JP2011504236A - ジアセチレンを含むポリマーセンサーを用いる細菌試料の分析方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、対象となる細菌試料を分析する方法に関する。特に、この方法は、特定の細菌に特徴的な１つ以上の識別可能な検体に対する抗原特異性を有する１つ以上の抗体の使用を含む最初の捕捉プロセスを含む。特定の細菌の最初の捕捉後に、分析技術は比色分析技術、特にポリジアセチレン（ＰＤＡ）物質を含む比色分析センサーの使用を含む。

Description

（政府の権利）
国防総省より補助金が交付された契約番号第ＤＡＡＤ−１３−０３−Ｃ−００４７（プログラム番号２６４０）の契約条件の下にアメリカ合衆国政府は本発明の特定の権利を有する。

（関連出願の相互参照）
本出願は、２００７年１１月２０日に出願された米国仮特許出願第６０／９８９，２９８号による利益を主張し、この出願は参照により本出願に組み込まれる。

一般的に使用される抗生物質に耐性を有する細菌の出現は、感染した人々の治療にとって深刻な意味を有する、増大しつつある問題である。したがって、このような細菌の存在を初期の段階で及び比較的迅速に見つけ出すことは、このような細菌のより良好な制御を得るためにますます重要になっている。これはまた様々な他の微生物にもあてはまる。

重要な関心が持たれる、そのような細菌の１つに黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）（以下、「Ｓ．ａｕｒｅｕｓ」）がある。これは、皮膚の小膿瘍及び傷口の感染などの表層病巣、心内膜炎、肺炎、及び敗血症などの全身性で生死にかかわる病的状態、並びに食中毒及び毒素性ショック症候群などの中毒症を含む広範囲の感染を引き起こす病原菌である。いくつかの菌株（例えば、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌）は、少数の選択された抗生物質を除いて、全ての抗生物質に対して耐性である。

特に抗生物質に耐性がある細菌を検出するための現在の技術は、一般的に時間がかかり、典型的に純粋な形態で細菌を培養する工程を伴う。急性感染、即ち、ヒト及び動物内の黄色ブドウ球菌、並びに動物内のスタフィロコッカス・インターメディウス及びスタフィロコッカス・ハイカス、に関連する病原性ブドウ球菌を特定するこのような技術は、血漿を凝固する細菌の能力に基づく。少なくとも２つの異なるコアグラーゼ試験：遊離コアグラーゼの試験管試験及び「細胞結合コアグラーゼ」又はクランピングファクターのスライド試験が記載されている。試験管コアグラーゼ試験は、通常はブレイン・ハート・インフュージョン培地中での１夜培養物を再構成血漿と混合し、混合物を４時間培養し、試験管の管にゆっくりと突き出される凝血を観察することを含む。少数の菌株は凝固形成に４時間を超える場合があるため、１夜試験培養は黄色ブドウ球菌に推奨されている。スライドコアグラーゼ試験は、通常はより迅速かつ安価であるが、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの菌株の１０％〜１５％は陰性の結果を生ずることがあり、この場合分離株を試験管試験で再試験することが必要である。

当該技術分野において、黄色ブドウ球菌、並びに他の病原菌を検出する方法が記載されているが、検出の改善された方法には利点がある。

本発明は対象となる細菌試料の分析方法を提供する。具体的には、これらの方法は、特に黄色ブドウ球菌の細菌の特性である細胞壁の成分等の、対象となる細菌の１つ以上の検体特性を検出するのに有用である。

この方法は比色分析センサーにより、検体の存在を比色分析センサー中のジアセチレンを含むポリマー集合の立体配座の変化を引き起こす様式で生じる検体（単数又は複数）及び／又はプローブ（単数又は複数）の相互作用の結果として生じるスペクトルの変化（裸眼又は比色計により認識可能な色の変化）により検出することを含む検出試験を使用する。本発明の方法において用いられる比色分析センサー（即ち、センサー成分）は、好適には、少なくとも１つのジアセチレンを含むポリマーを含む重合組成物（トランスデューサーを形成するための重合組成物に組み込まれた受容体）を含み、このトランスデューサーは検体（単数又は複数）及び／又はプローブ（単数又は複数）に接触したときに色の変化を示す。検出試験はまた、通常は、検体（単数又は複数）とトランスデューサーの間の相互作用を媒介する緩衝組成物も含む。

１実施形態では、細菌試料を分析する方法が提供され、この方法は、特定の細菌の特徴を持つ１つ以上の識別可能な検体を含むと疑われる試料を提供すること、特定の細菌の特徴を有する１つ以上の識別可能な検体（この検体は、例えば、プロテインＡ及びクランピングファクターなどの別個の分子、又は同一分子の２つの異なるエピトープであってよい）に対する抗原特異性を有する１つ以上の抗体を提供すること、固体の支持物質を提供すること、特定の細菌の特徴を持つ１つ以上の検体が存在する場合には、それを捕捉するのに有効な条件下で、試料、固体の支持物質、及び１つ以上の抗体の間に接触を提供すること、ジアセチレンを含むポリマー及び受容体を含む重合組成物を含む比色分析センサーを提供すること（この受容体は、１つ以上のプローブ（単数又は複数）及び／又は検体（単数又は複数）と結合することに応じて色の変化を提供するトランスデューサーを形成するために重合組成物に組み込まれている）、任意に、１つ以上の検体が存在する場合には、それを固体の支持物質から除去すること、及び引き続いて１つ以上の検体が存在する場合には、それを捕捉し、及び任意に除去し、特定の細菌の存在又は不在（例えば、１つ以上の検体の存在か、又は全ての検体の不在を通じて）を分析するために、１つ以上の検体を比色分析センサーによる直接的又は間接的な分析をすること、を含む。

特定の実施形態では、１つ以上の抗体は、検体結合物質を形成する固体の支持物質に取り付けられ、この方法は、特定の細菌の特徴を有する１つ以上の検体が存在する場合には、それらを捕捉するのに有効な条件下で、試料及び検体結合物質の間に接触を提供することを含む。

特定の実施形態では、この検体結合物質は、特定の細菌の特徴を有する２つ以上の識別可能な検体に対する抗原特異性を有する、２つ以上の抗体を含む。２つ以上の抗体は、好適には、それらの結合特性において共働的である。即ち、それらは標的検体（単数又は複数）の識別可能な領域に同時に結合する能力があるか、又は任意に、別の抗体の結合によって識別可能な検体の結合が増強される部位に相補的に結合することが見出されているものである。

抗体は、モノクローナル、ポリクローナル、又はそれらの組み合わせであることができる。特定の実施形態では、抗体はＭＡｂ−７６、ＭＡｂ−１０７、アフィニティー精製されたＲｘＣｌｆ４０、アフィニティー精製されたＧｘＣｌｆ４０、ＭＡｂ １２−９、それらのフラグメント、及びそれらの組み合わせよりなる群から選択される。

特定の実施形態では、固体支持物質は微粒子状物質を含む。好適には、この微粒子状物質は磁性粒子を含む。

特定の実施形態では、検体結合物質は少なくとも２つの部分を含む微粒子状物質を含み、微粒子状物質の１つの部分はその上に配置される１つの検体に対して特異的な１つの抗体を有し、第２の部分はその上に配置される識別可能な検体に対して特異的な異なる抗体を有する。微粒子状物質のこの２つの部分は同じ種類の粒子を含み得る。例えば、微粒子状物質は少なくとも２つの異なる抗体が異なる粒子に取り付けられた２つの異なる種類の粒子、又は同じ種類の粒子を含むことができる。

好適には、特定の細菌の特徴を持つ、この１つ以上の検体は全細胞上に存在する。したがって、本発明の特定の方法は細菌全細胞を捕捉することを含む。

試料と、固体支持物質と、及び１つ以上の抗体との間に接触を提供することは、試料と、固体支持物質と、及び１つ以上の抗体との間の同時及び／又は順次の（所望の任意の順序で）、好適には同時の接触を含むことができる。

特定の実施形態では、特定の細菌はグラム陽性菌を含む。特に対象となる特定の細菌は黄色ブドウ球菌を含む。

１実施形態では、本発明は細菌試料の分析方法を提供し、この方法は、特定の細菌の特徴を有する１つ以上の識別可能な検体を含むと疑われる全細胞を含む試料を提供すること、特定の細菌の特徴を有する１つ以上の識別可能な検体に対する抗原特異性を有する１つ以上の抗体がその上に配置された磁性粒子を含む検体結合物質を提供すること、少なくとも１つのジアセチレンを含むポリマー及び受容体を含む重合組成物を含む比色分析センサーを提供すること（この受容体は、１つ以上のプローブ（単数又は複数）及び／又は検体（単数又は複数）と結合することに応じて色の変化を提供するトランスデューサーを形成するために重合組成物に組み込まれている）、特定の細菌の特徴を有する１つ以上の検体が全細胞に存在する場合には、それを捕捉するのに有効な条件下で、試料及び検体結合物質に接触を提供すること、１つ以上の検体が存在する場合には、任意にそれを検体結合物質から除去すること、及び１つ以上の検体の捕捉及び任意の除去に引き続き、１つ以上の検体が存在する場合には、それを細菌の存在又は不在を分析するために比色分析センサーによる直接的又は間接的な分析すること、を含む。

別の実施形態では、本発明は黄色ブドウ球菌細菌試料の分析方法を提供し、この方法は、黄色ブドウ球菌細菌の特徴を有する１つ以上の識別可能な検体を含むと疑われる全細胞を含む試料を提供すること、黄色ブドウ球菌細菌の特徴を有する１つ以上の識別可能な検体に対する抗原特異性を有する１つ以上の抗体がその上に配置された磁性粒子を含む検体結合物質を提供すること（ここで、抗体はＭＡｂ−７６、ＭＡｂ−１０７、アフィニティー精製されたＲｘＣｌｆ４０、アフィニティー精製されたＧｘＣｌｆ４０、ＭＡｂ １２−９、それらのフラグメント、及びそれらの組み合わせよりなる群から選択され）、少なくとも１つのジアセチレンを含むポリマー及び受容体を含む重合組成物を含む比色分析センサーを提供すること（この受容体は、１つ以上のプローブ（単数又は複数）及び／又は１つ以上の検体（単数又は複数）と結合することに応じて色の変化を提供するトランスデューサーを形成するために重合組成物に組み込まれている）、黄色ブドウ球菌細菌の特徴を有する１つ以上の検体が全細胞に存在する場合には、それを捕捉するのに有効な条件下で、試料及び検体結合物質に接触を提供すること、１つ以上の検体が存在する場合には、任意にそれを検体結合物質から除去すること、及び１つ以上の検体の捕捉及び任意の除去に引き続き、この１つ以上の検体が存在する場合には、それを黄色ブドウ球菌細菌の存在又は不在を分析するために比色分析センサーによる直接的又は間接的な分析すること、を含む。

特定の実施形態では、この方法は直接的分析、及び１つ以上の検体が存在する場合には、それを１つ以上の検体と比色分析センサーとの接触を含む、比色分析センサーによる直接的分析することを含む。

特定の実施形態ではこの方法は１つ以上のプローブの使用を含む、間接的な分析を含む。好適には、かかる方法は、１つ以上のプローブを提供すること、捕捉前、捕捉後、又は任意の固体支持物質からの除去後に、１つ以上の検体が存在すれば、それとプローブが、結合するのに有効な条件を提供すること、及び特定の細菌の存在又は不在を分析するために結合していないプローブと比色分析センサーとの間に接触を提供すること、を更に含む。

「全細胞」とは、他の生物学的に活性な物質からの分離の間に、その構造を完全なままに保持するが、必ずしも再生が可能であることを必要としない、生物学的に活性な細菌の細胞を意味する。

用語「検体」及び「抗原」は、互換性を持って用いられ、様々な分子（例えば、プロテインＡ）若しくは分子のエピトープ（例えば、プロテインＡの異なる結合サイト）、又は対象となる微生物（即ち、細菌）に特徴的である微生物細胞の全細胞若しくはフラグメントを指す。これらには、細胞壁の成分（例えば、プロテインＡ等の細胞壁タンパク質、黄色ブドウ球菌に見られる細胞壁にあるフィブリノゲン受容体であるクランピングファクター）、細胞外成分（例えば、カプセル多糖類及び細胞壁炭水化物）等が含まれる。

「１つ以上の検体を検体結合物質から除去する」とは、対象となる微生物に特徴的な様々な分子、分子のエピトープ、全細胞、又は細胞のフラグメントを除去することを意味する。

「非結合プローブと比色分析センサーとの間に接触を提供する」とは、プローブと、例えば、比色分析センサーとの間に接触を与えるが、特定の検体と結合サイト（例えば、検体上の抗体の結合サイト）との間の直接的な接触を必ずしも必要としないことを意味する。

「１つ以上の検体と比色分析センサーとの間に接触を提供する」とは、対象となる微生物に特徴的な、様々な分子、分子のエピトープ、全細胞、又は細胞のフラグメントとの間に接触を提供することを意味する。これは、特定の検体の結合サイト（例えば、検体上の抗体の結合サイト）と、例えば、比色分析センサーとの間の直接的な接触を必要としない。

「磁性粒子」は、強磁性体粒子、常磁性体粒子、若しくは超常磁性体粒子により構成される粒子又は粒子集合体を意味し、それらの粒子がポリマービーズ中に分散していることを含む。

用語「好適な」及び「好適には」は、特定の状況下で、特定の利点をもたらし得る本発明の実施形態を指す。しかしながら、同じ又は他の状況下において、他の実施形態もまた好適な可能性がある。更に、１つ以上の好適な実施形態の詳細説明は、他の実施形態が有用でないことを示すものではなく、本発明の範囲内から他の実施形態を排除することを意図するものではない。

用語「含む」及びこの変形は、これらの用語が明細書及び特許請求の範囲中に現れる場合、制限する意味を有さない。

本明細書で使用するとき、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、「少なくとも１つの」及び「１つ以上の」は、同じ意味で使用される。したがって、例えば、「１種の」抗体を含む検体結合物質は、その検体結合物質が異なる検体を結合する「１種以上の」抗体を包含することを意味すると解釈することができる。

用語「又は」は、その内容が明確に指示しない限り、通常は「及び／又は」を含む意味で用いられる。

用語「及び／又は」は、列記されている要素の１つ若しくは全て、又は列記されている要素の２つ以上の組み合わせを意味する。

また本明細書において、端点による数の範囲の列挙には、その範囲内に包含される全ての数（例えば、１〜５には、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５等）が包含される。

本発明の上記の「課題を解決するための手段」は、本発明が開示するそれぞれの実施形態又は全ての実施例を説明することを意図したものではない。以下の説明により、例示的な実施形態をより具体的に例示する。本明細書にわたっていくつかの箇所で、実施例の一覧を通してガイダンスを提供するが、実施例は様々な組み合わせにおいて使用できる。それぞれの事例において、列挙された一覧は、代表的な群としてのみ役目を果たすのであって、排他的な一覧として解釈されるべきではない。

試験チャンバ中の溶液中のセンサーの実施形態を図示。 基板上のセンサー層又は部分の実施形態を図示。 センサー層又は部分を有する検出装置及びこの装置の本体が複層の構築により形成されるフロースルー膜を図示。

本発明は、対象となる細菌に特徴的な１つ以上の検体の分析に基づく、対象となる細菌試料を分析する様々な方法に関する。本発明の方法は、対象となる細菌に特徴的な検体の存在を検出するばかりではなく、好適にはその検体が特徴的である細菌の同定をもたらす、かかる検体の同定をも含み得る。特定の実施形態では、試料の分析は対象となる細菌に特徴的な検体の定量を含む。

本発明は、対象となる標的検体（単数又は複数）を捕捉する試料の調製システムと比色分析センサーを用いる検出試験を組み合わせることによる特定の検体を検出するための方法を提供する。試料調製システムは、例えば、捕捉されたときに１つ以上の全細胞に存在できることのできる、対象となる１つ以上の検体の捕捉に特異的な物質を含む。

好適には、本発明の方法は、１つ以上の、好適には２つ以上の、特定の細菌の特徴を有する識別可能な検体に対する抗原特異性を有する、１つ以上の、好適には２つ以上の抗体の使用を含む最初の捕捉プロセスを含む。２つ以上の抗体が用いられる場合、それらは好適にはその結合特性において共働的である。つまり、それらは、標的検体（単数又は複数）の異なる領域に同時に結合することが可能である、又は最適には相補的結合であることが明らかであり、それによって異なる検体の結合が別の抗体の結合により促進される。

特定の細菌の最初の捕捉後、本発明の方法での分析技術は比色分析技術、特にポリジアセチレン（ＰＤＡ）物質を含む比色分析センサーの使用を含む。より具体的には、比色分析センサーは、受容体及びジアセチレンを含むポリマー性物質（ポリジアセチレン集合体）を含む重合組成物を含み、この受容体は、１つ以上のプローブ（単数又は複数）及び／又は１つ以上の検体（単数又は複数）と結合することに応じて色の変化を提供するトランスデューサーを形成するために重合組成物に組み込まれている。

特定の細菌の特徴を有する１つ以上の標的検体の検出のための試験の最初の工程は、検体の捕捉を含む試料の調製を含む。これは好適には検体結合物質を対象となる細菌（即ち、標的細菌）を含むことが疑われる試料と接触させ、検体結合物質が標的細菌に特徴的な検体（即ち、標的検体（単数又は複数））を捕捉することを可能にすることを含む。代替的に、対象となる試料及び検体結合物質の別個の成分（例えば、抗体及び磁性粒子）は同時に組み合わせられ得る。

典型的な試料は様々な量の妨害物質を含み得る。妨害物質は標的検体（単数又は複数）を感知する検出試験の能力を阻害し得る他の生物学的成分及び化合物である。典型的な試料はまた、綿棒などの試料取得器具から溶出する可能性もあり、そのような場合に試料取得器具により採集された元の試料には存在しない妨害物質を試料取得器具から拾い上げる可能性がある。

特に好適な試料は検体結合物質、及び試料中の妨害可能物質の捕捉（例えば、非特異的な）を低減させ（及び好適には、除去し）ながら選択的に標的検体（単数又は複数）を捕捉する溶出緩衝液を含む。好適な検体結合物質は磁性固体支持物質、特に磁性粒子を含む。かかる磁性粒子を用いる捕捉工程の終了後、磁石は通常はその表面に検体（単数又は複数）が付着した（即ち、捕捉された検体（単数又は複数））粒子の収集及び濃縮に用いられ、妨害をする可能性のある物質を含む残りの試料の除去を可能にする。捕捉された検体（単数又は複数）を持つ粒子（即ち、粒子−検体複合体）は、所望であれば、粒子−検体複合体から弱く結合した汚染物質を洗うために、次いで清浄な緩衝液に再懸濁することができる。所望であれば、この洗浄プロセスを数回繰り返すことができる。

検体捕捉後、この試験は比色分析センサーを用いる分析を含む。好適には、試験は比色分析センサーと捕捉された検体を有する検体結合物質（例えば、粒子−検体複合体）との間に接触を提供することを含む。代替的に、比色分析センサーとの接触前に、捕捉された検体は検体結合物質から除去されることができる。

比色分析センサーは溶液中又は基板上に被覆されて機能できる。一般論としては、図１に示されるように、センサー（即ち、センサー成分）１００はセンサーチャンバ１２２の溶液１２０内にある。示されるように、チャンバ１２２は第１の流路部分１２４と第２の流路部分１２６との間の流路に配設されることができる。対象となる検体を含むことが疑われる試験試料は、チャンバ１２２へ流れ込み、溶液１２０と混合される。混合後すぐに、試験試料内に対象となる検体が存在すれば、それはセンサー成分１００の受容体と結合して検出可能な変化を引き起こす。

図２はセンサー成分１００が、薄層膜、多孔性膜、又は他の基板などの基板１３２上のセンサー層又は部分１３０から形成される例示的な実施形態を示している。１実施例では、このセンサー層又は部分１３０は薄層膜又は他の基板上に堆積されたポリジアセチレンリポソームを含む。

溶液中では、センサーは直接又は間接（競合）試験において使用できる。

溶液中の直接試験では、捕捉された検体を有する検体結合物質（例えば、適切な緩衝液に懸濁された粒子−検体複合体）、又は捕捉された後に検体結合物質から除去された検体は、直接比色分析センサーに結合して色の変化を引き起こす。

溶液中での間接試験では、最初に１つ以上のプローブが、捕捉された検体がその表面に付着する検体結合物質、又は捕捉された後に検体結合物質から除去された検体と相互作用することが可能にされ、引き続き非結合のプローブ（単数又は複数）が比色分析センサーと結合して色の変化を引き起こす。

間接分析を含む好適な方法では、粒子−検体複合体は適切な緩衝に懸濁され、粒子−検体−プローブ複合体を形成するのに有効な条件下で１つ以上のプローブがかかる複合体と組み合わされ、この複合体は液相（例えば、粒子が磁性の場合に磁場を与えることにより）から分離され、及び非結合のプローブが比色分析センサーと結合して色の変化を引き起こすことを可能にする条件下で比色分析センサーが液相に導入される。この間接的な様式では、非結合のプローブの濃度を、最初に存在する捕捉された検体の濃度の測定に用い得る。非結合のプローブが比色分析センサーに結合する前に、粒子−検体−プローブ複合体を除去することが望ましいが、粒子−検体−プローブ複合体は非結合のプローブと同じ効率では比色分析センサーとは反応しないため、これは必ずしも必要とされない。

溶液に達成される試験に起因する色の変化は、目視により検出可能である。代替的に、より高い感度が望まれる場合には、適切な流体システムを固相上への比色分析センサー物質の濃縮、したがって色の変化の増幅に用いることができる。

基板上に被覆された比色分析センサーについては、同様の直接及び間接試験が可能である。これらの試験では、比色分析センサー物質を溶液中に入れるよりも、むしろ２００７年１１月２０日出願の、同一出願人による同時係属の「検出装置及び方法」（DETECTION DEVICES AND METHODS）と題される米国特許出願第６０／９８９，２９１号に記載されるような、適切な流体システムを用いることにより被覆された比色分析センサーが溶液相に曝露される。かかる流体システムの特に好適な実施形態は、本明細書の実施例３２〜３４及び図３に説明されており、図３はセンサー層又は部分及びフロースルー膜を有する検出装置を図示しており、この装置の本体は複層構造により形成されている。

重大なことに、特定の細菌、又はそれに特徴的な検体（単数又は複数）のこの最初の捕捉は「汎用」センサーシステムを用いる検出を可能にする。それはまた、対象となる標的に合わせて調整する修正を必要とせずに、複数の細菌を検出する能力のあるシステムを用いる検出も可能にする。例えば、単独のトランスデューサー（ポリジアセチレン／受容体の組み合わせ）は、所与の標的細菌に特異的な試料調製物と組み合わせることにより、数多い特異的な細菌を検出する機能を果たすこともある。

有利なことに、本発明の方法は、側方流動免疫試験法などの他の臨床現場での試験に比較して、改善された感度と特異性を有し得る。更に本明細書において提示される実施例において記載されるように、Ｓ．ａｕｒｅｕｓは１×１０^５コロニー形成単位（colony forming units）（「ｃｆｕ」）／ｍＬ、１×１０^４ｃｆｕ／ｍＬ、及び１×１０^３ｃｆｕ／ｍＬの濃度において検出可能である。したがって、当業者は本発明の方法が１×１０^３ｃｆｕ／ｍＬという低い濃度においての標的検体の検出に用い得ることを認識する。標的検体は、例えば、最高で５×１０^７ｃｆｕ／ｍＬの高い濃度においても同様に検出できる。

有利なことに、本発明の方法は、側方流動免疫試験などの他の臨床試験及び培養法に比較して、改善された全体の検出時間を有することができる。即ち、本発明の方法は１つ以上の検体を比較的短時間において検出できる。例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓは、前述の任意の濃度において６０分間未満（例えば、６０分間、３０分間、１５分間、１０分間、又は５分間）で検出できる。

本発明の方法を用いると、捕捉時間が比較的短くなる。例えば、捕捉時間は、３０分未満、１５分未満、５分未満、６０秒未満、及び３０秒でさえあることができる。かかる組成物はまた、任意にプルロニックＬ−６４界面活性剤、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、又はそれらの組み合わせを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などの緩衝液を含むこともできる。物理的撹拌（又は混合）を大きな粒子（例えば、１マイクロメートル（マイクロメートル又はμｍ）の平均粒径を持つもの）及び小さな粒子（例えば、２００ナノメートル（ｎｍ）の平均粒径を持つもの）の両方に用いることができるが、小さな粒子は混合することなく用い得る。

本発明の方法を用いると、検出時間を比較的短くすることができる。例えば、検出時間は３０分間未満、１５分間未満、１０分間未満、５分間未満、１分間未満でさえあることができる。

比較的少ない量の試験試料を用い得る。１〜２ミリリットル（ｍＬ）の大きさの試験試料容積を用い得るが、有利なことに本発明の方法では１０マイクロリットル（μＬ）単位の試験試料で十分であり、特定の実施形態では最大２００μＬが好適である。

検体結合物質：反応物質分子
試料は、検体結合（例えば、細菌認識試薬を含む検体結合物質）のために適切な反応物質分子と接触させられる。かかる反応物質分子は、例えば、抗体を含む。このような抗体は、微粒子物質、膜、又は他の固体支持物質に付着させることができる。特に好適な反応物質分子は、標的全細胞と直接相互作用する能力のあるものであり、特に抗体対全細胞表面抗原、及び全細胞と相互作用することが知られているプロテインＡなどの他のタンパク質が好適である。

標的検体（例えば、標的全細胞）の捕捉のための本発明の方法において有用な検体結合物質は、典型的に、標的検体を結合する反応分子を支持体に結合して（非共有結合又は共有結合）誘導体化された固体支持物質を含む。好適には、標的検体と結合するために、標的検体（例えば、標的全細胞）を含む試料が検体結合物質と接触させられ、非結合の残りの混合物は支持物質から除去される。

精製された標的検体を得るために、結合した検体は支持物質から除去（例えば、溶出）されることができるか、又は検体結合物質に付着したまま処理される。これは洗浄用緩衝液並びに、例えば、ｐＨ及び／又はイオン強度の変化により達成できる。例えば、ｐＨ感受性の様式でアビジンに結合する２−イミノビオチンなどのビオチンの特定の誘導体が入手可能である。試料及びビーズは９〜１１のｐＨでインキュベートされ、このｐＨでアビジンは強く２−イミノビオチンと相互作用する。捕捉後に、ｐＨを６以下にすること、又はビオチンを加えること（ビオチンとアビジンの間の相互作用の軽減）により標的はビーズから溶出される。

上述のとおり、全細胞上の標的検体は、反応分子（例えば、黄色ブドウ球菌反応物質分子又は黄色ブドウ球菌の細菌認識試薬）で検出することができる。いくつかの実施形態では、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ抗体などの１つ以上の抗体がＳ．ａｕｒｅｕｓ反応物質として用いられる。「Ｓ．ａｕｒｅｕｓ抗体」は、その抗原結合フラグメントを含めた所与の抗原に特異的に結合する能力を有するイムノグロブリンを指す。

用語「抗体」は、例えば、タンパク質などの外来化合物に特異的に反応性である、例えば、哺乳類種などの脊椎動物からの、多種多様なアイソタイプ（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥなど）の全ての抗体、及びそれらのフラグメントを含むことが意図されている。

抗体は、モノクローナル、ポリクローナル、又はそれらの組み合わせであることができる。抗体は、従来の技術を使用してフラグメントにすることができ、フラグメントは抗体全体と同様に、使用するために選別される。したがって、この用語には、選択的に特定のタンパク質と反応することが可能な抗体分子の、タンパク質分解的に切断又は組み換え技術によって調製された部分が含まれる。このようなタンパク質分解フラグメント及び／又は組み換えフラグメントの非限定的な例には、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、並びにペプチドリンカーにより結合されたＶＬ及び／又はＶＨ領域を含有する単鎖抗体（ｓｃＦｖ）が挙げられる。ｓｃＦｖは、２つ以上の結合部位を有する抗体を形成するために共有結合又は非共有結合により結合することができる。抗体は当業者に周知の多種多様な検出可能な構成部分により標識され得る。一部の態様では、測定したい検体に結合する抗体（１次抗体）は標識されないが、その代わり、標識された２次抗体又は１次抗体に特異的に結合する他の試薬の結合により間接的に検出される。

様々な黄色ブドウ球菌抗体が、当該技術分野において既知である。例えば、黄色ブドウ球菌抗体は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ及びＡｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌから市販されている。更に、モノクローナル抗体ＭＡｂ−１２−９などの他のＳ．ａｕｒｅｕｓ抗体が、米国特許第６，９７９，４４６号に記載されている。特定の好ましい実施形態では、抗体は本明細書で記載されたもの（例えば、ＭＡｂ−７６、ＭＡｂ−１０７、アフィニティー精製されたＲｘＣｌｆ４０、アフィニティー精製されたＧｘＣｌｆ４０、ＭＡｂ１２−９からなる群から選択される）、これらのフラグメント、及びこれらの組み合わせから選択される。かかる抗体はまた、共に「プロテインＡ選択性を持つ抗体」（ANTIBODY WITH PROTEIN A SELECTIVITY）と題された米国特許出願公開第２００８−０１１８９３７号及びＰＣＴ出願第ＵＳ２００７／０８４，７３６号、並びに共に「プロテインＡ選択性を持つ抗体」（ANTIBODY WITH PROTEIN A SELECTIVITY）と題された２００６年１１月２２日に出願の米国特許出願第１１／５６２，７４７号、及びＰＣＴ出願第ＵＳ２００７／０８４，７３９号、並びに共に「選択的溶出条件による特異的抗体の選別」（SPECIFIC ANTIBODY SELECTION BY SELECTIVE ELUTION CONDITIONS）と題された２００６年１１月２２日に出願の米国特許出願第６０／８６７，０８９号、及び２００７年１１月２０日出願の米国特許出願第１１／９４３，１６８号に開示されている。

好適な抗体は、モノクローナル抗体である。特に好適な抗体は、黄色ブドウ球菌（本明細書において「Ｓ．ａｕｒｅｕｓ」又は「Ｓｔａｐｈ Ａ」とも呼ばれる）のプロテインＡに結合するモノクローナル抗体である。

より特別には、１実施形態では、好適なモノクローナル抗体、及びこれらの抗原結合フラグメントは、ハイブリドーマ細胞株３５８Ａ７６．１により産生されるようなモノクローナル抗体７６の免疫学的結合特性を示すものである。マウスモノクローナル抗体７６は、マウスＩｇＧ２Ａ、プロテインＡで免疫化されたマウスから単離されたκ抗体である。ブタペスト条約に従って、モノクローナル抗体７６を産生するハイブリドーマ３５８Ａ７６．１は、２００６年１０月１８日に米国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）細胞バンク（１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０−２２０９）に寄託され、特許寄託指定ＰＴＡ−７９３８（本明細書では受入番号ＰＴＡ−７９３８とも示される）を与えられた。ハイブリドーマ３５８Ａ７６．１は、本明細書で「Ｍａｂ ７６」と呼ばれる抗体を産生する。Ｍａｂ ７６は、本明細書で「Ｍａｂ７６」、「Ｍａｂ−７６」、「ＭＡｂ−７６」、「モノクローナル７６」、「モノクローナル抗体７６」、「７６」、「Ｍ７６」、又は「Ｍ ７６」とも示され、本明細書では全て相互互換的に使用され、米国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）に２００６年１０月１８日に寄託され、受入番号ＰＴＡ−７９３８が付与されたハイブリドーマ細胞株３５８Ａ７６．１により産生される免疫グロブリンを指す。

別の実施形態では、好適なモノクローナル抗体及びこの抗原結合フラグメントは、ハイブリドーマ細胞株３５８Ａ１０７．２により産生されるようなモノクローナル抗体１０７の免疫学的結合特性を示すものである。マウスモノクローナル抗体１０７は、マウスＩｇＧ２Ａ、プロテインＡで免疫化されたマウスから単離されたκ抗体である。ブタペスト条約に従って、モノクローナル抗体１０７を産生するハイブリドーマ３５８Ａ１０７．２は、２００６年１０月１８日に米国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）細胞バンク（１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０−２２０９）に寄託され、特許寄託指定ＰＴＡ−７９３７（本明細書では受入番号ＰＴＡ−７９３７とも示される）を与えられた。ハイブリドーマ３５８Ａ１０７．２は、本明細書で「Ｍａ ｂ１０７」と呼ばれる抗体を産生する。Ｍａｂ １０７は、本明細書は「Ｍａｂ１０７」、「Ｍａｂ−１０７」、「ＭＡｂ−１０７」、「モノクローナル１０７」、「モノクローナル抗体１０７」、「１０７」、「Ｍ１０７」、又は「Ｍ １０７」とも示され、本明細書では全て相互互換的に使用され、米国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）に２００６年１０月１８日に寄託され、受入番号ＰＴＡ−７９３７が付与されたハイブリドーマ細胞株により産生される免疫グロブリンを指す。

好適なモノクローナル抗体はまた、モノクローナル抗体Ｍａｂ−７６が黄色ブドウ球菌のプロテインＡへ結合するのを阻害するものである。本発明は、モノクローナル抗体Ｍａｂ−７６により認識される黄色ブドウ球菌のプロテインＡの同一のエピトープに結合するモノクローナル抗体を利用することができる。モノクローナル抗体がモノクローナル抗体Ｍａｂ−７６による黄色ブドウ球菌のプロテインＡへの結合を阻害するかを決定するための方法、及びモノクローナル抗体がモノクローナル抗体Ｍａｂ−７６により認識される黄色ブドウ球菌のプロテインＡの同一のエピトープに結合するかを決定するための方法は、免疫学の当業者に周知である。

好適なモノクローナル抗体はまた、モノクローナル抗体ＭＡｂ−１０７が黄色ブドウ球菌のプロテインＡへ結合するのを阻害するものである。本発明は、モノクローナル抗体ＭＡｂ−１０７により認識される黄色ブドウ球菌のプロテインＡの同一のエピトープに結合するモノクローナル抗体を利用することができる。モノクローナル抗体がモノクローナル抗体ＭＡｂ−１０７による黄色ブドウ球菌のプロテインＡへの結合を阻害するかを決定するための方法、及びモノクローナル抗体がモノクローナル抗体ＭＡｂ−１０７により認識される黄色ブドウ球菌のプロテインＡの同一のエピトープに結合するかを決定するための方法は、免疫学の当業者に周知である。

好適なモノクローナル抗体は、このハイブリドーマの子孫又は誘導体により産生されるもの及び同等又は類似のハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体である。

また本発明における使用に適するものは抗原結合性フラグメントとも称される、様々な抗体フラグメントを含み、これらは完全な抗体の１部分のみを有し、通常は完全な抗体の抗原結合領域を含み、したがって抗原に結合する能力を保持している。抗体フラグメントの例としては、例えば、タンパク質分解消化及び／又はジスルフィド架橋の還元により産生されるＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｄ、Ｆｄ’、Ｆｖ、ｄＡＢ、及びＦ（ａｂ’）_２フラグメント、並びにＦａｂ発現ライブラリから産生されるフラグメントが挙げられる。そのような抗体フラグメントは、当該技術分野において周知の技術により作成することができる。

本発明で有用なモノクローナル抗体には、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント、Ｆｖフラグメント、二重特異性抗体、Ｆａｂ発現ライブラリーにより作製される直鎖抗体フラグメント、ＶＬ又はＶＨ領域のいずれかを包含するフラグメント、細胞内産生抗体（即ち、細胞内抗体）、及びこれらの抗原結合抗体フラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。

本発明に有用なモノクローナル抗体は、多種多様なアイソタイプの抗体であってよい。本発明に有用なモノクローナル抗体は、例えば、マウスＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＡ、ＩｇＤ、又はＩｇＥであってよい。本発明に有用なモノクローナル抗体は、例えば、ヒトＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、又はＩｇＥであってよい。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体はマウスＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ１、又はＩｇＧ３であってよい。本発明について、所与の重鎖は、κ又はλ形状のいずれかの軽鎖と対になっていてよい。

本発明において有用なモノクローナル抗体は、動物（限定されないが、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、ヤギ、ウマ、ニワトリ、又はシチメンチョウを含む）により産生され、化学的に合成され、又は組み換えにより発現されることができる。本発明に有用なモノクローナル抗体は、免疫グロブリン分子の精製のための当該技術分野において既知の多種多様な方法、例えば、クロマトグラフィ（例えば、イオン交換、アフィニティー、及びサイズ排除カラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差、又はタンパク質の精製のための多種多様な他の標準的な技法によって、精製することができる。

好適な抗体はまた、黄色ブドウ球菌の組み換えクランピングファクター（ｒＣｌｆ４０）タンパク質を好適には少なくとも１ピコグラム毎ミリリットル（ｐｇ／ｍＬ）、より好適には１００ｐｇ／ｍＬまでの濃度で検出する、高結合活性抗黄色ブドウ球菌クランピングファクタータンパク質ポリクローナル抗体調製物を包含する。好適な抗体はまた、黄色ブドウ球菌クランピングファクタータンパク質抗血清と比較して、検出感度において少なくとも４倍の増加を示す高結合活性抗黄色ブドウ球菌クランピングファクタータンパク質ポリクローナル抗体調製物を包含する。

特定の実施形態では、高親和性抗黄色ブドウ球菌クランピングファクタータンパク質ポリクローナル抗体調製物が有用であり、高親和性抗Ｓ．ａｕｒｅｕｓクランピングファクタータンパク質ポリクローナル抗体調製物は、抗血清をＳ．ａｕｒｅｕｓの組み換えクランピングファクター（ｒＣｌｆ４０）タンパク質により免疫された動物より得ること、この抗血清をＳ．ａｕｒｅｕｓクランピングファクター（Ｃｌｆ４０）プロテイン・アフィニティー・カラムに結合させること、カラムを０．５Ｍの塩を有するｐＨ４の洗浄緩衝液で洗浄すること、及び高親和性抗Ｓ．ａｕｒｅｕｓクランピングファクタータンパク質ポリクローナル抗体調製物をカラムからｐＨ２の溶出緩衝液で溶出すること、を含む方法により調製される。ここで、ウサギ及びヤギからの高結合活性抗黄色ブドウ球菌クランピングファクターポリクローナル抗体調製物はそれぞれ、アフィニティー精製ＲｘＣｌｆ４０及びアフィニティー精製ＧｘＣｌｆ４０として示される。いくつかの実施形態では、高結合活性抗黄色ブドウ球菌クランピングファクタータンパク質ポリクローナル抗体調製物は、黄色ブドウ球菌クランピングファクター（Ｃｌｆ４０）タンパク質アフィニティーカラムに抗血清を結合するのに先立って、ＩｇＧクラスの抗体のために抗血清を濃縮することを更に包含する方法によって得られてもよい。そのような濃縮は、調製物から非免疫グロブリンタンパク質を除去することができ、及び／又は試料内の抗体のＩｇＧクラスを濃縮することができる。

本明細書に用いられる、抗血清とは、免疫されたホスト動物からの血液から凝固タンパク質及び赤血球（ＲＢＣ）を除去したものを指す。標的抗原に対する抗血清は、多種多様な宿主動物を免疫することにより得ることができる。多種多様な免疫プロトコルを使用してよい。

抗体結合活性は、ポリクローナル抗体の作成の機能的親和性の尺度である。結合活性は、複数の抗体／抗原の相互作用の化合物親和性である。つまり、結合活性は、真の親和性ではなく、抗原／抗体結合の見かけの親和性である。ほとんどの抗血清の親和性が不均質であるにもかかわらず、平均の親和性（Ｋ_０）を規定することによりそのような母集団を特徴づけることができる。

検体結合物質：固体支持物質
固体支持物質には、微粒子物質、膜、ゲル（例えば、アガロース）、又は管若しくはプレートの表面などの他の固体支持物質を挙げることができる。例示的な固体支持物質としては、ニトロセルロース、ポリスチレン、ポリプロピレン、ナイロン、強磁性体物質、金ゾル、ポリカーボネート、ポリエチレン、セルロース、多糖類、ポリビニルアルコールなどの物質、又はそれらの組み合わせを挙げることができる。特定の実施形態において、微粒子物質及び膜が好ましい。

好適には、特定の実施形態において、検体結合物質の固体支持物質には、機能化された微粒子状物質（例えば、２マイクロメートル未満、好適には０．０５マイクロメートル〜１マイクロメートルの平均粒径を有する磁性ビーズ）が挙げられる。例えば、カルボキシル基、アミン基、及びトシル基などの種々の基で官能化された磁気ビーズがＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）及びＡｄｅｍｔｅｃｈ（Ｐｅｓｓａｃ，Ｆｒａｎｃｅ）から市販されている。ストレプトアビジンでコーティングされた粒子もまた、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ａｄｅｍｔｈｅｃｈ（Ｐｅｓｓａｃ，Ｆｒａｎｃｅ）、及びＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ（Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）などのいくつかの供給元から入手可能である。

検体結合物質は固体支持物質、好適には固体支持物質の上に１つ以上の抗体が配置された微粒子物質を含む。特定の実施形態では、微粒子物質のそれぞれの粒子は、そこに配置される異なる検体を結合する少なくとも２種の抗体を有する。例えば、特定の実施形態では、検体結合物質は、その上にＭＡｂ−７６及びＧｘＣｌｆａ抗体が（好適には、１：１の比率で）配置された固体支持物質（好適には微粒子物質）を含む。

特定の実施形態では、検体結合物質は少なくとも２つの部分を含む微粒子状物質を含み、微粒子状物質の１つの部分はその上に配置される１つの検体に対して特異的な１つの抗体を有し、第２の部分はその上に配置される識別可能な検体に対して特異的な異なる抗体を有する。微粒子状物質のこの２つの部分は同じ種類の粒子を含み得る。微粒子状物質は、少なくとも２つの異なる抗体がそれぞれ異なる粒子に付着する少なくとも２つの異なる種類の粒子、又は同じ種類の粒子を含むことができる。

抗体は、共有結合又は非共有結合のいずれかを介して、支持物質、好適には粒子支持物質に結合することができる。

固体支持物質への抗体の非共有結合性付着は、例えば、イオン性相互作用又は水素結合による付着を包含する。本発明に含まれる非共有結合の１実施例は、既知のビオチン−アビジン系である。アビジン−ビオチン親和力に基づく技術は、生物学及び生物工学の数多くの分野で広い汎用性が見出されている。アビジンとビオチンとの親和力定数はきわめて高く（解離定数Ｋｄは、およそ１０^−１５Ｍである（Ｇｒｅｅｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．８９，５９９（１９６３）を参照）、かつビオチンが非常に多種多様な生体分子に結合される場合にも有意に減じられない。数多くの化学反応が、生体分子の活性又は他の所望の特性において、最小若しくは無視できる損失しか伴わずに生体分子をビオチンにカップリングするために同定されている。ビオチン−アビジン技術の総説は、「Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ａｖｉｄｉｎ−Ｂｉｏｔｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｔｏ Ａｆｆｉｎｉｔｙ−Ｂａｓｅｄ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ」，Ｂａｙｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｊ．ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ｐｇｓ．３〜１１（１９９０）に見出される。

ストレプトアビジン、及びその機能的同族体であるアビジンは、４つの同一のサブユニットを有する四量体タンパク質である。ストレプトアビジンは、アクチノバクテリウム・ストレプトマイセス・アビジニイ（actinobacterium Streptomyces avidinii）により分泌される。ストレプトアビジン又はアビジンのモノマーは、水溶性ビタミンであるビオチンに対する１つの高親和性結合部を含み、ストレプトアビジン又はアビジン四量体は、４つのビオチン分子を結合する。

ビタミンＨ又はシス−ヘキサヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−チエノ−［３−，４］−イミダゾール−４−ペンタン酸としても知られるビオチンは、細菌及び酵母を含むほとんどの生物に不可欠である基本のビタミンである。ビオチンは、その結合相手のアビジン及びストレプトアビジンよりはるかに小さい約２４４ダルトンの分子量を有する。ビオチンはまた、ピルベートカルボキシラーゼ、トランス−カルボキシラーゼ、アセチル−ＣｏＡ−カルボキシラーゼ及びβ−メチルクロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼの酵素補助因子でもあり、それらは、多種多様な基質を共にカルボキシル化する。

ストレプトアビジン及びアビジンの両方とも、周知のタンパク質とリガンドとの間の非共有結合の相互作用としては最も強いものの１つであり、１０^−１５モル（Ｍ）のモル解離定数（Ｇｒｅｅｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２９，ｐｐ．８５〜１３３（１９７５））、及び８９日のリガンド解離のｔ１／２（Ｇｒｅｅｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２９，ｐｐ．８５〜１３３（１９７５））を持つ、極端に緊密かつ高度に特異的なビオチンに対する結合を示す。アビジン−ビオチン結合は、血清中及び循環中において安定である（Ｗｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ，Ｖｏｌ．２７，ｐｐ．３６６〜３６８（１９７０年））。一度形成されると、アビジン−ビオチン錯体は、究極のｐＨ、有機溶媒及び変性条件に影響を受けない。ビオチンからのストレプトアビジンの分離は、８Ｍグアニジン、ｐＨ１．５、又は１２１℃で１０分間（ｍｉｎ）のオートクレーブなどの条件を必要とする。

抗体は、多種多様な既知の方法を使用してビオチン化することができる。例えば、抗体は、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬから市販されるＮ−ヒドロキシサクシンイミドビオチン（ＮＨＳ−ビオチン）等の活性化ビオチン類似体を使用して化学的にビオチン化することができ、抗体上に遊離１級アミノ基の存在を必要とする。

本発明の好ましい方法において、磁気粒子はストレプトアビジンでコーティングされることができ、ビオチン化された抗体と接触させることができる。これらの粒子は、更に細菌捕捉に使用することができる。２つ以上の抗体により、同時又は連続した捕捉を行うことができる。逐次捕捉は、当業者には理解できる、多種多様な試薬の添加の順序を含むことができる。

別の方法では、ビオチン化された抗体は、最初に細菌を捕捉するために試料と混合され、次いでビオチン化された抗体−細菌複合体は非共有結合的にストレプトアビジンにより被覆されたビーズに結合されることができる。特定の実施形態において、ビオチンの抗体に対する比率は、特定の粒子の凝集を防止するために最適化することができる。

特定の実施形態において、ビオチン分子の数と抗体数の比率は、特定の粒子の凝集を回避するために最適化することができる。例えば、Ａｄｅｍｔｅｃｈの２００ｎｍのストレプトアビジンにより被覆された粒子では、約２：１の比率が好適である。より高い比率、特に７：１を超えるものではこれらの粒子の凝集の問題を示している。

微粒子の担体物質への抗体の共有結合の代表的方法は、活性化化合物（グルタルアルデヒド、カルボジイミド、臭化シアンなど）により活性化された担体物質の官能基（カルボキシル基、アミン基、ヒドロキシル基、マレイミド基、ヒドラジド基）の抗体中の別の反応性基（ヒドロキシル基、アミノ基、アミド基、又はスルフヒドリル基）との反応の利用を含む。この結合は、例えば、ジスルフィド結合、チオエステル結合、アミド結合、チオエーテル結合などであってよい。抗体はまた、抗体上の官能基（アミン基など）と直接反応することができる基（トシル基、クロロメチル基など）で官能化された支持体物質に直接付着させてもよい。

抗体は、当該技術分野において既知の多種多様な方法により、微粒子支持体物質に共有結合されてよい。例えば、カルボキシル基で誘導体化されたビーズは市販されている。したがって、抗体は、抗体上の１級アミンとビーズ表面上のカルボキシル基との間のアミド結合の形成を介してこれらのビーズにカップリングすることができる。このカップリング反応は、カルボジイミドによる活性化によって媒介される。

典型的に、粒子濃度及び抗体と粒子の比率は、早い捕捉を達成するために対象となるシステムに最適化される。一般的に、これは、粒子依存性である。例えば、Ｄｙｎａｌ １−マイクロメートル（μｍ）粒子において、粒子濃度は好適には０．０４ミリグラム毎ミリリットル（ｍｇ／ｍＬ）を超え、より好適には０．１ｍｇ／ｍＬを超え、更により好適には０．１６ｍｇ／ｍＬを超える。同じ粒子において、抗体対粒子の比率は、好適には１ｍｇの粒子当たり１μｇの抗体を超え、より好適には１０μｇ／ｍｇを超え、及び更により好適には４０μｇ／ｍｇ粒子を超える。

本発明の方法の捕捉工程の別の実施形態では、サブマイクロメートルの粒径の粒子（例えば、捕捉ビーズ）を用いる場合、粒子濃度は、好適には０．０４ｍｇ／ｍＬを超え、より好適には０．１ｍｇ／ｍＬを超え、及び更により好適には０．１６ｍｇ／ｍＬを超える。本発明の方法の捕捉工程の別の実施形態では、サブマイクロメートルの粒径の粒子を用いる場合、抗体対粒子の比率は、好適には１ｍｇの粒子当たり０．０１μｇの抗体を超え、より好適には１ｍｇの粒子当たり０．１μｇの抗体を超え、及び更により好適には１ｍｇの粒子当たり１０μｇの抗体を超えるが、通常は１ｍｇの粒子当たり１０μｇの抗体を超えない。

好適な粒子は、非特異的結合を防止するためにブロックされても又はブロックされなくてもよい。このようなブロッキングは、抗体結合前又は後に行ってよい。例えば、購入した特定の磁気ビーズ（例えば、Ｄｙｎａｌ Ｔ１ ＭｙＯｎｅストレプトアビジンビーズ）はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロックされる。他の好適な非特異的結合のブロッキング剤を使用することができ、それらは、当該技術分野において既知である。また、ブロッキング剤（例えば、ポリミキシン）を比色分析センサー内のプローブ（例えば、ポリミキシン）の非特異的結合の防止のためにも使用できる。

粒子は、沈降、遠心分離、又は濾過により分離することができる。好適には、磁気粒子が使用され、磁場の使用により分離される。かかる分離された粒子（好適にはその表面に全細胞を有する）は、例えば、プルロニックＬ−６４、又はＴＷＥＥＮ ２０を含みＢＳＡなどを含んでも含まなくてもよいＰＢＳを含む様々な緩衝液によって洗浄できる。

重大なことに、本発明の方法を用い、好適には標的全細胞の少なくとも２０％が捕捉され、より好適には標的全細胞の少なくとも５０％が捕捉され、及び更により好適には標的全細胞の少なくとも８０％が捕捉される。

比色分析センサー：ポリジアセチレン集合体
本発明の方法における使用に好適な比色分析センサーは、受容体及びジアセチレンを含むポリマー性物質（ポリジアセチレン集合体）を含む重合組成物を含み、この受容体は１つ以上のプローブ（単数又は複数）及び／又は１つ以上の検体（単数又は複数）と結合することに応じて色の変化を提供するトランスデューサーを形成するために重合組成物に組み込まれている。かかる比色分析センサーは分子認識事象の比色分析検出の基礎として機能できる。

比色分析センサーにおける使用に好適なジアセチレン化合物は、溶液中で自己集合し、電磁スペクトルの紫外又は可視領域の電磁波放射などの化学線照射を用いて重合できる、秩序のある集合体を形成する。ジアセチレン化合物の重合は、その立体配座及び外部要因への曝露に応じて、５７０ナノメートル（ｎｍ）未満、５７０ｎｍ〜６００ｎｍ、又は６００ｎｍを超える可視スペクトルの色を有する重合反応生成物を生じる。通常は、本明細書で開示されるジアセチレン化合物の重合はポリジアセチレン骨格を有する準安定青相ポリマーネットワークを生じる。これらの準安定青相ポリマーネットワークは、例えば、熱、可能な場合には溶媒若しくはカウンターイオンの変化、又は物理的応力などの外部要因への曝露を受けて青みがかった色から赤みががったオレンジ色までの色の変化を起こす。

本明細書で開示される、物理的応力への曝露により可視の色の変化を起こすジアセチレン化合物及びその重合生成物の能力は、それらを検体検出のための感知装置の調製のための候補物質とする。開示されたジアセチレン化合物から形成されるポリジアセチレン集合体は、バイオセンシングでの応用におけるトランスデューサーとして機能し得る。

所定のセンシングでの応用に関するジアセチレン性分子の構造的要求は、通常はその応用に特異的である。全体の鎖長、溶解性、極性、結晶化度、及び更なる分子修飾のための官能基の存在などの特徴の全てが、共働的にセンシング物質としてのジアセチレン性分子の能力を決定する。

例えば、水性媒体中の検体の生物的検知の場合、ジアセチレン性化合物の構造は、水中での安定な分散物形成能力、有色物質への重合効率、検体に結合するための適切な受容体化学構造の取り込み能力、及び結合相互作用を色の変化に利用する変換能力を持つべきである。これらの能力はジアセチレン化合物の構造特性に依存する。

本発明のジアセチレン化合物は上述した能力を保持し、容易にかつ効率的に、所望の色変化を起こすポリジアセチレン集合体に重合する。加えて、このジアセチレン化合物は、安定かつ重合性の溶液を形成しながら、以下に述べられるような大過剰の非重合性物質を取り込むことを可能にする。

開示されたジアセチレン化合物は、ハイスループット合成法を含む迅速で高収率の様式で合成可能である。これらのジアセチレン性化合物の骨格中のヘテロ原子などの官能基の存在は、例えば、所定のセンシング応用での要求を満たすための、容易な構造の精緻化の可能性を提供する。ジアセチレンを、水などの好適な溶媒に加え、例えば、混合物を超音波処理し、次いで溶液を通常は２５４ｎｍの波長の紫外光で照射することで、ジアセチレン性化合物はネットワークを含む所望のポリジアセチレン骨格に重合させることができる。重合するとすぐに、溶液は青みがかった紫へと色の変化を受ける。

本発明において有用なジアセチレンは、通常はカルボキシル基、１級アミン基及び３級アミン基、カルボキシルのメチルエステルなどの少なくとも１つの官能基を含む平均８原子の炭素鎖を含む。好適なジアセチレンとしては、米国特許第５，４９１，０９７号（Ｒｉｂｉ，ｅｔ ａｌ．）、ＰＣＴ公開第ＷＯ ０２／００９２０号、米国特許第６，３０６，５９８号及びＰＣＴ公開ＷＯ ０１／７１３１７号に記載されたようなものが挙げられる。

好適な実施形態では、ポリジアセチレン集合体は下式の重合化合物であり、

式中、Ｒ^１は

Ｒ^２は、

Ｒ^３、Ｒ^８、Ｒ^１３、Ｒ^２１、Ｒ^２４、Ｒ^３１及びＲ^３３は、独立して、アルキルであり、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^７、Ｒ^１４、Ｒ^１６、Ｒ^１９、Ｒ^２０、Ｒ^２２、Ｒ^２５、及びＲ^３２は、独立して、アルキレンであり、Ｒ^６、Ｒ^１５、Ｒ^１８、及びＲ^２６は、独立して、アルキレン、アルケニレン、又はアリーレンであり、Ｒ^９は、アルキレン又は−ＮＲ^３４−であり、Ｒ^１０、Ｒ^１２、Ｒ^２７、及びＲ^２９は、独立して、アルキレン又はアルキレン−アリーレンであり、Ｒ^１１及びＲ^２８は、独立して、アルキニルであり、Ｒ^１７は、エステルの活性化基であり、Ｒ^２３は、アリーレンであり、Ｒ^３０は、アルキレン又は−ＮＲ^３６−であり、Ｒ^３４、及びＲ^３６は、独立して、Ｈ又はＣ_１〜Ｃ_４アルキルであり、ｐは、１〜５であり、及びｎは、１〜２０であり、かつここで、Ｒ^１とＲ^２は同一ではない。例示的な化合物は、米国特許第６，９６３，００７号及び米国特許出願第０４−０１２６８９７−Ａ１号及び同第０４−０１３２２１７−Ａ１号に更に記載されている。好適な実施形態では、Ｒ^１は

式中、Ｒ^７は、エチレン、トリメチレン、テトラメチレン、ペンタメチレン、ヘキサメチレン、ヘプタメチレン、オクタメチレン、又はノナメチレンであり、Ｒ^６は、エチレン、トリメチレン、エチニレン、又はフェニレンであり、ここで、Ｒ^２は

式中、Ｒ^２０は、エチレン、トリメチレン、テトラメチレン、ペンタメチレン、ヘキサメチレン、ヘプタメチレン、オクタメチレン、又はノナメチレンであり、Ｒ^２１は、ウンデシル、トリデシル、ペンタデシル、ヘプタデシルであり、ここで、ｐは、１である。

本発明は、構造異性体、幾何異性体、塩、溶媒和物、多形体などの異性体を含む本明細書に記載された化合物を含む。

式ＸＸＩＩＩのジアセチレンは、スキーム１に概略が示されているように調製でき、ここで、ｎは、通常は１〜４であり、ｍは、通常は１０〜１４である。

式ＸＸＩＩＩの化合物は式ＸＸＩＩの化合物の、好適な溶媒、例えばＤＭＦ中での、好適な酸化剤による酸化を経て調製できる。好適な酸化剤としては、例えばジョーンズ試薬及び重クロム酸ジピリジニウムが挙げられる。上述の反応は、１時間〜４８時間、通常は８時間の時間で、０℃〜４０℃、通常は０℃〜２５℃の温度で行われる。

式ＸＸＩＩの化合物は式ＸＸＩの化合物の好適な酸塩化物との反応により調製できる。好適な酸塩化物としては、例えば塩化ラウロイル、塩化１−ドデカノイル、塩化１−テトラデカノイル、塩化１−ヘキサデカノイル、及び塩化１−オクタデカノイルなどの所望の生成物を与える酸塩化物が挙げられる。好適な溶媒としては、例えば、エーテル、テトラヒドロフラン、ジクロロメタン、及びクロロホルムが挙げられる。上述の反応は、通常は１時間〜２４時間、通常は、３時間の時間で、０℃〜４０℃、通常は０℃〜２５℃の温度で、トリアルキルアミン又はピリジンのような塩基の存在下で行われる。

式ＸＸＩの化合物は、市販品として入手可能であるか（例えば、ｎが１〜４の場合）、又はスキーム１に概略が示され、例えばＡｂｒａｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｓｙｎｔｈ．，６６，１２７〜３１（１９８８）、及びＢｒａｎｄｓｍａ，Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ Ａｃｅｔｙｌｅｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７１）に開示されているように、式ＸＶＩＩＩの化合物から化合物ＸＩＸ及びＸＸを経て調製することができる。

本明細書で開示されるジアセチレン性化合物はまた、式ＸＸＩＩの化合物を無水コハク酸、無水グルタル酸、又は無水フタル酸などの酸無水物と、トルエンなどの好適な溶媒の存在下に反応させることによっても調製できる。上述の反応は通常は１時間〜２４時間、通常は１５時間、５０℃〜１２５℃、通常は１００℃〜１２５℃の温度で行われる。

ポリジアセチレン集合体を含むセンサーは、適切な担体上に移転する前に従来のＬＢ（ラングミュアー・ブロジェット（Ｌａｎｇｍｕｉｒ−Ｂｌｏｄｇｅｔｔ））プロセスにより膜を形成する必要なしに得ることができる。代替的に、ポリジアセチレン集合体は、Ａ．Ｕｌｍａｎ，Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｕｌｔｒａｔｈｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｆｉｌｍｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１０１〜２１９（１９９１）に記載されているとおりの周知のＬＢプロセスを用いて基板上に形成できる。

比色分析センサー：受容体
比色分析センサーは、溶液中のポリジアセチレン集合体内に組み込まれた受容体から形成されるトランスデューサーを含む。このセンサーは、受容体をジアセチレン単量体に、重合の前又は後に加えることにより調製することができる。この受容体は、ポリジアセチレン集合体を、物理的混合、共有結合、及び非共有結合（静電的相互作用、極性相互作用など）を含む様々な手段により機能化することができる。

重合中又はその後に、この受容体は、効果的に受容体と検体又はプローブとの相互作用などによりポリマーネットワークに組み込まれ、共役エン−インポリマー骨格の摂動に起因する可視の色の変化を生じる。

受容体のポリジアセチレン集合体への取り込みは、１つ以上のプローブ及び／又は検体との相互作用若しくは結合に対応して変形する能力を有する構造的形態を提供する。特に有用な受容体は、ｖ／（ａ_０ｌ_ｃ）により定義される充填パラメーター（Ｉｓｒａｅｌａｃｈｖｉｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｑ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，１３，１２１（１９８０））により定義される、棒型形状分子構造を通常有する両親媒性分子の集合体であり、式中、ｖは、分子の炭化水素成分（例えば、リン脂質又は脂肪酸の炭化水素鎖）により占有される容積、ａ_０は、極性の頭部基（例えばリン脂質の頭部基又は脂肪酸のカルボン酸頭部基）の占める有効面積、及びｌ_ｃは、いわゆる臨界長であり、一般的にその環境中における分子の長さを表す。受容体のための好ましい両親媒性分子は、充填パラメーター、ｖ／（ａ_０ｌ_ｃ）、の値が１／３〜１のものである。

有用な受容体の例としては、限定されないが、脂質、表面膜タンパク質、酵素、レクチン、抗体、組み換えタンパク質など、合成タンパク質、核酸、ｃ−グリコシド、炭水化物、ガングリオシド、及びキレート剤が挙げられる。ほとんどの実施形態では、受容体はリン脂質である。好適なリン脂質としては、Ｓｉｌｖｅｒ，Ｔｈｅ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ １，ｐｐ １〜２４（１９８５）に記載されているようなホスホコリン（例えば、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ホスホエタノールアミン、及びホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、並びにホスファチジルグリセロールが挙げられる。

１実施形態では、受容体は、物理的に混合され、ポリジアセチレンの間に分散され、その構造自身が、対象となるプローブ及び／又は検体に対して結合親和性を有する構造を形成する。構造には、限定されないが、リポソーム、ミセル、及びラメラが含まれる。好適な実施形態では、この構造はリポソームである。理論に拘束されることを意図しないが、リン脂質が細胞膜を模倣する一方で、ポリジアセチレン集合体は、リポソームに起こる物理化学的変化が可視の色変化に変換されることを可能にすると考えられている。この調製されたリポソームは、明確な形態、寸法分布、及び明確な表面電位などの他の物理的特性を有する。

リポソ−ム中の受容体のジアセチレン化合物に対する比率は、物質の選択及び所望の比色分析応答に基づいて変化させることができる。ほとんどの実施形態では、リン脂質のジアセチレン化合物に対する比率は少なくとも２５：７５、より好適には少なくとも４０：６０である。好ましい実施形態ではリポソームは、ジアセチレン化合物：ＨＯ（Ｏ）Ｃ（ＣＨ_２）_２Ｃ（Ｏ）Ｏ（ＣＨ_２）_４Ｃ≡Ｃ−Ｃ≡Ｃ（ＣＨ_２）_４Ｏ（Ｏ）Ｃ（ＣＨ_２）_１２ＣＨ_３ ［コハク酸モノ−（１２−テトラデカノイルオキシ−ドデカ−５，７−ジイニル）エステル］、及び両性イオン性リン脂質である、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン［ＤＭＰＣ］の６：４の比率の混合物からなる。

リポソームは、調製緩衝液と称される緩衝液中に懸濁された物質の混合物に、プローブによる超音波を当てることにより調製できる。例えば、調製緩衝液は、低イオン強度（５ｍＭ）のＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸［ＨＥＰＥＳ］緩衝液（ｐＨ＝７．２）であってよい。別の有用な調製緩衝液は、低イオン強度（２ｍＭ）の、トリスヒドロキシメチルアミノエタン［ＴＲＩＳ］緩衝液（ｐＨ＝８．５）である。

比色分析センサー：プローブ
本発明の比色分析センサーは、好適には１つ以上のプローブがリン脂質などの受容体及び重合ジアセチレンの両方を含むリポソームと相互作用することを利用できるように設計される。リポソームは生体膜のモデルであり、これらのタンパク質などのプローブとの相互作用を考えられることができるものは、Ｏｅｌｌｅｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ Ｂ，１０８，３８７１〜３８７８（２００４）、及びＺｕｃｋｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓｉ．Ｊ．，８１，２４５８〜２４７２（２００１）に記載されているようなものであり得る。

タンパク質とリポソームの相互作用を、脂質（リポソーム相中に分配されたもの）対タンパク質濃度の比率に関連して記載することが便利である。高い脂質対タンパク質濃度の比率では、タンパク質は静電相互作用を介して最初にリポソームの表面に吸着される。タンパク質濃度が増大するにつれて、脂質対タンパク質濃度の比率は低下するが、タンパク質は、完全に飽和するか、又はリポソームを完全に包み込むまで、静電的にリポソーム表面に吸着され続ける。このプロセスが進行するにつれ、リポソーム表面を覆うタンパク質の疎水性部位がリポソーム構造の疎水性内部と相互作用を開始することができるまで、リポソーム及びタンパク質の両方は、形態的及び立体配座の変化を受けることができる。この時点で、タンパク質は疎水的に結合され始め、リポソーム構造を貫通し、リポソームの寸法及び浸透性の劇的な変化を伴う、リポソーム構造の実質的な形態的変化をもたらす。最終的には、リポソームの軟凝集を経て、吸着されたタンパク質の層は懸濁安定性の喪失をもたらし、ついには脂質相の沈殿をもたらす。

静電相互作用の存在は、存在するタンパク質及び脂質の種類ばかりでなく、環境にも高度に依存する。理論に拘束されることを望まないが、所定の緩衝組成物のイオン強度は、リポソーム及び荷電したタンパク質の両方の表面電位の確立、したがって顕著に静電的に相互作用するそれらの能力を確立するのに有用であろうと考えられる。

例えば、中性ｐＨ（例えば、ＨＥＰＥＳ、ＴＲＩＳ）の低イオン強度（２〜５ｍＭ）の緩衝液組成物では、荷電したプローブは静電的にポリジアセチレンリポソームに吸着できる。最初の吸着自身は、リポソームの実質的な寸法及び形態変化を引き起こさないかもしれず、したがって初期的には小さな又は無視できる比色分析応答であるが、もしプローブが脂質に対して過剰に存在すると、最終的にはプローブがリポソームに疎水的に結合され始め、その内部膜構造に貫通する可能性がある。この時点で、プローブのリポソーム構造への組み込みにより与えられる大きな機械的応力が、顕著にポリジアセチレン立体配座を変化させ、同時に起こる比色分析応答を容易に観察可能なものとすることが期待される。

代替的に、もし中性ｐＨにおいてプローブが陰電荷を帯びていると、そのポリジアセチレンリポソームと静電的に相互作用する能力は著しく阻害され、プローブ及び受容体を含むポリジアセチレンリポソームの疎水的相互作用に起因する比色分析応答を生成する能力に障害が起きる可能性がある。この場合、中性ｐＨ（例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、イミダゾール緩衝液）で高いイオン強度の（１００ミリモル（ｍＭ）を超える）緩衝液が、リポソームの表面電位を低下させる（リポソームの表面電荷を遮蔽することにより）手段を提供し、無荷電のプローブとリポソームの直接的な疎水的相互作用を促進し、リポソームの構造内へのタンパク質の取り込みをもたらす。したがって、この場合、緩衝液組成物は、実質的な比色分析応答を可能とすることを助け、それ以外の方法では応答は生じることができない。緩衝液組成のより高いイオン強度は、リポソームの表面電位への効果のために、プローブの不在下で実質的な比色分析応答を導入できるが、発明者らは、プローブが存在する場合、タンパク質−リポソーム疎水的相互作用に起因して、比色分析応答が顕著に増大されることを見出した。この結果は大変に有用な実用的結果を有する：即ち、所定の限界における検出時間が大幅に短縮できること、又は逆にいえば、固定された試験時間に関して検出の限界を大幅に低下させることができることである。

この現象に基づいて、比色分析応答を引き起こす、所与の検体標的及びポリジアセチレンリポソームと特異的に相互作用できる能力に基づき、プローブを選択できる。ポリジアセチレンを含むリポソームの比色分析応答は、プローブ又はプローブ−検体複合体の濃度に直接的に比例する。

特定の応用のためのプローブ（単数又は複数）の選択は、プローブの寸法、形態、電荷、疎水性及び分子に対する親和性に部分的に依存するであろう。プローブは環境のｐＨに応じて、陽電荷、陰電荷、又は両性電荷を帯びることができる。プローブの等電点より低いｐＨでは、プローブは陽電荷を帯び、等電点より上のｐＨでは、陰電荷を帯びる。本明細書に用いられる用語「等電点」はプローブがゼロの正味荷電を有するｐＨを指す。

ポリジアセチレン／リン脂質システムを用いる生化学的試験を設計するために、受容体（又はプローブ）の等電点を知ることは、緩衝液の組み合わせの選択に影響する。リポソームの形態変化を得るために、低い等電点を持つプローブでは、より高いイオン強度の緩衝液が必要であろう。より高い等電点を持つタンパク質は、ＨＥＰＥＳ緩衝液のような低イオン強度の緩衝液において色の変化を引き起こすために用い得る。

プローブは、標的検体及び受容体の両方に対して親和性を持つ分子であってよい。本発明において使用される可能性のあるプローブとしては、アラメチシン、マガイニン、グラミシジン、ポリミキシンＢ硫酸塩、及びメリチンなどの膜破壊ペプチド、フィブリノーゲン、ストレプトアビジン、抗体、レクチン、及びそれらの組み合わせが挙げられる。例えば、米国特許出願公開第２００４／１３２２１７号を参照されたい。ポリミキシンＢ硫酸塩などのポリミキシンは、グラム陽性細菌の検出に特に有用である。

抗体及び抗体のフラグメントもまたプローブとして用い得る。これは、選択的に特定のタンパク質と反応する能力のある、タンパク質分解的に開裂されたか、又は組み替え的に調製された抗体分子の部分の部位を含む。かかるタンパク質分解的及び／又は組み換えフラグメントの非限定的な例としては、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ）_２、Ｆｖ、及びペプチドリンカーにより連結されたＶＬ及び／又はＶＨドメインを含む単鎖抗体（ｓｃＦｖ）が挙げられる。ｓｃＦｖは、２つ以上の結合部位を有する抗体を形成するために共有結合又は非共有結合により結合することができる。ｓｃＦｖは、２つ以上の結合部位を有する抗体を形成するために共有結合又は非共有結合により結合することができる。抗体は当業者に周知の多種多様な検出可能な構成部分により標識され得る。一部の態様では、測定したい検体に結合する抗体（１次抗体）は標識されないが、その代わり、標識された２次抗体又は１次抗体に特異的に結合する他の試薬の結合により間接的に検出される。

本明細書で既に検体結合物質の文脈において記載されているように、様々なＳ．ａｕｒｅｕｓ抗体が当技術分野で周知である。

検出試験緩衝液組成
検出試験はまた、通常は、検体（単数又は複数）とトランスデューサーの間の相互作用を媒介する緩衝組成物も含む。緩衝液組成物は、プロトン受容体のプロトン供与体に対する比が１に近い、共役酸−塩基の１対からなり、他の成分の存在下にｐＨの変化に抵抗する能力のあるシステムを提供する。加えて、本発明の緩衝液組成は、検体と比色分析センサーの成分との間の物理的又は化学的相互作用を媒介する。例えば、緩衝液組成物の適切な選択は、タンパク質プローブとジアセチレンリポソームとの相互作用を促進できる一方、試料に存在する可能性のある他の潜在的な妨害性タンパク質との相互作用を阻害する。特に有用である可能性のある緩衝液組成としては、ＨＥＰＥＳ緩衝液、イミダゾール緩衝液、及びＰＢＳ緩衝液が挙げられる。

例えば、ｐＨ７．２のＨＥＰＥＳ緩衝液のみを含むシステム中では、ポリミキシンＢ硫酸塩（７．７の等電点を持つ）は陽電荷を持ち、ただちに陰電荷を持つリン脂質の極性頭部基に付着し、比色分析センサーでの青から赤への色の変化を誘発できる。例えば、米国特許出願公開第２００６／１３４７９６号を参照されたい。更に、傷からの浸出液中のアジュバントタンパク質である、通常は４．５〜５．５の範囲の等電点を持つヒト血清アルブミンは、同じＨＥＰＥＳ緩衝液組成中では陰電荷を有し、リン脂質の極性頭部基への吸着又は静電相互作用が最小となり、試験の妨害の可能性が軽減される。

代替的に、イミダゾール又はＰＢＳなどの、より高いイオン強度を持つ緩衝液の存在下では、このイオン強度が、リポソームの形態（又は他のトランスデューサーの構造）を、疎水性部分を露出するように変更し、したがって、色の変化を引き起こすタンパク質の疎水性部分との直接の相互作用を可能とする。

最終的に、同様の様式で、プローブと比色分析センサーの疎水的相互作用を助力できる、界面活性剤成分を緩衝液組成物に導入できる。本発明において特に有用な界面活性剤は、非イオン性界面活性剤を含む。ポリアルキル化、特にポリエトキシ化された、非イオン性界面活性剤は、溶液中の本発明の成分を特に良好に安定化できる。

有用である非イオン性型の界面活性剤としては、以下のものが挙げられる：
１．ポリエチレンオキシドにより伸長されたソルビタンモノアルキレート（即ち、ポリソルベート）。特に、ＮＩＫＫＯＬ ＴＬ−１０として（Ｂａｒｒｅｔ Ｐｒｏｄｕｃｔｓから）市販品が入手可能なポリソルベート２０は大変効果的である。

２．ポリアルキル化されたアルカノール。ＩＣＩ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥから商標名ＢＲＩＪで入手可能な、ＨＬＢが少なくとも約１４である界面活性剤は、有用であることが実証されている。特に、ステアリルアルコールエトキシレートである、それぞれ２０及び１００モルのポリエチレンオキシドを持つＢＲＩＪ ７８及びＢＲＩＪ ７００は、有用であることが実証されている。また、ＢＡＳＦ Ｃｏｒｐ．，Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｄｉｖ．，Ｍｔ．Ｏｌｉｖｅ，ＮＪからＰＬＵＲＡＦＡＣ Ａ−３９の商標名で入手可能なｃｅｔｅａｒｅｔｈ ５５も有用である。

３．ポリアルキル化されたアルキルフェノール。この種類の有用な界面活性剤としては、ＢＡＳＦ Ｃｏｒｐ．，Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｄｉｖ．，Ｍｔ．Ｏｌｉｖｅ，ＮＪ及びＵｎｉｏｎ Ｃａｒｂｉｄｅ Ｃｏｒｐ．，Ｄａｎｂｕｒｙ，ＣＴから、それぞれ、ＩＣＯＮＯＬ及びＴＲＩＴＯＮの商標名で入手可能な、少なくとも約１４のＨＬＢ値を有するポリエトキシ化されたオクチルフェノール又はノニルフェノールが挙げられる。例としては、ＴＲＩＴＯＮ Ｘ１００（１５モルのエチレンオキシドを持つオクチルフェノール、Ｕｎｉｏｎ Ｃａｒｂｉｄｅ Ｃｏｒｐ．，Ｄａｎｂｕｒｙ，ＣＴから入手可能である）並びにＩＣＯＮＯＬ ＮＰ７０及びＮＰ４０（それぞれ、４０モル及び７０モルのエチレンオキシド単位を持つノニルフェノール、ＢＡＳＦ Ｃｏｒｐ．，Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｄｉｖ．，Ｍｔ．Ｏｌｉｖｅ，ＮＪから入手可能である）が挙げられる。これらの界面活性剤の硫酸化及びリン酸化された誘導体もまた有用である。かかる誘導体の例としては、ＲＨＯＤＡＰＥＸ ＣＯ−４３６の商標名でＲｈｏｄｉａ，Ｄａｙｔｏｎ，ＮＪから入手可能なアンモニウムノノキシノール−４−サルフェートが挙げられる。

４．ポロキサマー。エチレンオキシド（ＥＯ）及びプロピレンオキシド（ＰＯ）のブロック共重合体を主成分とする界面活性剤は、本発明の膜形成ポリマーの安定化に効果的であり、良好な濡れを提供することが示されている。ＨＬＢが少なくとも約１４、好適には少なくとも約１６である限り、ＥＯ−ＰＯ−ＥＯブロック及びＰＯ−ＥＯ−ＰＯブロックの両方とも良好に作用することが期待される。かかる界面活性剤はプルロニック及びＴＥＴＲＯＮＩＣの商標名でＢＡＳＦ Ｃｏｒｐ．，Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｄｉｖ．，Ｍｔ．Ｏｌｉｖｅ，ＮＪから市販品として入手可能である。ＢＡＳＦからのプルロニック界面活性剤が、上記に記載されているものとは異なる計算によるＨＬＢ値を報告していることに注意すべきである。かかる状況下では、ＢＡＳＦにより報告されているＨＬＢ値を使用すべきである。例えば、好適なプルロニック界面活性剤はＬ−６４及びＦ−１２７であり、それぞれ、１５及び２２のＨＬＢを有する。プルロニック界面活性剤は、本発明の組成物の安定化においてきわめて効果的であり、ヨウ素をきわめて有効な活性成分として含むが、それらはポビドンヨウ素を活性剤として用いる組成物の抗菌活性を減弱させる可能性がある。

５．ポリアルキル化されたエステル。エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロールなどのポリアルキル化されたグリコールは、部分的に又は完全にエステル化されることができ、即ち、１つ以上のアルコールが（Ｃ８〜Ｃ２２）アルキルカルボン酸によりエステル化され得る。少なくとも約１４、及び好適には少なくとも約１６のＨＬＢを持つ、かかるポリエトキシ化されたエステルは、本発明の組成物における使用に好適である。

６．アルキルポリグルコシド。米国特許第５，９５１，９９３号（Ｓｃｈｏｌｚ ｅｔ ａｌ．）の第９欄、４４行から記載されているようなアルキルポリグルコシドは、本発明の膜形成ポリマーに対して相溶性があり、ポリマー安定性に寄与できる。例としては、ｇｌｕｃｏｐｏｎ ４２５が挙げられ、これは、１０．３炭素の平均鎖長及び１〜４のグルコース単位を持つ（Ｃ８〜Ｃ１６）のアルキル鎖長を有する。

試料及び検体
特に対象となる細菌は、グラム陽性及びグラム陰性細菌を含む。特に関連性のある生物としては、腸内細菌科、若しくは球菌科又はブドウ球菌属の種、連鎖球菌種、シュードモナス種、腸球菌種、サルモネラ菌種、レジオネラ菌種、赤痢菌種、エルシニア菌種、エンテロバクター菌種、エシェリキア菌種、バシラス菌種、リステリア菌種、ビブリオ菌種、コリネバクテリウム種並びにヘルペスウイルス、アスペルギルス種、フザリウム種、及びカンジダ種が挙げられる。特に悪性の生物には、黄色ブドウ球菌（メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）などの耐性菌株を包含する）、表皮ブドウ球菌、肺炎球菌、ストレプトコッカス・アガラクチア、化膿レンサ球菌、エンテロコッカス・フィカリス、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌（ＶＲＳＡ）、バンコマイシン低度耐性黄色ブドウ球菌（ＶＩＳＡ）、炭疽菌、緑膿菌、大腸菌、クロコウジカビ、アスペルギルス・フミガータス、アスペルギルス・クラバタス、フザリウム・ソラニ、フザリウム・オキシスポラム、フザリウム・クラミドスポラム（F. chlamydosporum）、リステリア・モノサイトゲネス、リステリア・イバノビ、コレラ菌、腸炎ビブリオ、サルモネラ・コレラスイス、チフス菌、ネズミチフス菌、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・グラブラタ、カンジダ・クルセイ、エンテロバクター・サカザキ、大腸菌Ｏ１５７及び多剤耐性グラム陰性桿菌（ＭＤＲ）が挙げられる。

特に対象となるものは、黄色ブドウ球菌等のグラム陽性菌である。典型的には、これらは、細胞壁タンパク質などの、細菌の細胞壁成分の特性の存在を検出することにより検出できる。また、特に対象となるものは、ＭＲＳＡ、ＶＲＳＡ、ＶＩＳＡ、ＶＲＥ、及びＭＤＲなどの抗生物質耐性菌である。典型的には、これらは、抗生物質耐性の原因となる、膜タンパク質、輸送タンパク質、酵素などのような細胞内構成要素の存在を追加的に検出することにより検出することができる。

対象となる種は、例えば、血液、唾液、眼水晶体液、滑液、脳脊髄液、膿、汗、滲出液、尿、粘液などの生理液、粘膜組織（例えば、口腔、歯肉、鼻腔、眼、気管、気管支、消化管、直腸、尿道、尿管、膣、子宮頚部、及び子宮内膜の）及び泌乳などの多種多様なソース由来の試験試料内で分析される。更に、試験試料は、例えば、傷、皮膚、鼻孔、鼻咽頭腔、鼻腔、前鼻腔、前庭、頭皮、爪、外耳、中耳、口、直腸、膣、又は他の同様の部位などの身体の部位由来でもある。生理学的な流体以外に、他の試験試料としては、他の液体並びに液体媒質に溶解された固体（単数又は複数）を挙げることができる。対象となる試料としては、製造過程の流水、水、土壌、植物又は他の植物、空気、（例えば、汚染された）表面などが挙げられる。

当該技術は、黄色ブドウ球菌等の細菌の検出のための様々な患者のサンプリング技法を記載する。このような試料採取技術は、本発明の方法にも同様に好適である。例えば、無菌の綿棒での拭き取り又はサンプリングデバイスにより、患者の鼻孔、例えば、患者の前鼻孔を拭き取って試料を得ることは一般的である。例えば、乾燥した又は適切な溶液で予め湿潤させておいた綿棒を被験者の鼻孔の前端の中に挿入し、綿棒を粘膜表面に沿って２回完全に周回させることにより、試料採取を実行することができる。

多種多様な綿棒又は他の試料収集器具が、例えば、商品表記ＰＵＲＥ−ＷＲＡＰＳとしてＰｕｒｉｔａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｏ．ＬＬＣ，Ｇｕｉｌｆｏｒｄ，ＭＥ、又は商品表記マイクロレオロジックス・ナイロン・フロック綿棒（microRheologics nylon flocked swab）、イースワブ・コレクション（ESwab Collection）及びトランスポート・システム（Transport System）としてＣｏｐａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｕｒｒｉｅｔｔａ，ＣＡから市販されている。所望であれば、例えば、米国特許第５，８７９，６３５号（Ｎａｓｏｎ）に開示されているような試料収集手段も用い得る。綿棒は、綿、レーヨン、アルギン酸カルシウム、ダクロン、ポリエステル、ナイロン、ポリウレタンなどを包含する様々な物質からなることができる。

特定の実施形態では、物質の試料は、通常は、例えば、水、生理食塩水、ｐＨ緩衝された溶液、若しくは任意の他の溶液、又は検体若しくは試料を試料収集器具から溶出する溶液の組み合わせなどの緩衝溶液を用いて、試料収集器具から溶出（又は「放出」若しくは「洗浄」）される。溶出緩衝液の例としては、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられ、これは、例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐ．から入手できるＴＷＥＥＮ ２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート）又はプルロニックＬ６４（ＢＡＳＦ Ｃｏｒｐ．から入手できるポリ（オキシエチレン−コ−オキシプロピレン）ブロック共重合体）と組み合わせて用いることができる。他の抽出溶液は、試料採取場所から試料分析場所への輸送の間、標本安定性を維持するように機能する。これらの種類の抽出溶液の例には、エイミーによる（Amies’）及びスチュアートによる（Stuart’s）輸送媒体が挙げられる。

試験試料（例えば、液体）は、粘稠流体の希釈などの前処理を行なってよい。試験試料（例えば、液体）は、試料ポートに注入する前に、濃縮、濾過、蒸留、透析、希釈、天然成分の不活性化、試薬の添加、化学処理などの他の処理方法にかけることができる。

即ち、試験試料は、当業者に周知の多種多様な手段を使用して調製することができる。例えば、試料は、物理的方法（例えば、超音波処理、圧縮、煮沸又は他の加熱方法、ガラスビーズでの撹拌等）を使用して対象となる特定の細菌に特徴的な検体の分析が可能となるように分離させることができる。あるいは、試料を分離させて、１種以上の構成成分を包含することができる様々な化学試薬を使用し、特定の対象となる微生物に特徴的である検体の分析に利用できるようにすることができる。

本発明の方法は、個別の分子（例えば、黄色ブドウ球菌の分析のためのプロテインＡ及びクランピングファクター等の分子）又は同じ分子（例えば、タンパク質）の２つの異なるエピトープについて試料を分析するために使用することができる。このような検体には、例えば、プロテインＡなどの細胞壁タンパク質、並びにフィブリノーゲン結合タンパク質（例えば、クランピングファクター）、フィブロネクチン結合タンパク質、コラーゲン結合タンパク質、ヘパリン関連多糖結合タンパク質などの微生物表面構成要素認識接着性マトリックス分子（ＭＳＣＲＡＭＭ）が挙げられる。プロテインＡ、並びにフィブリノゲン結合因子及びクランピングファクターＡ、Ｂ、及びＥｆｂ等のクランピングファクターもまた、黄色ブドウ球菌の存在を検出する方法に特に有用である。他の対象となる細胞壁構成要素としては、莢膜多糖類及び細胞壁炭水化物（例えば、テイコ酸及びリポテイコ酸）が挙げられる。

必要な場合に、本発明の方法は、対象となる検体として、細胞膜に関連する又は関連しない細胞内成分について試料を分析する工程を更に含むことができる。細胞内構成要素は、ＭＲＳＡ、ＶＲＳＡ、ＶＩＳＡ、ＶＲＥ、及びＭＤＲなどの抗生物質耐性微生物を分析するのに特に有用である。このような微生物に特徴的であることができる細胞内構成要素には、膜タンパク質が挙げられる。このような膜タンパク質の例には、原形質膜タンパク質、外膜タンパク質、及び細胞膜タンパク質が挙げられる。ペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）（例えば、ＰＢＰ２’又はＰＢＰ２ａ）などの細胞質膜タンパク質は、特に抗生物質耐性菌に特徴的であることができる。例えば、細胞質膜タンパク質ＰＢＰ２’は、ＭＲＳＡに特徴的である。

したがって、本発明の方法を用いる分析には全細胞が好適であるが、特定の実施形態では、本発明の方法は試験試料中に溶解した細胞を含む。本発明の方法では、溶菌は、細胞を溶解剤と接触させる工程又は物理的に細胞を溶解する工程を含む。溶菌は、例えば、５℃〜４２℃（おそらく５０℃の高さ）の温度、好適には１５℃〜２５℃の温度などの従来の条件下で行うことができる。

溶菌は、細胞を物理的に溶解して実施できる。物理的溶菌は、ガラスビーズで試験試料を撹拌する、超音波処理する、加熱及び煮沸する、又は例えば、フレンチプレス（French press）を使用することによって行われるような、試験試料を高圧さらすことによって、行える。

溶菌は、溶解剤を使用して実施できる。好適な溶菌剤としては、例えば、酵素（例えば、プロテアーゼ、グリコシダーゼ、ヌクレアーゼ）が挙げられる。代表的な酵素には、リソスタフィン、ペプシン、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、リゾチーム、アクロモペプチダーゼ、エンドペプチダーゼ、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニンアミダーゼ、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、ＡＬＥ−１、ＤＮａｓｅ、及びＲＮａｓｅが挙げられる。所望される場合には、様々な組み合わせの酵素を使用することができる。リゾスタフィンは、黄色ブドウ球菌の存在を検出する方法において特に有用である。

他の溶菌剤には、塩（例えば、カオトロピック塩）、可溶化剤（例えば、洗剤）、還元剤（例えば、β−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリトリトール（ＤＴＥ）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸（ＴＣＥＰ；Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）、システイン、ｎ−アセチルシステイン）、酸（例えば、ＨＣｌ）、及び塩基（例えば、ＮａＯＨ）が挙げられる。このような溶菌剤は、他に対してよりも特定の生物に対して好適となることがあり、例えば、これらは、グラム陽性細菌と共に使用するよりも、グラム陰性細菌と共に使用するのに好適であることができる。

所望の場合、かかる溶菌剤の様々な組み合わせを用い得る。

溶菌の方法は更に米国特許出願公開第２００５／０１５３３７０号において議論されている。特に、かかる溶菌の方法は対象となる細菌に特徴的である細胞壁の１つ以上の成分の検出、及び任意に、更に対象となる種に特徴的な１つ以上の細胞内成分（例えば、対象となる抗生物質抵抗性細菌）の検出を含む。分析された細胞壁フラグメントは、細胞壁の固体片であると考えられている。つまり、それらは溶解しても可溶化されず、細胞壁は単にフラグメントに破壊されると考えられている。更に、分析される細胞壁成分は、まだ細胞壁フラグメントの１部分である（即ち、細胞壁中又は細胞壁の上にある）。つまり、それらは溶菌によって可溶化されていない。有意に、これは、溶解されていない細胞の同じ成分と比較すると、細胞壁成分の信号を強化する。

Ｓ．ａｕｒｅｕｓが存在する場合に、その１例は、試験試料中の溶解された細胞について、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに特徴的であり、バイオセンサー上に固定されたプロテインＡ特異的抗体によりプロテインＡを分析することである。加えて、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ細菌などの溶解された細胞は、細胞内部から（細胞の細胞壁部分とは対照的に）タンパク質マーカーを放出する。かかるタンパク質マーカーは抗体などのプローブにより検出できる。

加えて、所望されると共に試料が粘液含有試料である場合には、試料は溶解の前又は後のいずれかで、粘液溶解剤を包含することができる少なくとも１種の試薬で、更に処理することができる。粘液溶解剤での粘液含有試料の処理は、分析の間の粘液の存在から生じる妨害を減少できる。

粘液溶解剤の例としては、酵素（例えば、ペプシン、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、グリコシダーゼ）、塩（例えば、カオトロピック塩）、安定剤（例えば、界面活性剤、洗剤）、還元剤（例えば、β−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリトリトール（ＤＴＥ）、システイン、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ；Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）、ｎ−アセチルシステイン）、及び酸（例えば、ＨＣｌ）が挙げられる。所望される場合には、このような溶解剤の様々な組み合わせを、使用することができる。例えば、全ての溶解剤が粘液溶解剤であるわけではないが、溶菌剤と粘液溶解剤との間には重複が存在可能であることが、当業者には理解される。

ある実施形態において、試料が粘液含有試料であり、粘液溶解剤が還元剤である場合に、還元剤は酸性化（例えば、ｐＨ３未満を有する）することができる。還元剤は、無機酸（例えば、ＨＣｌ）又は有機酸（例えば、乳酸、クエン酸）などの様々な酸を使用して酸性化することができる。あるいは、十分に高濃度で使用される場合には、還元剤のｐＨは、酸で調整される必要はない。また、別の方法としては、単独の酸（例えば、ＨＣｌ）を粘液溶解剤として使用することができる。

特定の実施形態では、粘膜試料及び酵素性溶解剤が、細胞の溶解及び少なくともいくらかの細胞の抗原構成要素の放出を可能にするのに十分な時間にわたってインキュベートされ、続いて、試料及び酵素性溶解剤が、酵素性溶解剤とは別個である粘液溶解剤と組み合わせられる。

典型的には、しかしながら所望により、還元剤を添加した後、試料調製は組成物中の還元剤の不活性化を含む。用語「不活性化する（inactivate）」又は「不活性化（inactivating）」又は「不活性化（inactivation）」は、試薬の活性を止めること、又は反応を止めること、例えば、多種多様な機構、例えばブロッキング、希釈、阻害、変性、拮抗などにより生じることができるものを指す。

不活性化は、例えば、拮抗性基質（例えば、ｎ−アセチルシステインに対してウシ血清アルブミン）を提供することによって行うことができる。還元剤を不活性化する試薬の他の例には、中和緩衝液を含む、希釈剤が挙げられる。中和緩衝液の代表的成分としては、例えば、緩衝剤（単数又は複数）（例えば、リン酸）、塩（単数又は複数）（例えば、ＮａＣｌ）、タンパク質安定剤（単数又は複数）（例えば、ＢＳＡ、カゼイン、血清）ポリマー（単数又は複数）、単糖類、及び／又は洗剤（単数又は複数）若しくは界面活性剤（単数又は複数）（例えば、１つ以上の以下の商標名及び一般的で入手可能な販売者により一覧される化学物質：ＮＩＮＡＴＥ ４１１（アミンのアルキルベンゼンスルホン酸塩、Ｓｔｅｐａｎ Ｃｏ．，Ｎｏｒｔｈｆｉｅｌｄ，ＩＬから入手可能）、ＺＯＮＹＬ ＦＳＮ １００（ポリエチレングリコールを含むＴｅｌｏｍｅｒ Ｂモノエーテル、Ｅ．Ｉ．ＤｕＰｏｎｔ ｄｅ Ｎｅｍｏｕｒｓ Ｃｏ．から入手可能）、Ａｅｒｏｓｏｌ ＯＴ ｌ００％（ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム塩、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｙａｎａｍｉｄｅ Ｃｏ．から入手可能）、ＧＥＲＯＰＯＮ Ｔ−７７（Ｎ−オレイル−Ｎ−メチルタウリン酸ナトリウム塩、Ｒｈｏｄｉａ Ｎｏｖａｃａｒｅから入手可能）、ＢＩＯ−ＴＥＲＧＥ ＡＳ−４０（オレフィン（Ｃ_１４〜Ｃ_１６）スルホン酸ナトリウム、Ｓｔｅｐａｎ Ｃｏ．から入手可能）、ＳＴＡＮＤＡＰＯＬ ＥＳ−１（ナトリウムポリオキシエチレン（１）ラウリルサルフェート、Ｃｏｇｎｉｓ Ｃｏｒｐ．，Ａｍｂｌｅｒ，ＰＡから入手可能）、ＴＥＴＲＯＮＩＣ １３０７（エチレンジアミンアルコキシレートブロック共重合体、ＢＡＳＦ Ｃｏｒｐ．から入手可能）、ＳＵＲＦＹＮＯＬ ４６５、４８５、及び１０４ ＰＧ−５０（全てＡｉｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から入手可能）、ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ２１０（オクチルフェノールエトキシレート、Ｓｔｅｐａｎ Ｃｏ．から入手可能）、ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−４５、Ｘ−１００、及びＸ−３０５（オクチルフェノキシポリエトキシエタノール、全てＤｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．から入手可能）、ＳＩＬＷＥＴ Ｌ−７６００（ポリジメチルシロキサンメチルエトキシレート、Ｍｏｍｅｎｔｉｖｅ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｉｌｔｏｎ，ＣＴから入手可能）、ＲＨＯＤＡＳＵＲＦ ＯＮ−８７０（ポリエトキシ化された（２）オレイルアルコール、Ｒｈｏｄｉａ Ｎｏｖａｃａｒｅから入手可能）、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ ＥＬ（ポリエチルオキシ化されたヒマシ油、ＢＡＳＦ Ｃｏｒｐ．から入手可能）、ＴＷＥＥＮ ２０及びＴＷＥＥＮ ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート及びモノオレエート、両方ともＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐ．から入手可能）、ＢＲＩＪ ３５（ポリオキシエチレン（２３）ドデシルエーテル、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐ．から入手可能）、ＣＨＥＭＡＬ ＬＡ−９（ポリオキシエチレン（９）ラウリルアルコール、ＰＣＣ Ｃｈｅｍａｘ，Ｐｉｅｄｍｏｎｔ，ＳＣから入手可能）、プルロニックＬ６４（ポリ（オキシエチレン−コ−オキシプロピレン）ブロック共重合体、ＢＡＳＦ Ｃｏｒｐ．から入手可能）、界面活性剤１０Ｇ（ｐ−ノニルフェノキシポリ（グリシドール）、Ａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴから入手可能）、ＳＰＡＮ ６０（ソルビタンモノステアレート、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐ．から入手可能）、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ ＥＬ（ポリエトキシ化されたヒマシ油、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐ．から入手可能）を挙げることができる。所望される場合には、中和緩衝液は試料のｐＨを調整するためにも使用することができる。

還元剤に加えて、又は代えて、粘液含有試料の試料調製は、１種以上の界面活性剤又は洗剤の使用（例えば、試料及び酵素性溶解剤を粘液溶解剤と組み合わせることに続いて、又はそれと同時に）を包含できる。好適な界面活性剤は、非イオン性、アニオン性、カチオン性、又は両性であることができる。好適な例には、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）及びラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）が挙げられる。必要に応じて、様々な界面活性剤の組み合わせを使用することができる。

所望により、試料調製方法は、続けて界面活性剤を不活性化することを包含できる。これは、例えば、拮抗性基質を提供することにより行うことができる。界面活性剤を不活性化するための他の例は、粘液溶解剤試験試料及び界面活性剤のｐＨを、少なくともｐＨ５に調整するのに十分な緩衝液のような、試薬中和緩衝液を使用することを含む。好適には、緩衝液は、ｐＨを８以下に調整するのに十分である。

更に、試料調製試薬の１種以上が酸性である場合、対象となる検体を包含する生成組成物は、好適にはｐＨ７〜７．５又は７．２付近に中和される。これを、例えば、緩衝液及び／又は希釈剤を提供することによって行うことができる。

特に対象となる他の試料の種類には、外傷滲出物、尿、及び培養血液が挙げられる。外傷滲出物試料は、綿棒又は同様に設計された試料採取装置を使用して、生理食塩水洗浄を用いて清浄化された外傷に接触することにより、典型的には採取される。綿棒試料は、抽出溶液に溶出することができる。このような抽出物（即ち、溶出）溶液は、典型的には水を包含し、所望により緩衝液及び少なくとも１種の界面活性剤を包含できる。溶出緩衝液の例には、例えば、ＴＷＥＥＮ２０又はプルロニックＬ−６４を有する、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。他の抽出溶液は、試料採取場所から試料分析場所への輸送の間、標本安定性を維持するように機能する。これらの種類の抽出溶液の例には、エイミーによる（Amies’）及びスチュアートによる（Stuart’s）輸送媒体が挙げられる。

溶出された滲出液の試験試料は、１μｍを超える大きさの細胞及び他の非細菌成分（即ち赤血球及び白血球、皮膚細胞、肉眼的な破片）を除くために試験の前に濾過されることができる。試料は、本明細書に記載される試験のために、この点において準備されていてよい。溶出された外傷滲出物試験試料を調製する他の手段には、懸濁液中に細菌を維持したまま妨害タンパク質の沈殿を促進するために凝集剤を添加することが包含されてよい。可能な別の試料処理には、細菌細胞に影響を与えることなく真核細胞を溶解する、示差（differential）溶解剤の使用が挙げられる。かかる物質による溶解は、細菌の細胞を捕捉及び単離する一方で、溶解された成分を洗い流して除去するための、１μｍ未満の細孔寸法を持つ膜による濾過を可能とする。フィルター上に捕捉された細菌細胞は、次に、綿棒からの元の試料の溶出に関して記載されたものと同様に、溶出緩衝液を使用してこのフィルターから溶出することが可能である。

物理的方法もまた、外傷滲出物試料を調製するのに有用であることがある。例えば、遠心分離が、上清中に標的細菌を維持したままで、微生物よりも大きなサイズの妨害試料構成要素を分離するために使用されてよい。これらの試料処理方法は、当業者には周知である。

尿試料は、わずかに異なるやり方で処理することが可能である。まず、試料は、綿棒よりもむしろ流体処理システムを使用して収集されてよい。このように、綿棒試料に関して記載されたような溶出は必ずしも必要とされない。しかしながら、上述のような、濾過、凝集、示差溶解、及び遠心分離を包含するその後の試料処理は、目的の細菌から妨害試料構成要素を粗分離するのに有用であり得る。

培養血液試料は、尿試料に類似したやり方で処理することが可能である。例えば、遠心分離は、細菌性内容物検出において、対象である構成要素である血漿から赤血球及び白血球を分離するのに使用される一般的な方法である。

検出の方法
本発明に従う１つ以上の検体の分析方法は、直接的及び間接的方法を含む。好適な方法は、間接的検出を含む。

１実施形態では、上述の比色分析センサーの使用は、比色分析センサーの色の変化の検出のための直接的な吸収測定を提供するか、又は裸眼による目視の観察を提供する。いくつかの場合には、プローブが、センサーと直接相互作用する検体との複合体を形成し、比色分析応答が検体の濃度に直接比例する直接試験を生み出す。

代替的な実施形態では、ポリジアセチレン集合体に組み込まれた受容体及び検体の両方に対する結合親和性によりプローブを選択することにより、本発明は検体の検出のための間接的な方法を提供する。選択されたプローブは、検体に対する拮抗的親和性を示す。対象となる検体が存在する場合、プローブはポリジアセチレン骨格上の受容体よりも、むしろ検体に結合し、検体濃度に反比例する色の変化を生じる。検体が存在しない場合は、プローブは、ポリジアセチレン骨格に組み込まれた受容体に結合する。検体がセンサーに接触した後に、プローブはセンサーに接触するか、又は混合物がセンサーに接触する前にプローブは検体と混合される。

間接的な検出試験の１実施形態では、プローブと標的検体は緩衝液中での相互作用を可能とされ、続いてセンサーと接触させられる。緩衝液中の遊離のプローブ濃度は、存在する標的検体の量に依存し、検体濃度が高いほど残存するプローブ濃度は低くなる。センサーの比色分析応答は利用可能な遊離プローブ量に依存するため、比色分析応答は検体濃度に反比例する。

間接試験の特に好適な実施形態では、センサー成分は、グラム陰性又は陽性の細菌を検出するためにポリミキシンＢ硫酸塩プローブ又は他の試薬と結合するように構成されたポリジアセチレンリポソームを含む。細菌と結合させるために、穏やかに撹拌しながら、ポリミキシンＢ硫酸塩プローブは、試験試料と混合される。ポリジアセチレンリポソームは、間接的に試験試料の細菌量を測定するために、非結合のポリミキシンを検出するために用いられる。非結合のポリミキシンとポリジアセチレンリポソームとの間の結合によって、ポリジアセチレンセンサー成分は色の変化を受け、色の変化は試験試料中の細菌濃度に間接的に比例する。

１実施形態では、本発明の方法は、緩衝液組成中に検体を含む試験試料を提供すること、緩衝液組成中のプローブを提供すること、試験試料及びプローブを組み合わせることを含み、プローブは受容体に対するよりも、検体に対してより大きな結合親和性を有し、かつバイオセンサーの変化を検出する。

いくつかの試験では、フラグメント化によるか、さもなければ検体標的の溶解によって、プローブはその場で生成され得るであろう。プローブはまた、センサーとの直接相互作用に利用できる、生体の細胞壁外に存在するタンパク質又はタンパク質のフラグメントとして見なされることもできる。プローブと検体との間の相互作用は、リポソームとの相互作用を排除することにより機能できる。代替的に、プローブは、検体と相互作用して複合体を形成し、生成する複合体はリポソームと相互作用する。プローブは、溶液中又は被覆された基板上でセンサーと接触できる。

このように、試験試料及びプローブは様々な好適な様式で組み合わされ得る。１態様では、プローブはセンサーに提供され、試験試料は比色分析センサーに任意の順序で別個の部分として提供される。例えば、表面がポリミキシンを含む溶液により被覆され、任意に乾燥される。別の態様では、試験試料及びプローブは混合物として組み合わされ、混合物が比色分析センサーに提供される。好適な実施形態では、プローブは検体を含む試験試料と比色分析センサーに接触する前に相互作用する。

間接的な検出方法を用いて、使用されるプローブ濃度に基づいて、低濃度の検出をもたらす高い感度が可能である。検出戦略に関して、プローブ濃度は、所望の検出濃度レベルに対応するように選択できる。プローブを用いる間接的検出方法は、所定の適用における所望の感度のためのプローブの種類及び濃度についてのシステムの設計を可能にする。このことは、トランスデューサーが複数の対象となる検体について汎用性になることを可能にする。例えば、トランスデューサーと接触するプローブを、プローブの検体に対する親和性に従って変えることで、単一のトランスデューサー（ポリジアセチレン／受容体の組み合わせ）が複数の検体を検出できる可能性がある。

特定の実施形態では、比色分析センサーは、単一バイアル系の溶液又は懸濁物中に設けられることができ、検体は、対象となる検体に対して特異的なトランスデューサーを含む溶液を含むバイアルに直接加えられることができる。代替的に、このシステムは、それぞれのバイアルが異なる検体に対して特異的な受容体を組み込んだポリジアセチレン集合体を含むトランスデューサーを含む複数のバイアルをキットとして含むことができる。

検体を直接ポリジアセチレントランスデューサーに加えられない応用においては、２つの部分のバイアルのシステムを用い得るであろう。バイアルの１つの区画は、ポリジアセチレン集合体から形成されるトランスデューサーを含む第２の区画から物理的に分離されていて、検体の試料調製物のための試薬を含むことができる。いったん試料調製が完了すると、検出のために検体をトランスデューサーと混合するために区画を分離する物理的障壁は除かれる。

代替的に、２次元の基板上に被覆された比色分析センサーとの接触の前に、キットはまた、試薬貯蔵のためと、検体の混合のためのバイアルを含むこともできる。１実施形態では、基板上に被覆された本発明のトランスデューサーを収納するキャップシステムを持つ試薬貯蔵及び検体調製のためのバイアルを含むことができる。

次いで、比色分析センサーの溶液又は懸濁物を、基板に滴下し、液体の担体（例えば、水）を蒸発させることにより固体基板上に被覆することができる。好適な基板としては、原子的に平坦なシリコン（１１１）ウエハーにエバポレートされた金、原子的に平坦なシリコン（１１１）ウエハー、又は平坦なガラスなどの高度に平坦な基板を挙げることができ、これらは裸であり、それらの表面エネルギーを体系的な様式で変更するために自己集合単層（ＳＡＭ）により修飾されているか、又は高度にテキスチャ化された、紙の基板、ポリマー性インク受容性被覆、構造化されたポリマー性膜、微細孔膜、及び膜物質を含むトポグラフィーを有する基板を挙げることができる。

代替的に、ポリジアセチレン集合体を封入して、被覆された膜を得るために、比色分析センサーの溶液又は懸濁物は適切な孔寸法を持つ膜を通して押し出すことができ、この膜はその後に乾燥される。適切な膜は、一般的に２００ｎｍ以下の孔寸法を持つ、ポリカーボネート、ナイロン、ＰＴＦＥ、ポリエチレン（他のものを挙げることもできる）などの物質を含むものである。

これらの基板はジアセチレン集合体の重合懸濁物により被覆されるか、又は懸濁物は非重合形態で被覆され、引き続いて被覆状態で重合されることができる。センサーの被覆重量は、通常はセンサーの感度に影響する。理想的には、被覆重量は、検体との結合及び妥当な時間内で検知できる変化を生じるために設計されるべきである。また好適には、例えば、試験試料をセンサー成分に均一に暴露させるために、被覆重量は基板上の全域で均一であるべきである。

例えば、テープ又はラベルの形態を含む、様々な形態の比色分析センサーを用いることができる。例えば、米国特許出願公開第２００４／１３２２１７号を参照されたい。

特定の実施形態では、細菌又は他の検体の存在の多面的な決定を提供するために、本発明の比色分析センサーは、他の周知の診断的方法を組み合わせることができる。

本発明は、以下に記載される特定の実施例に限定されると考えられるべきではなく、むしろ添付の請求項に適正に明示されるように、本発明の全ての態様を保護するものであると理解されるべきである。様々な修正、同等の方法、及び、本発明を適用可能である多くの構造は、本発明が対象となる技術分野の当業者が本発明の明細書を検討することにより、容易に明らかになるであろう。実施例中、及び残りの明細書中の、全ての分率、パーセンテージ、比率などは、特に指示がないかぎりモルによるものである。供給者の名前が挙げられていない全ての溶媒及び試薬はＡｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩから購入した。水はＵ−Ｖ Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水精製器（water purifier）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を使用して、１８．２Ｍオーム／ｃｍの抵抗率で精製した。

ポリジアセチレンインジケーターからの比色分析応答は色相角（hue angle）（ｈ°）の測定により特性化した。ｈ°の値は０°〜３６０°の範囲にわたり、本質的に所定の色のＲＧＢ（赤、緑、青）値を測定している。純粋な赤色は０°のｈ°値に相当し、純粋な緑色は１２０°のｈ°値に相当し、及び純粋な青色は２４０°のｈ°値に相当する。色相環は連続的であり、したがって３６０°〜０°（両方の値とも純粋な赤色に相当する）の間に不連続はない。平均では、好適なポリジアセチレンインジケーターのダイナミックレンジは、約２６０°（青相）〜約３６０°（赤相）の色相角の区間に及ぶ。ｈ°値は、市販の分光光度計（Ｗｉｌｋｅｎｓ−ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｃｏ．，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬから入手可能なＡｖａｎｔｅｓ ＡｖａＳｐｅｃ−２０４８−ＳＰＵ２−ＳＤ２５６）を用いた色の直接測定により決定された。

調製実施例１−抗体により機能化された磁性ビーズの調製
マウス抗プロテインＡモノクローナル抗体、ＭＡｂ−１０７は、２００６年１１月２２日に出願された、米国特許出願第１１／５６２，７４７号、及びＰＣＴ出願第ＵＳ２００７／０８４，７３９号に記載されており、両出願とも「ＡＮＴＩＢＯＤＹ ＷＩＴＨ ＰＲＯＴＥＩＮ Ａ ＳＥＬＥＣＴＩＶＩＴＹ」と題されている。

Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ用抗体（カタログ番号Ｊ−２６０８００−０１ ロット００１６Ｎ２Ｂ−８及び００１Ｉ６ＯＦＱ−ウサギ抗Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ抗体）はＥｄｇｅｗｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｅｄｇｅｗｏｏｄ，Ｍａｒｙｌａｎｄから入手した。

すべての抗体調製物は、製造業者の使用法に従って、ＰｉｅｒｃｅからのＥＺ−リンクＮＨＳ−ＰＥ０４−ビオチン（製品番号２１３３０）を用いてビオチン化された。ストレプトアビジン被覆磁性粒子（１μｍ Ｄｙｎａｌ Ｔ１）はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡから入手した。すべての反応及び洗浄は、他に規定されない限り、ＰＢＳ Ｌ−６４緩衝液（０．２％ｗ／ｖプルロニックＬ６４を有するリン酸緩衝生理食塩水）中で実施された。洗浄工程は、他に規定されない限り、３回の連続洗浄を含んだ。洗浄プロセスは、磁石に近位の管側に、粒子を引き込むための管に隣接して磁石を設置する工程と、隣接した磁石で管から液体を除去する工程と、除去された液体を交換するために等量の新しい緩衝液を添加する工程からなる。再懸濁及び粒子の混合を可能にするために磁石が除去される。

２．５ミリグラム毎ミリリットル（ｍｇ／ｍＬ）の濃度のストレプトアビジン被覆磁性粒子を５００マイクロリットル（μＬ）のＰＢＳ Ｌ−６４緩衝液中のビオチン化された抗体調製物と混合した。抗体を結合するための粒子に対する質量比は４０μｇ抗体／ｍｇ粒子であった。得られる混合物を３７℃で１時間（ｈｒ）インキュベートした。続いて、粒子を、ＰＢＳ Ｌ−６４緩衝液中で洗浄し、結合しなかった抗体を除去した。最終洗浄後、粒子を２．５ｍｇ／ｍＬの粒子濃度で再懸濁した。

調製実施例２−Ｓ．ａｕｒｅｕｓ細菌懸濁物の調製
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ細菌は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（The American Type Culture Collection）（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から、商標名ＡＴＣＣ ２５９２３のものを入手した。細菌は、５〜１０ミリリットルの調製された無菌トリプティック・ソイ培地（Tryptic Soy Broth）（Ｈａｒｄｙ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｓａｎｔａ Ｍａｒｉａ，ＣＡ）に細菌を接種して調製したブロス中で１夜（１７〜２２時間、３７℃において）ブロス培養された。培養物は、遠心分離（エッペンドルフモデル番号５８０４Ｒ遠心分離機（Ｂｒｉｎｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）で８，０００〜１０，０００ｒｐｍで１５分間）により洗浄され、ＰＢＳ Ｌ６４緩衝液に再懸濁され、この溶液により遠心分離により追加の３サイクル洗浄された。

調製実施例３−表皮ブドウ球菌（S.epidermidis）細菌懸濁物の調製
Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ細菌は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（The American Type Culture Collection）（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から、商標名ＡＴＣＣ １２２２８のものを入手した。細菌は、５〜１０ミリリットルの調製された無菌トリプティック・ソイ培地（Tryptic Soy Broth）（Ｈａｒｄｙ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｓａｎｔａ Ｍａｒｉａ，ＣＡ）に細菌を接種して調製したブロス中で１夜（１７〜２２時間、３７℃において）ブロス培養された。培養物は、遠心分離（エッペンドルフモデル番号５８０４Ｒ遠心分離機（Ｂｒｉｎｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）で８，０００〜１０，０００ｒｐｍで１５分間）により洗浄され、ＰＢＳ Ｌ６４緩衝液に再懸濁され、この溶液により遠心分離により追加の３サイクル洗浄された。

調製実施例４−バチルス・チューリンゲンシス（B.thuringiesis）胞子懸濁物の調製
Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ細菌は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（The American Type Culture Collection）（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から、商標名ＡＴＣＣ １０７９２のものを入手した。細菌は、最初にニュートリエント寒天培地プレート上に筋状に接種して１晩３７℃で培養した。胞子を発生させるために、３〜５個の分離したコロニーの縁からの物質を１０ｍＬのシェファーの（Shaeffers’）胞子形成培地に接種した。細胞を完全に懸濁するためにボルテックスを用いた。懸濁物を撹拌下に３７℃で１８時間インキュベートした。ほとんどの細胞が胞子を含み、顕著な数の細胞に溶解が起こる前に、細菌を収穫した。胞子は、４℃で１５，０００×ｇ、３０分間の遠心分離（エッペンドルフモデル番号５８０４Ｒ遠心分離機（Ｂｒｉｎｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）により収集され、３５ｍＬの冷（４℃）蒸留水中に懸濁された。次いで胞子は、４℃で６，０００×ｇ、１０分間遠心分離され、及び冷（４℃）蒸留水中で４回洗浄された。冷水による洗浄に続き、胞子をもう１回、４℃で、６、０００×ｇ、１０分間遠心分離し、１０ｍＬの冷（４℃）１Ｍ ＫＨＰＯ_４緩衝液（ｐＨ７．１）に懸濁した。次いで４℃での１，５００×ｇ、２分間の遠心分離により増殖性細胞及び破片を除くため、胞子を１２ｍＬの１Ｍ ＫＨＰＯ_４緩衝液（ｐＨ７．１）溶液中の冷（４℃）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に移した。上部ＰＥＧ層内の胞子を除き、追加の５ｍＬのＰＥＧによる抽出を合計７回行った。ＰＥＧにより精製された胞子は、４℃での１２，０００×ｇ、１５分間の遠心分離により収集され、３５ｍＬの冷（４℃）蒸留水により７回洗浄した。精製された胞子調製物は４℃でＨＰＬＣグレードのＨ_２Ｏ中に保存された。

調製実施例５−ＨＥＰＥＳ緩衝液の調製
Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液は、１．３０グラム（ｇ）のＨＥＰＥＳナトリウム塩（Ｆ．Ｗ．（２６０．２９）、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩから入手可能）を１Ｌの水に溶解して調製した。これは、５ｍＭの緩衝塩濃度をもたらす。次いで、ｐＨが７．２になるまで、この緩衝溶液に塩酸又は酢酸（両方ともＡｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩから入手可能）のどちらかを滴下した。

調製実施例６−プルロニックＬ６４緩衝液を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ−Ｌ６４緩衝液）の調製
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液は１０ｘ ＰＢＳ濃縮液（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から市販品として入手可能）を１０倍に希釈して調製した。これにより以下の塩組成のＰＢＳ緩衝溶液が得られた：１０ｍＭリン酸ナトリウム、１３７ｍＭ塩化ナトリウム、２．７ｍＭ塩化カリウム。このＰＢＳ緩衝溶液は、２５℃で７．５のｐＨを示す。プルロニックＬ６４溶液を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ−Ｌ６４緩衝溶液）を調製するために、０．２％（ｗ／ｖ）のプルロニックＬ６４界面活性剤（ＢＡＳＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｏｕｎｔ Ｏｌｉｖｅ，ＮＪから入手可能）をＰＢＳ緩衝溶液に加えた。ＰＢＳ−Ｌ６４緩衝溶液は、２５℃で７．５のｐＨを示す。

調製実施例７−ポリミキシンＢ硫酸塩溶液の調製
ポリミキシンＢ硫酸塩（ＰｍＢ、式量（Ｆ．Ｗ．）１３８５、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから入手可能）のストック溶液は、７．２１ｍｇのＰｍＢを１０ｍＬのＨＥＰＥＳ緩衝（調製実施例５において調製されたもの）に加えて、完全なペプチドの溶解が達成されるまで撹拌することにより調製した。これにより、５２０ｎｍｏｌ／ｍＬの最終的なポリミキシンＢ硫酸塩溶液濃度が得られる。

調製実施例８−ポリジアセチレンリポソーム懸濁物の調製
ジアセチレン、ＨＯ（Ｏ）Ｃ（ＣＨ_２）_２Ｃ（Ｏ）Ｏ（ＣＨ_２）_４Ｃ≡Ｃ−Ｃ≡Ｃ（ＣＨ_２）_４Ｏ（Ｏ）Ｃ（ＣＨ_２）_１２ＣＨ_３、は米国特許出願公開第２００４／０１３２２１７号の実施例６に記載されている方法に従って調製された。基本的な操作は、５，７−ドデカジイン−１，１２−ジオール（ＨＯ（ＣＨ_２）_４Ｃ≡Ｃ−Ｃ≡Ｃ（ＣＨ_２）_４ＯＨ）と塩化ミリストイルを反応させ、次いでこの生成物の無水コハク酸との反応により、ジアセチレン、ＨＯ（Ｏ）Ｃ（ＣＨ_２）_２Ｃ（Ｏ）Ｏ（ＣＨ_２）_４Ｃ≡Ｃ−Ｃ≡Ｃ（ＣＨ_２）_４Ｏ（Ｏ）Ｃ（ＣＨ_２）_１２ＣＨ_３、を白色固体として得ることを含む。

ジアセチレン化合物：ＨＯ（Ｏ）Ｃ（ＣＨ_２）_２Ｃ（Ｏ）Ｏ（ＣＨ_２）_４Ｃ≡Ｃ−Ｃ≡Ｃ（ＣＨ_２）_４Ｏ（Ｏ）Ｃ（ＣＨ_２）_１２ＣＨ_３（コハク酸モノ−（１２−テトラデカノイルオキシ−ドデカ−５，７−ジイニル）エステル）、及び両性イオン性のリン脂質である１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ、式量（Ｆ．Ｗ．）６７８、（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから入手可能）との６：４混合物をガラスバイアル中に秤量し、１ｍＭ溶液を作成するために水（ｐＨ ５．８）に懸濁した。この溶液に、次いでＭｉｓｏｎｉｘ ＸＬ２０２プローブソニケーター（Ｍｉｓｏｎｉｘ Ｉｎｃ．，Ｆａｒｍｉｎｇｔｏｎ，ＮＹから市販品として入手可能）を用いて、プローブによる超音波処理を２分間して、４℃の冷蔵庫に約２０時間保存した。このプロセスは、安定なリポソーム懸濁物の形成をもたらした。

調製実施例９−ジアセチレンリポソーム懸濁物の重合
調製実施例８において調製された懸濁物を、最初に水で１：１０に希釈して、次いでこの希釈された試料を、Ｆｕｓｉｏｎ ＵＶ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）のｈｉｇｈ ｐｏｗｅｒ（２５０ｍジュール）ＵＶ ｓｔａｔｉｏｎ（２５４ｎｍの波長で０．２５４メートル／秒（５０ｆｔ／ｍｉｎ）の速度で３回通過）に曝露して重合させた。代替的に、調製実施例６において調製された懸濁物を、最初に水に１：１０に希釈し、希釈した試料を撹拌しながら、２５４ｎｍのＵＶランプ（ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡより市販品として入手可能）により、３ｃｍの距離から３５分間、照射した。両方法は、通常は２６０°〜２７０°の範囲の色相角を伴う青色（青相）の観測をもたらした。重合は、通常は１０ｍＬの容積の希釈したリポソーム懸濁物を用いて行われた。

調製実施例１０−流体システムの調製
本発明の発明者らの試験に用いられた流体システムは、本質的にフロースルーシステムである。このシステムは、ブランクの９６−ｗｅｌｌ ３Ｍ Ｅｍｐｏｒｅ Ｆｉｌｔｅｒ Ｐｌａｔｅ（Ｎｏ．６０６０、Ｆｉｌｔｅｒ ＰＰＴ ｓｍａｌｌ ｖｏｌｕｍｅ ９６−ｗｅｌｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｐｌａｔｅ、３Ｍ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）から入手可能）により構成され、それぞれのウエルには、正確に８ｍｍ^２の濾過面積を画成するために、膜のより大きなシート側から打ち抜かれて、ビニール・テープ（Ｓｃｏｔｃｈ Ｓｕｐｅｒ ３３ Ｐｌｕｓ Ｖｉｎｙｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ Ｔａｐｅ、３Ｍ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮから入手可能）によりマスクされた、ＨＴ Ｔｕｆｆｒｙｎ ４５０膜（親水性ポリスルホン４５０ｎｍ膜、Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩから入手可能）の１センチメートル（ｃｍ）の直径のディスクが充填されている。マスクされた膜ディスクは、ポリプロピレンのフェルール（３Ｍ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮから入手可能）を用いて、９６ウエルプレートのそれぞれのウエルの底部に対向して保持されている。このようにして調製されたプレートは、真空連結管（３Ｍ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮから入手可能）と共に１００〜２５０μＬ／ｍｉｎの流速になるように真空度を調整して用いられる。完了した試験からもたらされるリポソーム懸濁物は、この流体システムにより濾過され、ウエルの底にある膜ディスクの上に被覆を形成する。リポソーム被覆の色相角は、９６ウエルプレートのウエルの内側に適合する光ファイバーのプローブが外装された市販の分光光度計（Ｗｉｌｋｅｎｓ−ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｃｏ．，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬから入手可能なＡｖａｎｔｅｓ ＡｖａＳｐｅｃ−２０４８−ＳＰＵ２−ＳＤ２５６）を用いて直接的に測定された。

調製実施例１１−ジアセチレンリポソーム懸濁物により被覆された試料の調製
調製実施例８で調製された懸濁物は、２００（ｎｍ）の直径の細孔を持つ多孔性ポリカーボネート膜（Ａｖｅｓｔｉｎ，Ｉｎｃ．Ｏｔｔａｗａ，Ｃａｎａｄａから入手可能）に、Ｂｉｏｄｏｔ ｃｏａｔｅｒ（Ｂｉｏｄｏｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡから入手可能）を用いて１００μＬ／ｃｍ^２の被覆重量で被覆された。被覆された膜は、被覆表面を上にしてガラススライドの上に置かれ、及び５℃の冷蔵庫に少なくとも３時間入れられた。次いでこの試料をＣａＳＯ_４を含むデシケーター中で３０分間乾燥させ、２５４ナノメートル（ｎｍ）のＵＶ光（ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ；Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡから市販品として入手可能）に３０〜９０秒間曝露して、被覆されたジアセチレンリポソームを重合させた。１ｃｍの直径の円形試料を、被覆され重合された膜から打ち抜き、ポリカーボネート２４ウエルプレート（ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ；Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡから入手可能）の底部に、両面テープ（３Ｍ Ｓｔａｔｉｏｎｅｒｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮから入手可能）を用いて積層した。

調製実施例１２−クロルヘキシジン二酢酸塩溶液の調製
クロルヘキシジン二酢酸塩（ＣＨｄｉＡ、式量（Ｆ．Ｗ．）６２５．５５、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから入手可能）のストック溶液は、１．５６４ｍｇのＣＨｄｉＡを１００ｍＬのＨＥＰＥＳ緩衝液（調製実施例５で調製されたもの）に加え、固体が完全に溶解するまで撹拌することにより調製した。これにより、２５ｎｍｏｌ／ｍＬの最終ＣＨｄｉＡ溶液濃度が得られた。

実施例１〜１５−Ｓ．ａｕｒｅｕｓの検出
Ｓ．ａｕｒｅｕｓの検出試験は、以下のように実施された：
（１）３２μＬのＭＡｂ １０７抗体（調製実施例１で調製されたもの）で機能化された磁性ビーズ懸濁物をポリプロピレン微小遠心管（ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡから入手可能）に加えた。同じ微小遠心管に４６８μＬのＰＢＳ−Ｌ６４緩衝液（調製実施例２及び６で調製されたもの）中の所定の濃度（表１に記載されている）のＳ．ａｕｒｅｕｓ細菌懸濁物を加えた。混合物をＢａｒｎｓｔｅａｄ ＬａｂＱｕａｋｅ ｓｈａｋｅｒ（Ｂａｒｎｓｔｅａｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｄｕｂｕｑｕｅ，ＩＡ）を用いた揺動撹拌下に、室温で１５分間インキュベートした。

（２）次いで、ビーズを分離し、微小遠心管をダイナル・マグネチック・フィクスチャー（Dynal magnetic fixture）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡから入手可能）に少なくとも５分間入れることによって濃縮した。凝集したビーズをかき乱すことなく上澄みをマイクロピペッティングにより捨てた。

（３）次いで、０．５ｍＬのＨＥＰＥＳ緩衝（調製実施例５に記載されたもの）を管に加え、５分間揺動により撹拌することによりビーズを洗浄した。次いでビーズを再び分離し、微小遠心管をダイナル・マグネチック・フィクスチャー（Dynal magnetic fixture）に少なくとも５分間入れることにより濃縮した。凝集したビーズをかき乱すことなく洗浄溶液をマイクロピペッティングにより捨てた。この洗浄工程は、２回繰り返された。

（４）所定の容積（表１に示されている）のポリミキシンＢストック溶液（調製実施例７で調製されたもの）を洗浄された磁性ビーズに加えた。次いで、微小遠心管を１０秒間ボルテックスし、５分間放置した。次に、０．５ｍＬのＨＥＰＥＳ緩衝を管に加え、溶液を追加の５分間撹拌した。

（５）次いで、ビーズを再び分離し、微小遠心管をダイナル・マグネチック・フィクスチャー（Dynal magnetic fixture）に少なくとも５分間入れることにより濃縮した。次に、上澄みを新しい微小遠心管にマイクロピペッティングにより移し、そこに表１に示されている所定の容積のＰＤＡリポソーム溶液（調製実施例８及び９で調製されたもの）を加えた。管を穏やかに１分間撹拌した。

（６）溶液を３Ｍ Ｅｍｐｏｒｅ ９６ウエルプレート（調製実施例１０で調製されたもの）のウエルの１つにピペットにより入れ、ＰＤＡリポソームを捕捉して濃縮するために真空下で濾過した。試料溶液の全容積が濾過されるとすぐに、ＡＶＥＮＴＩＳ装置（調製実施例１０に記載されたもの）を色相角の測定に用いた。３回の反復測定の平均色相角（ｈ°）は、表１に示されている。次式で与えられる比色分析応答も、表１に示されている：

式中、実施例１は全ての他の実験の陽性対照（色相角（陽性対照））の機能を果たし、実施例２〜６は対応する実施例７〜１５（色相角（試料））に対する陰性対照（色相角（陰性対照））である。大きな比色分析応答は、細菌の陽性検出結果を示す。比色分析応答の報告値の１σの標準偏差は±１０％である。これらの実施例は、試薬（ＰｍＢ）及びＰＤＡリポソームの異なる組み合わせの、濃度範囲にわたる標的微生物の検出能力を実証する。

実施例１６〜２０−Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの存在下でのＳ．ａｕｒｅｕｓの検出
Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの存在下でのＳ．ａｕｒｅｕｓを検出するための試験は、顕著な濃度の妨害微生物（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）の存在下での標的検体（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の検出を実証するために、Ｓ．ａｕｒｅｕｓを含む溶液にＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ（調製実施例３で調製されたもの）を混合して含ませた試料を用いて、実施例１〜１５に記載されたように実施された。３回の反復測定の平均色相角（ｈ°）及び対応する比色分析応答は、表２に示されている。比色分析応答の報告値の１σの標準偏差は、±１５％である。

実施例１６〜２０−Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの検出
Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓを検出するための試験は、Ｊ−２６０８００−０１抗体で機能化された磁性ビーズ（調製実施例１で調製されたもの）及び標的微生物としてＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ（調製実施例４で調製されたもの）を用いて実施例１〜１５に記載されたように実施された。これらの実施例は、適切な試料調製物システムを置き換えることによる異なる標的微生物の検出能力を実証する。３回の反復測定からの平均色相角（ｈ°）及び対応する比色分析応答は表３に示されている。比色分析応答の報告値の１σの標準偏差は±１０％である。

実施例２８〜３１−ＰｍＢ及び被覆されたＰＤＡインジケーターの代わりにＣＨＧを用いるＳ．ａｕｒｅｕｓの検出
Ｓ．ａｕｒｅｕｓの検出試験は、以下のように実施された：
（１）ＭＡｂ １０７抗体（調製実施例１で調製されたもの）で機能化された３２μＬの磁性ビーズ懸濁物をポリプロピレン微小遠心管（ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡから入手可能）に加えた。同じ微小遠心管に４６８μＬのＰＢＳ−Ｌ６４緩衝液（調製実施例２及び６で調製されたもの）中の所定の濃度（表１に記載されている）のＳ．ａｕｒｅｕｓ細菌懸濁物を加えた。混合物をＢａｒｎｓｔｅａｄ ＬａｂＱｕａｋｅ ｓｈａｋｅｒ（Ｂａｒｎｓｔｅａｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｄｕｂｕｑｕｅ，ＩＡ）を用いた揺動撹拌下に、室温で１５分間インキュベートした。

（２）次いで、ビーズを分離し、微小遠心管をダイナル・マグネチック・フィクスチャー（Dynal magnetic fixture）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡから入手可能）に少なくとも５分間入れることによって濃縮した。凝集したビーズをかき乱すことなく上澄みをマイクロピペッティングにより捨てた。

（３）次いで、０．５ｍＬのＨＥＰＥＳ緩衝（調製実施例５に記載されたもの）を管に加え、５分間揺動により撹拌することによりビーズを洗浄した。次いでビーズを再び分離し、微小遠心管をダイナル・マグネチック・フィクスチャー（Dynal magnetic fixture）に少なくとも５分間入れることにより濃縮した。凝集したビーズをかき乱すことなく洗浄溶液をマイクロピペッティングにより捨てた。この洗浄工程は、２回繰り返された。

（４）１ｍＬのＣＨＧストック溶液（調製実施例１２で調製されたもの）を洗浄された磁性ビーズに加えた。次いで、微小遠心管を１０秒間ボルテックスし、５分間放置した。

次いでビーズを再び分離し、微小遠心管をダイナル・マグネチック・フィクスチャー（Dynal magnetic fixture）に少なくとも５分間入れることにより濃縮した。次いで、上澄みを、被覆されたＰＤＡインジケーターを含む２４−ウエルプレート（調製実施例１１で調製されたもの）のウエルの１つにマイクロピペッティングにより移した。この２４−ウエルプレートをＥｂｅｒｂａｃｈ Ｍｏｄｅｌ ６０００ ｓｈａｋｅｒ（Ｅｂｅｒｂａｃｈ Ｃｏｒｐ．，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）上で撹拌した。デジタルカメラを用いて６０分後に写真を撮影した。この写真を、Ａｄｏｂｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄのソフトウエア（商標名ＡＤＯＢＥ ＰＨＯＴＯＳＨＯＰ ｖｅｒｓｉｏｎ ５．０、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）によりＰＤＡインジケーターの色相角を抽出するために分析した。３回の反復測定からの平均色相角（ｈ°）及び対応する比色分析応答は、表４に示されている。比色分析応答の報告値の１σの標準偏差は±１０％である。これらの実施例は、異なる試薬（ＰｍＢの代わりにＣＨＧ）及び被覆インジケーター（固体相対溶液相検出）を用いる標的微生物を検出する能力を実証する。

実施例３２〜３４−臨床現場での応用のための使い捨て検出装置によるＳ．Ａｕｒｅｕｓの検出
図３は、センサー層又は部分１３０及びフロースルー膜４６０を有し、装置本体が複層により形成される検出装置４５０を示している。図示されるように、複層構造体は、表面又は第１外側層４５４、裏面又は第２外側層４５６、及び１つ以上の中間層を包含する。図示されている実施形態では、センサー成分１００は、開口部４５７の近傍に中間層４５８を介して支持されている。センサー層又は部分１３０は、膜４６０上に配設され、この膜は開口部４５７の最近位で中間層４５８に連結している。中間層４５８は、遮水性である。複層構造はまた、表面層４５４と中間層４５８との間に配設されるスペーサー層４６２も含む。スペーサー層４６２は、注入口４６４及び第１流路部分を形成するためにパターン付けされている。吸収層４６６は、フロースルー膜４６０を開口部４５７において貫通して形成されたセンサー通路を横断して流体の流れを生じさせるために、開口部４５７近傍で中間層４５８及び背後層４５６の間に配設されている。

記載されたように、第１流路部分は、第１の方向に流れを供給するために、表面層４５４と中間層４５８との間の複層構造の長さに沿うように配向された通路により形成されている。本装置はまた、第１流路部分を横断して形成される第２流路部分を包含し、フロースルー膜４６０を通過する第１方向をほぼ横断する第２方向に流れを供給する。例示される実施形態では、検体のセンサー成分１００との反応によるセンサー成分１００の検知可能な変化が、目視により識別できるように、表面層４５４は、透明又はシースルーの膜により形成されている。代替的にセンサー成分１００が視察できるように、表面層４５４の部分が透明又はシースルーであることができる。

例示される実施形態では、流体の流れは、吸収層４６６によりフロースルー膜４６０を通過して誘導される。層４６６はパターン付けされて、フロースルー膜４６０の下流にある吸収性領域を形成し、横断流路又は通過域を形成することができる。図３は個別の背後又は外部層４５６を図示しているが、代替的な実施形態では、吸収層４６６が装置の背後層を形成することができ、応用は示されている特定の層に限定されない。

それぞれの例示された実施形態では、試験試料のセンサー成分１００への曝露の時間又は期間は、試験試料がセンサー成分１００を横断する流速に基づいて限定される。いったん流体がセンサー成分１００を流れ去ると、それはもはやセンサー層又は部分には曝露されず、したがって、センサー成分１００への試験試料の限定された曝露は、引き続く試験の結論を大幅に変えることがない比較的安定な試験結果を与える。

これらの実施例では、上述の装置は以下の物質により構築される：層４５６はビニールテープ（３Ｍ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮから入手可能なＳｃｏｔｃｈ Ｓｕｐｅｒ ３３ Ｐｌｕｓ Ｖｉｎｙｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ Ｔａｐｅ）、層４６６はグラスファイバー芯材（Ｓｔｅｒｌｉｔｅｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｋｅｎｔ，ＷＡより入手可能なＳｔｅｒｌｉｔｅｃｈ ＧＢ １４０ Ｇｌａｓｓ Ｆｉｂｅｒ）、層４６０は４５０ｎｍ多孔性ポリエーテルスルホン膜（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩから入手可能なＰａｌｌ Ｓｕｐｏｒ ４５０ Ｍｅｍｂｒａｎｅ）、層４５８は片側に圧感受性接着剤（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｃｏｎｓｕｌｔｉｎｇ Ｎｅｔｗｏｒｋ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡから入手可能なＤｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｃｏｎｓｕｌｔｉｎｇ Ｎｅｔｗｏｒｋ Ｍｉｂａ−０１０）を有する、０．０８ｃｍ（１／３２−インチ）厚のＰＶＣ裏当て材、層４６２は、両側に圧感受性の接着剤を有する、０．１６ｃｍ（１／１６−ｉｎｃｈ）厚の３Ｍポリエチレン・ブローン・フォーム（３Ｍ Ｃｏｍｐａｎｙ，３Ｍ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮから入手可能）、及び層４５４は、３Ｍ Ｐｏｌｙｅｓｔｅｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｕｓｅ Ｔｒａｎｓｐａｒｅｎｃｙ Ｆｉｌｍ（３Ｍ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮから入手可能）。

検出装置を構築するために、それぞれの膜の層は、ロータリー・ダイにより適正な形状及び寸法に打ち抜かれた。組み立ては、水流式フィルター膜４６０を開口部４５７を覆って中間層４５８の接着剤側の上に置くことにより開始する。次に、吸収層４６６がこのフィルター膜の上に置かれ、開口部４５７を覆って中間層４５８の接着剤側に置かれる。次いで、この最初の積層を吸収層４６６を下にして背後層４５６の接着剤側に置き、背後層４５６が吸収層４６６の周りで中間層４５８に接着して密封を形成することを確実にするために、端部に圧力をかける。次に、スペーサー層４６２の１つの側面から裏地を取り除き、スペーサー層４６２の接着剤側を中間層４５８の非接着剤側に積層する。最終的に、スペーサー層４６２の他の側から裏地を取り除き、外層４５４をスペーサー層４６２の接着剤側に積層する。試料チャンバの最上部に位置する２つの通気口を作成するために針が使われた。

検出装置を試験するために、Ｓ．ａｕｒｅｕｓを検出するための試験が以下のプロトコルに従って実施された：
（１）ＭＡｂ １０７抗体（調製実施例１で調製されたもの）で機能化された３２μＬの磁性ビーズ懸濁物をポリプロピレン微小遠心管（ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡから入手可能）に加えた。同じ微小遠心管に４６８μＬのＰＢＳ−Ｌ６４緩衝液（調製実施例２及び６で調製されたもの）中の所定の濃度（表１に記載されている）のＳ．ａｕｒｅｕｓ細菌懸濁物を加えた。この混合物をＢａｒｎｓｔｅａｄ ＬａｂＱｕａｋｅ ｓｈａｋｅｒ（Ｂａｒｎｓｔｅａｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｄｕｂｕｑｕｅ，ＩＡ）を用いた揺動撹拌下に、室温で１５分間インキュベートした。

（２）次いで、ビーズを分離し、微小遠心管をダイナル・マグネチック・フィクスチャー（Ｄｙｎａｌ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｆｉｘｔｕｒｅ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡから入手可能）に少なくとも５分間入れることによって濃縮した。凝集したビーズをかき乱すことなく上澄みをマイクロピペッティングにより捨てた。

（３）次いで、０．５ｍＬのＨＥＰＥＳ緩衝（調製実施例５に記載されたもの）を管に加え、５分間揺動により撹拌することによりビーズを洗浄した。次いでビーズを再び分離し、微小遠心管をダイナル・マグネチック・フィクスチャー（Dynal magnetic fixture）に少なくとも５分間入れることにより濃縮した。凝集したビーズをかき乱すことなく洗浄溶液をマイクロピペッティングにより捨てた。この洗浄工程は、２回繰り返された。

（４）所定の容積（表１に示されている）のポリミキシンＢストック溶液（調製実施例７で調製されたもの）を洗浄された磁性ビーズに加えた。次いで、微小遠心管を１０秒間ボルテックスし、５分間放置した。次に、０．５ｍＬのＨＥＰＥＳ緩衝を管に加え、溶液を追加の５分間撹拌した。

（５）次いで、ビーズを再び分離し、微小遠心管をダイナル・マグネチック・フィクスチャー（Dynal magnetic fixture）に少なくとも５分間入れることにより濃縮した。次いで、上澄みをマイクロピペットで新しい微小遠心管に移し、そこに表５に示されている所定の容積のＰＤＡリポソーム溶液（調製実施例８及び９で調製されたもの）を加えた。管を穏やかに１分間撹拌した。

（６）この溶液をピペットで検出装置に移した。この時点で、溶液は毛細管現象によりフロースルー膜に染み透り始め、ＰＤＡリポソームは、この膜により収集されて濃縮される。いったん試料溶液の全量が濾過される試料チャンバが排液され空になると、Ａｖｅｎｔｉｓ（商標）装置（調製実施例１０に記載されているもの）が色相角の測定に用いられた。３回の反復測定からの平均色相角（ｈ°）は、表５に示されている。表５には下式で与えられる比色分析応答も示されている：

式中、実施例３２は全ての他の実験の陽性対照（色相角（陽性対照））の機能を果たし、実施例３３は対応する実施例３４（色相角（試料））に対する陰性対照（色相角（陰性対照））である。大きな比色分析応答は、細菌の陽性検出結果を示す。比色分析応答の報告値の１σの標準偏差は±１０％である。これらの実施例は、検出装置の標的微生物を検出する能力を実証する。

本明細書に記載されるすべての特許、特許出願、刊行物、並びに核酸及びタンパク質データベースエントリ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号を含む）のすべての開示は、個々に組み込まれるように、参照することによって本願に組み込まれる。本発明の範囲及び意図から逸脱することなく、本発明の様々な変更及び変化が当業者には明らかであろうし、本明細書に記載の説明的実施例に本発明が不当に制限されないことは理解されるべきである。

Claims (40)

1. 細菌試料の分析方法であって、
   特定の細菌に特徴的な１つ以上の識別可能な検体を含むことが疑われる試料を提供することと、
   特定の細菌に特徴的な１つ以上の識別可能な検体に対する抗原特異性を有する１つ以上の抗体を提供することと、
   固体支持物質を提供することと、
   特定の細菌に特徴的な１つ以上の検体が存在する場合に、それを捕捉するのに有効な条件下で、試料、固体支持物質、及び１つ以上の抗体に接触を提供することと、
   ジアセチレンを含むポリマー及び受容体を含む重合組成物を含む比色分析センサーであって、該受容体は、１つ以上のプローブ及び／又は検体と結合することに応じて色の変化を提供するトランスデューサーを形成するために重合組成物に組み込まれている比色分析センサーを提供することと、
   任意に、１つ以上の検体が存在する場合に、それを固体支持物質から除去することと、
   １つ以上の検体の捕捉及び除去に引き続き、特定の細菌の存在又は不在を分析するために、１つ以上の検体が存在する場合に、それを比色分析センサーによって直接的又は間接的に分析することとを含む分析方法。
2. 前記試料、前記固体支持物質、及び前記１つ以上の抗体に接触を提供することが、前記試料、前記固体支持物質、及び前記１つ以上の抗体に同時に接触を提供することを含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記１つ以上の抗体が検体結合物質を形成する固体支持物質に付着しており、前記方法が、前記試料及び前記検体結合物質に、特定の細菌に特徴的な１つ以上の検体が存在する場合に、それを捕捉するのに有効な条件下で接触を提供することを含む、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記検体結合物質が、特定の細菌に特徴的な２つ以上の識別可能な検体に対する抗原特異性を有する２つ以上の抗体を含む、請求項３に記載の方法。
5. 前記抗体が、モノクローナル、ポリクローナル、又はそれらの組み合わせである、請求項４に記載の方法。
6. 前記抗体が、ＭＡｂ−７６、ＭＡｂ−１０７、アフィニティー精製ＲｘＣｌｆ４０、アフィニティー精製ＧｘＣｌｆ４０、ＭＡｂ１２−９、これらのフラグメント、及びこれらの組み合わせよりなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
7. 前記検体結合物質が、少なくとも２つの部分を含む微粒子状物質を含み、微粒子状物質の１つの部分が、その上に配置される１つの検体に対して特異的な１つの抗体を有し、第２の部分がその上に配置される識別可能な検体に対して特異的な異なる抗体を有する、請求項３〜６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記固体支持物質が、微粒子物質を含み、微粒子状物質のそれぞれの粒子が、その上に配置される異なる検体と結合する少なくとも２つの抗体を有する、請求項３〜６のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記固体支持物質が、磁性粒子を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記検体（単数又は複数）及びトランスデューサー間の相互作用を媒介する緩衝液組成物を更に提供する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記特定の細菌に特徴的な１つ以上の検体が、全細胞上に存在する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 特定の細菌が、グラム陽性細菌を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 特定の細菌が、黄色ブドウ球菌を含む、請求項１２に記載の方法。
14. 前記１つ以上の検体が存在する場合に、それを比色分析センサーによる直接分析することを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 間接試験において１つ以上のプローブを使用することを更に含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
16. １つ以上のプローブを提供することと、
    前記１つ以上の検体が存在する場合に、その捕捉前、若しくは捕捉後、又は前記固体支持物質からの任意の除去後に、前記プローブが、１つ以上の検体に結合するために有効な条件を提供することと、
    特定の細菌の存在又は不在を分析するために、前記非結合のプローブ及び前記比色分析センサーの間に接触を提供することとを更に含む、請求項１５に記載の方法。
17. 前記１つ以上のプローブが、ポリミキシンを含む、請求項１６に記載の方法。
18. 前記試料が、粘液を含む試料である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
19. 前記試料が、尿試料、傷からの滲出液、又は培養された血液である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
20. 細菌試料を分析する方法であって、
    特定の細菌に特徴的な１つ以上の識別可能な検体を含むことが疑われる全細胞を含む試料を提供することと、
    磁性粒子を含む検体結合物質であって、前記磁性粒子は、その上に配置された、特定の細菌に特徴的な１つ以上の識別可能な検体に対する抗原特異性を有する１つ以上の抗体を有するものを提供することと、
    少なくとも１つのジアセチレンを含むポリマー及び受容体を含む重合組成物を含む比色分析センサーであって、該受容体は、１つ以上のプローブ及び／又は検体と結合することに応じて色の変化を提供するトランスデューサーを形成するために重合組成物に組み込まれている比色分析センサーを提供することと、
    前記特定の細菌に特徴的な１つ以上の検体が全細胞上に存在する場合には、それを補足するのに有効な条件の下で、前記試料及び前記検体結合物質に接触を提供することと、
    任意に、１つ以上の検体が存在する場合に、それを固体支持物質から除去することと、
    １つ以上の検体の捕捉及び除去に引き続き、特定の細菌の存在又は不在を分析するために、１つ以上の検体が存在する場合に、それを比色分析センサーによって直接的又は間接的に分析することとを含む分析方法。
21. 前記抗体が、ＭＡｂ−７６、ＭＡｂ−１０７、アフィニティー精製ＲｘＣｌｆ４０、アフィニティー精製ＧｘＣｌｆ４０、ＭＡｂ１２−９、これらのフラグメント、及びこれらの組み合わせよりなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
22. 前記特定の細菌が、グラム陽性菌を含む、請求項２０又は２１に記載の方法。
23. 特定の細菌が、黄色ブドウ球菌を含む、請求項２２に記載の方法。
24. 前記１つ以上の検体が存在する場合に、それを比色分析センサーによる直接分析する、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の方法。
25. １つ以上のプローブを間接試験に用いることを更に含む、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の方法。
26. １つ以上のプローブを提供することと、
    前記１つ以上の検体が存在する場合に、その捕捉前、若しくは捕捉後、又は前記固体支持物質からの任意の除去後に、前記プローブが、１つ以上の検体に結合するために有効な条件を提供することと、
    特定の細菌の存在又は不在を分析するために、前記非結合のプローブ及び前記比色分析センサーの間に接触を提供することとを更に含む、請求項２５に記載の方法。
27. 前記１つ以上のプローブが、ポリミキシンを含む請求項２６に記載の方法。
28. 前記磁性粒子が、少なくとも２つの部分を含み、磁性粒子の１つの部分がその上に配置される１つの検体に対して特異的な１つの抗体を有し、第２の部分がその上に配置される識別可能な検体に対する異なる抗体を有する、請求項２０〜２７のいずれか一項に記載の方法。
29. 前記検体結合物質のそれぞれの磁性粒子が、その上に配置される異なる検体に対する少なくとも２つの抗体を有する、請求項２０〜２７のいずれか一項に記載の方法。
30. 前記試料が、尿試料、傷からの滲出液、又は培養された血液を含む、請求項２０〜２９のいずれか一項に記載の方法。
31. 黄色ブドウ球菌細菌試料を分析する方法であって、
    特定の細菌に特徴的な１つ以上の識別可能な検体を含むことが疑われる全細胞を含む試料を提供することと、
    磁性粒子を含む検体結合物質であって、前記磁性粒子は、その上に配置された、黄色ブドウ球菌細菌に特徴的な１つ以上の識別可能な検体に対する抗原特異性を有する１つ以上の抗体を有するものであって、該抗体は、ＭＡｂ−７６、ＭＡｂ−１０７、アフィニティー精製されたＲｘＣｌｆ４０、アフィニティー精製されたＧｘＣｌｆ４０、ＭＡｂ−１２９、それらのフラグメント、及びそれらの組み合わせよりなる群から選ばれものを提供することと、
    少なくとも１つのジアセチレンを含むポリマー及び受容体を含む重合組成物を含む比色分析センサーであって、該受容体は、１つ以上のプローブ及び／又は検体と結合することに応じて色の変化を提供するトランスデューサーを形成するために重合組成物に組み込まれている比色分析センサーを提供することと、
    前記黄色ブドウ球菌細菌に特徴的な１つ以上の検体が、全細胞上に存在する場合には、それを補足するのに有効な条件の下で、前記試料及び前記検体結合物質に接触を提供することと、
    任意に、１つ以上の検体が存在する場合に、それを固体支持物質から除去することと、
    １つ以上の検体の捕捉及び除去に引き続き、黄色ブドウ球菌細菌の存在又は不在を分析するために、１つ以上の検体が存在する場合に、それを比色分析センサーによって直接的又は間接的に分析することとを含む分析方法。
32. 前記磁性粒子が、少なくとも２つの部分を含み、磁性粒子の１つの部分がその上に配置される１つの検体に対して特異的な１つの抗体を有し、第２の部分がその上に配置される識別可能な検体に対する異なる抗体を有する、請求項３１に記載の方法。
33. 前記検体結合物質のそれぞれの磁性粒子が、その上に配置される異なる検体に対する少なくとも２つの抗体を有する、請求項３１に記載の方法。
34. 比色分析センサー中のプローブの非特異的結合を防止するために前記磁性粒子が阻害される、請求項３１〜３３のいずれかの一項に記載される方法。
35. 前記磁性粒子が、ポリミキシンにより阻害される、請求項３４に記載の方法。
36. 黄色ブドウ球菌細菌に特徴的な１つ以上の検体が存在する場合に、それに前記比色分析センサーとの接触を提供する前に、検体結合物質から除去することを更に含む、請求項３１〜３５のいずれかの一項に記載される方法。
37. 前記１つ以上の検体が存在する場合に、それを比色分析センサーによって直接分析する、請求項３１〜３６のいずれかの一項に記載される方法。
38. 前記１つ以上のプローブを間接試験に使用することを更に含む、請求項３１〜３６のいずれかの一項に記載される方法。
39. 前記１つ以上のプローブが、ポリミキシンを含む、請求項３８に記載の方法。
40. 前記試料が、尿試料、傷からの滲出液、又は培養された血液である、請求項３１〜３９のいずれかの一項に記載される方法。

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