ型の構造物に多層化することもできる。それらの寸法もまたさまざまである。多くのその他の形状も製造しうる。その他の形状のうち、二重連鎖(Kuo,et al .,Macromolecule,p.3225,Vol.23,1990)、ラメラ(Rhodes,et al.,Langmuir,p.267 ,Vol.10,1994)、中空管及び編組(Franker,et al.,Journal of the American Che mistry Society,Vol.116,1994)が形成されうる。これらの集成体が固定化されると、集合して更に大きな構築物を形成しうる。本発明のリポソームの実施態様を生み出すのに成功した報告書の一実施例は以下のとおりである。・小さなバイアル中で、適量の脂質のクロロホルム溶液（１〜１５mM）を混合し、・窒素流でクロロホルムを蒸発させ、・適量の脱イオン水を添加し（総脂質濃度１〜２mM）、・前記溶液を脂質の相転移温度以上に加熱し（約８０乃至９０℃）、・溶液を１５分間超音波処理し（プローブ超音波処理器、Fisher sonic disme mbrator model 300,最大処理量５０％、微小先端）、・０．８μmのナイロンフィルター(Gelman)で暖かい不透明な溶液を濾過して溶液から小さなチタン粒子を除去し、・溶液を１時間乃至１日冷蔵庫（４℃）で冷却し、・重合する前に５乃至１０分間試料中に窒素を泡立たせることにより溶液中の酸素を除去し、・全ての酸素を置換して試料を冷却するために、重合前及び重合中に２０分間窒素でパージした小さな室内において３cmの距離で小さな２５４nmのＵＶランプ (ペン光線、エネルギー：１６００μw/cm²)を用い１cmの石英キューベット(cuve tte)で攪拌リポソーム溶液を重合させた。重合時間は所望のリポソームの性質（色、重合度）に依存して５乃至３０分間である。実施例１図１に示されるように、本発明の一実施態様で使用された二官能性分子（１）には、ウイルスと結合するためのシアル酸リガンドと重合するための炭化水素中のジアセチレン官能基の両方が導入されている。この化合物における炭素−グリコシドは、ウイルスノイラミニダーゼによる加水分解を妨げるように設計されている。この化合物を10,12-ペンタコサジイン酸（２）と混合して水和させ、リポソームを形成した。リポソームを形成する多くの天然の脂質は２つのアルキル連鎖からなるが、１つしかアルキル連鎖をもっていないリポソームを形成する合成脂質も存在する。例えば、Hunfer,et al.,Phys.Lipids,pp.355-374,vol.33、及びBader,Chem.,Int.Ed.Engl.,pp,91-92,Vol.20,1981 を参照されたい。以前の研究では、リポソーム中に１乃至１０％の化合物（１）が存在する混合物で最適なウイルスとの結合がおこることが示された。Spevak,et al.,J.Am.Chem.Soc.,161 ,115&p.1146,1993。したがって、この比色検出研究では５％及び１０％のシアル酸脂質を使用した。プローブ超音波処理法[Liposomes:A Practical Approach;New,Ed.;Oxford Uni versity Press;Oxford,pp.33-104,1990]を用いてリポソームを調製し、その後ペンシルランプを用い２５４nmにおいて照射することにより紫外線重合させた。表１は、ウイルスなし（実線）及び６０HAU(血球凝集性単位)のインフルエンザウイルスでインキュベートした後（破線）の、（Ａ）青色リポソーム溶液（８分ＵＶ）及び（Ｂ）紫色リポソーム溶液（２４分ＵＶ）の可視光吸収スペクトルを含む、リポソーム（重合したジアセチレンシアル酸脂質（１）による５％インフルエンザウイルス）の比色検出を示す。リポソーム溶液のPBS 緩衝液中における濃度は０．１３mMであり、ウイルスを用いたインキュベーション時間は１時間であった。リポソーム（脱イオン水中１mM）の溶液を約５乃至１０分照射すると、濃い青色のリポソーム（表１Ａ，実線）が形成される。重合時間が長くなると（1０乃至３０分）、紫色が観察される（表１Ｂ，実線）。インフルエンザウイルスをリポソームのPBS 緩衝液溶液に添加すると、溶液は、最初の調製品がそれぞれ青色又は紫色（表１Ａ及びＢ）であるか否かに依存して、直ちにピンク又は橙色に変化する。これらの色の変化は裸眼で容易に目に見え、可視吸収スペクトルにより定量しうる。比色応答（ＣＲ）は、総吸収極大に対する６２６nm（物質に青色を与える）における吸収の％変化を測定することにより定量する。所与の量のウイルスに対するリポソーム溶液の応答を定量するために、ウイルスなしのリポソーム溶液の可視吸収スペクトルを、Ｂ₀＝Ｉ₆₂₆／（Ｉ₅₃₆＋Ｉ₆₂₆）（式中、Ｂ₀は６２６nmにおける吸収強度を５３６及び６２６nmにおける吸収強度の合計で割ったものであると定義される）として分析した。インフルエンザウイルスに暴露したリポソーム溶液は、同様にして、Ｂ_v＝Ｉ₆₂₆／（Ｉ₅₃₆＋Ｉ₆₂₆）（式中、Ｂ_v はウイルスを用いて培養した後の吸収強度の新しい割合を表す）として分析した。リポソーム溶液の比色応答（ＣＲ）は、ウイルスに暴露したときのＢにおける％変化として定義される。ＣＲ＝〔（Ｂ₀−Ｂ_v）／Ｂ₀〕×１００％発明者の以前の研究と一致させるために、６２６及び５３６nmにおける吸収極大を任意に選択して、リポソーム溶液の青色吸収の百分率を計算した。計算のために４８０nmにおける第二の吸収極大を使用すると、示される結果の相対的な結果は変化しない。表１に示されるように、６０HAU のウイルスを用いて青色のリポソーム（８分ＵＶ）をインキュベートすると、ＣＲは４７％となる。同量のウイルスを用いて紫色のリポソーム（２４分ＵＶ）をインキュベートすると、ＣＲは８７％となる。HAU は、赤血球の１％溶液を完全に凝集させるウイルス溶液の最高希釈度の尺度である。本発明者は、紫色のリポソームの感度の増大が、光学密度の上昇により示唆されるように（データは示されていない）、ポリマー含量の増大のためであると推測している。純粋なPBS 緩衝液又はBSA のPBS 緩衝液溶液(１mg/mL)をリポソーム溶液に添加した場合には、色の変化は検出されなかった（２時間以内にＣＲ≦５％）。非特異的な吸収の効果を直接言及するために、図１に示されるシアル酸脂質（１）なしでリポソームを調製した。同様にして、これらのリポソームはウイルスに暴露した後色が変化しなかった。実施例２インフルエンザウイルス及びシアル酸リポソーム間の相互作用の特異的な性質を競争阻害実験により確認した。５４HAU のインフルエンザウイルスを用いてリポソーム溶液（１０％のシアル酸脂質（１））をインキュベートすると、ＣＲは青色リポソームに関しては３１％で紫色リポソームに関しては７０％である。わずかに過剰の、インフルエンザウイルス血球凝集の公知の阻害剤であるO-メチルノイラミン酸を用いて同一の実験を実施すると、色の変化はなかった。動力学実験によれば、ウイルスのアリコートの添加により誘導される色の変化は、５分以内に明らかとなるが、３０分後には平坦域に達することが示された。所与の重合時間においては、ＣＲは、表２に示されるように、添加したウイルスの量に依存する。表２は、インフルエンザウイルスの連続添加に対する紫色のリポソーム溶液（５％のシアル酸脂質（１）、２４分ＵＶ）の比色応答のプロットである。リポソームは、ウイルスの添加毎に３０分間インキュベートさせ、可視吸収スペクトルを記録した。３回の独立した実験において、各ウイルス濃度に関するＣＲが観察された。ウイルスなしの緩衝液中のリポソームの色の変化が２時間以内で４％未満の場合には、数分以内の５％以上のＣＲが有意であると考えられる。したがって、この値以上のＣＲを生ずるのに必要なウイルスの量が、この特別な実施例における方法の検出限界を定義する。表２の滴定曲線は、１１HAU 程度の少量でも検出しうることを示す。このことは、電子顕微鏡計数による１１×１０７個のウイルス粒子に対応する。本発明は、リポソームを含む重合構造物が、分子認識機能（シアル酸）及び検出要素（ポリジアセチレン主鎖）を単一の超分子集成体内に提供する生物分子物質であることを示した。結合の結果が視覚的な色の変化に変換され、裸眼で容易に見られ、吸収スペクトルにより定量される。色の変化の特異性は、競争阻害研究により示された。更に、起こるとすれば、非特異的吸収はリポソーム溶液の色に影響をおよぼさないと思われる。実施例３：リポソームの基質への固定化膜のポリ（エーテルウレタン）又はポリアクリロニトリルへの結合。これらの膜は多孔性で親水性であり、親和分離又は免疫診断に使用しうる。リポソームは、まず膜に、−ＮＨ₂、−ＳＨ、−ＯＨのようなリポソーム内の求核性の基に迅速に付加するイミダゾリル−カルボニル、スクシンイミド、ＦＭＰ又はイソシアネートのような活性基を結合させることにより結合しうる。したがって、これらの官能基を含むいずれのリポソーム調製物も直接膜に結合しうる。この方法は、タンパク質の膜への結合と類似しており、後者は文献に見出しうる。(C.H.Bamford,K.G.Allamee,M.D.Purbrick,T.J.Wear,J.Chromatography,1992 ,606,19 又はC.H.Bamford,K.G.Allamee,Clinical Materials,1992,10,243)。原則として、以前にタンパク質を固定化するのに開発されたいずれの方法もリポソームの固定化に使用しうる。 −ＳＨ官能基を有するリポソームは又、チオール−金結合により金表面、粒子、又は電極に直接固定化しうる。この場合には、−ＳＨ基を含むリポソームの溶液は、室温で攪拌しながら１２乃至２４時間水中のきれいな金表面でインキュベートさせる。リポソームは以下の方法を用いシリコンチップ又はシリカゲル（二酸化珪素）に固定化しうる。ゲル又はウェファーを１：１ＨＣｌ：メタノール中で酸洗浄し、水中で洗浄し、脳硫酸中に置く。十分な水洗浄の後、ウェファーチップ又はゲルを２度蒸留した脱イオン水中で沸騰させ、冷却及び乾燥させて、乾燥トルエン中で調製した3-メルカプトプロピルトリメトキシシランの２％溶液中の不活性雰囲気下でシラン化する。次いで、チップ又はゲルを０．１Ｍホスフェート緩衝液中で調製したＧＭＢＳ（N-スクシンイミジル 4- マレイミドブチレート）又はＥＭＣＳ（N-スクシンイミジル 6- マレイミドカプロエート）の２mM溶液中に置く（架橋剤を最初に少量のジメチルホルムアミドに溶解させる）。ホスフェート緩衝液で洗浄した後、チップを、pHが8.0のホスフェート緩衝液中で調製したリポソームの0.05mg/ml 溶液中に置く。最後に、チップ又はゲルを使用する前に緩衝液で十分洗浄してその中に貯蔵する。リポソームは、ＧＭＢＳ又はＥＭＣＳと架橋して作用するための−ＮＨ₂官能基を有するべきである。この方法は、酵素をシリコンチップ又はゲルに固定化するのに用いた以前に開発された方法の改良である。リポソームの固定化のために改良された（K.M.Rusin,T.L.Fare,I.Z.S temple,Biosensors and Bioelectronics,1992,7,367）。 −ＮＨ₂官能化リポソームは又、タンパク質の固定化にしばしば用いられるような標準グルタルアルデヒドカップリング反応の使用により表面に固定化しうる。実施例４：検出及び選別リポソームは、標準放射性標識検定をリガンド−受容体選別に代えるのに使用しうる。例えば、リガンドがドーパミン（例えば“スピペロン’という化合物）の類似物である場合には、リガンドは重合したリポソーム（重合した集成体）に導入しうる。ドーパミンD-2 受容体のようなドーパミンの膜受容体がスピペロン変性リポソームに導入される場合には、青色からピンクへの色の変化が観察される。これは、ウイルス及び細菌の検出と同様にして分光学的に追跡しうる。ドーパミン又はスピペロンと同じくらい強く又はそれより強く結合する付加反応化合物により効果は阻害されうる。９６−wellのプレートフォーマットを用いることにより、ドーパミンの類似物である９６の化合物を新規薬剤になりうるものとして選別しうる。この効率の高い選別は高価な放射性標識化合物を使用する必要がなく、それに伴う健康及び安全上の問題もない。方法：0.5乃至２０％のスピペロンリガンドを含む２０乃至５０μｌのリポソーム溶液を１００乃至２００μｌの適度に緩衝した媒体中で希釈させる。溶液は青色又は紫色となる。この点で試料の可視吸収スペクトルを記録しうる。検出研究：ドーパミンD2膜受容体調製物を１０乃至５０μｌから１００乃至２００μｌまで連続したアリコートに添加する。色の変化は目により観察してもよいし、可視吸収スペクトルを記録してもよい。薬物選別研究：新しいリガンド又は新しい薬剤化合物と混合したドーパミンD2膜受容体調製物を添加する。室温又は３７℃ において５乃至６０分インキュベートすることにより結合がおこる。阻害された膜受容体調製物を希釈したリポソーム溶液に添加する。溶液がピンク色に変われば、新しいリガンド又は薬剤は効果がない。溶液が青色であれば、新しいリガンド又は薬剤は受容体の効果的なバインダーである。実施例５：放射性金属の検出ジインモノマーは、ガンマ線に暴露することにより重合しうる。金属キレート剤であるリガンドを導入して、モノマーの形のリポソームを放射性金属の溶液に暴露する。金属がキレート剤リガンドと結合することにより、放射されたガンマ線がリポソームの重合に役立つ。溶液は、白っぽい不透明な溶液（重合していないリポソーム）から濃い青色又は濃い赤色のポリマー溶液に変化する。リポソームは２つの目的、すなわち１）放射性金属の存在を検出する、及び２）放射性金属の溶液をきれいにするのに役立つ。工程２は、金属結合リポソームを単に濾過又は遠心分離することによりなされる。この方法は、リポソームが周囲の環境から放射性金属を検出及び精製するために“見てきれいにする(seen and cleaned) ”方法と呼ばれる。方法：ＵＶ照射する点まで記載したようにしてリポソームを調製する。モノマーの形のリポソームは不透明で白っぽいであろう。検出：１０乃至１００μl のリポソームを５０乃至２００μl の水又は適する緩衝液中で希釈する。リポソームは0.5乃至２０％のキレート剤リガンドを含むであろう。これを９６−ウェルプレートフォーマットで処理した。５０乃至１００μl の試験する環境試料を添加した。ガンマ線照射の存在、すなわち放射性金属の存在を示す青色乃至赤色の形成を観察した。大規模な精製の目的で、リポソームを、例えばSuperfund 清掃サイト又はその他のDOE 設備において見出されるような、廃水処理帯の流出液付近の大きな濾過単位装置に固定化しうる。処理された水は濾過単位装置を通過する。水中に残存する放射性金属は濾過単位装置の青色乃至赤色により検出されるであろう。同時に、これらの金属は、水が環境に戻るか再び試験されるように処理された水から除去されるであろう。実施例６：グルコースセンサーリポソームはpHに敏感である。高いpHにおいてはリポソームは赤色状態であり、低いpHにおいてはリポソームは青色状態である。効果は可逆性である。リポソームは、適する酵素又はその他の代謝性細胞プロセスの存在下で周囲の媒体を変化させる小さな分子の被検物を検出するのに使用しうる。例えば、グルコースの検出に使用しうる。リポソームを、赤色状態とするのに十分高いpHの媒体に添加する。１０乃至５０μl のリポソームを５０乃至２００μl の適する媒体で希釈する。１０乃至１００μl の試料を添加する。これを９６−ウェルプレートフォーマットで処理する。試料に１０乃至５０μl のグルコースオキシダーゼを添加する。グルコースが存在すれば、グルコースオキシダーゼはグルコースをグルカラオン酸（glucaraonic acid）に変換するであろう。この変換は溶液のpHを低下させるので、リポソームは青色状態となるであろう。この赤色から青色への変化が試料中のグルコースの存在を示す。試験は視覚的になされてもよいし、可視吸収スペクトルを測定することにより定量的になされてもよい。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＧ０１Ｎ 33/545 Ｇ０１Ｎ 33/545 Ａ 33/569 33/569 Ｚ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ )，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ライカートアンケアメリカ合衆国カリフォルニア州 94706 アルバニースターネージ 704

Claims

【特許請求の範囲】１．被検物の存在下で色を変化させる三次元高分子多層検定集成体であって、ａ）被検物に対して直接親和性を有するか又は被検物に対して競合バインダーとして機能しうるリガンド、ｂ）２つの末端を有する線状構造のリンカーであって、その第一の末端が前記リガンド部分に結合しているリンカー、ｃ）前記構造のリンカーがその第二の末端で結合している共役ポリマー主鎖、及びｄ）前記構造のリンカーにより占められていない位置で共役ポリマー主鎖の表面に結合している秩序頭部基、を含む集成体。２．前記集成体が、リポソーム、二重鎖、編組、ラメラ、ヘリックス、管状、又は繊維様の形状である請求の範囲第１項記載の集成体。３．前記被検物が、生物医学物質、病原体、薬物、放射性金属、又は工業材料である請求の範囲第１項記載の集成体。４．前記生物医学物質が、病原体及びそれにより感染した細胞、薬物、ホルモン、血液成分、疾患指標生物、細胞成分、抗体、レクチン、酵素、遺伝物質、及びそれらの代謝性誘導体からなる群から選択される請求の範囲第３項記載の集成体。５．前記病原体が、ウイルス、細菌、寄生生物及びその他の病原体からなる群から選択される請求の範囲第３項記載の集成体。６．前記ウイルスが、インフルエンザ、かぜ、風疹、水痘、Ａ及びＢ型肝炎、単純ヘルペス、ポリオ、天然痘、悪疫、ＨＩＶ、完全痘庖、狂犬病、エプスタインバー、レオウイルス、ライノウィルス、及び突然変異、それらのリガンド認識部分からなる群から選択される請求の範囲第５項記載の集成体。７．前記細菌が、大腸菌、結核、サルモネラ、連鎖球菌、及び突然変異体、菌株及びその分解した部分からなる群から選択される請求の範囲第５項記載の集成体。８．前記寄生生物及びその他の病原体が、マラリア、睡眠病、リバー失明、及びトキソプラスマ症からなる群から選択される請求の範囲第５項記載の集成体。９．前記リガンドが病原体被検物の検出のために提供される請求の範囲第１項記載の集成体。 10．前記被検物がウイルスである請求の範囲第９項記載の集成体。 11．前記リガンドが、完全痘庖被検物のための表皮細胞成長因子、狂犬病被検物のためのアセチルコリン受容体、エプスタインバー被検物のための補体受容体、レオウイルス被検物のためのβ−アドレナリン受容体、ライノウイルス被検物のためのICAM-1、ポリオウイルス被検物のためのポリオウイルス受容体、コレラトキシン被検物のための三糖類被検物、好中球被検物のための四糖類、及び被検物と結合しうるそれらの誘導体及び類似物からなる群から選択される請求の範囲第９項記載の集成体。 12．前記リガンドが、コロナウイルス、インフルエンザウイルス、脳脊髄炎、クラミジア、センダイウイルス、おたふくかぜ、ニューカッスル病、ミクソウイルス、脳心筋炎ウイルス、髄膜炎、又はマラリアと結合するシアル酸及びその誘導体及び類似物である請求の範囲第９項記載の集成体。 13．前記リガンド：被検物の対が、四糖類と好中球、細胞接着ペプチドと目標細胞、三糖類と細菌毒素又は膜内外受容体とホルモンである請求の範囲第９項記載の集成体。 14．ＨＩＶ被検物を検出するのに提供されたリガンドが、ＣＤ４、ｓＣＤ４、ＣＤ２６、血管作用性小腸ペプチド、ペプチドＴ、シアル酸、及びＨＩＶと結合しうるその誘導体及び類似物からなる群から選択される請求の範囲第９項記載の集成体。 15．前記ポリマーが重合性脂質モノマーを含む請求の範囲第１項記載の集成体。 16．前記モノマーが、アセチレン、ジアセチレン、アルケン、チオフェン、イミド、アクリルアミド、メタクリレート、ビニルエーテル、無水マレイン酸、ウレタン、アリルアミン、シロキサン、アニリン、ピロール及びビニルピリジニウムからなる群から選択される請求の範囲第１５項記載の集成体。 17．前記ポリマー主鎖がジアセチレンモノマーからなる請求の範囲第１６項記載の集成体。 18．前記秩序頭部基が、相互に水素結合する能力を有する親水性である請求の範囲第１項記載の集成体。 19．前記秩序頭部基が、−ＣＨ₂ＯＨ、−ＣＨ₂ＯＣＯＮＨＰｈ、−ＣＨ₂ＯＣＯＮＨＥｔ、−ＣＨ₂ＣＨ（Ｅｔ）ＯＣＯＮＨＰｈ、−（ＣＨ₂）₉ＯＨ、−ＣＨ₂ＯＣＯＰｈ、−ＣＨ₂ＯＣＯＮＨＭｅ、−ＣＨ₂ＯＴｓ、−ＣＨ（ＯＨ）Ｍｅ、−ＣＨ₂ＯＣＯＲ₂（式中、Ｒ₂はn-Ｃ₅Ｈ₁₁、n-Ｃ₇Ｈ₁₅、n-Ｃ₉Ｈ₁₉、n-Ｃ_llＨ₂₃、n- Ｃ₁₃Ｈ₂₇、n-Ｃ_l5Ｈ₃₁、n-Ｃ₁₇Ｈ₃₅、Ｐｈ、ＰｈＯ、又はo-（ＨＯ₂Ｃ）Ｃ₆Ｈ₄ である）、 −ＯＳＯ₂Ｒ₂（式中、Ｒ₂はＰｈ、p-ＭｅＣ₆Ｈ₄、p-ＦＣ₆Ｈ₄、p-ＣｌＣ₆Ｈ₄ 、p-ＢｒＣ₆Ｈ₄、p-ＭｅＯＣ₆Ｈ₄、m-ＣＦ₃Ｃ₆Ｈ₄、2-Ｃ₁₀Ｈ₇、又はＭｅである）、 −ＣＯ₂Ｍ（式中、ＭはＫ、Ｈ、又はＢａ／２である）、 −ＣＨ₂ＯＣＯＮＨＲ₂又は−ＣＨ₂ＣＯＮＨＲ₂（式中、Ｒ₂ はＥｔ、n-Ｂｕ、n-Ｃ₆Ｈ₁₃、n-Ｃ₈Ｈ₁₇、n-Ｃ₁₂Ｈ₂₅、シクロ-Ｃ₆Ｈ₁₁、Ｐｈ、p-ＭｅＣ₆Ｈ₄、 m-ＭｅＣ₆Ｈ₄、o-ＣｌＣ₆Ｈ₄、m-ＣｌＣ₆Ｈ₄、p-ＣｌＣ₆Ｈ₄、o-ＭｅＯＣ₆Ｈ₄、 3-チエニル、Ｍｅ、Ｅｔ、Ｐｈ、l-Ｃ₁₀Ｈ₇、Ｅｔ、Ｐｈ、ＥｔＯＣＯＣＨ₂、ＢｕＯＣＯＣＨ₂、Ｍｅ、Ｅｔ、i-Ｐｒ、n-Ｃ₆Ｈ₁₃、ＥｔＯＣＯＣＨ₂、ＢｕＯＣＯＣＨ₂、Ｐｈ、2,4(ＮＯ₂)₂Ｃ₆Ｈ₃ＯＣＨ₂、又はＣＨ₂ＣＨ₂ＯＨである）からなる群から選択される請求の範囲第１８項記載の集成体。 20．前記秩序頭部基がカルボン酸である請求の範囲第１８項記載の集成体。 21．前記モノマーの非結合末端が、ＣＨ₃−、ＣＨ₃Ｏ−、ネオ- Ｃ₅Ｈ₁₁Ｏ−、シクロ- Ｃ₆Ｈ₁₁Ｏ−、ＰｈＣＨ₂Ｏ−、p-ＡｃＣ₆Ｈ₄Ｏ−、p-ＢｚＣ₆Ｈ₄Ｏ−、 p-ＢｒＣ₆Ｈ₄ＣＯＣＨ₂Ｏ−、p-（ＰｈＣＨ＝ＣＨＣＯ）Ｃ₆Ｈ₄Ｏ−、p-（ＰｈＣＯＣＨ＝ＣＨ）Ｃ₆Ｈ₄Ｏ−、o-ＢｚＣ₆Ｈ₄ＮＨ−、p-ＢｚＣ₆Ｈ₄ＮＨ−、ＭｅＯＣＨ₂ＣＨ₂ＮＨ−、n-Ｃ₆Ｈ₁₃ＮＨ−、及びＥｔＯ−からなる群から選択される請求の範囲第１項記載の集成体。 22．前記末端がメチル基である請求の範囲第２１項記載の集成体。 23．前記集成体が支持体に結合している請求の範囲第１項記載の集成体。 24．前記支持体が、シフェデックス、シリカゲル、又はセフェロス、ポリアクリロニトリル、フィルター、金、シリコンチップ、シリカゲルからなる群から選択される請求の範囲第２３項記載の集成体。 25．前記色の変化が青又は紫からピンク、橙又は黄色である請求の範囲第１項記載の集成体。 26．請求の範囲第１項記載の集成体を組み込んだ容器を含む試験キット。 27．ウェル構造物が集成体の懸濁液を含む請求の範囲第２６項記載の試験キット。 28．前記キット容器が試験方法の道具に関する構築物も含む請求の範囲第２６項記載の試験キット。 29．請求の範囲第１項記載の三次元高分子多層検定集成体を製造する方法であって、ａ）有機溶媒中でジインモノマーとリガンドを結合させ、ｂ）前記溶媒を蒸発させ、ｃ）水溶液を添加し、ｄ）前記溶液を前記ジインモノマーの主な相転移温度以上に加熱し、ｅ）前記溶液を振盪して少なくとも４℃に冷却し、ｇ）重合室内にジイン−リガンドを入れ、ｈ）前記室から酸素を除去し、ｉ）赤色相ではない前記ジイン−リガンド混合物を重合させる、ことを含む方法。 30．工程ａ）において、前記溶媒が、クロロホルム、ベンゼン、アルコール、シクロヘキサン、メチレンクロライド、アセトニトリル、及び四塩化炭素から選択される請求の範囲第２９項記載の方法。 31．工程ｃ）の前記水溶液が、水、緩衝溶液、細胞媒体、生理食塩水、ホスフェート緩衝食塩水、トリズマ緩衝液、HEPES及びMOPSから選択される請求の範囲第２９項記載の方法。 32．工程ｅ）における冷却の前に、溶液を濾過する請求の範囲第２９項記載の方法。 33．前記ジイン−リガンド混合物を４乃至−２０℃に５分乃至５時間冷却する請求の範囲第２９項記載の方法。 34．前記混合物を０乃至−１５℃に５乃至２０分間冷却する請求の範囲第３３項記載の方法。 35．前記混合物を０乃至−５℃に５乃至１２分間冷却する請求の範囲第３３項記載の方法。 36．前記ジイン−リガンド混合物を重合中に１乃至２２℃に冷却する請求の範囲第２９項記載の方法。 37．前記ジイン−リガンド混合物を重合中に１６乃至１９℃に冷却する請求の範囲第３６項記載の方法。 38．工程ｈ）が、前記室に不活性ガスを吹き込むことによりなされる請求の範囲第２９項記載の方法。 39．前記不活性ガスがアルゴン又は窒素である請求の範囲第３８項記載の方法。 40．前記重合が、ペン光線ランプ又は手に持つランプを用いてＵＶ照射によりなされる請求の範囲第２９項記載の方法。 41．前記重合が、ガンマ線、電子線又はＸ線、又はその他の低エネルギーイオン化源によりなされる請求の範囲第２９項記載の方法。 42．前記重合が、１０乃至１００MJ/cm²のエネルギー線量でなされる請求の範囲第２９項記載の方法。 43．リポソームが青色又は紫色の相になるまで前記重合を継続する請求の範囲第２９項記載の方法。 44．溶液中で被検物を直接検出する方法であって、ａ）請求の範囲第１項記載の懸濁した検定集成体を試料と接触させ、かつｂ）被検物の存在を示す色の変化に関して溶液を観察する、ことを含む方法。