JPH05172815A

JPH05172815A - 免疫分析方法及びその分析装置

Info

Publication number: JPH05172815A
Application number: JP34424191A
Authority: JP
Inventors: Kazunari Imai; 一成今井; Yasushi Nomura; 靖野村; Tadataka Koga; 正太佳古賀; Yasuaki Setsu; 育明薛; Kenji Yasuda; 健二保田; Kazunobu Okano; 和宣岡野; Satoshi Takahashi; 智高橋; Daizo Tokinaga; 大三時永
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 1991-12-26
Filing date: 1991-12-26
Publication date: 1993-07-13

Abstract

(57)【要約】【目的】免疫分析方法において、径が小さい管状体の
反応容器を使用する場合において、反応容器内の洗浄を
高い洗浄度で行い、且つ洗浄液の流れを他の手段で強制
的に早めることなく比較的に短時間で行う。【構成】受容体が結合された固相を有するキャピラリ
ー１に試料を供給し、試料中の分析対象物を受容体に結
合させるステップと、電気泳動による洗浄で未反応試料
をキャピラリー１から除去した後、蛍光性粒子で標識さ
れた標識受容体を管状反応容器に供給し、分析対象物を
介して固相に標識受容体を結合させるステップと、電気
泳動による洗浄で余剰の標識受容体をキャピラリー１か
ら除去した後、キャピラリー１に遊離剤を含む遊離試薬
を供給するステップと、固相から遊離された蛍光性粒子
を含む被測定液をフローセルに導入し、フローセルを通
る蛍光性粒子に基づく蛍光を検出して検出粒子数を計数
し、計数された粒子数に基づき試料中の分析対象物濃度
を演算するステップから構成される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、免疫分析方法及びその
分析装置に係り、特に、生体試料中に含まれている抗
原、抗体、ハプテン等の分析対象物を標識化した後、標
識物をフローセルに導いて測光する免疫分析方法及びそ
の分析装置であり、免疫分析で使用される洗浄手段の改
良に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、血液のような生体試料中の微量物
質を測定するために、抗原抗体反応を利用する免疫分析
方法が知られている。この分析方法又は分析装置につい
ての先行技術は次の通りである。特開平１−１８７４５
９号は、抗原抗体反応と光音響分光法を組み合わせた分
析方法を示している。この先行技術では、内壁に抗体が
固定化された反応容器に、分析対象物である抗原を含む
サンプルを加え、次いで、未反応試料の洗浄除去、ラテ
ックス又は無機酸化物のような微小粒子が結合された抗
体を含有する液の添加、余剰抗体の洗浄除去、遊離液の
添加の４つの工程を経て、反応容器内に遊離された微小
粒子を含む浮遊液を生成する。その後、浮遊液を光音響
セルに移し、断続的にレーザ光を照射して光音響セル内
の圧力変化を検出することによって光音響信号を得る。
特開昭６３−２１４６６８号は高感度免疫分析方法を提
案している。この先行技術では、蛍光物質を封入したマ
イクロカプセルと抗体とを結合させた標識抗体を用い
る。この例では、固相が用いられない。被検細胞を含む
サンプルにマイクロカプセル標識抗体を加えて免疫結合
させた後、遠心洗浄する。遠心洗浄後の再浮遊液を、フ
ローサイトメータのシースフローセルに注入する。細胞
と標識抗体による免疫複合体が、フローセルに照射され
るレーザ光束を横切って流れる際、マイクロカプセルか
らの蛍光が検出される。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】前述の各先行技術を、
洗浄方法の観点から検討する。特開平１−１８７４５９
号による分析方法では、固相を備えた反応容器に標識抗
体を加える場合に、標識抗体が、固相に結合している抗
原に対して特異的結合を行い、更に相表面にも非特異的
に吸着される。このため、通常の洗浄操作によっては、
非特異的な吸着がされている標識抗体が除去できないと
いう問題が生じる。

【０００４】特開昭６３−２１４６６８号による分析方
法では、固相を用いる必要がないので、個々の標識から
の検知信号量は大きくなる。しかし、遠心分離器を用い
た洗浄が行われるので、操作が面倒であり、自動化が困
難である。一般的な問題として、底を有するキュベット
を反応容器として用いた場合には、反応容器内部での標
識抗体の洗浄を十分に行うことができない。そこで、従
来では、反応容器に対し内部で洗浄液が滞らない構造を
与えることにより、洗浄の効果を大幅に改善していた。
すなわち反応容器を管状体とし、洗浄液を一方の端から
他方の端に流すことにより、滞りなく未反応の標識物を
排除できるようにしていた。ところが、管状の反応容器
を使用する場合、標識物として微小粒子を用いると、洗
浄液の流束に応じて抗原抗体反応により反応容器に結合
した標識抗体が剥がれる現象がある。この現象では、粒
子の大きさが大きいほど、反応効率を低下させる。一
方、管状体の反応容器に、例えば径の細いを毛細管を使
用すると、反応効率を高めることができる。しかしこの
場合、試料等の液の導入が困難となり、その結果、液体
の導入に時間を要したり、あるいは圧力が必要となるの
で、望ましいものではない。

【０００５】本発明の目的は、径が比較的小さい管状体
の反応容器を使用する場合において、反応容器内の洗浄
を高い洗浄度で行い、且つ洗浄液の流れを強制的に早め
ることなく比較的に短時間で行うことができる免疫分析
方法及び分析装置を提供することにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明に係る第１の免疫
分析方法は、受容体が結合された固相を有する管状反応
容器に試料を供給し、試料中の分析対象物を受容体に結
合させるステップと、電気泳動による洗浄で未反応試料
を管状反応容器から除去した後、蛍光性粒子で標識され
た標識受容体を管状反応容器に供給し、分析対象物を介
して固相に標識受容体を結合させるステップと、電気泳
動による洗浄で余剰の標識受容体を管状反応容器から除
去した後、管状反応容器に遊離剤を含む遊離試薬を供給
するステップと、固相から遊離された蛍光性粒子を含む
被測定液をフローセルに導入し、フローセルを通る蛍光
性粒子に基づく蛍光を検出して検出粒子数を計数し、計
数された粒子数に基づき試料中の分析対象物濃度を演算
するステップから構成される。本発明に係る第２の免疫
分析方法は、受容体が核酸を介して結合されている固相
を有する管状反応容器に試料を供給し、この試料中の分
析対象物を受容体に免疫結合させるステップと、標識受
容体を管状反応容器に供給し、固相に結合させるステッ
プと、電気泳動による洗浄で余剰の標識受容体を管状反
応容器から除去した後、制限酵素含有液を管状反応容器
に供給し核酸を切断するステップと、固相から遊離され
た標識物を含む被測定液をフローセルに導入し、フロー
セルを通る標識物の数を計数し、計数された数に基づい
て試料中の分析対象物濃度を演算するステップとから構
成される。前記の各免疫分析方法において、好ましく
は、試料の導入及び標識受容体の導入を電気泳動によっ
て行う。前記の各免疫分析方法において、好ましくは、
管状反応容器は、キャピラリー（毛細管）であり、その
内径が１ｍｍ以下である。前記の各免疫分析方法におい
て、好ましくは、試料の導入及び標識受容体の導入を毛
管現象により行う。前記の各免疫分析方法において、好
ましくは、管状反応容器はガラス製又は合成樹脂製であ
る。前記の各免疫分析方法において、好ましくは、各受
容体は抗体であり、分析対象物は抗原又はハプテンであ
る。前記の各免疫分析方法において、好ましくは、遊離
試薬はカオトロピックイオンを含むものである。前記の
第１の免疫分析方法において、好ましくは、蛍光性粒子
は、ラテックス粒子もしくは無機物粒子の表面に蛍光性
物質層を形成させたもの、又は粒子形成組成物と蛍光性
物質の混合物が粒子化されたものである。前記の第１の
免疫分析方法において、好ましくは、蛍光性粒子の粒径
は１０ ^-2〜１０^-5mmである。前記の第２の免疫分析方
法において、好ましくは、核酸は塩基対を有するもので
ある。前記の第２の免疫分析方法において、好ましく
は、核酸はオリゴヌクレオチドである。前記の第２の免
疫分析方法において、好ましくは、固相は、管状反応容
器の内壁を、受容体に対し、化学結合可能に表面処理し
たものからなる。本発明に係る第１の免疫分析装置は、
受容体が結合された固相を有する管状反応容器に試料を
供給する試料供給部と、蛍光性粒子で標識された標識受
容体を管状反応容器に供給する標識受容体供給部と、管
状反応容器に遊離剤を含む遊離試薬を供給する遊離試薬
供給部と、反応後の管状反応容器内から未反応試料を除
去すること及び管状反応容器内から余剰の標識受容体を
除去することをそれぞれ行う洗浄部と、固相から遊離さ
れた蛍光性粒子を含む被測定液をフローセルに導入し、
フローセルを通る蛍光性粒子に基づく蛍光を検出して検
出粒子数を計数し、計数された粒子数に基づいて試料中
の分析対象物濃度を演算する測定部とを含む免疫分析装
置であり、前記の洗浄部が、高電圧電源と、この高電圧
電源の出力電圧に基づき管状反応容器の内容物に所定電
圧を印加する電圧印加部とから構成される。本発明に係
る第２の免疫分析装置は、受容体が核酸を介して結合さ
れている固相を有する管状反応容器に試料を供給する試
料供給部と、標識受容体を管状反応容器に供給する標識
受容体供給部と、管状反応容器に制限酸素含有液を供給
する制限酸素含有液供給部と、管状反応容器内から余剰
の標識受容体を除去する洗浄部と、固相から遊離された
標識物を含む被測定液をフローセルに導入し、フローセ
ルを通る標識物の数を計数し、計数された数に基づいて
試料中の分析対象物濃度を演算する測定部とを含む免疫
分析装置において、洗浄部は、高電圧電源と、この高電
圧電源の出力電圧に基づき管状反応容器の内容物に所定
電圧を印加する電圧印加部とから構成される。

【０００７】

【作用】本発明による免疫分析方法では、試料の洗浄や
標識抗体の洗浄工程において、電気泳動の作用を利用す
ることにより洗浄を行うことである。電気泳動による洗
浄では、従来の如く洗浄液を管状の反応容器に流してそ
の流体圧で浮遊粒子等の不要物を洗浄するのとは異な
り、不必要に高い圧力を加えることなく、排除する必要
がある物質を極めて高い精度で取り除くことができる。
また、反応によって管状反応容器に結合した標識抗体を
剥がすことない。従って、反応時に得られる反応効率を
損なうことがなく、洗浄を行うことができる。また固相
を備えた管状反応容器に生体試料を供給して分析対象物
を固相に結合させた後、管状反応容器にはその分析対象
物と免疫結合しうる標識抗体が加えられる。こうして作
られた液は余剰の標識抗体を含むので、管状反応容器か
ら、電気泳動作用によって除去される。この洗浄除去操
作によれば、固相表面に非特異的に吸着されている標識
抗体が脱離されず、管状反応容器内に残存する。本発明
による免疫分析装置では、電気泳動による洗浄の作用
を、管状反応容器の内容物で発生させるため、高電圧を
与えることのできる電圧源と、この電圧源光電圧を、適
時にタイミングで管状反応容器の内容物に与えるための
電極及ぶ通電路等の電気構成を備えている。固相に核酸
を介して受容体が結合されている管状反応容器の場合、
試料中の分析対象物を固相に免疫結合させた後、標識物
を持った受容体が結合される。この場合の標識物の固相
からの脱離のための標識遊離剤としては、制限酵素が用
いられる。制限酵素としては、制限エンドヌクレアー
ゼ、ホスホジエステラーゼ、ピロホスファターゼ、ペプ
チターゼ、エステラーゼなどの加水分解酵素が好適に用
いられる。このような制限酵素によって核酸の二本鎖が
所定の部位で切断される。

【０００８】反応固相を管状体とすることにより洗浄性
が向上し、洗浄不良によるバックグラウンドの上昇を大
幅に抑えることができる。また、洗浄効率が上がるの
で、洗浄時間の短縮にも有効である。

【０００９】

【実施例】以下に、本発明の実施例を添付図面に基づい
て説明する。図１は、本発明に係る免疫分析装置の一実
施例の全体的構成を示す概略図である。この免疫分析装
置では、反応容器として径が比較的に小さい管状体を使
用する。特に、ガラスキャピラリー（ガラス毛細管）の
内面を固相として用いることが望ましい。キャピラリー
の径としては１ｍｍ以下のものが望ましい。またキャピ
ラリーは、材質的に合成樹脂製のものを使用することも
できる。図中、１が装置上面に用意された複数のガラス
キャピラリーであり、反応用キャピラリーとして使用さ
れる。複数のキャピラリー１はキャピラリートレイ２に
配置されている。複数のキャピラリー１のうち１つのキ
ャピラリーが、装置上面の所定位置で、キャピラリー保
持機構３により垂直姿勢で保持される。キャピラリー保
持機構３に保持されたキャピラリー１は、装置上面で、
制限された３次元的な移動空間内にて任意の位置に移動
することができる。装置上面に平行なＸＹ平面内での移
動は、ＸＹ移動機構４によって行われる。例えば図２及
び図３に示す如くＸ及びＹの各方向が定義される。他の
方向ＺはＸＹ平面に垂直である。キャピラリー保持機構
３のＸ方向の移動は、ガイド部材５に案内される。６は
ガイド部材５を両側で支持する支柱である。上記のキャ
ピラリー１に関し、その内面には前述の如く受容体が結
合された固相を有する。この固相は、ガラス製又は合成
樹脂製のキャピラリー１の表面を、結合されるべき受容
体に対し化学結合可能に表面処理されたものである。キ
ャピラリー１はキャピラリー保持機構３で保持された状
態において、後述する如く、その内部に試料容器から所
定の試料が供給される。供給された試料の中に含まれる
分析対象物は、キャピラリー１の内面の固相に結合す
る。このように本実施例によるキャピラリー１では、核
酸、例えばオリゴヌクレオチドを介さず、直接に各測定
対象ごとの抗体をその内面に固定化するようにしてい
る。またキャピラリー１の内面に相補オリゴヌククレオ
チドの一本鎖を固定化し、オリゴヌクレオチドを介して
抗体を固定化することも可能である。受容体としての抗
体又は抗原を固相に結合するため核酸を使用する場合、
キャピラリー１内の固相側の抗体又は抗原は、試料供給
時には二本鎖の核酸を介して固相に結合される。また固
相に結合されている受容体として、分析対象物が抗原又
はハプテンである場合にはそれに特異的に結合し得る抗
体が用いられ、分析対象物が抗体である場合にはそれに
特異的に結合し得る抗原が用いられる。

【００１０】特に本実施例での特徴は、キャピラリー１
の内部の洗浄において、後述の如く電気泳動の作用を利
用して行う点である。この特徴については、後で、詳細
に説明される。また、上記キャピラリー１の内部への試
料や標識抗体の導入に関しても、必要があれば、電気泳
動の作用を利用することによって行うことが可能であ
る。

【００１１】図１において、装置上面には、上記の通り
反応容器としての複数のキャピラリー１が配列され、更
に、マイクロプレート（試料）１１、標識抗体１２、遊
離液１３、洗浄液１４がそれぞれの容器に収容されて配
置される。装置上面における配置構成は、図２及び図３
によって詳細に示される。マイクロプレート（試料）１
１、標識抗体１２、遊離液１３、洗浄液１４がそれぞれ
の容器は、冷却器１５の上に配置され、これにより試料
１１や標識抗体１２等の試薬部は冷却器１５によって保
冷されている。上記の標識抗体１２としては、蛍光性の
微小粒子が好適である。この蛍光性粒子は、ラテックス
粒子又は無機物粒子の表面に蛍光物質層を形成せしめた
ものを使用できる。また粒子形成組成物と蛍光物質の混
合物を粒子化したものを使用することもできる。フロー
サイトメータによって蛍光検出が行われ、フローセルを
通った粒子数が計数されるが、この場合の蛍光性粒子の
粒径は１０^-2〜１０^-5mmである。蛍光性粒子のために用
いられる蛍光性物質は、通常、フルオレセイン、クマリ
ン誘導体、ローダミン誘導体、ダンシル、ウンベリフェ
ロン等の既知物質である。上記の標識遊離剤の１つは、
中性溶液中のカオトロピックイオンである。カオトロピ
ックイオンとしては、ＣＣｌ₃ＣＯＯ^-，ＳＣＮ^-，Ｃ
Ｆ₃ＣＯＯ^-等を用いることができる。またこの装置に
は電気泳動用バッファ１６が配置される。電気泳動用バ
ッファ１５の内部にはアースを介して電気泳動用高電圧
電源１７に接続された電極１８が配置される。電気泳動
用バッファ１６は、シリンジポンプ２４の内部に設けら
れる。高電圧電源１７には、更に他の電極１９が接続さ
れ、この電極１９はキャピラリー保持機構３にキャピラ
リー１に対し平行に取り付けられる。従ってこの電極１
９は、キャピラリー１の移動と共に、自動的に試料１１
及び標識抗体１２等に移動する。通常、電極１８は高電
圧電源１７のアース側端子に接続され、電極１９は高電
圧が印加されるよう高電圧電源１７の高圧側端子に接続
される。高電圧のリークについては充分に配慮されるも
のとする。なお高電圧極性は任意に選択できる。また電
気泳動用バッファ１６は洗浄液１４と同一の組成を有す
るように構成される。洗浄液１４は、ポンプ２０により
供給容器２１から吸い上げられ、容器に注入される。ま
た洗浄液１４の廃棄容器２２への排出は、バルブ２３を
開閉することにより行われる。洗浄液１４の注入及び排
出の動作は、それぞれ対応する電気泳動が発生するたび
にタイミングを合せて自動的に行われる。

【００１２】キャピラリー保持機構３の構成を、図４〜
図７に基づいて説明する。キャピラリー１の上端には軟
質な材質で形成されたセプタム３１が取り付けられ、保
持を各ずつにするために突起部３２が設けられている。
この突起部３２はキャピラリー１の外周囲に沿って連続
した鍔形状でよいし、突起形状の代りに凹み形状であっ
てもよい。キャピラリー保持機構３の保持部分には、セ
プタム３１を貫通した状態で使用されるノズル３３が配
置される。このノズル３３は、チューブ（図示せず）を
介してシリンジポンプ２４に接続されている。キャピラ
リー１は、キャピラリー保持機構３の保持部分に形成さ
れたガイド３４に沿って挿入され、支点回りに回転自在
な押え部材３５で固定される。押え部材３５の動作は自
動的に制御される。図４はキャピラリー６１を固定する
前の状態を示し、図５は固定状態を示している。図６及
び図７は、キャピラリー１を保持するための他のキャピ
ラリー保持機構３′の構成を示す。この構成に従えば、
吸引作用を利用している。真空ポンプ４１にバッファタ
ンク４２を接続し、これをリークバルブ４３を経由して
キャピラリー保持機構３′の保持部分に開口部を有する
吸引系を形成する。キャピラリー１の上部の平坦部に、
上記の吸引系の開口部を密着させ、キャピラリー１を保
持する。キャピラリー１の固定状態を解除する場合には
リークバルブ４３を開く。図７では、図６中のＡ−Ａ線
断面図であり、前述の吸引系の開口部４４とノズル３３
との位置関係が明示される。

【００１３】測定部の構成を、その拡大図である図８を
参照して説明する。５１はシースフローセルである。こ
のフローセル５１には、上方の開口部を通して、キャピ
ラリー保持機構３に保持され且つ分析試料を内部に有す
る状態のキャピラリー１から分析試料すなわち測定液が
供給される。キャピラリー１からフローセル５１に測定
液を供給するには、シリンジポンプ２４の送液作用を利
用する。また、このフローセル５１の下部の所定箇所に
は、所定のレーザ光が照射される。レーザ光の光源５２
としては、例えば、発振波長６３５ｎｍの半導体レーザ
光源が用いられる。測光部には、外来光が入らないよう
に遮光板５３を設けた。光源５２から出射されたレーザ
光は、プリズム５４で整形され、更にレンズ５５で集光
され、フローセル５１の０記の所定箇所に照射される。
フローセル５１を流れる測定液から発生する蛍光は、顕
微鏡用の対物レンズ５６で集められ、空間フィルタ５
７、干渉（波長選択）フィルタ５８を通した後、半導体
光検知器（光電検知器としてのフォトマルチプライヤ）
５９で検出される。半導体光検知器５９の出力信号は、
アンプ６０で増幅され、パルス波高弁別器６１で信号を
選択してからカウンタ６２に入力するように構成した。
得られたデータの処理は、コントローラ（コンピュー
タ）６３で行う。必要に応じてインターフェイス６４を
接続し、外部の機器６５とも通信できるように構成され
る。分析結果の出力の形態としては、プリンタ等のほ
か、ＩＣメモリカードを利用することもできる。また装
置の初期設定に関しても、ＩＣカードに記憶させてお
き、立ち上げを容易にすることができる。

【００１４】またフローセル５１の内部構成は、既知の
フローサイトメータで用いられているものと同様であ
る。上方には、前述の通り、開口部すなわち試薬注入室
が形成されている（例えば特開平２−８０９３７号に開
示されている）。キャピラリー１の先端は、注入室入口
内に侵入し、シリンジポンプ２４の動作で測定液をフロ
ーセル５１内に吐出することができる。図８に示す如
く、送液ポンプ６６によってシース液槽６７内のシース
液が一定流量で送液され、フローセル５１の内壁に沿っ
て流れ、廃液溜６８に排出される。フローセル１内に導
入された被測定液は、シース液の流れの中央位置を流れ
る。なお、シース液等に含まれる気泡が影響しないよう
に、脱気装置６９を設置した。また蛍光性微粒子として
メチレンブルーを含む粒径０．１及び０．２μｍの粒子
を用いた。シース液を送液するための送液ポンプ６６と
しては、シリンジポンプや、加圧空気によりニューマチ
ックポンプを用いることができる。後者のポンプを使用
すれば、脈流が減少する効果がある。

【００１５】図１に示した構成において、説明していな
い他の構成については、以下の作用の説明の中で行う。

【００１６】市販の蛍光性微粒子に抗体を結合させた標
識抗体１２を準備し、図１の分析装置を用いて、ＣＥＡ
の免疫測定を行った例を、図９、図１０Ａ、図１０Ｂの
模式図及び前述の各図を用いて説明する。先ず準備とし
て図１０Ｂに示すように、カルボキシル基を表面に導入
してある蛍光性粒子（フルオレセイン含有；粒子径０．
１μｍ，Molecular Probe Inc.)７１に、水溶性カルボ
ジイミドを用いて抗ＣＥＡ抗体７２を結合し、前述の標
識抗体１２を作る。また複数のガラス製キャピラリー１
のそれぞれには抗ＣＥＡ抗体７３を結合しておき、反応
固相とする。測定操作の前に、ＣＥＡの標準溶液を調製
し、前述の試料１１を準備する。主に図１、図９、図１
０Ａ及び図１０Ｂを参照して、測定の手順に従って、動
作を説明する。ＸＹ移動機構４を制御して、キャピラリ
ー保持機構３を反応用キャピラリートレイ２の位置に移
動させ、当該キャピラリー保持機構３が前述の保持機能
によって１つのキャピラリー１を保持する。次に試料１
１の位置に移動し、シリンジポンプ２４の作用によりキ
ャピラリー１の内部に試料１１を吸引導入する。その
後、もとのキャピラリートレイ２上の位置に戻る。ここ
で、一定時間放置して、反応を行わせる。この状態が、
図１０Ａの試料反応工程８１である。キャピラリー１の
上端部にはセプタム３１が設けられているので、キャピ
ラリー１内の試料が外部に漏れることはない。この待ち
時間の間に、他のキャピラリーに用いて順次に試料導入
の動作が並行して行われる。反応が完了したキャピラリ
ー１については、同様にしてキャピラリー保持機構３で
保持し、洗浄液１４の位置に移動する。その後、キャピ
ラリー１の先端を洗浄液１４に浸漬し、高電圧電源１７
から電極１９に対して所要の高電圧を印加する。電圧印
加を方向を適宜に設定することにより、高電圧が電極１
９に印加されると、電気泳動作用に基づいてキャピラリ
ー１の内部の未反応成分が洗浄液１４の側に移動する。
この状態が、図１０Ａの洗浄工程８２である。次にキャ
ピラリー１の外部を洗浄する。キャピラリーの外部の洗
浄のために、キャピラリー１は、洗浄器８３の位置に移
動する。洗浄器８３ではシャワー８４が設けられてお
り、洗浄液８５が、シャワー８４によってキャピラリー
１の外部にかけられ、洗浄が行われる。シャワー８４に
よる洗浄液８５の噴射動作は、シリンジポンプ２４によ
って行われる。８６は切替え弁であり、シリンジポンプ
２４による各種の吸引又は吐出しの動作の切替えは、切
替え弁８６によって行われる。上記のキャピラリー１の
外部の洗浄の工程は、図１０Ａで８７として示される。
なお、図９で、８８はポンプ、８９はデガッサ（脱気装
置）である。

【００１７】次に、内外の洗浄が完了したキャピラリー
１は、標識抗体１２の配置位置に移動させられる。ここ
で、シリンジポンプ２４の吸引作用により、キャピラリ
ー１内に、蛍光性粒子７１を含む標識抗体１２を導入す
る。そして、キャピラリー１内で試料１１と標識抗体１
２とを反応させる。この状態が、図１０Ａにおける標識
抗体反応工程９１である。反応後、キャピラリー１をキ
ャピラリー保持機構３で保持した状態で、洗浄液１４の
位置に移動する。ここで、前述と同様に、キャピラリー
１の先端部を洗浄液１４に浸漬させた後、再び高電圧電
源１７によって電極１９に高電圧を印加し、キャピラリ
ー１の内部において未反応の標識抗体１２を洗浄液１４
の側に移動させる。そしてこの後に、再び、洗浄器８３
の位置でキャピラリー１の外側を、シャワー８４で供給
される洗浄液８５を用いて洗浄する。上記のキャピラリ
ー１の内外の洗浄の工程を、図１０Ａにおいて工程９２
で示す。

【００１８】上記の如く電気泳動の作用によって、キャ
ピラリー１の内部を充分に洗浄した後においては、カオ
トロピックイオン遊離液１３をシリンジポンプ２４を利
用してキャピラリー１の内部に導入し、抗原抗体反応で
キャピラリー１の内部に捕捉されている蛍光性粒子７１
を遊離させる。この状態が、遊離液添加工程９３であ
る。そして、そのままの状態にてキャピラリー１はフロ
ーセル５１の位置に移動させられる。ここで、シリンジ
ポンプ２４の吐出作用により、キャピラリー１内の遊離
された測定液を、フローセル５１の中に送給し、前述の
測定部の測定構成に基づいて計数を行う（工程９４）。
すなわち遊離した蛍光性粒子７１を含む液を測定液とし
て、被測定液中に存在する微粒子数を計数する。

【００１９】上記の構成に基づくＣＥＡ濃度に対する検
量線に関し、比較のための実験結果によれば、電気泳動
の作用で洗浄を行わず、シリンジポンプによる送液で洗
浄を行った場合には、見掛上の反応効率が約０．７倍に
低下するという結論を得た。このことは、液流によって
反応粒子が剥がれ、且つこれらの反応粒子が洗浄されず
キャピラリー１内に残存していることが原因となってい
ると想定される。図１１は、上記の電気泳動の洗浄によ
るキャピラリー内の状態Ｓ１と、液流洗浄によるキャピ
ラリー内の状態Ｓ２をイメージ化したものである。

【００２０】上記の如く、電気泳動を利用してキャピラ
リーの内部を洗浄し、未反応の試料や標識抗体を取り除
くように構成したため、高い精度で未反応試料等を取り
除くことができる。洗浄工程において、電気泳動の作用
を利用するようにしたため、洗浄液の液流を生じさせる
ことなく浮遊粒子を移動させることができるので、反応
によって管状反応容器に結合した標識抗体を剥がすこと
ない。従って、反応時に得られる反応効率を損なうこと
がなく、洗浄を行うことができる。なお粒子の電気泳動
については、アナティカル・ケミストリー６２巻、２４
８４−２４９０（１９９０年）（Analitical Chemistr
y, 62,2482-2490(1990)）に論じられる。クマリン誘導
体が含まれているラテックス粒子として粒径が０．１ｍ
のものを用い、且つＣＥＡ標準試料を用いて求めた検量
線例を図１３のａに示す。定量直線性が高く、特に低濃
度の定量性に優れており、酵素反応を利用した検出法の
ような低濃度での検量線の曲がりはなかった。粒子１個
を１分子に対応させて、検出下限を求めると、絶対量で
１０^-15mol 、濃度で１０^-18mol/l 以下であった。

【００２１】また本発明の効果を確認するため、標識物
として酵素の１つである西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ
（ＰＯＤ）を用い、蛍光性基質を反応させてＰＯＤ量を
検出する方法で、検量線を作成した。これを図１３で示
す。この場合、免疫反応後の標識物（ＰＯＤ）を遊離さ
せ別のマイクロプレートに移してから酵素反応させて測
定した場合（図１３のｂで示す）と、遊離せずにそのま
まマイクロプレートで酵素反応、蛍光測定した場合（図
１３のｃで示す）を行う。明らかに本発明による方法の
方が、バックグラウンドが低く且つ低濃度の検出感度の
高いことがわかる。電気泳動を容易に行うために、図１
２Ａ〜１２Ｄに示すように、キャピラリーの端面及び側
面に予め電極を設置しておくことにより用いてもよい。
様々な形のキャピラリー１０１，１０２，１０３，１０
４に電極１０５，１０６，１０７，１０８を設けてあ
る。キャピラリー１０３には、側面に孔１０９を有す
る。キャピラリー１０４はケース１１０に収められてお
り、長い毛細管を保持できる。試料導入等はケース１１
０から外に出された末端１１１と他端１１２を用いて行
われる。また試料、標識抗体、洗浄液等を収める容器に
予め電極を設置しておいても良い。

【００２２】他の実施例として、反応容器として図１に
示したキャピラリー１を利用した免疫分析装置の構成に
おいて、受容体が核酸を介して結合されている固相を有
するキャピラリーを使用することができる。この場合に
も、キャピラリーに試料を供給する試料供給部と、キャ
ピラリーに標識抗体を供給する標識抗体供給部と、キャ
ピラリー内から余剰の標識抗体を除去する洗浄部と、固
相から遊離された標識物を含む被測定液をフローセルに
導入し、フローセルを通る標識物の数を計数し、計数さ
れた数に基づいて試料中の分析対象物濃度を演算する測
定部が、それぞれ設けられる。これらの構成要素の具体
的構成は、前述の実施例で説明した構成と同じである。
すなわち洗浄部は、高電圧電源と、この高電圧電源の出
力電圧に基づきキャピラリーの内容物に所定電圧を印加
できるための電圧印加機構を有し、電気泳動の作用を利
用して洗浄を行うように構成される。この免疫分析装置
ではキャピラリーの内部に所定の所定のタイミングで制
限酸素含有液を供給する制限酸素含有液供給部を備え
る。制限酵素としては、制限エンドヌクレアーゼ、ホス
ホジエステラーゼ、ピロホスファターゼ、ペプチター
ゼ、エステラーゼなどの加水分解酵素が好適に用いられ
る。

【００２３】

【発明の効果】以上の如く本発明によれば、各洗浄工程
において、電気泳動の作用を利用して洗浄を行うように
したため、未反応の試料や標識抗体のみを確実に取り除
くことができ、洗浄効率が実用的に高くなり、作業性が
向上すると共に、反応で発生した分析対象物のみを正確
に測定部に取り出すことができ、試料中の分析対象物が
微量であっても正確で高感度な測定結果が得ることがで
きる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の一実施例を示す全体装置の概略構成図
である。

【図２】装置上部の一部構成を示す正面図である。

【図３】装置上部の一部構成の平面図である。

【図４】キャピラリー取付け部の取付け前の構造を示す
部分構成図である。

【図５】キャピラリー取付け部の取付け後の構造を示す
部分構成図である。

【図６】キャピラリーを固定するための他の実施例を示
す構成図である。

【図７】図６におけるＡ−Ａ線から見た図である。

【図８】測定部を拡大して示す構成図である。

【図９】キャピラリーの内部及び外部の洗浄について説
明するために構成図である。

【図１０Ａ】測定液の作製工程及び測定工程を説明する
ための模式的工程図である。

【図１０Ｂ】標識抗体の構造を示す模式図である。

【図１１】電気泳動洗浄と液流洗浄を比較するための説
明図である。

【図１２Ａ】キャピラリー及び電極の他の実施例を示す
斜視図である。

【図１２Ｂ】キャピラリー及び電極の他の実施例を示す
斜視図である。

【図１２Ｃ】キャピラリー及び電極の他の実施例を示す
斜視図である。

【図１２Ｄ】キャピラリー及び電極の他の実施例を示す
構成図である。

【図１３】ＣＥＡ標準試料を測定した結果を比較した図
である。

【符号の説明】

１キャピラリー２キャピラリートレイ３キャピラリー保持機構４ＸＹ移動機構１１試料１２標識抗体１３遊離液１４洗浄液１６電気泳動バッファ１７高電圧源１８，１９電極

フロントページの続き (72)発明者薛育明茨城県勝田市市毛882番地株式会社日立製作所那珂工場内 (72)発明者保田健二茨城県勝田市市毛882番地株式会社日立製作所那珂工場内 (72)発明者岡野和宣東京都国分寺市東恋ケ窪一丁目280番地株式会社日立製作所中央研究所内 (72)発明者高橋智東京都国分寺市東恋ケ窪一丁目280番地株式会社日立製作所中央研究所内 (72)発明者時永大三東京都千代田区神田駿河台４丁目６番地株式会社日立製作所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（ａ）受容体が結合された固相を有する
管状反応容器に試料を供給し、前記試料中の分析対象物
を前記受容体に結合させること、（ｂ）電気泳動による洗浄で未反応試料を前記管状反応
容器から除去した後、蛍光性粒子で標識された標識受容
体を前記管状反応容器に供給し、前記分析対象物を介し
て前記固相に前記標識受容体を結合させること、（ｃ）電気泳動による洗浄で余剰の標識受容体を前記管
状反応容器から除去した後、前記管状反応容器に遊離剤
を含む遊離試薬を供給すること、（ｄ）前記固相から遊離された蛍光性粒子を含む被測定
液をフローセルに導入し、前記フローセルを通る蛍光性
粒子に基づく蛍光を検出して検出粒子数を計数し、計数
された粒子数に基づいて前記試料中の分析対象物濃度を
演算すること、からなることを特徴とする免疫分析方法。
【請求項２】（ａ）受容体が核酸を介して結合されて
いる固相を有する管状反応容器に試料を供給し、この試
料中の分析対象物を前記受容体に免疫結合させること、（ｂ）標識受容体を前記管状反応容器に供給し、前記固
相に結合させること、（ｃ）電気泳動による洗浄で余剰の標識受容体を前記管
状反応容器から除去した後、制限酵素含有液を前記管状
反応容器に供給し前記核酸を切断すること、（ｄ）前記固相から遊離された標識物を含む被測定液を
フローセルに導入し、前記フローセルを通る前記標識物
の数を計数し、計数された数に基づいて前記試料中の分
析対象物濃度を演算すること、からなることを特徴とする免疫分析方法。
【請求項３】請求項１又は２記載の免疫分析方法にお
いて、前記試料の導入及び前記標識受容体の導入を電気
泳動によって行うことを特徴とする免疫分析方法。
【請求項４】請求項１又は２記載の免疫分析方法にお
いて、前記管状反応容器は毛細管であり、その内径が１
ｍｍ以下であることを特徴とする免疫分析方法。
【請求項５】請求項１又は２記載の免疫分析方法にお
いて、前記試料の導入及び標識受容体の導入を毛管現象
により行うことを特徴とする免疫分析方法。
【請求項６】請求項１又は２記載の免疫分析方法にお
いて、前記管状反応容器がガラス製又は合成樹脂製であ
ることを特徴とする免疫分析方法。
【請求項７】請求項１又は２記載の免疫分析方法にお
いて、前記の各受容体は抗体であり、前記分析対象物は
抗原又はハプテンであることを特徴とする免疫分析方
法。
【請求項８】請求項１又は２記載の免疫分析方法にお
いて、前記遊離試薬はカオトロピックイオンを含むもの
であることを特徴とする免疫分析方法。
【請求項９】請求項１記載の免疫分析方法において、
前記蛍光性粒子は、ラテックス粒子もしくは無機物粒子
の表面に蛍光性物質層を形成させたもの、又は粒子形成
組成物と蛍光性物質の混合物が粒子化されたものである
ことを特徴とする免疫分析方法。
【請求項１０】請求項１記載の免疫分析方法におい
て、前記蛍光性粒子の粒径は１０^-2〜１０^-5mmであるこ
とを特徴とする免疫分析方法。
【請求項１１】請求項２記載の免疫分析方法におい
て、前記核酸は塩基対を有するものであることを特徴と
する免疫分析方法。
【請求項１２】請求項２記載の免疫分析方法におい
て、前記核酸はオリゴヌクレオチドであることを特徴と
する免疫分析方法。
【請求項１３】請求項２記載の免疫分析方法におい
て、前記固相は、前記管状反応容器の内壁を、前記受容
体に対し、化学結合可能に表面処理したものからなるこ
とを特徴とする免疫分析方法。
【請求項１４】受容体が結合された固相を有する管状
反応容器に試料を供給する試料供給部と、蛍光性粒子で
標識された標識受容体を前記管状反応容器に供給する標
識受容体供給部と、前記管状反応容器に遊離剤を含む遊
離試薬を供給する遊離試薬供給部と、反応後の前記管状
反応容器内から未反応試料を除去すること及び前記管状
反応容器内から余剰の標識受容体を除去することをそれ
ぞれ行う洗浄部と、前記固相から遊離された蛍光性粒子
を含む被測定液をフローセルに導入し、前記フローセル
を通る蛍光性粒子に基づく蛍光を検出して検出粒子数を
計数し、計数された粒子数に基づいて前記試料中の分析
対象物濃度を演算する測定部とを含む免疫分析装置にお
いて、前記洗浄部は、高電圧電源と、この高電圧電源の
出力電圧に基づき前記管状反応容器の内容物に所定電圧
を印加する電圧印加部とからなることを特徴とする免疫
分析装置。
【請求項１５】受容体が核酸を介して結合されている
固相を有する管状反応容器に試料を供給する試料供給部
と、標識受容体を前記管状反応容器に供給する標識受容
体供給部と、前記管状反応容器に制限酸素含有液を供給
する制限酸素含有液供給部と、前記管状反応容器内から
余剰の標識受容体を除去する洗浄部と、前記固相から遊
離された標識物を含む被測定液をフローセルに導入し、
前記フローセルを通る前記標識物の数を計数し、計数さ
れた数に基づいて前記試料中の分析対象物濃度を演算す
る測定部とを含む免疫分析装置において、前記洗浄部
は、高電圧電源と、この高電圧電源の出力電圧に基づき
前記管状反応容器の内容物に所定電圧を印加する電圧印
加部とからなることを特徴とする免疫分析装置。