JPH06209758A - 核酸分析装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】高感度な分析方法を採用する核酸分析装置を提
供すること。 【構成】反応固相を磁石に保持した状態で、液相部分を
フローセルに導入する機構を有し、該フローセルを通る
反応液の粒子に基づく光学的特性を測定して試料中の分
析対象物の濃度を求めるように構成した核酸分析装置。 【効果】ハイブリダイゼーションにより捕捉された標識
物すなわち微粒子を、一旦遊離させてから計測するの
で、高感度な核酸分析装置を提供できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、核酸測定用分析装置に
係り、特に、分析対象物を粒子で標識した後に、粒子を
フローセルに導いて計測する分析装置に関する。

【０００２】

【従来の技術】感染症の診断には、病原微生物の検出同
定が必須である。しかし、感染症の原因微生物を培養に
よって検出同定するには時間がかかり、疾病の診断と治
療に間に合わないことが多い。このために、免疫学的検
査法による診断が普及するようになってきている。免疫
学的検査法は、主として表層の蛋白質とか、増殖過程で
多量に生産された抗原物質を検出しているが、これらの
蛋白質は必ずしも微生物の病原性と関連している訳でも
ない。すなわち、特定の病原微生物またはその特異抗原
に対する患者血清の抗体価上昇を証明することは、感染
症の影を見ているに過ぎず、その本態を確認するもので
はない。

【０００３】近年、核酸ハイブリダイゼイションの技術
を使用して、試料中の特定塩基配列の有無を調べること
により、感染症の病因菌の特定ならびに、感染症の発症
前の診断が可能になってきた。

【０００４】すなわち、ＤＮＡプローブを用いる方法で
ある。すなわち、検出対象とする核酸の塩基配列に相補
的な配列を有する一本鎖ＤＮＡ（これをＤＮＡプローブ
と呼ぶ）を特異的な反応試薬として利用する。試料中に
ＤＮＡプローブの塩基配列と相補的な塩基配列の有無を
検出することにより、目的病原菌の有無を判断できる。

【０００５】具体的な方法としては、各種提案されてき
た。日本臨床，４７巻，７３７−７５４(１９８９)等に
紹介されている。例えば、ドットハイブリダイゼイショ
ンと呼ばれる方法がある。試料を変性処理して得た一本
鎖ＤＮＡ（ＳＳ−ＤＮＡ）を固相に結合させ、この固相
にラジオアイソトープを標識したＳＳ−ＤＮＡを作用さ
せて固相のＳＳ−ＤＮＡとハイブリッドを形成させてか
ら未反応の標識ＳＳ−ＤＮＡを除去し、固相の放射線を
測定する方法が行なわれていた。

【０００６】この方法の変法として、サンドイッチハイ
ブリダイゼイションがある。この方法では、吸着による
バックグラウンドを下げることができ、不純なサンプル
を用いる場合に特に有効である。この方法では、識別し
ようとする標的核酸に由来するＤＮＡフラグメントを少
なくとも２つ使用する。一方のＤＮＡフラグメントは固
相に結合させて、捕獲試薬として使用する。もう一方の
フラグメントは検出用試薬として標識し、ハイブリダイ
ゼイション溶液に可溶化した標本サンプルと一緒に加え
る。標本サンプル中に、両方の試薬に相同的な塩基配列
が存在している場合には、その配列は、捕獲試薬にも検
出用試薬にもハイブリダイズするはずである。ハイブリ
ダイズしたか否かは、固相への標識を介して知ることが
できる。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】以上の２つの方法で
は、特に検出対象核酸の量が少ない場合に問題がある。
また、測定の際に数多くの作業工程を必要とし、特に試
料の固定化に長時間を要することから操作の労力及び、
測定の迅速性にも問題があった。測定の自動化という点
から見ると適していない方法であると言える。さらに、
これらの方法の主要な欠点としては従来プローブとして
はアイソトープで標識したプローブが広く使用されてい
ることである。アイソトープを使うと、コストが高い上
に、安全性や廃棄の点を考慮しなくてはならないという
欠点がある。

【０００８】これを解決するような方法が、たとえば、
特公平3−78120号（特願昭58−199702号）に提案されて
いる制限酵素を用いる方法である。この方法では、測定
対象である一本鎖ポリヌクレオチドを、標識物が結合さ
れかつ測定対象一本鎖ポリヌクレオチドと反応して二本
鎖ポリヌクレオチドを形成する一本鎖ポリヌクレオチド
を結合した固相と溶液中で接触させて二本鎖ポリヌクレ
オチドを形成させて、形成された二本鎖ポリヌクレオチ
ドに制限酵素を作用させて、この二本鎖ポリヌクレオチ
ドを切断し、溶液又は固相の標識物を測定する。

【０００９】同様に制限酵素または選択可能な切断部位
を導入した試薬を用いる方法が特開平2−92300号に示さ
れている。

【００１０】一方、核酸の分析との関連づけはないが、
特願平3−34031号は、微粒子を標識体として用いる高感
度免疫分析方法を提案している。この先行技術では、微
粒子を標識体として用い、抗原抗体反応等の特異反応に
より測定対象物量に比例した微粒子を反応固相に捕捉し
た後、これを遊離させて、遊離液中の微粒子数を計数す
ることにより、測定対象物量を求める。遊離体を含む被
測定液をフローセル中に導入し、流れと直行する方向か
ら照射したレーザ光束中を微粒子が通過する際に発生す
るパルス状の蛍光を検出し、パルス数を数えることによ
り、微粒子を計数する。この技術では、一旦反応固相上
に捕捉された標識物すなわち微粒子を遊離させてから計
測するので、非特異的に固相に結合する標識物の影響を
免れることができた。微粒子を標識とし、これを計数す
ることにより、低濃度でも直線性の高い検出を実現して
いる。

【００１１】

【課題を解決するための手段】発明者は、従来技術の課
題を解決すべく検討を続けた結果、微粒子を標識体とし
て用いて粒子標識体と試料が関係するハイブリダイゼー
ションによって、粒子標識体を検出することによって、
試料中に存在する核酸分析物の特定のオリゴヌクレオチ
ド配列の検出方法を提供できることがわかり、該方法に
よる測定を自動化するに好適な本発明の分析装置を完成
するに至った。

【００１２】すなわち、本発明の分析装置においては、
試料中に存在する核酸分析物の特定のオリゴヌクレオチ
ド配列を検出するために、該試料をハイブリダイゼーシ
ョン条件下で粒子標識したポリヌクレオチド（ＤＮＡプ
ローブ）試薬と混合する工程、ハイブリダイゼーション
によって形成した二本鎖を切断する工程、該切断により
遊離する微粒子を検出する工程を自動で行なう。

【００１３】本発明で使用する粒子としては、蛍光性の
微小粒子および磁性体粒子を用いるのが好適である。

【００１４】本発明に基づく分析装置は、反応固相を磁
石に保持した状態で、液相部分をフローセルに導入する
機構を有し、該フローセルを通る反応液の粒子に基づく
光学的特性を測定して試料中の分析対象物の濃度を求め
るように構成される。

【００１５】本発明に基づく他の分析装置は、複数の試
料容器と複数の試薬容器を移送する機構を有し、複数の
反応容器を配列した反応デイスクの特定の領域に一つ或
いは複数の洗浄プローブからなる洗浄機構を有し、該洗
浄領域の周囲に磁石を配置し、反応固相を磁石に保持し
た状態で、液相部分をフローセルに導入する機構を有
し、該フローセルを通る反応液の粒子に基づく光学的特
性を測定して試料中の分析対象物の濃度を求めるように
構成される。

【００１６】本発明に基づく他の分析装置は、複数の試
料容器と複数の試薬容器を移送する機構を有し、反応液
をチューブに導入する機構を有し、該チューブの周囲に
磁石を配置し、反応固相を磁石に保持した状態で、チュ
ーブ内の液相部分をフローセルに導入する機構を有し、
該フローセルを通る反応液の粒子に基づく光学的特性を
測定して試料中の分析対象物の濃度を求めるように構成
される。

【００１７】

【作用】まず試料と蛍光性微粒子を結合（標識）させた
螢光粒子標識ＤＮＡプローブと、磁性体微粒子を結合さ
せた磁性体粒子ＤＮＡプローブを反応させる。反応容器
に分注した試料と蛍光粒子標識ＤＮＡプローブ試薬と磁
性体粒子結合ＤＮＡプローブ試薬は反応して二本鎖を形
成する。それぞれのＤＮＡプローブとしては、該試料中
に含まれる測定対象のヌクレオチド配列に相補的なヌク
レオチド配列を有するものを使用する。このためにこれ
らの二種類の粒子標識プローブは、該試料中に含まれる
測定対象のヌクレオチドとハイブリダイズして二本鎖を
形成する。反応デイスクの特定の領域例えば洗浄のため
の領域の周囲には磁石を配置してある。このために、反
応容器が該領域に進むと、試料と反応して二本鎖を形成
した磁性体粒子結合ＤＮＡプローブと未反応の磁性体粒
子結合ＤＮＡプローブは共に反応容器壁に吸着する。こ
れに対して未反応すなわち余剰の蛍光粒子標識ＤＮＡプ
ローブは反応溶液中を遊離している。一方、該領域には
一つ或いは複数の洗浄プローブからなる洗浄機構が設置
されている。磁性体粒子結合ＤＮＡプローブが反応容器
壁に吸着している状態で洗浄プローブによって反応液を
排出することによって、余剰の蛍光粒子標識ＤＮＡプロ
ーブは反応容器外に排出される。必要に応じて反応容器
内を洗浄することもできる。次に、反応容器内に残存し
たハイブリダイズ産物に適当な制限酵素を作用させる
と、ハイブリダイゼーションによって形成した二本鎖部
位が切断されて蛍光粒子が遊離する。遊離した蛍光粒子
をフローセルに導入する。フローセルを通る粒子に基づ
く蛍光を検出し、検出粒子数を計数する。計数された粒
子数に基づいて上記試料中の分析対象物の濃度を演算す
ることができる。

【００１８】また、ハイブリダイズ産物を含む反応液を
チューブに導入してもよい。該チューブの周囲に配置し
た磁石に反応固相である磁性体粒子を保持させた状態
で、チューブ内を洗浄して余剰の蛍光粒子標識ＤＮＡプ
ローブを除去したのちに、ハイブリダイズ産物に適当な
制限酵素を作用させると、ハイブリダイゼーションによ
って形成した二本鎖部位が切断されて蛍光粒子が遊離す
る。遊離した液相部分の蛍光粒子をフローセルに導入し
てフローセルを通る粒子に基づく蛍光を検出し、検出粒
子数を計数する。計数された粒子数に基づいて上記試料
中の分析対象物の濃度を演算することができる。

【００１９】また、試料と、ビオチンを結合させたＤＮ
Ａプローブと、ＤＮＡプローブを結合させた磁性体微粒
子を反応させたのちに、ビオチンを結合させた余剰のＤ
ＮＡプローブを洗浄によって反応液から除去して、しか
る後に、アビジンを結合させた蛍光性微粒子を反応液に
加えてもよい。アビジンを結合させた余剰の蛍光性微粒
子は、洗浄によって除去すれば良い。試料とＤＮＡプロ
ーブ試薬とは反応して二本鎖を形成する。それぞれのＤ
ＮＡプローブとしては、該試料中に含まれる測定対象の
ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有する
ものを使用する。ハイブリダイズ産物に適当な制限酵素
を作用させると、ハイブリダイゼーションによって形成
した二本鎖部位が切断されて蛍光性粒子が遊離するから
上述のように該粒子に基づく蛍光を検出し、検出粒子数
を計数すればよい。

【００２０】洗浄機構に設けた一つ或いは複数の洗浄プ
ローブの反応容器内への挿入を制御するように構成すれ
ば、該反応容器中への洗浄プローブの挿入を止めること
ができるから、反応時間が、反応ディスクが一回転する
に要する時間を超えるように設定することができる。複
数の洗浄プローブを使用する場合には、一本ずつ制御し
てもよいし、全体を同時に制御してもよい。

【００２１】蛍光性微小粒子は、ラテックス粒子または
無機物粒子の表面に蛍光物質層を形成せしめたものを実
用でき、あるいは粒子形成組成物と蛍光物質の混合物を
粒子化したものを実用できる。蛍光性粒子の粒径は０.
１−１.０ｕｍであると好適に使用することが出来る。

【００２２】

【実施例】本発明に基づく第１の実施例を、図１及び図
２を参照して説明する。

【００２３】図１は、第１の実施例である核酸分析装置
の全体構成を示す概略図である。ターンテーブル１は、
血清などの試料を収容した複数のサンプル容器３３がサ
ークル上に配列され、ターンテーブル２には反応恒温槽
内に複数の測定セルを兼ねた反応容器３４がサークル上
に配列され、未反応の過剰の蛍光標識粒子を分離できる
よう反応容器３４の周囲には磁石が一部配置されてい
る。このターンテーブル１および２は、コントローラ４
６によって動作制御されるパルスモータ９２によって所
望のサンプル容器３３および反応容器３４を、ピペッテ
ィングノズル４３による吸引位置にて位置するように回
転自在に構成されている。サンプル容器３３内のサンプ
ルの移送は、ピペッティングノズル４３によって行なわ
れる。ピペッティングノズル４３によりサンプルの一定
量が吸入され、サンプル吐出位置に移送された反応容器
３４内に吐出される。

【００２４】試薬テーブル３５上には、分析操作に必要
な各種の試薬液容器が配置される。すなわち、核酸分析
に必要な、各種分析項目Ａ，Ｂ，Ｃにそれぞれ対応する
磁性体粒子標識プローブ液を収容した容器９０ａ，９０
ｂ，９０ｃと蛍光性粒子標識プローブ液を収容した容器
３６ａ，３６ｂ，３６ｃと制限酵素液収容容器３８と、
その他必要な緩衝液容器等が、試薬テーブル３５に保持
されている。コントローラ４６によって動作制御される
パルスモータ９３は試薬テーブル３５を所望の角度回転
し、必要なタイミングで指定された試薬容器をノズル４
３による吸入位置に停止するように位置づける。すなわ
ち、第一の試薬は、第一の試薬分注位置でノズル４３に
よって反応容器３４内に注入されることができる。ま
た、第二の試薬は、第二の試薬分注位置でノズル４３に
よって反応容器３４内に注入されることができる。

【００２５】自動ピペット機構３９は、可動アーム４２
に取り付けられたピペッティングノズル４３，アーム４
２を水平回転させるための回転駆動部４５，アーム４２
を上下動するための上下駆動部４４，チューブ４１を介
してノズル４３に接続されたシリンジポンプ４０、およ
び押出液を兼ねた洗浄液槽３７を備えている。アーム４
２の動作に伴ってピペッティングノズル４３は、ターン
テーブル１上の吸入位置，試薬分注位置，フローセル４
７の注入室入口４８、およびノズル洗浄槽９４の上を回
転半径として回転することができ、それぞれの位置で下
降および上昇することができる。

【００２６】シースフローセル４７の内部構成は、既知
のフローサイトメータで用いられているものと同様であ
るが、上方には特開平2−80937号に示されているものと
同等の試薬注入室が開口されている。それゆえ、ノズル
４３は注入室入口４８内に侵入して被測定液をシースフ
ローセル４７ないに吐出することができる。送液ポンプ
９によってシース液槽６内のシース液が一定流量で送液
され、フローセル４７の内壁に沿って流れ、廃液溜９５
に排出される。フローセル内に導入された被測定液は、
シース液の流れの中央を流れる。

【００２７】レーザ光源４９は、発振波長が４８８ｎｍ
のアルゴンレーザを出射することができ、このレーザ光
束はビームエクスパンダ５０でビーム幅を広げられた
後、レンズ５１によって絞られ被測定液の流れに合焦点
するようにシースフローセル４７に照射される。フロー
セル４７からの蛍光の集光には顕微鏡用の対物レンズ５
２を用いている。光電検知器としてのフォトマルチプラ
イヤ５３の前に空間フィルタ５４および波長選択フィル
タ５５を設け、散乱光およびラマン光を除去する。フォ
トマルチプライヤ５３の出力をプリアンプ１８で増幅し
た後、リニアアンプ１９で増幅し、下限波高弁別器２０
ａおよび上限波高弁別器２０ｂによりノイズを除去す
る。その後２種の閾値の間にあるパルスをカウンタ５６
で積算する。

【００２８】トランス９６および高圧電源９７を介して
フォトマルチプライヤ５３には高電圧が印加される。試
料番号，計数結果，検量線，蛍光測定のヒストグラム、
等はディスプレイ５７，プリンタ２２，フロッピーディ
スク５８に出力する。またインターフェイス５９を介し
て、パーソナルコンピュータとも通信できる。

【００２９】信号処理のダイヤグラムを図２に示す。プ
リアンプの出力８０をパルス波高値により弁別する回路
２０を経て、パルス列８２を得る。これをカウンタ５６
で積算する。もう一方の信号処理経路では、出力８０を
平滑化回路８４を通し、パルス数を電圧変化に変換して
信号８５を得、電圧変化を電圧計８６で計測する。この
平滑化による計測は、例えば、ペンレコーダを接続し
て、記録した値を読み取ることによっても行なえる。

【００３０】反応容器内における分析操作過程を、ＨＢ
Ｖ（Ｂ型肝炎ウイルス）を例にして説明する。分析項目
は、操作開始後に加えられる粒子プローブの種類によっ
て特定される。

【００３１】粒子標識プローブ液容器９０ａには、一本
鎖ＨＢＶ−ＤＮＡプローブタイプ１を固定化した磁性体
ラテックス粒子試薬を準備しておく。一方、蛍光性粒子
標識プローブ液容器３６ａには、蛍光性物質としてのク
マリン誘導体が含有されている蛍光ラテックス粒子に一
本鎖ＨＢＶ−ＤＮＡプローブタイプ２を結合させた蛍光
標識ラテックス粒子試薬を準備しておく。それぞれの一
本鎖ＨＢＶ−ＤＮＡプローブ（一本鎖ＨＢＶ−ＤＮＡプ
ローブタイプ１と一本鎖ＨＢＶ−ＤＮＡプローブタイプ
２）は、測定対象の核酸成分に対して相補的なヌクレオ
チド配列を持つが、互いには相補的なヌクレオチド配列
を持たないものを使用した。

【００３２】制限酵素液としては、蛍光標識ラテックス
粒子に結合させた一本鎖ＨＢＶ−ＤＮＡプローブタイプ
２と測定対象の核酸成分がハイブリダイズして形成した
二本鎖ＤＮＡを切断する制限酵素として、例えばＨａｅ
IIIを準備しておく。

【００３３】分析操作が開始されると、反応容器３４に
は、サンプル容器３３からノズル４３によって分取され
た試料が添加される。次に、ノズル４３により磁性体ラ
テックス粒子試薬液容器９０ａから磁性体ラテックス粒
子試薬が分取され、前記反応容器３４内に吐出される。
これにより試料中のＨＢＶ−ＤＮＡは、一本鎖HBV−Ｄ
ＮＡプローブタイプ１を固定化した磁性体ラテックス粒
子と反応する。反応容器３４は所定温度（３７℃）のも
とで一定時間（１５分間）ターンテーブル上で反応を維
持する。

【００３４】次に、蛍光標識ラテックス粒子試薬を、試
薬テーブル３５上の容器３６ａからノズル４３で一定容
量吸入し対応する反応容器３４に吐出する。反応容器３
４は所定温度（３７℃）のもとで一定時間（１５分間）
ターンテーブル上で反応を維持する。これにより、先の
ハイブリダイズ反応物にさらに一本鎖ＨＢＶ−ＤＮＡプ
ローブタイプ２が反応する。

【００３５】ターンテーブル２上の特定の領域には、反
応容器３４の周囲に磁石が配置されている。該領域に反
応容器３４が移送されると、磁性体ラテックス粒子に反
応したハイブリダイズ産物と未反応の磁性体ラテックス
粒子は磁石の作用で反応容器壁に吸着するが、未反応の
蛍光標識ラテックス粒子は液中に遊離している。反応容
器内の余剰の蛍光標識ラテックス粒子を含む液は洗浄プ
ローブによって反応容器外に排出される。反応容器内へ
洗浄液が吐出され、さらにその洗浄液を排出する操作が
繰り返される。

【００３６】次いで試薬テーブル３５の回転により吸入
位置に制限酵素液容器３８が位置付けられ、その容器３
８内の制限酵素ＨａｅIII ２５を含む液がピペッティン
グノズル４３により一定量吸入され、ターンテーブル２
上の対応する反応容器３４に吐出される。反応容器内で
は、蛍光標識ラテックス粒子に結合させた一本鎖HBV−
ＤＮＡプローブタイプ２と測定対象の核酸成分がハイブ
リダイズして形成した二本鎖ＤＮＡが、所定の切断箇所
で切断される。これにより、反応容器３４内の液に蛍光
標識ラテックス粒子が遊離する。このような遊離反応の
ためにも所定の時間（１５分間）が必要である。これら
の遊離体を含む被測定液は、ピペッティングノズル４３
によって吸入されシースフローセル４７に吐出される。
遊離粒子を計数して第二の成分である核酸濃度を求め
る。

【００３７】

【発明の効果】本発明に依れば、試料中の分析対象物が
微量であっても正確で高感度な測定結果が得られるの
で、核酸分析の自動化にとって多大に貢献する。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の一実施例の概略構成図である。

【図２】図１の装置で二系統の信号処理を行なうダイア
グラムである。

【符号の説明】

２…ターンテーブル、１０…分光器、１１…光源ラン
プ、１５…排液装置、１６…洗浄装置、３３…サンプル
容器、３４…反応容器、３５…試薬テーブル、３６ａ,
３６ｂ,３６ｃ…蛍光性粒子標識プロ…ブ液容器、３８
…制限酵素液収容容器、４２…可動アーム、４３…ピペ
ッティングノズル、４６…コントローラ、４７…シース
フローセル、４８…注入室入口、５６…カウンタ、９０
ａ，９０ｂ，９０ｃ…磁性体粒子標識プロ…ブ液容器、
９４…ノズル洗浄槽。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】反応固相を磁石に保持した状態で、液相部
   分をフローセルに導入する機構を有し、該フローセルを
   通る反応液の粒子に基づく光学的特性を測定して試料中
   の分析対象物の濃度を求めるように構成したことを特徴
   とする核酸分析装置。
2. 【請求項２】複数の試料容器と複数の試薬容器を移送す
   る機構を有し、複数の反応容器を配列した反応デイスク
   の特定の領域に一つ或いは複数の洗浄プローブからなる
   洗浄機構を有し、該洗浄領域の周囲に磁石を配置し、反
   応固相を磁石に保持した状態で、液相部分をフローセル
   に導入する機構を有し、該フローセルを通る反応液の粒
   子に基づく光学的特性を測定して試料中の分析対象物の
   濃度を求めるように構成したことを特徴とする核酸分析
   装置。
3. 【請求項３】複数の試料容器と複数の試薬容器を移送す
   る機構を有し、反応液をチューブに導入する機構を有
   し、該チューブの周囲に磁石を配置し、反応固相を磁石
   に保持した状態で、チューブ内の液相部分をフローセル
   に導入する機構を有し、該フローセルを通る反応液の粒
   子に基づく光学的特性を測定して試料中の分析対象物の
   濃度を求めるように構成したことを特徴とする核酸分析
   装置。