JPS6040955A - 自動マイクロプレ−ト分光分析装置及び方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は細胞の機能を測定する方法及び装置に関するも
ので、特に細胞粘着能、０２−産生能。

酵素活性、酵素標識抗原抗体反応等の測定に好適な細胞
機能測定に用いられる自動マイクロプレート分光分析装
置及び方法に関する。

従来の技術 溶液中の微量物質を検出する手段として従来ＲＩＡ（ラ
ジオイムノアッセイ）法やＩＦ（免疫螢光）法があった
が、法的規制や試薬寿命、感度などそれぞれに一長一短
があシ、断しい技術の開発が望まれていた。

近年抗原または抗体をラジオアイソトープや螢光色素の
代わ〕に酵素で標識する技術が開発され、当初は組織化
学の分野で利用されていたが、その後溶液系にも応用可
能であることがわかシ、専用の試薬も開発されるにいた
り、各方面で注目を注びている。

（１−ｏ　技術ハ、エンデイム・イムノアッセイまたは
酵素免疫測定法と呼ばれ、ＥＩＡまたはＥｌ、ＩＳＡと
略称されておシ、その原理は、おる担体に吸着させた抗
原（または抗体）を用い溶液中の抗体（または抗原）を
抗原−抗体反応で捕捉しておき、次に同じ原理で酵素標
識抗体を作用させ、洗浄して未反応成分を除去後酵素基
質を加えて発色させるものである。

酵素反応による生成物の吸光度又は螢光は、溶液中の未
知抗体（または抗原）量に依存するので、前もって既知
濃度で標準曲線をめておけに吸光度及び螢光強度から検
体中の反応生成物質の量を算出することができる。

この担体としてマイクロプレートを導入することによシ
、検体、試薬の微量化と操作の迅速化が可能となシ多数
検体処理の技術が開かれた。

従来のこのマイクロプレート分光分析針の１例を第１図
に示す。どの動作原理を説明すると次の通シである。光
源ランｆ２からの光は、コンデンサレンズを通シビンホ
ール３上に集光され、コリメータレンズで平行光束にな
った後、ゾリズムで直角にまげられてマイクロプレート
の試料入れ（マイクログレートウェル）を垂直に通過す
る。元はマイクログレートウェル底部に収斂されて通過
する。試料を通過した光は、フィルターを経てノ・−フ
ミラーによ如λ１．λ２側に導びかれる。各々の光は干
渉フィルタλ１．λ２によシ羊色光となシ受光素子で光
電変換され、ゾリアンフ０を経て演算増ｌＪ部に入る。

増ｒｌｊ演算部では、λｌλ２各々の信号を増ｒｌｊし
た後対数演算し、２波長の吸光度差として表示する。

しかし、これらの方法を更に自動化及び迅速化すること
が出来れば、生きた細胞を検体として用いることができ
るため生体に近い反応系を再現出来、爽に応用面が開か
れることが期待出来る。

従来技術の欠点 第１図に示した従来例では、吸光度を測定するため一組
の照射手段と検出器よシ成υ立っているため、処理速度
を上げるには限界があった。

そのため、−列に並んだウェルの個数と等しい照射光学
系と検出器をもつダイクロミクフィルターを用いた方法
が提案されているが、光学素子の数が多くなシ栴成が複
雑であるなど笑用土問題がらりた。又マイクログレート
へ溶液、試薬を分注する場合マイクロ分光分析装置とは
別の場所で分注器による分注を行い、分注したマイクロ
グレートを手動によりマイクロ分光分析装置にセットし
て測定を行う方法が採用されていた。従って、分注から
測定まで自動化されてなくおのずからスピードに限界が
ある上、酵素標識抗原抗体反応の酵素活性値をめるため
に必要な分注後の一定時間間隔の吸光度や螢光強度をめ
る機能、いわゆるレートアッセイの継時変化６１１］定
機能を有していなく、又マイクロプレート部の温調が行
なわれていないため、温度変化の影響で測定精度が悪い
欠点も有していた。

目　的 本発明の目的は、従来法の欠点を改良すると同時に処理
出来る能力を向上させ、マイクロプレート上で多検体を
同時に反応させるなどの改良開発を行い、生体に近い反
応系での細胞機能測定装置を提供することにあ）、特に
多検体同時測定機能を可能にすることにより、生きたま
まの細胞を生体に近い反応系で再現測定を可能とし。

Ａ、白血球（主に好中球）の機能検査 特に（１）ライリゾーム酵素放出能、（２）　０２−産
生能、（３）細胞粘着能 迅速、自動的にその活性のＫｉｎｅｔｉｃｓ測定Ｂ、パ
ーオキシデース標識抗体を用いた酵素免疫測冗法の測足
精度、感度向上 Ｃ０−膜化化学の酵素活性の初速度測定が出来る細胞機
能測定装置を提供することを目的とする。

更に本発明のもう一つの目的は、多検体同時測定を試料
による光の吸収による測定と試料による螢光測定が可能
にした装置を提供するととにある。

螢光法による高感度多検体迅速測定によシ。

ん白血球（主に好中球）の機能のうち （１）ライリゾーム酵素（β−ダルクロンデース。

β−ガラクトンデース、β−がラクトザミニデース、ノ
イラミンデース、リゾチーム等の糖加水分解酵素群） （２）アシドオスファターゼ、スルファクーゼ等の加水
分解酵素群 （３）パーオキシデース の酵素と血清中に含まれる上記酵素を高感度測定し、Ｋ
ｉｎｅｔｌｋａの測定 Ｂ、ｆラクトシデースを標識とした酵素免梗蓼３定を可
能としだ装置を提供することにある。

措成 上記目的を達成するため、分注手段と光照射手段と検出
手段をマイクロプレートがセットされる装置内に設置し
、複数の試薬の同時分注。

多検体同時照射、多検体同時照射を行うことによシ多検
体迅速測定を可能にしたｇｈＸを行っている。

すなワチ、マイクロプレートの一列に並んだ複数個のウ
ェルに、溶液を分注する複数の分注手段、励起光の波長
を選択する波長選択手段、−列に並んだ複数個のウェル
を同時に照射するオプティカルファイバーを用いた照射
手段、ウェルに入った試料の照射光による吸光度、螢光
を測定する複数個の検出手段、分注の終了信号おるいは
前もって設定された信号によって、マイクロプレートを
前後に移動させる移動制御手段の各手段を一つの装置に
設置し、多検体同時処理測定しデータ表示する構城であ
る。

オプティカルファイバーを用いた照射手段は、一端に分
光された光が照射され、他端が複数の本数に分割され、
そのうちの１本は照射光強就のモニターとして用いられ
、残シは一列に並んだウェルの個数と等しく、該ファイ
バーの先端から複数のウェルを同時に照射する構成とな
っている。

酵素活性値を始めとした細胞機能を測定するため上記の
構成からなる装置を用いて。

マイクロプレートの第一列に並んだウェルに試薬を分注
終了後、ウェル移動制御手段によ）次列への移動と分注
を順次行なう工程。

複数個の検出手段によシ、分注された試料の吸光度ある
いは螢光を第１ウェル列よシ順次同時検出して記憶させ
、分注した最終列の試料の吸収ないし螢光を同時検出後
、マイクロプレートを移動手段によシもどす工程。

再び最前列のウェルの試料の吸光度あるいは螢光を検出
記憶し、順次１列分づつ移動させて各ウェルの吸光度な
いし螢光強度を検出記憶する工程。

の各工程を複数回くシ返すことによって、各試料の分注
時を出発点として一定時間間隔での試料の吸光度ないし
螢光強度の時間変化をめ、データ処理手段によって時間
的変化のデータを最小２乗法によシ直線近似として傾き
をめ、単位時間当りの吸光度、螢光強度の変化量に、物
質及び測定条件から定まる定数を乗じて種々の値、たと
えば酵素活性値や細胞の０２−産生能をめ表示する方法
を行っている。

マイクロプレートのウェルには、生体に近い反応系で試
薬、試料が入っているため、温度を一定にすることが安
定した反応系となり検出信号の感度が良くなるため、マ
イクログレート全体を温度１ＩＡ１節する構成となって
いる。

実施例 本発明による実施例の全体借成図を８１′！２図に示す
。第３図、第４図にマイクログレートに並んだウェルに
同時照射して、複数の試料の同時検出する構成及び照射
光をフィルター分光する構成と回折格子分光構成を示す
。

第２図に示された全体構成図中、マイクロシレー）２−
１のウェル２−１０に一定量の検体を手動で注入後本装
置にセットされる。光源２−２からの光はフィルター２
−３で波長選択されてウェル２−１Ｏ中の試料に照射さ
れ、透過度あるいは螢光が検出器２−８で検出される。

この波長選択手段、照射手段、検出手段を含むブロック
２−Ａは、更に第３図、第４図に実施例を示しである。

バッファー溶液２−１３は、弁２−１２が駆動部２−１
１で開閉されて分注器２−９で、ｉイクロプレート２−
１上のウェル２−１０に分注される。

所定の位置に設置された照射手段、検出手段。

分注手段の場所を、マイクログレートが位置センサー２
−５．駆動部２−６　、　Ｃｐｕ　２−１６から成る移
動制御手段によシ前後に移動する。プレートキャリヤー
２−７による移動距離の基準を位置セン−ν゛−２−５
で検出しウェル−列分だけ順次移動し、分注されている
最後の列のウェルが測定されると最前列のウェルが検出
手段の場所にもどされる。移動される方向、移動距離紘
キー？−ド２−１７の設定値によって種々の値を取るこ
とが可能になっている。光検出器２−８からの出力は、
参照信号２−８′の出力で割算されて吸光度、螢光強度
が記憶される。吸光度、螢光強度の時間的変化をめて酵
素活性値をめるため、Ｃｐｕにおいて横・ｉＮｌ＋を時
間、緩軸を吸光度ないし螢光強度とし、測定された値と
最小２乗法によシ直線近似で結ぶ。この直紡の傾きをめ
記憶表示する。

検出器と分注器は、マイクロプレート移動距離内に設置
されていれば良いが、マイクロプレート上で検出器と分
注器が近接して設置されれば、分注後移動距離の短かく
なった分測定が早くなる。又吸光度ないし螢光の時間賀
化をめる場合、分注を全てのウェルにするのでなく、途
中で分注を終了し前何列かの列での検出を行いデータ処
理することも出来る。

第３図の３人は、干渉フィルターによる分光選択を行う
例で、３−１Ｏは光源、集光レンズ３−１１、赤外光を
カットする熱カットフィルター３−１２、波長選択用フ
ィルター−′″３−１４、集光レンズ３−１５、同期検
出を行う場合に用いるチ買ツバ−である。オノティカル
ファイバーの一端３−７は、照射光のモニター検出器３
−１６で参照信号として検出される。３−５の出力と比
をめるために用いられる。オノティカルファイバーの照
射端３−６よシ照射光が３−００ウエルに照射され３−
５の検出器で検出される。Ｂのブロック部分は、螢光を
検出する場合に用いられ、集光レンズ３−２、螢光選択
フィルター３−４を有している。中心に照射光をカット
するだめのカット板がある。

第４図は、螢光を検出する場合の溝底を示す。

Ａのブロック部分は、干渉フィルターの代）に回折格子
３−１４を用いた波長選択手段を示す。

新たに螢光検出器用オプティカルファイバーヲ設設置し
、集光レンズ３−２を前面に配置する。

次に前記マイクロプレート分光分析装置を用いた分析方
法を説明する。

２−１のマイクロプレート６試料入れ（ウェル）に一定
量の検体をマニアルで入れる。

マイクログレートの雰囲気を一定温度（室温３０Ｃ，３
７２；）にする。（２−Ｂの温調器）測定条件をキー？
−ド（２−１７）で入力して測定を開始する。

８本並列に並んだ分注器（２−９）は、基質バッファー
容器（２−１３）よシ基質バッファー溶液を弁（２−１
２）を開放して駆動部（２−１１）の動作によって、マ
イクログレート上のウェル（２−１０）に同時に分注す
る。

分注完了後、マイクロプレートを試料入れ（ウェル）１
個分移動させる。

移動終了後、次の試料入れ（ウェル）に分注器によシ分
注する。

上の分注、移動１分注をくシ返して行なう。

最初の試料入れ（ウェル）が検知器の場所に移動する。

測定（吸光度、螢光）し記憶する。

全部測定完了でスタート位置にもどる。

一定時間後、再びプレート移動する。

検知器の場所に試料入れ（ウェル）が来ると測定（吸光
度、螢光の時間経過による変化の測定）試料の測定開始
から時間経過による測定値の変化は、任意時間、任意回
数可能である。

終了後、測定値（吸光度、螢光）の時間変化を直線近似
として、傾きを計算よ請求め物質及び測定条件から定ま
る定数を乗じて活性値を表示する分析方法を行っている
。

本発明装置を用いて、実際に測定を行った結果の一例を
示す。

第１表は本装置によって測定した白血球（主に好中球）
のライリゾーム酵素放出能（ミエロｉ４−オキシデース
）の測定例で１０μｔ・の試料をマイクロプレートに入
れ、それに反応試薬を分注して反応を開始させ６５０　
ｎｍの波長での吸光度合くシ返し測定した結果でこれに
よ如うイリゾーム酵素の放出能が算定出来る。

第２表は生きた細胞（白血球）の産生ずる０２−を測定
した例で生きた細胞浮遊液をマイクロプレートのウェル
に入れ、３７Ｃ１０分間加熱後シトクロームＣを加え３
分間安定化した後刺激剤を分注し測定を開始、波長５４
６　ｎｍでの吸光度をくシ返し測定したものでシトクロ
ームＣの還元速度が算定された。このシトクロームＣの
還元速度よｈ　０２−の産生能が算定される。この表よ
シ多検体の酵素の放出能０２−の産生能の測定に有効で
あることが判る。

第２表 効　果 以上マイクロプレートによる本発明装置を用いることに
よシ少量の試料（５〜１０Ｐｔ）で、しかも多検体（９
６検体）を数分で自動測定可能のため、生きた細胞検体
を使用して、細胞機能の測定を可能にしたものである。

測定のために用いる光学法は、吸光度測定、螢光測置い
ずれも可能であシ、測定ｇ！庇の高い高感度の酵素免疫
測定も可能となル、白血球機能検査と併せて臨床検査で
果す本発明の意義は多大なものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、従来のマイクロプレートの実施例であシ、第
２図は本発明による実施例である。第３図は、第２図に
示した実施例の多検体照射部及び多検体同時検出部を示
す。第４図は、多検体の螢光を検出する場合の実施例を
示す。 １・・・マイクロプレート、２・・・光源、４　プリズ
ム、５・・・ハーフミラ−１８・・・増巾演算、９・・
・デスグレイ、６１．７１・・・干渉フィルター、６２
．７２・・・受光素子、２−１・・・マイクロプレート
、２−２・・・光源、２−３・・・干渉フィルター、２
−４・・・モーター、２−５・・・位置センサー、２−
６・・・マイクロプレート移動駆動部、２−７・・・プ
レートキャリヤー、２−８・・・光検出器、２−９・・
・分注器、２−１１・・・弁駆動部、２−１２・・・弁
、２−１３・・・バッファー容器、２−１４・・・増ｒ
ｌ−＋器、２−１５　・Ａ／Ｄ変換器、２−１６−　Ｃ
ｐｕ。 ２−１７・・・キーが一ド、２−１８・・・外部出力、
２−Ａ・・・多検体熱射検出部、２−Ｂ・・・温調器、
３−１・・・マ（クロ；”レー）、３−２・・・レンズ
、３−３・・・遮光板、３−４・・・干渉フィルター、
３−５・・・検出器、３−６・・・オノティカルファイ
バー、３−７・・・参照光ファイバー、３−８・・・螢
光検出用ファイ／？＋、３−１０・・・光源、３−１１
．３−１５・・・レンズ、３−１２・・・熱カツトフィ
ルター、３−１３・・・チ嘗ツ／ｆ−１３−１４・・・
干渉フィルター、３−１６−・・検出器、３−２０・・
・データ処理部、Ａ・・・波長選択部、Ｂ・・・多検体
同時検出部。 特許出願人　日本分光工業株式会社 代理人　丸　山　幸雄

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）縦、横に複数個並んだ微量試料入れ（ウェル）を
   有するマイクロプレートを用いて、試料の吸光度ないし
   螢光を測定するマイクログレート分光分析装置において
   、 ■マイクロプレートの一列に並んだ複数個の試料入れ（
   ウェル）に、溶液を分注する複数の分注手段、■励起光
   の波長を選択する波長選択手段、■−列に並んだ複数個
   のウェルを同時に照射するオプティカルファイバーを用
   いた照射手段、■ウェルに入った試料の照射光による吸
   光度、螢光を測定する複数個の検出手段、■分注の終了
   信号あるいは前もって設定された信号によってマイクロ
   プレートを前後に移動させる移動制御手段の各手段を一
   つの装置に備え、多検体同時処理測定してデータ表示す
   ることを特徴とす゛る自−動マイクロプレート分光分析
   装置。
2. （２）上記オプティカルファイバーを用いた照射手段は
   、一端に分光された光が照射され、他端が複数の本数に
   分割され、そのうちの１本は照射光強度のモニターとし
   て用いられ、残シは一列に並んだウェルの個数と等しく
   、該ファイバーの先端から複数のウェルを同時に照射す
   ることを特徴とする前記第（０項記載の自動マイクログ
   レート分光分析装置。
3. （３）上記マイクログレートが恒温槽の内で一定の温度
   に制御されていることを特徴とする前記第（１）項記載
   の自動マイクログレート分光分析装置。
4. （４）縦、横に複数個並んだ微量試料入れ（ウェル）を
   有するマイクロプレートを用いて、試料の吸光雁ないし
   螢光を測定するマイクロプレート分光分析法において、 ■複数個のウェルに分注する分注手段、■オプティカル
   ファイバーを用いた照射手段、■光を検出する複数個の
   検出手段、■マイクロプレートを移動制御する移動制御
   手段、■検出した値を処理するデータ処理手段を用いて
   。 マイクログレートの第一列のウェルに分注終了後、ウェ
   ル移動制御手段によシ次列への移動と分注をＩＩ次行な
   う工程。 複数個の検出器手段によシ、分注された試料の吸光度あ
   るいは螢光を第１ウェル列よシ順次同時検出して記憶さ
   せ、分注した最終列の試料の吸収ないし螢光を同時検出
   後、マイクログレートを移動手段によシもどす工１？。 再び最前列のウェルの試料の吸光度わるいは螢光を検出
   記憶し、順次１列分づつ移動させて各ウェルの吸光度な
   いし螢光強度を検出記憶する工程の各工程を複数回くり
   返すことによって、各試料の分注時を出発点として一定
   時間間隔での試料の吸光度あるいは螢光強度の時間変化
   をめることを特徴とする自動マイクログレート分光分析
   方法。
5. （５）複数個の試料を各試料の分注時を出発点として一
   定時間間隔での試料の吸光度あるいは螢光強度の時間変
   化をめ、該時間的変化のデータを直線的に変化すると近
   似して最小二乗法によシ直線の傾きをめ、単位時間当シ
   の吸光度、螢光強度の変化量に物質及び測定条件で定ま
   る定数を乗じて酵素活性値ないし細胞の０２−産生能を
   め、表示記録するデータ処理を行うことを特徴とする前
   記第（４）項記載の自動マイクロプレート分光分析方法
   。