JPH1048216A - 診断法およびプローブ - Google Patents
診断法およびプローブInfo
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- JPH1048216A JPH1048216A JP9112275A JP11227597A JPH1048216A JP H1048216 A JPH1048216 A JP H1048216A JP 9112275 A JP9112275 A JP 9112275A JP 11227597 A JP11227597 A JP 11227597A JP H1048216 A JPH1048216 A JP H1048216A
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
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- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 本発明は、試料中の標的被検物質を検出する
ための方法およびプローブを提供することを目的とす
る。 【解決手段】 本発明は試料中の標的被検物質を検出す
る方法を特徴とする。この方法においては、試料と検出
用プローブおよび捕捉プローブとを接触させて、検出用
プローブ−被検物質−捕捉プローブ複合体を形成する。
検出用プローブは、予め決定されたｐＩを有し且つ検出
可能な標識を含む新規残基を含む。複合体中に結合して
いない任意の検出用プローブから複合体を分離し、複合
体から残基を遊離させ、遊離した残基を等電点電気泳動
または他の方法により濃縮する。例えば、そのｐＩに対
応するｐＨ勾配中の位置における残基の検出を、試料中
の被検物質の存在および濃度の尺度として用いることが
できる。
ための方法およびプローブを提供することを目的とす
る。 【解決手段】 本発明は試料中の標的被検物質を検出す
る方法を特徴とする。この方法においては、試料と検出
用プローブおよび捕捉プローブとを接触させて、検出用
プローブ−被検物質−捕捉プローブ複合体を形成する。
検出用プローブは、予め決定されたｐＩを有し且つ検出
可能な標識を含む新規残基を含む。複合体中に結合して
いない任意の検出用プローブから複合体を分離し、複合
体から残基を遊離させ、遊離した残基を等電点電気泳動
または他の方法により濃縮する。例えば、そのｐＩに対
応するｐＨ勾配中の位置における残基の検出を、試料中
の被検物質の存在および濃度の尺度として用いることが
できる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、試料中の標的被検
物質を検出するための方法およびプローブに関する。
物質を検出するための方法およびプローブに関する。
【０００２】本発明は、一部分、商務省によって与えら
れた先進技術計画事業第95-08-0012号および協約第70NA
NB5H1108号に基づいて米国政府によって援助され、そし
て National Institute of Standards and Technology
によって管理された。政府は本発明の当然の権利を有す
る。
れた先進技術計画事業第95-08-0012号および協約第70NA
NB5H1108号に基づいて米国政府によって援助され、そし
て National Institute of Standards and Technology
によって管理された。政府は本発明の当然の権利を有す
る。
【０００３】
【従来の技術】試料中に微量に存在する被検物質の検出
は、敏感な且つ特異的な方法を必要とする。さもなけれ
ば、このような被検物質の検出は、試料中に高濃度で見
出される物質の存在によって妨げられることがある。被
検物質が、それを容易に検出させる物理的または化学的
性状を有していない場合、この問題は大きくなる。
は、敏感な且つ特異的な方法を必要とする。さもなけれ
ば、このような被検物質の検出は、試料中に高濃度で見
出される物質の存在によって妨げられることがある。被
検物質が、それを容易に検出させる物理的または化学的
性状を有していない場合、この問題は大きくなる。
【０００４】等電点電気泳動（ＩＥＦ）は、ｐＨ勾配中
の分子に対して電場を与えて、該勾配中においてその正
味電荷がゼロである、すなわち、その等電点（ｐＩ）に
ある位置に該分子を局在させる電気泳動法である。ＩＥ
Ｆは、しばしば、複雑な混合物中のタンパク質を分画す
るために、および未知の組成の生物分子を特性決定する
手段として用いられる。ＩＥＦで用いられるｐＨ勾配
は、商業的に入手可能であり、そして密な間隔の既知の
ｐＩ値および高導電率を有する低分子量化合物（例え
ば、ポリアミノポリカルボン酸）である多電荷両性電解
質の混合物から成る。両性電解質の混合物は、電場を与
えることによってｐＨ勾配を生じる。
の分子に対して電場を与えて、該勾配中においてその正
味電荷がゼロである、すなわち、その等電点（ｐＩ）に
ある位置に該分子を局在させる電気泳動法である。ＩＥ
Ｆは、しばしば、複雑な混合物中のタンパク質を分画す
るために、および未知の組成の生物分子を特性決定する
手段として用いられる。ＩＥＦで用いられるｐＨ勾配
は、商業的に入手可能であり、そして密な間隔の既知の
ｐＩ値および高導電率を有する低分子量化合物（例え
ば、ポリアミノポリカルボン酸）である多電荷両性電解
質の混合物から成る。両性電解質の混合物は、電場を与
えることによってｐＨ勾配を生じる。
【０００５】毛管は、ＩＥＦを含めた種々の電気泳動法
で用いられてきた（例えば、ノボトニー（Novotny）
ら、Electrophoresis,11:735-749，1990年を参照された
い）。毛管ＩＥＦの一つの用途は、試料中の標的被検物
質の検出に対してであった。例えば、アフェヤン（Afey
an）ら、米国特許第5,376,249号明細書（1994）は、被
検物質と標識された被検物質特異的結合残基（moiety）
との間に形成された複合体を毛管ＩＥＦによって分画す
る方法を記載している。同様に、カーガー（Karger）
ら、米国特許第5,348,633号明細書（1994）は、被検物
質と免疫グロブリンの標識Ｆａｂフラグメントとの間に
形成された複合体を毛管ＩＥＦによって濃縮する方法を
記載している。これらの方法の両方において、検出され
るそれぞれの被検物質に対する被検物質−プローブ複合
体のｐＩは経験的に決定されなければならない。被検物
質が数種類より多く存在する場合、この経験的決定は難
しくなることがある。
で用いられてきた（例えば、ノボトニー（Novotny）
ら、Electrophoresis,11:735-749，1990年を参照された
い）。毛管ＩＥＦの一つの用途は、試料中の標的被検物
質の検出に対してであった。例えば、アフェヤン（Afey
an）ら、米国特許第5,376,249号明細書（1994）は、被
検物質と標識された被検物質特異的結合残基（moiety）
との間に形成された複合体を毛管ＩＥＦによって分画す
る方法を記載している。同様に、カーガー（Karger）
ら、米国特許第5,348,633号明細書（1994）は、被検物
質と免疫グロブリンの標識Ｆａｂフラグメントとの間に
形成された複合体を毛管ＩＥＦによって濃縮する方法を
記載している。これらの方法の両方において、検出され
るそれぞれの被検物質に対する被検物質−プローブ複合
体のｐＩは経験的に決定されなければならない。被検物
質が数種類より多く存在する場合、この経験的決定は難
しくなることがある。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、試料中の標
的被検物質を検出するための方法およびプローブを提供
することを目的とする。
的被検物質を検出するための方法およびプローブを提供
することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、新規の検出可
能なおよび単離可能な残基を簡単な方法で用いて、複雑
な試料中の様々な被検物質を検出することができるとい
う発見に基く。特別な残基を、標的被検物質に対して特
異的に結合するプローブに結合させ、試料をその被検物
質特異的プローブと混合し、該プローブを被検物質に結
合させて被検物質−プローブ複合体を形成し、非結合プ
ローブを複合体から除去し、そして残基を複合体から遊
離させ、そして例えば、ＩＥＦによるｐＨ勾配中の分画
によって単離する。残基の、例えば、そのｐＩに対応す
る勾配中の位置での検出は、試料中の被検物質の存在の
尺度として用いられる。
能なおよび単離可能な残基を簡単な方法で用いて、複雑
な試料中の様々な被検物質を検出することができるとい
う発見に基く。特別な残基を、標的被検物質に対して特
異的に結合するプローブに結合させ、試料をその被検物
質特異的プローブと混合し、該プローブを被検物質に結
合させて被検物質−プローブ複合体を形成し、非結合プ
ローブを複合体から除去し、そして残基を複合体から遊
離させ、そして例えば、ＩＥＦによるｐＨ勾配中の分画
によって単離する。残基の、例えば、そのｐＩに対応す
る勾配中の位置での検出は、試料中の被検物質の存在の
尺度として用いられる。
【０００８】したがって、一つの態様において、本発明
は、試料中の被検物質を検出する方法に関する。この方
法では、試料を、検出可能な標識を含む残基（例えば、
フィコエリトリン）を含む検出用プローブおよび捕捉プ
ローブと接触させて、検出用プローブ−被検物質−捕捉
プローブ複合体を形成する。次に、その複合体中に結合
していない任意の検出用プローブから複合体を分離し、
該残基を複合体から遊離させ、遊離した残基を複合体か
ら単離し、そして場合により、濃縮する。次に、単離さ
れた残基を、試料中の被検物質の存在の尺度として検出
することができる。
は、試料中の被検物質を検出する方法に関する。この方
法では、試料を、検出可能な標識を含む残基（例えば、
フィコエリトリン）を含む検出用プローブおよび捕捉プ
ローブと接触させて、検出用プローブ−被検物質−捕捉
プローブ複合体を形成する。次に、その複合体中に結合
していない任意の検出用プローブから複合体を分離し、
該残基を複合体から遊離させ、遊離した残基を複合体か
ら単離し、そして場合により、濃縮する。次に、単離さ
れた残基を、試料中の被検物質の存在の尺度として検出
することができる。
【０００９】検出可能な標識の他に、残基は、その単離
および／または濃縮を容易にする性状、例えば、予め決
定されたｐＩを有する。残基が予め決定されたｐＩを有
する場合、遊離した残基の単離および濃縮は、等電点電
気泳動によって行うことができる。次に、電気泳動によ
って分離された残基を、試料中の被検物質の存在の尺度
として、残基のｐＩに対応するｐＨ勾配中の位置で検出
することができる。残基はまた、寸法を基準として、例
えば、カラムクロマトグラフィーまたはモレキュラーシ
ーブの使用によって単離するおよび／または濃縮するこ
とができる。
および／または濃縮を容易にする性状、例えば、予め決
定されたｐＩを有する。残基が予め決定されたｐＩを有
する場合、遊離した残基の単離および濃縮は、等電点電
気泳動によって行うことができる。次に、電気泳動によ
って分離された残基を、試料中の被検物質の存在の尺度
として、残基のｐＩに対応するｐＨ勾配中の位置で検出
することができる。残基はまた、寸法を基準として、例
えば、カラムクロマトグラフィーまたはモレキュラーシ
ーブの使用によって単離するおよび／または濃縮するこ
とができる。
【００１０】試料、検出用プローブおよび捕捉プローブ
は、互いにいずれの順序でも接触させることができる。
例えば、試料は、分画チャンバのルーメン中において固
定化捕捉プローブと接触させる前に、検出用プローブと
接触させることができる。或いは、試料および検出用プ
ローブを、分画チャンバのルーメン中において捕捉プロ
ーブと独立して接触させることができるし、または試料
を、検出用プローブの前に、分画チャンバのルーメン中
において捕捉プローブと接触させることができる。
は、互いにいずれの順序でも接触させることができる。
例えば、試料は、分画チャンバのルーメン中において固
定化捕捉プローブと接触させる前に、検出用プローブと
接触させることができる。或いは、試料および検出用プ
ローブを、分画チャンバのルーメン中において捕捉プロ
ーブと独立して接触させることができるし、または試料
を、検出用プローブの前に、分画チャンバのルーメン中
において捕捉プローブと接触させることができる。
【００１１】本発明の方法で用いるための捕捉プローブ
は、特異的結合対の第一メンバーを含むことができ、そ
して分離工程は、複合体と、固体支持体（例えば、アガ
ロース若しくはガラスビーズ、または毛管などの分画チ
ャンバのルーメン中の支持体）上に固定化されている特
異的結合対の第二メンバーとを接触させることによって
行うことができる。特異的結合対は、例えば、１対の相
補的核酸、互いに特異的に結合する１対のポリペプチド
（例えば、抗体の抗原結合部位（例えば、一本鎖抗体な
どの抗体の場合）および該抗原結合部位が結合する抗原
を含むポリペプチド）、またはアビジンおよびビオチン
でありうる。
は、特異的結合対の第一メンバーを含むことができ、そ
して分離工程は、複合体と、固体支持体（例えば、アガ
ロース若しくはガラスビーズ、または毛管などの分画チ
ャンバのルーメン中の支持体）上に固定化されている特
異的結合対の第二メンバーとを接触させることによって
行うことができる。特異的結合対は、例えば、１対の相
補的核酸、互いに特異的に結合する１対のポリペプチド
（例えば、抗体の抗原結合部位（例えば、一本鎖抗体な
どの抗体の場合）および該抗原結合部位が結合する抗原
を含むポリペプチド）、またはアビジンおよびビオチン
でありうる。
【００１２】本発明の方法で用いられる捕捉プローブ
は、分画チャンバのルーメン中（例えば、毛管またはプ
レート表面の溝）に固定化することができ、したがっ
て、単離、遊離および濃縮工程は、分画チャンバのルー
メン中において行うことができる。
は、分画チャンバのルーメン中（例えば、毛管またはプ
レート表面の溝）に固定化することができ、したがっ
て、単離、遊離および濃縮工程は、分画チャンバのルー
メン中において行うことができる。
【００１３】本発明の方法を用いて検出することができ
る標的被検物質としては、例えば、核酸（例えば、転座
またはそのｐｒｅ−ｍＲＮＡ若しくはｍＲＮＡ転写物を
含む染色体）、ポリペプチド、炭水化物、脂質、代謝産
物および薬物がある。捕捉プローブおよび検出用プロー
ブは、例えば、核酸またはポリペプチド（例えば、一本
鎖抗体などの抗体の抗原結合部位を含むポリペプチド）
でありうる。
る標的被検物質としては、例えば、核酸（例えば、転座
またはそのｐｒｅ−ｍＲＮＡ若しくはｍＲＮＡ転写物を
含む染色体）、ポリペプチド、炭水化物、脂質、代謝産
物および薬物がある。捕捉プローブおよび検出用プロー
ブは、例えば、核酸またはポリペプチド（例えば、一本
鎖抗体などの抗体の抗原結合部位を含むポリペプチド）
でありうる。
【００１４】残基は、例えば、化学的切断等の方法を用
いて検出用プローブから遊離させることができる。例え
ば、残基がジスルフィド結合によって検出用プローブに
結合している場合、ジスルフィド結合の還元によってそ
の残基を遊離させることができる。残基はまた、酵素的
切断によって、例えば、制限酵素、ＤＮＡｓｅ、ＲＮＡ
ｓｅまたはリボザイムの使用によって遊離することがで
きる。
いて検出用プローブから遊離させることができる。例え
ば、残基がジスルフィド結合によって検出用プローブに
結合している場合、ジスルフィド結合の還元によってそ
の残基を遊離させることができる。残基はまた、酵素的
切断によって、例えば、制限酵素、ＤＮＡｓｅ、ＲＮＡ
ｓｅまたはリボザイムの使用によって遊離することがで
きる。
【００１５】第二の態様において、本発明は、試料中の
染色体転座を含む染色体（すなわち、第一の染色体の一
部分および第二の染色体の一部分を含む染色体）の存在
を検出する方法に関する。この方法では、試料と、捕捉
プローブおよび検出用プローブとを接触させて、検出用
プローブ−被検物質−捕捉プローブ複合体を形成する。
捕捉プローブは、第一の染色体の一部分またはその対応
するＲＮＡ転写物に対して結合し且つ特異的結合対の第
一メンバーを含む。検出用プローブは、該第二の染色体
の一部分またはその対応するＲＮＡ転写物に対して結合
し且つ検出可能な標識を含む。次に、複合体と、固体支
持体上に固定化された特異的結合対の第二メンバーとを
接触させることによって、複合体中に結合していない任
意の検出用プローブから複合体を単離する。次に、複合
体中に存在する検出可能な標識を、試料中における染色
体転座を含む染色体の存在の尺度として検出することが
できる。
染色体転座を含む染色体（すなわち、第一の染色体の一
部分および第二の染色体の一部分を含む染色体）の存在
を検出する方法に関する。この方法では、試料と、捕捉
プローブおよび検出用プローブとを接触させて、検出用
プローブ−被検物質−捕捉プローブ複合体を形成する。
捕捉プローブは、第一の染色体の一部分またはその対応
するＲＮＡ転写物に対して結合し且つ特異的結合対の第
一メンバーを含む。検出用プローブは、該第二の染色体
の一部分またはその対応するＲＮＡ転写物に対して結合
し且つ検出可能な標識を含む。次に、複合体と、固体支
持体上に固定化された特異的結合対の第二メンバーとを
接触させることによって、複合体中に結合していない任
意の検出用プローブから複合体を単離する。次に、複合
体中に存在する検出可能な標識を、試料中における染色
体転座を含む染色体の存在の尺度として検出することが
できる。
【００１６】本発明は、更に、遊離可能な残基を含むプ
ローブ（例えば、核酸またはポリペプチド（例えば、抗
体）プローブ）であって、標識を含み且つそれらの単離
および／または濃縮を容易にする性状（例えば、予め決
定されたｐＩ）を有するプローブに関する。
ローブ（例えば、核酸またはポリペプチド（例えば、抗
体）プローブ）であって、標識を含み且つそれらの単離
および／または濃縮を容易にする性状（例えば、予め決
定されたｐＩ）を有するプローブに関する。
【００１７】本発明は、高感度で微小規模での試料中の
多数の被検物質の同時分析を可能にするように、いくつ
かの利点を提供する。被検物質結合プローブから遊離し
た残基のＩＥＦ分析を用いる場合、本発明の方法は、検
出されるべきそれぞれの被検物質に対する被検物質−プ
ローブ複合体のｐＩの経験的決定を必要としない。予め
決定されたｐＩを有する残基を、目的の任意の被検物質
に特異的なプローブに対して結合させることができる。
同様に、寸法または質量に基づいて残基を単離する場
合、予め決定された寸法または質量を有する残基を特異
的プローブに対して結合させる。本発明の方法は、更
に、僅かな試料および試薬容量しか必要とせず、迅速で
あり且つ自動操作に対して容易に適合しうる。更に、残
基の物理的濃縮による（例えば、ＩＥＦまたはカラムク
ロマトグラフィーによる）増幅は、酵素的増幅（例え
ば、ＰＣＲ）を用いる多数の検出方法に固有のバックグ
ラウンド問題を免れる。
多数の被検物質の同時分析を可能にするように、いくつ
かの利点を提供する。被検物質結合プローブから遊離し
た残基のＩＥＦ分析を用いる場合、本発明の方法は、検
出されるべきそれぞれの被検物質に対する被検物質−プ
ローブ複合体のｐＩの経験的決定を必要としない。予め
決定されたｐＩを有する残基を、目的の任意の被検物質
に特異的なプローブに対して結合させることができる。
同様に、寸法または質量に基づいて残基を単離する場
合、予め決定された寸法または質量を有する残基を特異
的プローブに対して結合させる。本発明の方法は、更
に、僅かな試料および試薬容量しか必要とせず、迅速で
あり且つ自動操作に対して容易に適合しうる。更に、残
基の物理的濃縮による（例えば、ＩＥＦまたはカラムク
ロマトグラフィーによる）増幅は、酵素的増幅（例え
ば、ＰＣＲ）を用いる多数の検出方法に固有のバックグ
ラウンド問題を免れる。
【００１８】特に断らない限り、本明細書中で用いられ
る技術用語および科学的用語は全て、本発明が属する当
業者によって一般的に理解されるのと同様の意味を有す
る。本明細書中で記載のものと同様のまたは同等の方法
および材料を、本発明の実施または試験において用いる
ことができるが、若干の好ましい方法および材料を以下
に記載する。本明細書中で記述された刊行物、特許出
願、特許および他の参考文献はいずれも、本明細書中に
そのまま援用される。抵触の場合、本明細書が支配す
る。更に、記載された材料、方法および実施例は、単に
例示するものであり、制限するためのものではない。
る技術用語および科学的用語は全て、本発明が属する当
業者によって一般的に理解されるのと同様の意味を有す
る。本明細書中で記載のものと同様のまたは同等の方法
および材料を、本発明の実施または試験において用いる
ことができるが、若干の好ましい方法および材料を以下
に記載する。本明細書中で記述された刊行物、特許出
願、特許および他の参考文献はいずれも、本明細書中に
そのまま援用される。抵触の場合、本明細書が支配す
る。更に、記載された材料、方法および実施例は、単に
例示するものであり、制限するためのものではない。
【００１９】本発明の他の特徴および利点は、以下の詳
細な記述および請求の範囲から明らかであろう。
細な記述および請求の範囲から明らかであろう。
【００２０】
【発明の実施の形態】本発明は、試料中の標的被検物質
の存在を検出する方法を提供する。本発明の方法は、
（１）検出可能な標識を含み、且つ（２）その単離およ
び／または濃縮を容易にする性状（例えば、予め決定さ
れたｐＩ）を有する残基によって標識された検出用プロ
ーブを用いる。検出用プローブを標的被検物質に対して
結合させて検出用プローブ−被検物質複合体を形成し、
そしてその複合体を試料成分および非結合検出用プロー
ブから精製した後、特定の残基に適当な方法を用いて、
残基を複合体から遊離させ、単離するおよび／または濃
縮する。例えば、予め決定されたｐＩを有する残基の場
合、その残基は、ＩＥＦによってｐＨ勾配中で単離され
且つ濃縮される。このような残基のそのｐＩに対応する
ｐＨ勾配中の位置での検出は、試料中の標的被検物質の
存在および濃縮の尺度として用いられる。
の存在を検出する方法を提供する。本発明の方法は、
（１）検出可能な標識を含み、且つ（２）その単離およ
び／または濃縮を容易にする性状（例えば、予め決定さ
れたｐＩ）を有する残基によって標識された検出用プロ
ーブを用いる。検出用プローブを標的被検物質に対して
結合させて検出用プローブ−被検物質複合体を形成し、
そしてその複合体を試料成分および非結合検出用プロー
ブから精製した後、特定の残基に適当な方法を用いて、
残基を複合体から遊離させ、単離するおよび／または濃
縮する。例えば、予め決定されたｐＩを有する残基の場
合、その残基は、ＩＥＦによってｐＨ勾配中で単離され
且つ濃縮される。このような残基のそのｐＩに対応する
ｐＨ勾配中の位置での検出は、試料中の標的被検物質の
存在および濃縮の尺度として用いられる。
【００２１】本発明の方法を、予め決定されたｐＩを有
する標識残基の使用に関して以下に記載する。しかしな
がら、本発明は、更に、単離および／または濃縮を容易
にする他の性状を有する標識残基を用いて行うことがで
きる。寸法等の他の性状に基づいて残基を単離し濃縮す
る方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、
カラムクロマトグラフィーがある。モレキュラーシーブ
もまた、異なる分子量を有する残基を単離するおよび／
または濃縮するのに用いることができる。例えば、細孔
度が漸進的に小さくなるフィルターの積層を用いること
ができる。更に、残基は、常磁性粒子を含むことがで
き、それは磁場に対する暴露によって単離し濃縮するこ
とができる。このような残基を多重検定において用いる
ために、残基は、例えば、異なった種類のリンカーによ
ってそれらのそれぞれのプローブに結合させることがで
き、したがって、単離および濃縮のために検出用プロー
ブから逐次的に遊離させることができる。
する標識残基の使用に関して以下に記載する。しかしな
がら、本発明は、更に、単離および／または濃縮を容易
にする他の性状を有する標識残基を用いて行うことがで
きる。寸法等の他の性状に基づいて残基を単離し濃縮す
る方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、
カラムクロマトグラフィーがある。モレキュラーシーブ
もまた、異なる分子量を有する残基を単離するおよび／
または濃縮するのに用いることができる。例えば、細孔
度が漸進的に小さくなるフィルターの積層を用いること
ができる。更に、残基は、常磁性粒子を含むことがで
き、それは磁場に対する暴露によって単離し濃縮するこ
とができる。このような残基を多重検定において用いる
ために、残基は、例えば、異なった種類のリンカーによ
ってそれらのそれぞれのプローブに結合させることがで
き、したがって、単離および濃縮のために検出用プロー
ブから逐次的に遊離させることができる。
【００２２】ハイブリダイゼーション検定 被検物質−プローブ複合体を形成させるための標的被検
物質への単一プローブのハイブリダイゼーションは、標
準的な方法を用いて行われる。或いは、２個のプローブ
を、例えば、サンドイッチハイブリダイゼーション検定
の場合に用いることができる（例えば、ランキ（Rank
i）ら、Gene 21:77-85,1983年；米国特許第4,486,539号
明細書（1984）を参照されたい）。図１および図２に図
示されるように、サンドイッチハイブリダイゼーション
検定は、捕捉プローブ１０および検出用プローブ１２の
使用を含み、それらは標的被検物質１４に対して同時に
結合するように設計されている。本発明の場合、サンド
イッチハイブリダイゼーション検定で用いられる検出用
プローブ１２は、残基１６を包含し、それは、本明細書
中で記載のように、検出可能な標識を含み、且つ残基が
単離されおよび／または濃縮されることができる予め決
定されたｐＩまたは他の既知の特性を有する。捕捉プロ
ーブは、例えば、（１）特異的結合対１８の第一メンバ
ーを含むことができるし（図１）、または（２）固体支
持体２０上に（例えば、ディップスティック上、または
毛管などの分画チャンバのルーメン中の固体支持体上
に）固定化されうる（図２）。これらのどちらの場合
も、捕捉プローブの使用は、試料成分からの、更には非
結合検出用プローブからの被検物質−プローブ複合体２
６の精製を容易にする。試料は、検出用プローブおよび
捕捉プローブと同時にまたは順々に接触することができ
る。
物質への単一プローブのハイブリダイゼーションは、標
準的な方法を用いて行われる。或いは、２個のプローブ
を、例えば、サンドイッチハイブリダイゼーション検定
の場合に用いることができる（例えば、ランキ（Rank
i）ら、Gene 21:77-85,1983年；米国特許第4,486,539号
明細書（1984）を参照されたい）。図１および図２に図
示されるように、サンドイッチハイブリダイゼーション
検定は、捕捉プローブ１０および検出用プローブ１２の
使用を含み、それらは標的被検物質１４に対して同時に
結合するように設計されている。本発明の場合、サンド
イッチハイブリダイゼーション検定で用いられる検出用
プローブ１２は、残基１６を包含し、それは、本明細書
中で記載のように、検出可能な標識を含み、且つ残基が
単離されおよび／または濃縮されることができる予め決
定されたｐＩまたは他の既知の特性を有する。捕捉プロ
ーブは、例えば、（１）特異的結合対１８の第一メンバ
ーを含むことができるし（図１）、または（２）固体支
持体２０上に（例えば、ディップスティック上、または
毛管などの分画チャンバのルーメン中の固体支持体上
に）固定化されうる（図２）。これらのどちらの場合
も、捕捉プローブの使用は、試料成分からの、更には非
結合検出用プローブからの被検物質−プローブ複合体２
６の精製を容易にする。試料は、検出用プローブおよび
捕捉プローブと同時にまたは順々に接触することができ
る。
【００２３】図１に示されるように、特異的結合対１８
の第一メンバーを含む捕捉プローブ１０をサンドイッチ
ハイブリダイゼーション検定で用いる場合、検出用プロ
ーブ−被検物質−捕捉プローブ複合体２６は、固体支持
体２４に対して結合した特異的結合対２２の第二メンバ
ーとの接触によって精製されうる。例えば、特異的結合
対の第二メンバーは、ガラスまたはアガロースビーズな
どのビーズ上に固定化することができる。試料とビーズ
との接触は、ビーズ上に複合体を固定化させるであろ
う。当該技術分野において知られているように、このよ
うなビーズに対する検出用プローブ−被検物質−捕捉プ
ローブ複合体の結合は、例えば、試料およびプローブを
ビーズと一緒に絶えず混合することによって促進されう
る。次に、ビーズを洗浄して、非結合プローブおよび非
特異的結合試料成分を除去することができる。次に、残
基１６を精製複合体から遊離させ、そして例えば、ＩＥ
Ｆによる濃縮のために、毛管などの分画チャンバに入れ
ることができる。
の第一メンバーを含む捕捉プローブ１０をサンドイッチ
ハイブリダイゼーション検定で用いる場合、検出用プロ
ーブ−被検物質−捕捉プローブ複合体２６は、固体支持
体２４に対して結合した特異的結合対２２の第二メンバ
ーとの接触によって精製されうる。例えば、特異的結合
対の第二メンバーは、ガラスまたはアガロースビーズな
どのビーズ上に固定化することができる。試料とビーズ
との接触は、ビーズ上に複合体を固定化させるであろ
う。当該技術分野において知られているように、このよ
うなビーズに対する検出用プローブ−被検物質−捕捉プ
ローブ複合体の結合は、例えば、試料およびプローブを
ビーズと一緒に絶えず混合することによって促進されう
る。次に、ビーズを洗浄して、非結合プローブおよび非
特異的結合試料成分を除去することができる。次に、残
基１６を精製複合体から遊離させ、そして例えば、ＩＥ
Ｆによる濃縮のために、毛管などの分画チャンバに入れ
ることができる。
【００２４】特異的結合対２２の第二メンバーは、更
に、ディップスティックなどの固体支持体２４上に、ま
たは分画チャンバのルーメン中に、例えば、毛管のルー
メンの壁上に、またはこのようなチャンバ内に含まれる
任意の標準的なカラム充填材料（例えば、ガラスミクロ
ビーズ、アガロースビーズ、ガラスウール、またはポリ
アクリルアミドゲルなどのゲル）から製造されうるマト
リックス上に固定化することができる。例として、特異
的結合対は、１対の相補的オリゴヌクレオチド、例え
ば、ポリＡおよびポリＴオリゴヌクレオチドでありう
る。この立体配置は、一つの毛管、例えば、捕捉プロー
ブ１０がポリＴ結合部分１８を含むという条件で、固定
化されたポリＡ２２および任意の捕捉および検出用プロ
ーブセットを含む毛管２４の使用を可能にする。
に、ディップスティックなどの固体支持体２４上に、ま
たは分画チャンバのルーメン中に、例えば、毛管のルー
メンの壁上に、またはこのようなチャンバ内に含まれる
任意の標準的なカラム充填材料（例えば、ガラスミクロ
ビーズ、アガロースビーズ、ガラスウール、またはポリ
アクリルアミドゲルなどのゲル）から製造されうるマト
リックス上に固定化することができる。例として、特異
的結合対は、１対の相補的オリゴヌクレオチド、例え
ば、ポリＡおよびポリＴオリゴヌクレオチドでありう
る。この立体配置は、一つの毛管、例えば、捕捉プロー
ブ１０がポリＴ結合部分１８を含むという条件で、固定
化されたポリＡ２２および任意の捕捉および検出用プロ
ーブセットを含む毛管２４の使用を可能にする。
【００２５】特異的結合対として用いるためのオリゴヌ
クレオチドの最適長さおよび相補性のレベルは、当業者
によって容易に決定されうるし、そして配列組成、試料
の複雑性および検定条件（例えば、イオン強度、用いら
れる塩類の種類、有機溶媒の存在および／またはハイブ
リダイゼーション温度）等の因子に応じて変化しうる。
ホモポリマーオリゴヌクレオチド（例えば、ポリＡ、ポ
リＴ、ポリＧおよびポリＣ）の場合、例えば、特異的結
合対の第一メンバーは捕捉プローブの一成分であり、例
えば、８〜１００、１６〜６０または１８〜５０ヌクレ
オチド長さでありうる。特異的結合対の第二メンバーは
固体支持体上に（例えば、ディップスティック上にまた
は分画チャンバのルーメン中に）固定化されており、少
なくとも８ヌクレオチド長さであるべきであるが、好ま
しくは、はるかに長い、例えば、１６〜５０、１８〜１
００、または最大数百若しくは数千ヌクレオチドまでの
長さである。このような極めて長いホモポリマーオリゴ
ヌクレオチドは、標準的な方法を用いて、例えば、ター
ミナルトランスフェラーゼの使用によって製造される。
クレオチドの最適長さおよび相補性のレベルは、当業者
によって容易に決定されうるし、そして配列組成、試料
の複雑性および検定条件（例えば、イオン強度、用いら
れる塩類の種類、有機溶媒の存在および／またはハイブ
リダイゼーション温度）等の因子に応じて変化しうる。
ホモポリマーオリゴヌクレオチド（例えば、ポリＡ、ポ
リＴ、ポリＧおよびポリＣ）の場合、例えば、特異的結
合対の第一メンバーは捕捉プローブの一成分であり、例
えば、８〜１００、１６〜６０または１８〜５０ヌクレ
オチド長さでありうる。特異的結合対の第二メンバーは
固体支持体上に（例えば、ディップスティック上にまた
は分画チャンバのルーメン中に）固定化されており、少
なくとも８ヌクレオチド長さであるべきであるが、好ま
しくは、はるかに長い、例えば、１６〜５０、１８〜１
００、または最大数百若しくは数千ヌクレオチドまでの
長さである。このような極めて長いホモポリマーオリゴ
ヌクレオチドは、標準的な方法を用いて、例えば、ター
ミナルトランスフェラーゼの使用によって製造される。
【００２６】ヘテロポリマーオリゴヌクレオチド対の場
合、特異的結合対の第一および第二メンバーは、例え
ば、８〜１００、１６〜５０または１８〜４０ヌクレオ
チド長さでありうる。ホモポリマーおよびヘテロポリマ
ー両方について特異的結合対の第二メンバーは、リンカ
ー、例えば、３−グリシドオキシプロピルトリメトキシ
シランリンカーのような可変性炭素鎖によって固体支持
体に対して結合させることができる（例えば、マスコス
（Maskos）ら、Nucl.Acids Res.20(7):1679-1684，1992
年を参照されたい）。
合、特異的結合対の第一および第二メンバーは、例え
ば、８〜１００、１６〜５０または１８〜４０ヌクレオ
チド長さでありうる。ホモポリマーおよびヘテロポリマ
ー両方について特異的結合対の第二メンバーは、リンカ
ー、例えば、３−グリシドオキシプロピルトリメトキシ
シランリンカーのような可変性炭素鎖によって固体支持
体に対して結合させることができる（例えば、マスコス
（Maskos）ら、Nucl.Acids Res.20(7):1679-1684，1992
年を参照されたい）。
【００２７】捕捉プローブ自体もまた、分画チャンバ
（例えば、毛管）のルーメン中にまたは、ルーメンの壁
上に若しくはルーメン中の任意の標準的なカラム充填材
料（例えば、ガラスミクロビーズ、アガロースビーズ、
ガラスウール、またはポリアクリルアミドゲルなどのゲ
ル）から製造されうるマトリックス上に固定化すること
ができる。プローブ（例えば、核酸またはタンパク質プ
ローブ）をガラスまたはプラスチック表面などの表面上
に、例えば、毛管の内部に固定化する方法は、当該技術
分野において周知である。例えば、上述のように、オリ
ゴヌクレオチドは、表面（例えば、ガラス、プラスチッ
ク（例えば、ポリプロピレン）、ケイ素、金または白金
などから製造される平滑または多孔質表面）に対して、
３−グリシドオキシプロピルトリメトキシシランリンカ
ーのようなリンカーの使用によって結合させることがで
きる（例えば、マスコスら、上記を参照されたい）。
（例えば、毛管）のルーメン中にまたは、ルーメンの壁
上に若しくはルーメン中の任意の標準的なカラム充填材
料（例えば、ガラスミクロビーズ、アガロースビーズ、
ガラスウール、またはポリアクリルアミドゲルなどのゲ
ル）から製造されうるマトリックス上に固定化すること
ができる。プローブ（例えば、核酸またはタンパク質プ
ローブ）をガラスまたはプラスチック表面などの表面上
に、例えば、毛管の内部に固定化する方法は、当該技術
分野において周知である。例えば、上述のように、オリ
ゴヌクレオチドは、表面（例えば、ガラス、プラスチッ
ク（例えば、ポリプロピレン）、ケイ素、金または白金
などから製造される平滑または多孔質表面）に対して、
３−グリシドオキシプロピルトリメトキシシランリンカ
ーのようなリンカーの使用によって結合させることがで
きる（例えば、マスコスら、上記を参照されたい）。
【００２８】試料および検出用プローブは、このような
分画チャンバの外部で互いに接触させた後、混合物とし
てチャンバに加えることができるし、または別個に、同
時にかまたは逐次的にチャンバに加えることができる。
分画チャンバ中の検出用プローブ−被検物質−捕捉プロ
ーブ複合体の形成は、電気泳動または標的被検物質をチ
ャンバの一端からもう一端へ各々の回にそれが結合しう
る固定化捕捉プローブを通過するように物理的（例え
ば、機械的ポンプ）に移動させることによって容易にな
りうる。複合体がいったん形成されたら、非特異的結合
試料成分および非結合検出用プローブは、チャンバに電
場を与えることによって、物理的洗浄によって、または
これらの方法の組合わせによってチャンバから除去する
ことができる。次に、残基を、固定化した検出用プロー
ブから遊離させ且つＩＥＦによって集中させる（focu
s）ことができる。以下に更に記載のように、多数の標
的被検物質に特異的な多数の捕捉プローブを、一つの毛
管のルーメン中の無作為の位置に固定化することができ
る。このような立体配置は、それぞれの検出用プローブ
に対して等電点が異なる残基の使用に応じて、単一の検
定において多数の標的被検物質を検出することを容易に
する。
分画チャンバの外部で互いに接触させた後、混合物とし
てチャンバに加えることができるし、または別個に、同
時にかまたは逐次的にチャンバに加えることができる。
分画チャンバ中の検出用プローブ−被検物質−捕捉プロ
ーブ複合体の形成は、電気泳動または標的被検物質をチ
ャンバの一端からもう一端へ各々の回にそれが結合しう
る固定化捕捉プローブを通過するように物理的（例え
ば、機械的ポンプ）に移動させることによって容易にな
りうる。複合体がいったん形成されたら、非特異的結合
試料成分および非結合検出用プローブは、チャンバに電
場を与えることによって、物理的洗浄によって、または
これらの方法の組合わせによってチャンバから除去する
ことができる。次に、残基を、固定化した検出用プロー
ブから遊離させ且つＩＥＦによって集中させる（focu
s）ことができる。以下に更に記載のように、多数の標
的被検物質に特異的な多数の捕捉プローブを、一つの毛
管のルーメン中の無作為の位置に固定化することができ
る。このような立体配置は、それぞれの検出用プローブ
に対して等電点が異なる残基の使用に応じて、単一の検
定において多数の標的被検物質を検出することを容易に
する。
【００２９】上記のサンドイッチハイブリダイゼーショ
ン検定に加えて、例えば、ディップスティックまたは一
つの標識プローブの使用を用いる他の標準的なハイブリ
ダイゼーション法を、本発明の方法で用いることができ
る。ディップスティックは、例えば、多数の捕捉プロー
ブを結合させる固体支持体として働くことによって用い
ることができる。したがって、検出用プローブ−被検物
質−捕捉プローブ複合体は、ディップスティック上で形
成されうるし、そして精製された複合体から遊離した残
基は、以下に記載のように、ＩＥＦによって分画されう
る。ディップスティックは、更に、捕捉プローブ上に存
在するその同族体結合パートナー（例えば、ポリＴ域）
に対して結合する特異的結合対の固定化されたメンバー
（例えば、ポリＡ域）を含む（上記を参照されたい）。
この種類の立体配置は、多数の被検物質に特異的な捕捉
プローブと一緒に用いられる固定化したプローブのたっ
た一つの種を含むディップスティックの使用を可能にす
る。
ン検定に加えて、例えば、ディップスティックまたは一
つの標識プローブの使用を用いる他の標準的なハイブリ
ダイゼーション法を、本発明の方法で用いることができ
る。ディップスティックは、例えば、多数の捕捉プロー
ブを結合させる固体支持体として働くことによって用い
ることができる。したがって、検出用プローブ−被検物
質−捕捉プローブ複合体は、ディップスティック上で形
成されうるし、そして精製された複合体から遊離した残
基は、以下に記載のように、ＩＥＦによって分画されう
る。ディップスティックは、更に、捕捉プローブ上に存
在するその同族体結合パートナー（例えば、ポリＴ域）
に対して結合する特異的結合対の固定化されたメンバー
（例えば、ポリＡ域）を含む（上記を参照されたい）。
この種類の立体配置は、多数の被検物質に特異的な捕捉
プローブと一緒に用いられる固定化したプローブのたっ
た一つの種を含むディップスティックの使用を可能にす
る。
【００３０】標的被検物質 本発明の方法を用いて検出することができる標的被検物
質としては、例えば、核酸、タンパク質、炭水化物、脂
質、代謝産物、ビタミン類および薬物がある。このよう
な分子の検出は、医学、法医学、農業、工業、食品科学
および獣医学などの分野において有用でありうる。例え
ば、医学の分野において、本発明の方法は、特定のマー
カー（例えば、タンパク質または核酸マーカー）の存在
若しくは不存在および／または天然に存在するタンパク
質（例えば、ホルモン、サイトカイン、リンホカイン、
抗体または酵素）若しくは核酸の変化量により特徴づけ
られる症状の診断において用いることができる。本発明
の方法はまた、例えば、一つの塩基対変化、小さい若し
くは大きい欠失、挿入若しくは転位（例えば、以下に記
載の染色体転座）により特徴づけることができる遺伝子
突然変異、および遺伝子多形性を検出するのに用いるこ
とができる。更に、本発明の方法は、試料、例えば、患
者からの試料中の感染性病原体（例えば、細菌、ウイル
ス、原生動物、寄生生物または真菌）の存在を検出する
のに用いることができる。本発明の方法を用いて検査さ
れうる試料としては、例えば、血液、血清、血漿、尿お
よび唾液などの体液、並びに植物抽出物、細胞抽出物、
細胞培養培地および発酵混合物がある。必要ならば、本
方法を用いる前に、標準的な方法を用いて試料からタン
パク質および／または核酸調製試料を調製することがで
きる。以下で論評されるように、その方法の感度ゆえ
に、本発明の方法を行うには、僅か少量の試料だけが必
要とされる。
質としては、例えば、核酸、タンパク質、炭水化物、脂
質、代謝産物、ビタミン類および薬物がある。このよう
な分子の検出は、医学、法医学、農業、工業、食品科学
および獣医学などの分野において有用でありうる。例え
ば、医学の分野において、本発明の方法は、特定のマー
カー（例えば、タンパク質または核酸マーカー）の存在
若しくは不存在および／または天然に存在するタンパク
質（例えば、ホルモン、サイトカイン、リンホカイン、
抗体または酵素）若しくは核酸の変化量により特徴づけ
られる症状の診断において用いることができる。本発明
の方法はまた、例えば、一つの塩基対変化、小さい若し
くは大きい欠失、挿入若しくは転位（例えば、以下に記
載の染色体転座）により特徴づけることができる遺伝子
突然変異、および遺伝子多形性を検出するのに用いるこ
とができる。更に、本発明の方法は、試料、例えば、患
者からの試料中の感染性病原体（例えば、細菌、ウイル
ス、原生動物、寄生生物または真菌）の存在を検出する
のに用いることができる。本発明の方法を用いて検査さ
れうる試料としては、例えば、血液、血清、血漿、尿お
よび唾液などの体液、並びに植物抽出物、細胞抽出物、
細胞培養培地および発酵混合物がある。必要ならば、本
方法を用いる前に、標準的な方法を用いて試料からタン
パク質および／または核酸調製試料を調製することがで
きる。以下で論評されるように、その方法の感度ゆえ
に、本発明の方法を行うには、僅か少量の試料だけが必
要とされる。
【００３１】プローブ 本発明で用いられる特異的プローブの種類は、検出され
るべき標的被検物質の具体的な種類に依り、且つ当該技
術分野において周知である。例えば、核酸標的（例え
ば、ＤＮＡまたはＲＮＡ標的）の場合、核酸プローブを
用いることができる。核酸プローブは、デオキシリボヌ
クレオチド、リボヌクレオチドまたはそれらの組み合わ
せ若しくは修飾を含むことができる。特異的結合を達成
するための最適の配列、長さおよび標的被検物質との相
補性のレベルは、当業者によって容易に決定されるパラ
メーターである。例えば、プローブは、標的核酸被検物
質に対して相補的である連続したヌクレオチドを少なく
とも８個、例えば、１６〜１００個または１８〜４０個
含むことができる。このようなプローブの設計は、標準
的なプロトコルマニュアルおよび公的に利用可能な計算
機プログラムを参照して容易にすることができる（例え
ば、オースベル（Ausubel）ら監修、Current Protocols
in Molecular Biology，ウィリー・アンド・サンズ（W
iley & Sons），ニューヨーク，1989年を参照された
い）。核酸プローブの合成は、標準的な化学的または組
換え方法を用いて行うことができる。或いは、核酸プロ
ーブは、販売業者から購入することができる。核酸プロ
ーブは、一本鎖であってもよく、または一本鎖領域およ
び二本鎖領域を含むことができる。核酸プローブの他
に、核酸標的被検物質は、ポリペプチドプローブ、例え
ば、ヌクレオチド配列特異的核酸結合ドメインを含むプ
ローブを用いて検出することができる。
るべき標的被検物質の具体的な種類に依り、且つ当該技
術分野において周知である。例えば、核酸標的（例え
ば、ＤＮＡまたはＲＮＡ標的）の場合、核酸プローブを
用いることができる。核酸プローブは、デオキシリボヌ
クレオチド、リボヌクレオチドまたはそれらの組み合わ
せ若しくは修飾を含むことができる。特異的結合を達成
するための最適の配列、長さおよび標的被検物質との相
補性のレベルは、当業者によって容易に決定されるパラ
メーターである。例えば、プローブは、標的核酸被検物
質に対して相補的である連続したヌクレオチドを少なく
とも８個、例えば、１６〜１００個または１８〜４０個
含むことができる。このようなプローブの設計は、標準
的なプロトコルマニュアルおよび公的に利用可能な計算
機プログラムを参照して容易にすることができる（例え
ば、オースベル（Ausubel）ら監修、Current Protocols
in Molecular Biology，ウィリー・アンド・サンズ（W
iley & Sons），ニューヨーク，1989年を参照された
い）。核酸プローブの合成は、標準的な化学的または組
換え方法を用いて行うことができる。或いは、核酸プロ
ーブは、販売業者から購入することができる。核酸プロ
ーブは、一本鎖であってもよく、または一本鎖領域およ
び二本鎖領域を含むことができる。核酸プローブの他
に、核酸標的被検物質は、ポリペプチドプローブ、例え
ば、ヌクレオチド配列特異的核酸結合ドメインを含むプ
ローブを用いて検出することができる。
【００３２】タンパク質標的（例えば、抗体、ホルモ
ン、酵素、病原体タンパク質、サイトカインおよびリン
ホカイン）の場合、被検物質に対して特異的に結合する
モノクローナル抗体などの抗体を本発明で用いることが
できる。抗体を産生する技術は、当該技術分野において
周知である（例えば、ハーロー（Harlow）ら、Antibodi
es,A Laboratory Manual，コールド・スプリング・ハー
バー・ラボラトリー・プレス（Cold Spring Harbor Lab
oratory Press），コールド・スプリング・ハーバー，
ニューヨーク，1988年を参照されたい）。特に有用な抗
体分子としては、免疫グロブリンのＦａｂフラグメン
ト、ならびに、組換えによって製造された一本鎖抗体が
ある（例えば、ヒューストン（Huston）ら、米国特許第
5,091,513号明細書（1992）および同第5,132,405号明細
書（1992）；およびラドナー（Ladner）ら、米国特許第
4,704,692号明細書（1987）および同第4,946,778号明細
書（1990）を参照されたい）。抗体の他に、標的タンパ
ク質被検物質に対して特異的に結合する非抗体タンパク
質および核酸を用いることができる。
ン、酵素、病原体タンパク質、サイトカインおよびリン
ホカイン）の場合、被検物質に対して特異的に結合する
モノクローナル抗体などの抗体を本発明で用いることが
できる。抗体を産生する技術は、当該技術分野において
周知である（例えば、ハーロー（Harlow）ら、Antibodi
es,A Laboratory Manual，コールド・スプリング・ハー
バー・ラボラトリー・プレス（Cold Spring Harbor Lab
oratory Press），コールド・スプリング・ハーバー，
ニューヨーク，1988年を参照されたい）。特に有用な抗
体分子としては、免疫グロブリンのＦａｂフラグメン
ト、ならびに、組換えによって製造された一本鎖抗体が
ある（例えば、ヒューストン（Huston）ら、米国特許第
5,091,513号明細書（1992）および同第5,132,405号明細
書（1992）；およびラドナー（Ladner）ら、米国特許第
4,704,692号明細書（1987）および同第4,946,778号明細
書（1990）を参照されたい）。抗体の他に、標的タンパ
ク質被検物質に対して特異的に結合する非抗体タンパク
質および核酸を用いることができる。
【００３３】上述のように、本発明の方法で用いられる
捕捉プローブは、例えば、（１）特異的結合対の第一メ
ンバーを含むことができ、または（２）固体支持体上に
（例えば、ディップスティック上または、毛管などの分
画チャンバのルーメン中の固体支持体上に）固定化する
ことができる。捕捉プローブと組み合わせて用いること
ができる結合対としては、例えば、ストレプトアビジン
−ビオチン、ならびに、抗体−抗原、酵素−基質、受容
体−リガンド（例えば、ホルモン）、核酸−核酸結合タ
ンパク質および核酸−核酸結合対並びに当該技術分野に
おいて知られている他の特異的結合対がある。結合対の
第二メンバーは、標準的な方法を用いてアガロースビー
ズ若しくはガラスミクロビーズなどの固体支持体上に固
定化され、またはこのような複合体を販売業者から購入
することができる。例えば、分画チャンバのルーメンま
たは、分画チャンバ中に含まれうるガラスミクロビーズ
に対する捕捉プローブの固定化は、上記に記載されてい
る。本発明の方法で用いられる検出用プローブは、残基
を含み、これを以下に記載する。
捕捉プローブは、例えば、（１）特異的結合対の第一メ
ンバーを含むことができ、または（２）固体支持体上に
（例えば、ディップスティック上または、毛管などの分
画チャンバのルーメン中の固体支持体上に）固定化する
ことができる。捕捉プローブと組み合わせて用いること
ができる結合対としては、例えば、ストレプトアビジン
−ビオチン、ならびに、抗体−抗原、酵素−基質、受容
体−リガンド（例えば、ホルモン）、核酸−核酸結合タ
ンパク質および核酸−核酸結合対並びに当該技術分野に
おいて知られている他の特異的結合対がある。結合対の
第二メンバーは、標準的な方法を用いてアガロースビー
ズ若しくはガラスミクロビーズなどの固体支持体上に固
定化され、またはこのような複合体を販売業者から購入
することができる。例えば、分画チャンバのルーメンま
たは、分画チャンバ中に含まれうるガラスミクロビーズ
に対する捕捉プローブの固定化は、上記に記載されてい
る。本発明の方法で用いられる検出用プローブは、残基
を含み、これを以下に記載する。
【００３４】残基 上述のように、本発明において用いられる検出用プロー
ブは、（１）検出可能な標識（例えば、蛍光、リン光、
放射性、発光または着色標識）を含み且つ（２）その単
離および／または濃縮を可能とする性状、例えば、予め
決定されたｐＩを有する残基を含む。残基は、これらの
性状の両方を有する一つの残基でありうるし、または一
緒になってこれらの性状を有する残基を与える２個また
はそれ以上の分子の複合体でありうる。残基は、天然に
存在する分子であってもよく、または化学的に合成する
ことができる。例えば、残基は、タンパク質、ペプチ
ド、タンパク質複合体、核酸、炭水化物、有機分子また
はそれらの修飾若しくは組み合わせでありうる。残基と
ともに用いることができる標識としては、例えば、蛍光
標識（例えば、フルオレセイン、ローダミンまたはテキ
サスレッド）、蛍光標識の混合物、発色団、リン光物質
および発光物質がある。
ブは、（１）検出可能な標識（例えば、蛍光、リン光、
放射性、発光または着色標識）を含み且つ（２）その単
離および／または濃縮を可能とする性状、例えば、予め
決定されたｐＩを有する残基を含む。残基は、これらの
性状の両方を有する一つの残基でありうるし、または一
緒になってこれらの性状を有する残基を与える２個また
はそれ以上の分子の複合体でありうる。残基は、天然に
存在する分子であってもよく、または化学的に合成する
ことができる。例えば、残基は、タンパク質、ペプチ
ド、タンパク質複合体、核酸、炭水化物、有機分子また
はそれらの修飾若しくは組み合わせでありうる。残基と
ともに用いることができる標識としては、例えば、蛍光
標識（例えば、フルオレセイン、ローダミンまたはテキ
サスレッド）、蛍光標識の混合物、発色団、リン光物質
および発光物質がある。
【００３５】本発明で用いることができる残基の具体的
な例としては、例えば、フィコビリタンパク質ファミリ
ーのメンバー（例えば、フィコエリトリンおよびアロフ
ィコシアニン）、Starburst Dendrimers（シグマ・ケミ
カル（Sigma Chemical）、セント・ルイス，ＭＯ）、小
アミノ酸鎖（例えば、タンパク質分解切断部位を含むア
ミノ酸鎖）に結合したＦＩＴＣ、および蛍光デキストラ
ン（モレキュラー・プローブス（Molecular Probes），
ユージーン，ＯＲ；例えば、発蛍光団などによって被覆
された数ナノメートル直径のデキストラン微粒子；微粒
子は、ジスルフィド結合などの切断可能な架橋を含むポ
リスチレンスペーサーアームによって検出用プローブに
対して結合することができる）がある。適当な残基およ
び化学結合の他の例は、例えば、ホーグランド（Haugla
nd）、「Handbook of Fluorescent Probes and Researc
h Chemicals」，モレキュラー・プローブス・インコー
ポレーテッド，ユージーン，ＯＲ，1992年に見出すこと
ができる。
な例としては、例えば、フィコビリタンパク質ファミリ
ーのメンバー（例えば、フィコエリトリンおよびアロフ
ィコシアニン）、Starburst Dendrimers（シグマ・ケミ
カル（Sigma Chemical）、セント・ルイス，ＭＯ）、小
アミノ酸鎖（例えば、タンパク質分解切断部位を含むア
ミノ酸鎖）に結合したＦＩＴＣ、および蛍光デキストラ
ン（モレキュラー・プローブス（Molecular Probes），
ユージーン，ＯＲ；例えば、発蛍光団などによって被覆
された数ナノメートル直径のデキストラン微粒子；微粒
子は、ジスルフィド結合などの切断可能な架橋を含むポ
リスチレンスペーサーアームによって検出用プローブに
対して結合することができる）がある。適当な残基およ
び化学結合の他の例は、例えば、ホーグランド（Haugla
nd）、「Handbook of Fluorescent Probes and Researc
h Chemicals」，モレキュラー・プローブス・インコー
ポレーテッド，ユージーン，ＯＲ，1992年に見出すこと
ができる。
【００３６】ストレプトアビジン−フィコエリトリンコ
ンジュゲートは、それらの蛍光収率／分子比率がローダ
ミン分子１００個またはフルオレセイン分子３０個のそ
れとほぼ等しいので、極めて敏感な標識である。商業的
に入手可能なストレプトアビジン−フィコエリトリンコ
ンジュゲート（モレキュラー・プローブス，ユージー
ン，ＯＲ）は、酸性ｐＩを有する多数の別個のピークに
集中する。したがって、ストレプトアビジン−フィコエ
リトリンは、別個のｐＩを有する多数の別々の残基の単
離用の源である。ストレプトアビジン−フィコエリトリ
ンは、ＩＥＦによって、例えば、狭いｐＨ勾配中で分画
することができ、そして別個のｐＩを有する種に対応す
るピークを、別々の残基として用いるためにプールする
ことができる。
ンジュゲートは、それらの蛍光収率／分子比率がローダ
ミン分子１００個またはフルオレセイン分子３０個のそ
れとほぼ等しいので、極めて敏感な標識である。商業的
に入手可能なストレプトアビジン−フィコエリトリンコ
ンジュゲート（モレキュラー・プローブス，ユージー
ン，ＯＲ）は、酸性ｐＩを有する多数の別個のピークに
集中する。したがって、ストレプトアビジン−フィコエ
リトリンは、別個のｐＩを有する多数の別々の残基の単
離用の源である。ストレプトアビジン−フィコエリトリ
ンは、ＩＥＦによって、例えば、狭いｐＨ勾配中で分画
することができ、そして別個のｐＩを有する種に対応す
るピークを、別々の残基として用いるためにプールする
ことができる。
【００３７】別個のｐＩを有する残基は、化学的処理に
よって得ることもできる。例えば、水溶性カルボジイミ
ド／Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（ＮＨＳ）／
エチレンジアミン（以下を参照されたい）によるストレ
プトアビジン−フィコエリトリンの処理は、タンパク質
のｐＩを増加させるエチレンジアミンを含むストレプト
アビジン−フィコエリトリン生成物の多様性の生成を引
き起こす。これらの生成物は６〜９の範囲のｐＩを有
し、そして残基として用いるための別個の種に分画する
ことができる。残基の修飾変種、例えば、フィコエリト
リンは、これらの方法または当該技術分野における任意
の他の標準的な方法を用いて製造することができる。
よって得ることもできる。例えば、水溶性カルボジイミ
ド／Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（ＮＨＳ）／
エチレンジアミン（以下を参照されたい）によるストレ
プトアビジン−フィコエリトリンの処理は、タンパク質
のｐＩを増加させるエチレンジアミンを含むストレプト
アビジン−フィコエリトリン生成物の多様性の生成を引
き起こす。これらの生成物は６〜９の範囲のｐＩを有
し、そして残基として用いるための別個の種に分画する
ことができる。残基の修飾変種、例えば、フィコエリト
リンは、これらの方法または当該技術分野における任意
の他の標準的な方法を用いて製造することができる。
【００３８】残基は、用いられるプローブおよび残基の
種類に基づいて選択される標準的な方法を用いて検出用
プローブに対して結合させることができる。例えば、第
一アミンを含む分子（例えば、タンパク質または核酸分
子）は、例えば、以下のように、ビオチンおよびジスル
フィド架橋を含む分子に対して結合することができる。
第一アミンを含む分子を、中性またはそれより上のｐＨ
で、スペーサーアーム（例えば、ＥＺ−リンク ＮＨＳ
−ＳＳ−ビオチン、ピアース・ケミカル・カンパニー
（Pierce Chemical Co.），ロックフォード，ＩＬ）中
にジスルフィド結合を含むビオチンのＮ−ヒドロキシス
ルホスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルと反応させて、
ＳＳ−ビオチンとの分子の共有結合およびＮ−ヒドロキ
シスルホスクシンイミドの遊離を引き起こす。このよう
な修飾分子の使用の具体的な例として、ＳＳ−ビオチン
に対して結合した被検物質特異的核酸プローブを、アビ
ジン−フィコエリトリンと結合させて、完全な検出用プ
ローブを形成することができる。残基の遊離は、検出用
プローブ−被検物質−捕捉プローブ複合体の単離後に、
ジチオトレイトールまたはβ−メルカプトエタノールな
どの還元剤と複合体を接触させることによって達成する
ことができる。
種類に基づいて選択される標準的な方法を用いて検出用
プローブに対して結合させることができる。例えば、第
一アミンを含む分子（例えば、タンパク質または核酸分
子）は、例えば、以下のように、ビオチンおよびジスル
フィド架橋を含む分子に対して結合することができる。
第一アミンを含む分子を、中性またはそれより上のｐＨ
で、スペーサーアーム（例えば、ＥＺ−リンク ＮＨＳ
−ＳＳ−ビオチン、ピアース・ケミカル・カンパニー
（Pierce Chemical Co.），ロックフォード，ＩＬ）中
にジスルフィド結合を含むビオチンのＮ−ヒドロキシス
ルホスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルと反応させて、
ＳＳ−ビオチンとの分子の共有結合およびＮ−ヒドロキ
シスルホスクシンイミドの遊離を引き起こす。このよう
な修飾分子の使用の具体的な例として、ＳＳ−ビオチン
に対して結合した被検物質特異的核酸プローブを、アビ
ジン−フィコエリトリンと結合させて、完全な検出用プ
ローブを形成することができる。残基の遊離は、検出用
プローブ−被検物質−捕捉プローブ複合体の単離後に、
ジチオトレイトールまたはβ−メルカプトエタノールな
どの還元剤と複合体を接触させることによって達成する
ことができる。
【００３９】もう一つの周知のカップリング反応は、Ｅ
ＤＡＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミド）（バイオラド（Biorad），ケンブ
リッジ，ＭＡ）などのカルボジイミドカップリング試薬
の存在下における一つの分子上のカルボキシル基と別の
分子上の第一アミンとの反応を含む。これらの成分の反
応は、尿素の遊離を伴って、二つの分子間に共有結合を
生じる。残基はまた、第一アミンなどの反応性基を含む
ヌクレオチドの化学修飾により、合成中または後に、修
飾されたヌクレオチドとして検出用プローブ中に導入す
ることができる（上記を参照されたい）。
ＤＡＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミド）（バイオラド（Biorad），ケンブ
リッジ，ＭＡ）などのカルボジイミドカップリング試薬
の存在下における一つの分子上のカルボキシル基と別の
分子上の第一アミンとの反応を含む。これらの成分の反
応は、尿素の遊離を伴って、二つの分子間に共有結合を
生じる。残基はまた、第一アミンなどの反応性基を含む
ヌクレオチドの化学修飾により、合成中または後に、修
飾されたヌクレオチドとして検出用プローブ中に導入す
ることができる（上記を参照されたい）。
【００４０】被検物質結合領域と残基との間に核酸セグ
メントを含む検出用プローブ（例えば、核酸プローブ）
の場合、ヌクレアーゼを用いて、検出用プローブ−被検
物質−捕捉プローブ複合体から残基を遊離させることが
できる。例えば、ＤＮＡｓｅを用いて、ＤＮＡを含むプ
ローブから残基を遊離させることができるし、ＲＮＡｓ
ｅ（例えば、ＲＮＡｓｅＡまたはＳ１ヌクレアーゼ）を
用いて、ＲＮＡを含むプローブから残基を遊離させるこ
とができる。当然ながら、このような酵素は、それらが
残基の一体性に悪影響を与える場合には用いられるべき
でない。
メントを含む検出用プローブ（例えば、核酸プローブ）
の場合、ヌクレアーゼを用いて、検出用プローブ−被検
物質−捕捉プローブ複合体から残基を遊離させることが
できる。例えば、ＤＮＡｓｅを用いて、ＤＮＡを含むプ
ローブから残基を遊離させることができるし、ＲＮＡｓ
ｅ（例えば、ＲＮＡｓｅＡまたはＳ１ヌクレアーゼ）を
用いて、ＲＮＡを含むプローブから残基を遊離させるこ
とができる。当然ながら、このような酵素は、それらが
残基の一体性に悪影響を与える場合には用いられるべき
でない。
【００４１】ＤＮＡｓｅおよびＲＮＡｓｅなどの酵素の
他に、配列特異性を有する酵素を用いて検出用プローブ
から残基を遊離させることができる。例えば、残基は、
制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む一本または二本
鎖ＤＮＡ配列によってプローブに対して結合させること
ができる。複合体の単離後、残基は、標準的な方法を用
いて、適当な制限エンドヌクレアーゼとのインキュベー
ションによって複合体から遊離させることができる。残
基に隣接した特異的リボヌクレオチド配列を含むプロー
ブを用いると、リボザイムを用いて遊離させることがで
きる。
他に、配列特異性を有する酵素を用いて検出用プローブ
から残基を遊離させることができる。例えば、残基は、
制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む一本または二本
鎖ＤＮＡ配列によってプローブに対して結合させること
ができる。複合体の単離後、残基は、標準的な方法を用
いて、適当な制限エンドヌクレアーゼとのインキュベー
ションによって複合体から遊離させることができる。残
基に隣接した特異的リボヌクレオチド配列を含むプロー
ブを用いると、リボザイムを用いて遊離させることがで
きる。
【００４２】残基はまた、配列特異的酵素によって切断
されうるアミノ酸配列を含むペプチド結合によって検出
用プローブ（例えば、核酸およびポリペプチド検出用プ
ローブ）に対して結合させることができる。例えば、残
基は、ピログルタミルペプチダーゼＩＩなどの酵素によ
って認識される配列を有するペプチドによってプローブ
に対して結合することができる（例えば、ウィルク（Wi
lk）ら、Neurochem.Int.15(1):81-89，1989年；ウィル
クら、Neuropeptides 12:43-47，1988年；ウィルク、Li
fe Sciences 39:1487-1492，1986年；チャーリ（Charl
i）ら、Neuropeptides 9:373-378，1987年を参照された
い）。このようなポリペプチドプローブは、例えば、標
準的な組換え法を用いて製造することができる（例え
ば、オースベルら、上記を参照されたい）。
されうるアミノ酸配列を含むペプチド結合によって検出
用プローブ（例えば、核酸およびポリペプチド検出用プ
ローブ）に対して結合させることができる。例えば、残
基は、ピログルタミルペプチダーゼＩＩなどの酵素によ
って認識される配列を有するペプチドによってプローブ
に対して結合することができる（例えば、ウィルク（Wi
lk）ら、Neurochem.Int.15(1):81-89，1989年；ウィル
クら、Neuropeptides 12:43-47，1988年；ウィルク、Li
fe Sciences 39:1487-1492，1986年；チャーリ（Charl
i）ら、Neuropeptides 9:373-378，1987年を参照された
い）。このようなポリペプチドプローブは、例えば、標
準的な組換え法を用いて製造することができる（例え
ば、オースベルら、上記を参照されたい）。
【００４３】プローブに対して残基を結合する更に別の
方法は当該技術分野において周知であり、例えば、生物
分解性エステルリンカーの使用がある。例えば、パルミ
トイル残基は、エステラーゼによって切断しうる結合に
よって核酸プローブの５’末端に対して結合することが
できる（例えば、ポルシン（Polushin）ら、NucleicAci
ds Res.22:5492-5496，1994年を参照されたい）。当該
技術分野において周知のように、エステル架橋はまた、
ｐＨを中性から９〜１０まで増加させることによって切
断することができる。特定の波長の照射によって切断さ
れる光化学的架橋もまた用いることができる。残基はま
た、抗体−抗原および受容体−リガンド相互作用によっ
て検出用プローブに対して結合することができる。例え
ば、α−マンノピラノシル残基またはα−グルコピラノ
シル残基に対して結合する複合糖質、例えば、コンカナ
バリンＡに対して結合する標識レクチンを用いることが
できる。更に、残基は、ポリペプチドプローブなどのプ
ローブに対して架橋することができる。
方法は当該技術分野において周知であり、例えば、生物
分解性エステルリンカーの使用がある。例えば、パルミ
トイル残基は、エステラーゼによって切断しうる結合に
よって核酸プローブの５’末端に対して結合することが
できる（例えば、ポルシン（Polushin）ら、NucleicAci
ds Res.22:5492-5496，1994年を参照されたい）。当該
技術分野において周知のように、エステル架橋はまた、
ｐＨを中性から９〜１０まで増加させることによって切
断することができる。特定の波長の照射によって切断さ
れる光化学的架橋もまた用いることができる。残基はま
た、抗体−抗原および受容体−リガンド相互作用によっ
て検出用プローブに対して結合することができる。例え
ば、α−マンノピラノシル残基またはα−グルコピラノ
シル残基に対して結合する複合糖質、例えば、コンカナ
バリンＡに対して結合する標識レクチンを用いることが
できる。更に、残基は、ポリペプチドプローブなどのプ
ローブに対して架橋することができる。
【００４４】等電点電気泳動 精製された検出用プローブ−被検物質−捕捉プローブ複
合体から切断された残基を、ｐＨ勾配中においてＩＥＦ
によって濃縮して、続く検出を容易にすることができ
る。ｐＨ勾配は、種々の量の水素供与基および水素受容
基を含む化合物（例えば、低分子量ポリアミノポリカル
ボン酸またはグリシンのポリマー、グリシルグリシン、
アミン、エピクロロヒドリン）である両性電解質の混合
物に対して電場を与えることによって生じることができ
る。電荷勾配の存在下において、両性電解質は、それら
のｐＩまで、すなわち、それらの正味電荷がゼロである
陽極と陰極との間の位置まで移動する。両性電解質は、
密な間隔のｐＩ値および高導電率を有することができ、
したがって、電場を与えた際に、滑らかなｐＨ勾配に分
かれることができる。
合体から切断された残基を、ｐＨ勾配中においてＩＥＦ
によって濃縮して、続く検出を容易にすることができ
る。ｐＨ勾配は、種々の量の水素供与基および水素受容
基を含む化合物（例えば、低分子量ポリアミノポリカル
ボン酸またはグリシンのポリマー、グリシルグリシン、
アミン、エピクロロヒドリン）である両性電解質の混合
物に対して電場を与えることによって生じることができ
る。電荷勾配の存在下において、両性電解質は、それら
のｐＩまで、すなわち、それらの正味電荷がゼロである
陽極と陰極との間の位置まで移動する。両性電解質は、
密な間隔のｐＩ値および高導電率を有することができ、
したがって、電場を与えた際に、滑らかなｐＨ勾配に分
かれることができる。
【００４５】具体的な両性電解質は、分画すべき１種類
または複数の残基に応じて選択することができる。例え
ば、浅い勾配、すなわち、単位長さ当たりのｐＨ変化が
比較的小さい勾配は、それらが類似のｐＩを有する残基
の分割を可能にするので、しばしば有用である。例え
ば、２．０ｐＨ単位未満にわたるようなｐＨ勾配を用い
ることができる。このような勾配は、近い関係にある化
学的構造を有するファミリーのメンバー間の分割を可能
にし、そして例えば、慣用的な両性電解質混合物を分画
して狭いｐＨ範囲を有する標品を得ることによって容易
に調製されうる。勾配の両端が、残基の予め決定された
ｐＩにかなり近い一定のｐＨ範囲を有するように勾配を
調製することは、しばしば有用である。例えば、ｐＩ
８．２の残基を検出するための勾配は、ｐＨ７．７〜ｐ
Ｈ８．７にわたることができる。この設計を用いて、勾
配の範囲外のｐＩを有する試料中の帯電種を排除するこ
とができる。このような種は、速やかに両極に移動す
る。両性電解質は、バイオ・ラド（ケンブリッジ、Ｍ
Ａ）およびファーマシア・バイオテク（Pharmacia Biot
ech）（ピスカタウェイ、ＮＪ）などのいくつかの製造
業者から入手可能である。
または複数の残基に応じて選択することができる。例え
ば、浅い勾配、すなわち、単位長さ当たりのｐＨ変化が
比較的小さい勾配は、それらが類似のｐＩを有する残基
の分割を可能にするので、しばしば有用である。例え
ば、２．０ｐＨ単位未満にわたるようなｐＨ勾配を用い
ることができる。このような勾配は、近い関係にある化
学的構造を有するファミリーのメンバー間の分割を可能
にし、そして例えば、慣用的な両性電解質混合物を分画
して狭いｐＨ範囲を有する標品を得ることによって容易
に調製されうる。勾配の両端が、残基の予め決定された
ｐＩにかなり近い一定のｐＨ範囲を有するように勾配を
調製することは、しばしば有用である。例えば、ｐＩ
８．２の残基を検出するための勾配は、ｐＨ７．７〜ｐ
Ｈ８．７にわたることができる。この設計を用いて、勾
配の範囲外のｐＩを有する試料中の帯電種を排除するこ
とができる。このような種は、速やかに両極に移動す
る。両性電解質は、バイオ・ラド（ケンブリッジ、Ｍ
Ａ）およびファーマシア・バイオテク（Pharmacia Biot
ech）（ピスカタウェイ、ＮＪ）などのいくつかの製造
業者から入手可能である。
【００４６】毛管電気泳動 本発明において用いるためのＩＥＦは、ガラス、プラス
チックまたは他の材料から製造され且つ内径が、例え
ば、約１ミリメートル未満、例えば、５００ミクロン未
満である毛管などの細長いチャンネル中で行うことがで
きる。例えば、内径が１００ミクロンで長さが５０ミリ
メートルの毛管を用いることができる。このような毛管
の表面積は、１０13程度の捕捉プローブの結合を可能に
すると考えられる。より高い表面積対容積比は、より細
いおよび／またはより長い毛管を用いることによって達
成されることができ、それによって、より一層迅速なハ
イブリダイゼーション速度論を可能にすることができ
る。毛管ＩＥＦを行う方法は、当該技術分野において周
知であり、そして例えば、カーガーら（J.Chromatograp
hy,492:585-614，1989年）およびノボトニーら（上記）
によって記載されている。
チックまたは他の材料から製造され且つ内径が、例え
ば、約１ミリメートル未満、例えば、５００ミクロン未
満である毛管などの細長いチャンネル中で行うことがで
きる。例えば、内径が１００ミクロンで長さが５０ミリ
メートルの毛管を用いることができる。このような毛管
の表面積は、１０13程度の捕捉プローブの結合を可能に
すると考えられる。より高い表面積対容積比は、より細
いおよび／またはより長い毛管を用いることによって達
成されることができ、それによって、より一層迅速なハ
イブリダイゼーション速度論を可能にすることができ
る。毛管ＩＥＦを行う方法は、当該技術分野において周
知であり、そして例えば、カーガーら（J.Chromatograp
hy,492:585-614，1989年）およびノボトニーら（上記）
によって記載されている。
【００４７】高い表面積対容積比を有し、したがって、
熱を放散させる高い能力を有する毛管の使用は、ＩＥＦ
法において高電圧を用いることを可能にし、したがっ
て、残基をそのｐＩで分割することを向上させ且つ促進
する。従来のＩＥＦでは、概して、１００Ｖ／ｃｍ程度
の電界が用いられるが、毛管ＩＥＦでは、２００〜５０
０Ｖ／ｃｍ程度の電界を用いることができる。したがっ
て、ＩＥＦ検定は、速やかに、例えば、数分または数秒
以内に行うことができる。更に、固定化された捕捉プロ
ーブを含有する毛管を用いる場合、毛管を通過する任意
の標的分子が捕捉プローブに極めて接近しているので、
毛管の高い表面積対容積比は、捕捉プローブに対する標
的被検物質ハイブリダイゼーションを容易にする。
熱を放散させる高い能力を有する毛管の使用は、ＩＥＦ
法において高電圧を用いることを可能にし、したがっ
て、残基をそのｐＩで分割することを向上させ且つ促進
する。従来のＩＥＦでは、概して、１００Ｖ／ｃｍ程度
の電界が用いられるが、毛管ＩＥＦでは、２００〜５０
０Ｖ／ｃｍ程度の電界を用いることができる。したがっ
て、ＩＥＦ検定は、速やかに、例えば、数分または数秒
以内に行うことができる。更に、固定化された捕捉プロ
ーブを含有する毛管を用いる場合、毛管を通過する任意
の標的分子が捕捉プローブに極めて接近しているので、
毛管の高い表面積対容積比は、捕捉プローブに対する標
的被検物質ハイブリダイゼーションを容易にする。
【００４８】本発明に関する毛管の高い表面積対容積比
のもう一つの結論は、極めて少量の試薬および試験試料
のみが必要とされるということである。例えば、電荷結
合素子（ＣＣＤ；例えば、マッケイ（Mackay）ら、米国
特許第4,874,492号明細書（1989）を参照されたい）に
よる検出には、僅か数百の発蛍光団しか必要とされない
ので、レーザーによる蛍光誘発後に、白血球を約１０6
〜１０7個含むたった１ミリリットルの血液が、本発明
の方法を用いる検出に十分な量の標的を提供するはずで
ある。細菌ｒＲＮＡが標的被検物質である場合、本発明
の方法を用いて、１ミリリットル試料中の１個の細菌を
検出できるはずである。
のもう一つの結論は、極めて少量の試薬および試験試料
のみが必要とされるということである。例えば、電荷結
合素子（ＣＣＤ；例えば、マッケイ（Mackay）ら、米国
特許第4,874,492号明細書（1989）を参照されたい）に
よる検出には、僅か数百の発蛍光団しか必要とされない
ので、レーザーによる蛍光誘発後に、白血球を約１０6
〜１０7個含むたった１ミリリットルの血液が、本発明
の方法を用いる検出に十分な量の標的を提供するはずで
ある。細菌ｒＲＮＡが標的被検物質である場合、本発明
の方法を用いて、１ミリリットル試料中の１個の細菌を
検出できるはずである。
【００４９】いくつかの標準的な毛管電気泳動システム
はいずれも、本発明の方法を実施するのに用いることが
できる。例えば、ベックマンＰ／ＡＣＥシステム２０５
０（ベックマン・インスツルメンツ（Beckman Instrume
nts），コロンビア，ＭＤ）を用いることができる。更
に、いくつかの毛管の同時処理を容易にするシステムを
用いることができる（例えば、ユング（Yeung）ら、米
国特許第5,324,401号明細書（1994）を参照された
い）。
はいずれも、本発明の方法を実施するのに用いることが
できる。例えば、ベックマンＰ／ＡＣＥシステム２０５
０（ベックマン・インスツルメンツ（Beckman Instrume
nts），コロンビア，ＭＤ）を用いることができる。更
に、いくつかの毛管の同時処理を容易にするシステムを
用いることができる（例えば、ユング（Yeung）ら、米
国特許第5,324,401号明細書（1994）を参照された
い）。
【００５０】毛管ＩＥＦの他に、他のＩＥＦ法を本発明
で用いることができる。例えば、ＩＥＦは、ガラスまた
はプラスチックプレートなどのプレート中に刻まれた溝
で行うことができる。この方法において、溝の両端はウ
ェルと接触していて、その一方に試料を適用する。この
種類のシステムの使用は、更に大きい試料容量の分析を
可能にする。更に、両性電解質をポリアクリルアミドゲ
ル支持マトリックス中に、例えば、細長い水平スラブゲ
ル中またはチューブゲル中に与える方法を用いることが
できる。
で用いることができる。例えば、ＩＥＦは、ガラスまた
はプラスチックプレートなどのプレート中に刻まれた溝
で行うことができる。この方法において、溝の両端はウ
ェルと接触していて、その一方に試料を適用する。この
種類のシステムの使用は、更に大きい試料容量の分析を
可能にする。更に、両性電解質をポリアクリルアミドゲ
ル支持マトリックス中に、例えば、細長い水平スラブゲ
ル中またはチューブゲル中に与える方法を用いることが
できる。
【００５１】集中した残基の検出 集中した（focused）残基の発光、吸光または他の検出
可能なシグナルは、残基の性質に応じて、いくつかの標
準的な方法のいずれかを用いて検出することができる。
例えば、残基の紫外線またはＸ線照射を検出するには、
分光光度計を用いることができる。蛍光残基は、ＣＣＤ
装置を用いて検出することができる。標準的な水銀光源
またはレーザービームを残基の励起に対して用いること
ができるし、そして線状ＣＣＤ装置などのＣＣＤ装置を
検出用に用いることができる。光源（例えば、レーザ
ー）は、励起すべき残基に対して垂直に光を向けること
ができるし、または毛管と連続した光ファイバーケーブ
ルによって連通することができるので、毛管自体が光ト
ンネルとして用いられる。同位体によって標識された残
基の場合、ＣＣＤ装置を用いて、γ照射を直接的に測定
することができる。当業者に明らかであるように、散乱
光または反射光を除去するために、適当なフィルター
を、ＣＣＤ装置または光電子増倍管などの検出装置と一
緒に用いることができる。
可能なシグナルは、残基の性質に応じて、いくつかの標
準的な方法のいずれかを用いて検出することができる。
例えば、残基の紫外線またはＸ線照射を検出するには、
分光光度計を用いることができる。蛍光残基は、ＣＣＤ
装置を用いて検出することができる。標準的な水銀光源
またはレーザービームを残基の励起に対して用いること
ができるし、そして線状ＣＣＤ装置などのＣＣＤ装置を
検出用に用いることができる。光源（例えば、レーザ
ー）は、励起すべき残基に対して垂直に光を向けること
ができるし、または毛管と連続した光ファイバーケーブ
ルによって連通することができるので、毛管自体が光ト
ンネルとして用いられる。同位体によって標識された残
基の場合、ＣＣＤ装置を用いて、γ照射を直接的に測定
することができる。当業者に明らかであるように、散乱
光または反射光を除去するために、適当なフィルター
を、ＣＣＤ装置または光電子増倍管などの検出装置と一
緒に用いることができる。
【００５２】検出器は、残基のｐＩに対応するｐＨ勾配
の正確な位置を特異的に監視するように配置することが
できる。或いは、検出器をｐＨ勾配に沿って移動させる
ことができるし、または勾配を含むチャンバ（例えば、
毛管）を、検出器を通り過ぎて移動させることができ
る。もう一つの実施例では、毛管も検出器も移動させな
い。むしろ、残基がいったん集中したら、それを毛管中
で移動させて、それが検出器を通り過ぎて移動するよう
にする。このような移動は、例えば、毛管を介して流体
をポンプ輸送して、勾配を対流によって移動させること
によって誘導することができる。複合体のプラグまたは
区域を検出器に相対して移動させるいずれの例において
も、予め決定されたｐＩは一定のままであろうが、集中
した残基の物理的位置は移動するであろう。勾配全体が
移動する装置において、検出器は、残基の通過と一致す
るように決定された時間などの、流動開始後の予め決定
された時間にのみ読取りをするようにプログラム化する
ことができる。更に、分画チャンバの長さにわたる線状
ＣＣＤ装置を用いることができる。シグナル誘導（例え
ば、レーザー）および検出（例えば、ＣＣＤ装置）装置
を組込んだ適当なシステムは、当該技術分野において周
知である（例えば、フジミヤ（Fujimiya）ら、米国特許
第5,069,769号明細書（1991）；ペントニー（Pentone
y）、米国特許第5,208,466号明細書（1993）を参照され
たい）。
の正確な位置を特異的に監視するように配置することが
できる。或いは、検出器をｐＨ勾配に沿って移動させる
ことができるし、または勾配を含むチャンバ（例えば、
毛管）を、検出器を通り過ぎて移動させることができ
る。もう一つの実施例では、毛管も検出器も移動させな
い。むしろ、残基がいったん集中したら、それを毛管中
で移動させて、それが検出器を通り過ぎて移動するよう
にする。このような移動は、例えば、毛管を介して流体
をポンプ輸送して、勾配を対流によって移動させること
によって誘導することができる。複合体のプラグまたは
区域を検出器に相対して移動させるいずれの例において
も、予め決定されたｐＩは一定のままであろうが、集中
した残基の物理的位置は移動するであろう。勾配全体が
移動する装置において、検出器は、残基の通過と一致す
るように決定された時間などの、流動開始後の予め決定
された時間にのみ読取りをするようにプログラム化する
ことができる。更に、分画チャンバの長さにわたる線状
ＣＣＤ装置を用いることができる。シグナル誘導（例え
ば、レーザー）および検出（例えば、ＣＣＤ装置）装置
を組込んだ適当なシステムは、当該技術分野において周
知である（例えば、フジミヤ（Fujimiya）ら、米国特許
第5,069,769号明細書（1991）；ペントニー（Pentone
y）、米国特許第5,208,466号明細書（1993）を参照され
たい）。
【００５３】標的被検物質の定量分析を行うには、最初
に、標準的な方法を用いて標準曲線を作成することがで
きる。例えば、本発明の方法を用いて検出される標識の
量は、既知の量の被検物質を含有する数種類の試料につ
いて決定することができる。次に、これらの読みによっ
て作成された標準曲線を用いて、検出されたシグナルの
量をその標準曲線に対して比較することにより、未知の
被検物質濃度を有する試料中の被検物質濃度を決定する
ことができる。
に、標準的な方法を用いて標準曲線を作成することがで
きる。例えば、本発明の方法を用いて検出される標識の
量は、既知の量の被検物質を含有する数種類の試料につ
いて決定することができる。次に、これらの読みによっ
て作成された標準曲線を用いて、検出されたシグナルの
量をその標準曲線に対して比較することにより、未知の
被検物質濃度を有する試料中の被検物質濃度を決定する
ことができる。
【００５４】試料中の複数の被検物質の検出 本発明の利点は、それが、単一のｐＨ勾配を用いて試料
中の複数の被検物質の検出を容易にするということであ
る。例えば、等電点の異なる残基をそれぞれが含んでい
る、いくつかの被検物質に特異的なプローブは、同一検
定において一緒に用いることができる。ハイブリダイゼ
ーション、捕捉、残基遊離およびＩＥＦの後、種々の残
基を、ｐＨ勾配中のそれらの独特の位置で、試料中のそ
れぞれの被検物質の存在の尺度として検出する。単一の
ｐＨ勾配中での複数の被検物質の検定においては、異な
る標的被検物質に対応するそれぞれの残基が、勾配中で
独特の且つ区別できるｐＩを有するということのみが必
要であり、すなわち、検出可能な標識は、他の点では異
なるそれぞれの残基について同一でありうる。実施しう
る同時検出の数（すなわち、異なったプローブの数）
は、検出装置の分解能および／またはＩＥＦ中に残基を
分割する能力によってのみ制限される。
中の複数の被検物質の検出を容易にするということであ
る。例えば、等電点の異なる残基をそれぞれが含んでい
る、いくつかの被検物質に特異的なプローブは、同一検
定において一緒に用いることができる。ハイブリダイゼ
ーション、捕捉、残基遊離およびＩＥＦの後、種々の残
基を、ｐＨ勾配中のそれらの独特の位置で、試料中のそ
れぞれの被検物質の存在の尺度として検出する。単一の
ｐＨ勾配中での複数の被検物質の検定においては、異な
る標的被検物質に対応するそれぞれの残基が、勾配中で
独特の且つ区別できるｐＩを有するということのみが必
要であり、すなわち、検出可能な標識は、他の点では異
なるそれぞれの残基について同一でありうる。実施しう
る同時検出の数（すなわち、異なったプローブの数）
は、検出装置の分解能および／またはＩＥＦ中に残基を
分割する能力によってのみ制限される。
【００５５】
【実施例】実施例Ｉ−生物学的試料中のサルモネラの検出 本発明の方法は、試料中の病原性生物、例えば、食品試
料中のサルモネラ属（Salmonella）の存在を検出するの
に用いることができる。この検定を実施するのに適用し
うる試薬および方法は、GENE-TRAK サルモネラ検定キッ
ト（GENE-TRAKインダストリアル・ダイアグノスティク
ス（Industrial Diagnostics），ホプキントン，ＭＡ）
で提供される。簡単にいうと、ポリＡプローブによって
被覆された遺伝子センサー（genosensor）（GENE-TRAK
検定でのディップスティックであるが、毛管を用いるこ
ともできる）を、試料、ポリＴテイルを含む捕捉プロー
ブ、および検出用プローブと接触させる。検出用プロー
ブは、ストレプトアビジン−フィコエリトリン残基のよ
うな本発明の残基を含むように設計される。本方法で用
いることができる検出用プローブの具体的な例は以下の
通りである。すなわち、フィコエリトリン−ストレプト
アビジン−ビオチン−ＳＳ−ＡｍＴ−ＡＧＣＴＣＡＣＡ
ＧＣＡＴＡＴＧＣＧＣＴＴＴＴＧＴＧＴＡＣ−３’（配
列番号：１）、ここにおいて、ＡｍＴは、６−炭素リン
カーを介して結合した第一アミンを含むチミジンである
アミノ修飾因子Ｃ6ｄＴである。非特異的に結合した材
料および非結合検出用プローブを洗浄除去した後、ディ
ップスティックを、両性電解質の１〜２％溶液および遊
離剤（例えば、上記の特異的プローブの場合、還元剤
（例えば、ジチオトレイトールまたは β−メルカプト
エタノール）を用いてジスルフィド結合を切断して、Ｓ
−ビオチン−ストレプトアビジン−フィコエリトリンの
遊離を引き起こす）が入っている管に移す。複合体から
残基を除去した後、溶液をＩＥＦ管に移し、これに電流
を与えてｐＨ勾配を生じさせる。次に、残基を、上記の
ように、ｐＨ勾配中のそのｐＩに対応する位置で検出す
る。
料中のサルモネラ属（Salmonella）の存在を検出するの
に用いることができる。この検定を実施するのに適用し
うる試薬および方法は、GENE-TRAK サルモネラ検定キッ
ト（GENE-TRAKインダストリアル・ダイアグノスティク
ス（Industrial Diagnostics），ホプキントン，ＭＡ）
で提供される。簡単にいうと、ポリＡプローブによって
被覆された遺伝子センサー（genosensor）（GENE-TRAK
検定でのディップスティックであるが、毛管を用いるこ
ともできる）を、試料、ポリＴテイルを含む捕捉プロー
ブ、および検出用プローブと接触させる。検出用プロー
ブは、ストレプトアビジン−フィコエリトリン残基のよ
うな本発明の残基を含むように設計される。本方法で用
いることができる検出用プローブの具体的な例は以下の
通りである。すなわち、フィコエリトリン−ストレプト
アビジン−ビオチン−ＳＳ−ＡｍＴ−ＡＧＣＴＣＡＣＡ
ＧＣＡＴＡＴＧＣＧＣＴＴＴＴＧＴＧＴＡＣ−３’（配
列番号：１）、ここにおいて、ＡｍＴは、６−炭素リン
カーを介して結合した第一アミンを含むチミジンである
アミノ修飾因子Ｃ6ｄＴである。非特異的に結合した材
料および非結合検出用プローブを洗浄除去した後、ディ
ップスティックを、両性電解質の１〜２％溶液および遊
離剤（例えば、上記の特異的プローブの場合、還元剤
（例えば、ジチオトレイトールまたは β−メルカプト
エタノール）を用いてジスルフィド結合を切断して、Ｓ
−ビオチン−ストレプトアビジン−フィコエリトリンの
遊離を引き起こす）が入っている管に移す。複合体から
残基を除去した後、溶液をＩＥＦ管に移し、これに電流
を与えてｐＨ勾配を生じさせる。次に、残基を、上記の
ように、ｐＨ勾配中のそのｐＩに対応する位置で検出す
る。
【００５６】実施例ＩＩ−染色体転座の検出 本発明は、染色体転座を検出するのに用いることができ
る。具体的な実施例として、この方法は、いわゆる「フ
ィラデルフィア」染色体を検出するのに用いることがで
き、その存在は急性リンパ性白血病および慢性骨髄性白
血病の潜在的原因である。フィラデルフィア染色体は、
染色体９番の末端部分の染色体２２番の末端部分への平
衡転座を有することを特徴とする。これは、染色体９番
上のａｂｌ癌遺伝子と染色体２２番上のｂｃｒ遺伝子と
の間に遺伝子融合を引き起こす。この遺伝子融合は、両
方の遺伝子に対応する部分を含むメッセージに転写され
る。
る。具体的な実施例として、この方法は、いわゆる「フ
ィラデルフィア」染色体を検出するのに用いることがで
き、その存在は急性リンパ性白血病および慢性骨髄性白
血病の潜在的原因である。フィラデルフィア染色体は、
染色体９番の末端部分の染色体２２番の末端部分への平
衡転座を有することを特徴とする。これは、染色体９番
上のａｂｌ癌遺伝子と染色体２２番上のｂｃｒ遺伝子と
の間に遺伝子融合を引き起こす。この遺伝子融合は、両
方の遺伝子に対応する部分を含むメッセージに転写され
る。
【００５７】本発明は、このような転座を以下のように
検出するのに用いることができる。捕捉プローブは、融
合のｂｃｒ領域（遺伝子自体かまたはそのＲＮＡ（ｐｒ
ｅ−ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ）転写物）に対してハイブ
リダイズするように設計することができ、検出用プロー
ブは、ａｂ１領域に対してハイブリダイズするように設
計することができる。ｂｃｒ捕捉プローブによるａｂｌ
検出用プローブの捕捉は、フィラデルフィア転座の存在
を示す。
検出するのに用いることができる。捕捉プローブは、融
合のｂｃｒ領域（遺伝子自体かまたはそのＲＮＡ（ｐｒ
ｅ−ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ）転写物）に対してハイブ
リダイズするように設計することができ、検出用プロー
ブは、ａｂ１領域に対してハイブリダイズするように設
計することができる。ｂｃｒ捕捉プローブによるａｂｌ
検出用プローブの捕捉は、フィラデルフィア転座の存在
を示す。
【００５８】他の実施態様 本発明をその詳細な記述と一緒に記載してきたが、前述
の説明は例示のためであり且つ本発明の範囲を制限する
ためのものではないことが理解されるべきである。本発
明の他の態様、利点および変更は、特許請求の範囲の範
囲内である。
の説明は例示のためであり且つ本発明の範囲を制限する
ためのものではないことが理解されるべきである。本発
明の他の態様、利点および変更は、特許請求の範囲の範
囲内である。
【００５９】
【００６０】配列番号：１ （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２８ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列：配列番号：１： AGCTCACAGC ATATGCGCTT TTGTGTAC 28
【図１】 図１は、捕捉プローブが特異的結合対の第一
メンバーを含む、捕捉プローブ−被検物質−検出用プロ
ーブ複合体の略図である。
メンバーを含む、捕捉プローブ−被検物質−検出用プロ
ーブ複合体の略図である。
【図２】 図２は、捕捉プローブが固体支持体に対して
結合している、捕捉プローブ−被検物質−検出用プロー
ブ複合体の略図である。
結合している、捕捉プローブ−被検物質−検出用プロー
ブ複合体の略図である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/543 ５０１ Ｇ０１Ｎ 33/543 ５０１Ｆ (71)出願人 597060357 3100 Ｗｏｏｄｃｒｅｅｋ Ｄｒｉｖｅ, Ｄｏｗｎｅｒｓ Ｇｒｏｖｅ，Ｉｌｌｉｎ ｏｉｓ 60515−5400，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓ ｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
Claims (33)
- 【請求項１】 試料中の被検物質を検出する方法であっ
て、 該試料と、検出用プローブおよび捕捉プローブとを接触
させて、検出用プローブ−被検物質−捕捉プローブ複合
体を形成し、ここにおいて、該検出用プローブは、検出
可能な標識を含む残基を含み；該複合体中に結合してい
ない任意の検出用プローブから該複合体を分離し；該複
合体から該残基を遊離させ；遊離した該残基を該複合体
から単離し；そして該試料中の該被検物質の存在の尺度
として該残基を検出する；の各工程を含む方法。 - 【請求項２】 前記単離工程が、前記残基を濃縮するこ
とを含む請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 前記残基が予め決定されたｐＩを有し；
前記複合体から遊離した前記残基の前記単離および濃縮
を、等電点電気泳動によって行い；そして前記試料中の
前記被検物質の存在の尺度としての該残基の前記検出
を、該濃縮された残基を該残基の該ｐＩに対応するｐＨ
勾配中の位置で検出することによって行う請求項２に記
載の方法。 - 【請求項４】 前記単離および濃縮を、カラムクロマト
グラフィーまたはモレキュラーシーブの使用によって行
う請求項２に記載の方法。 - 【請求項５】 前記捕捉プローブが分画チャンバのルー
メン中に固定化されており、前記単離、遊離および濃縮
工程を該ルーメン中で行う請求項１に記載の方法。 - 【請求項６】 前記試料を前記ルーメン中において前記
固定化捕捉プローブと接触させる前に、それを前記検出
用プローブと接触させる請求項５に記載の方法。 - 【請求項７】 前記試料および前記検出用プローブを、
前記ルーメン中において前記捕捉プローブと独立して接
触させる請求項５に記載の方法。 - 【請求項８】 前記試料を、前記検出用プローブの前
に、前記ルーメン中において前記捕捉プローブと接触さ
せる請求項７に記載の方法。 - 【請求項９】 前記捕捉プローブが特異的結合対の第一
メンバーを含み、そして前記分離工程を、前記複合体と
該特異的結合対の第二メンバーとを接触させることによ
って行い、ここにおいて、該特異的結合対の該第二メン
バーが固体支持体上に固定化されている請求項１に記載
の方法。 - 【請求項１０】 前記固体支持体が分画チャンバのルー
メン中にある請求項９に記載の方法。 - 【請求項１１】 前記特異的結合対が１対の相補的核酸
を含む請求項９に記載の方法。 - 【請求項１２】 前記特異的結合対が、互いに特異的に
結合する１対のポリペプチドを含む請求項９に記載の方
法。 - 【請求項１３】 前記特異的結合対の前記第一メンバー
が、抗体の抗原結合部位を含み、そして該特異的結合対
の前記第二メンバーが、該抗原結合部位が結合する抗原
を含む請求項１２に記載の方法。 - 【請求項１４】 前記特異的結合対の前記第一メンバー
がアビジンを含み、そして該特異的結合対の前記第二メ
ンバーがビオチンを含む請求項９に記載の方法。 - 【請求項１５】 前記電気泳動工程を、毛管のルーメン
中で行う請求項３に記載の方法。 - 【請求項１６】 前記電気泳動を、プレート表面の溝で
行う請求項３に記載の方法。 - 【請求項１７】 前記被検物質が核酸を含む請求項１に
記載の方法。 - 【請求項１８】 前記被検物質が、転座またはそのｐｒ
ｅ−ｍＲＮＡ若しくはｍＲＮＡ転写物を含む染色体を含
む請求項１７に記載の方法。 - 【請求項１９】 前記検出用プローブが核酸を含む請求
項１に記載の方法。 - 【請求項２０】 前記捕捉プローブが核酸を含む請求項
１に記載の方法。 - 【請求項２１】 前記被検物質がポリペプチドを含む請
求項１に記載の方法。 - 【請求項２２】 前記被検物質が、炭水化物、脂質、代
謝産物または薬物を含む請求項１に記載の方法。 - 【請求項２３】 前記検出用プローブがポリペプチドを
含む請求項１に記載の方法。 - 【請求項２４】 前記ポリペプチドが、抗体の抗原結合
部位を含む請求項２３に記載の方法。 - 【請求項２５】 前記ポリペプチドが１本鎖抗体を含む
請求項２４に記載の方法。 - 【請求項２６】 前記捕捉プローブがポリペプチドを含
む請求項１に記載の方法。 - 【請求項２７】 前記ポリペプチドが、抗体の抗原結合
部位を含む請求項２６に記載の方法。 - 【請求項２８】 前記検出用プローブが１本鎖抗体を含
む請求項２７に記載の方法。 - 【請求項２９】 前記遊離工程を化学的切断によって行
う請求項１に記載の方法。 - 【請求項３０】 前記残基が前記検出用プローブに対し
てジスルフィド結合によって結合しており、且つ前記遊
離工程を該ジスルフィド結合の還元によって行う請求項
２９に記載の方法。 - 【請求項３１】 前記遊離工程を酵素的切断によって行
う請求項１に記載の方法。 - 【請求項３２】 前記残基が、フィコエリトリンまたは
その修飾変種を含む請求項１に記載の方法。 - 【請求項３３】 試料中の染色体転座を含む染色体の存
在を検出する方法であって、ここにおいて、該染色体は
第一の染色体の一部分および第二の染色体の一部分を含
み、該試料と、捕捉プローブおよび検出用プローブとを
接触させて、検出用プローブ−被検物質−捕捉プローブ
複合体を形成し、ここにおいて該捕捉プローブは、該第
一の染色体の該一部分またはその対応するＲＮＡ転写物
に対して結合し且つ特異的結合対の第一メンバーを含
み、そして該検出用プローブは、該第二の染色体の該一
部分またはその対応するＲＮＡ転写物に対して結合し且
つ検出可能な標識を含み；該複合体を、固体支持体上に
固定化された該特異的結合対の第二メンバーと接触させ
ることによって、該複合体中に結合していない任意の検
出用プローブから該複合体を単離し；そして該試料中の
該染色体転座を含む該染色体の存在の尺度として該複合
体中に存在する該検出可能な標識を検出する；の各工程
を含む方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/643,109 US5824478A (en) | 1996-04-30 | 1996-04-30 | Diagnostic methods and probes |
| US643109 | 1996-04-30 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1048216A true JPH1048216A (ja) | 1998-02-20 |
Family
ID=24579389
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9112275A Pending JPH1048216A (ja) | 1996-04-30 | 1997-04-30 | 診断法およびプローブ |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5824478A (ja) |
| EP (1) | EP0805215A3 (ja) |
| JP (1) | JPH1048216A (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| JP2002544486A (ja) * | 1999-05-10 | 2002-12-24 | プロリンクス・インコーポレイテッド | 細胞分離装置およびその使用法 |
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| EP3754335A1 (en) | 2019-06-19 | 2020-12-23 | ARKRAY, Inc. | Target substance detection method, target substance detection kit, and target substance detection system |
Families Citing this family (58)
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|---|---|---|---|---|
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| WO1999057309A1 (en) | 1998-05-04 | 1999-11-11 | Dako A/S | Method and probes for the detection of chromosome aberrations |
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| AU2002347872A1 (en) * | 2001-10-12 | 2003-04-22 | Vysis, Inc. | Imaging microarrays |
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| AU2003265583C1 (en) | 2002-08-20 | 2009-05-21 | Cyvera Corporation | Diffraction grating-based optical identification element |
| US7190522B2 (en) | 2002-09-12 | 2007-03-13 | Cyvera Corporation | Chemical synthesis using diffraction grating-based encoded optical elements |
| US7508608B2 (en) | 2004-11-17 | 2009-03-24 | Illumina, Inc. | Lithographically fabricated holographic optical identification element |
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| US7900836B2 (en) | 2002-08-20 | 2011-03-08 | Illumina, Inc. | Optical reader system for substrates having an optically readable code |
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