MXPA96005828A - Proceso para detectar luminescencia excitada evanescentemente. - Google Patents

Abstract

La invencion se refiere a un proceso para detectar luminescencia con una plataforma plana de sensor optico dielectrico, plana que consiste en un sustrato transparente (3) al cual se le aplica una capa de guia de onda delgada transparente (b), dicha plataforma de sensor esta provista con una cuadricula para el acoplamiento de entrada de la luz de excitacion, y el indice de refraccion del sustrato (3) es mas bajo que el indice de refraccion de la capa de guia de onda (b), poniendo una muestra de liquido en contacto con la capa (b), y midiendo la luminescencia producida por sustancias que tengan propiedades de luminescencia en la muestra, o por sustancias que tenga propiedades de luminescencia inmovilizadas sobre la capa (b), de una manera optoelectronica. La invencion tambien se refiera al uso del proceso en la deteccion de afinidad cuatitativa, y al uso del mismo para la determinacion cuantitativa de los constituyentes luminescentes en soluciones opticamente turbias.

Description

PROCESO PARA DETECTAR LUMINESCENCIA EXCITADA EVANESCENTEMENTE La presente invención se refiere a un proceso para detectar luminescencia excitada evanescentemente, con una plataforma de sensor óptico dieléctrico plano, sobre una guía de onda. La invención también se refiere al uso de este proceso en la detección de afinidad cualitativa, y al uso del mismo para la determinación cuantitativa selectiva de componentes luminescentes, en soluciones ópticamente turbias. Cuando se acopla una onda de luz en una guia de onda plana que está rodeada por un medio ópticamente más delgado, se conduce mediante la reflectancia total hasta las interfaces de la capa de guia de onda. Una guia de onda plana consiste, en el caso más simple, en un sistema de tres capas: un sustrato, una capa conductora de onda, y un supet—estrato (por ejemplo, la muestra para ensayar), teniendo la capa conductora de onda el índice de refracción más alto. Las intercapas adicionales pueden mejorar la actividad de la onda de guía plana, todavía más. Una fracción de la energía de luz penetra en el medio ópticamente más delgado. Esta fracción se llama el campo evanescente (= que se desvanece) . La fuerza del campo evanescente depende mucho del espesor de la capa de guía de onda misma, así como de la proporción de los índices de refracción de la capa de guia de onda y el medio circundante. En el caso de guías de onda delgadas, es decir, con espesor de capa iguales o menores que los de la longitud de onda que se va a guiar, es posible distinguir modos discretos de la luz conducida. Con un campo evanescente, es posible, por ejemplo, excitar la luminéscencia en un medio ópticamente más delgado, pero sólo directamente adyacente a la onda de luz guiada. Este principio se llama excitación de luminéscencia evanescente. La excitación de luminéscencia evanescente es de gran interés en el campo analitico, ya que la excitación se limita al medio ambiente directo de la capa de guia de onda. Los métodos y aparatos para detectar la luminéscencia excitada evanescentemente de anticuerpos o antigenos etiquetados con colorantes luminescentes , son conocidos, y se describen, entre otras partes, en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Numero US-A- 582,809. La configuración reivindicada en la misma utiliza una fibra óptica para la excitación de luminéscencia evanescentemente. Estas fibras ópticas tienen típicamente un diámetro de hasta 1 milímetro, y conducen una gran cantidad de modos, cuando se acopla una luz de láser en las mismas. La luminéscencia excitada evanescentemente se puede medir de una manera simple, solamente por la fracción que se regresa por túnel hacia la fibra. Las dimensiones muy grandes del aparato, y el hecho de que se requieran volúmenes de muestreo comparativamente grandes, son otros inconvenientes. El aparato no se puede reducir sustancialmente en su tamaño, ni siquiera miniaturizar para sensores ópticos integrados. Una mejora de la sensibilidad normalmente está asociada con un incremento en el tamaño del aparato. Los instrumentos fotomÉtricos para detectar la luminescencia de biosensores bajo las condiciones de excitación evanescente con gulas de onda ópticas planas, son de la misma manera conocidos, y se describen, entre otras partes, en la Publicación Internacional de Patente Número WO 90/06503. Las capas de guia de onda utilizadas en la misma, tienen un espesor de 160 a 1000 nanómetros, y el acoplamiento de la luz en la onda de excitación se efectúa sin cuadriculas de acoplamiento. Se han hecho diferentes intentos por mejorar la sensibilidad de la luminescencia excitada evanescentemente , y por fabricar sensores ópticos integrados. Por consiguiente, por ejemplo, Biosensors & Bioelectroni.es 6 (1991), 595-607, reporta sobre guias de onda de un solo modo plano o de modo bajo, que se fabrican en un proceso de intercambio de iones de dos pasos, y en donde el acoplamiento de la luz en la onda de excitación se efectúa con prismas. El sistema de afinidad utilizado es inmunoglobulina G/proteina A etiquetada con fluoresceina , en donde el anticuerpo se inmoviliza sobre la guia de onda, y se agrega la proteina A etiquetada con fluoresceina que se va a detectar, en un regulador del pH de fosfato, a una película de alcohol polivinilico con la cual se cubre la región de medición de la guía de onda. Un inconveniente sustancial de este proceso, es que solamente se pueden alcanzar diferencias menores en los Indices de refracción entre la capa de guia de onda y la capa del sustrato, dando como resultado una sensibilidad relativamente baja. Se dice que la sensibilidad es de 20 nanómetros en el isotiocianato de fluoresceína enlazado con proteina A. Esto es todavía insatisfactorio para poder detectar microtrazas, y se necesita una mejora adicional de sensibilidad. Más aún, la reproducibilidad y la viabilidad práctica de la luz de acoplamiento en la onda de excitación mediante prismas, parece ser difícil, tomando en cuenta la considerable dependencia de la eficiencia del acoplamiento en la calidad y el tamaño del área de contacto entre el prisma y la gula de onda. Otro principio se propone en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número US-A-5,081 ,012. La capa de guía de onda plana tiene un espesor de 200 nanómetros a 1000 nanómetros, y contiene dos estructuras de cuadrículas, una de las cuales está diseñada como una cuadrícula de refleja, de tal manera que la anda de luz acoplada en la gula de onda debe atravesar la región del sensor entre las estructuras de la cuadrícula cuando menos dos veces. Se dice que se logra una mejor sensibilidad por este medio. Un inconveniente es que la radiación reflejada puede conducir a un incremento indeseado de la intensidad de radiación de fondo.

La fabricación de guias de onda planas es un procedimiento en donde, por consiguiente, son muy esenciales la estructura plana del sustrato, el espesor constante y la homogeneidad de la capa de guia de onda, y el Indice de refracción del material. Esto se describe, entre otras partes, en la Patente Europea Numero EP-A-0 , 533 , 074 , en donde se hace una proposición para aplicar guías de onda inorgánicas a sustratos de plástico. Este procedimiento tiene la ventaja de que, por ejemplo, se puede realizar una estructuración económicamente útil de la cuadricula de acoplamiento grabando la estructura en el material de plástico. Sin embargo, por otra parte, se hacen altas demandas de la calidad óptica de los sustratos de plástico. Las guías de onda planas proporcionan ventajas considerables en la producción á gran escala sobre las guias de onda que se basan en fibras ópticas. En particular, normalmente es necesario proporcionar a los extremos trozados de las fibras, un pulido final para obtener una calidad óptica perfecta. Sin embargo, las guias de onda planas se pueden fabricar en grandes dimensiones, y después se pueden perforar, romper, o cortar, hasta el tamaño deseado. En la mayoría de los casos se puede evitar la provisión de orillas con un acabado final, haciendo de esta manera que la producción a gran escala sea más económica. Otras ventajas de las guias de onda planas con cuadrículas de acoplamiento son la calibración simple en el dispositivo de medición, o en el establecimiento de medición, asi como la aplicación simple de un recubrimiento, por ejemplo, para inmovilizar un analito. Para este propósito, es posible utilizar métodos convencionales de tecnología de recubrimiento con los cuales se puedan preparar espesores constantes reproducibles de la capa. Los ejemplos típicos de estos métodos son pulverización, recubrimiento con cuchilla, recubrimiento por centrifugación, recubrimiento por inmersión. De la misma manera, el control de calidad se puede realizar mediante métodos conocidos y muy exactos. Los métodos adecuados incluyen métodos microscópicos o inter.ferométricos, elipsometrla, o mediciones de ángulo de contacto. Para las superficies curvas que se presentan en las guias de onda basadas en fibras ópticas, estos métodos son inaplicables, o se pueden aplicar solamente con dificultad. Además de la capa de guía de onda real, la naturaleza del acoplamiento de la onda de luz en la capa de gula de onda constituye un problema principal. Los requerimientos hechos de cuadriculas para acoplar la luz en gulas de onda adelgazadas para sensores ópticos integrados se discuten, entre otras partes, en Chemical, Biochemical and Environmental Fiber Sensor V, Proc. SPIE, Volumen 2068, 1-13, 1994. La modulación de la profundidad de la cuadricula y el espesor de la capa de la guia de onda se describen en esta referencia como características cruciales. Los sistemas propuestos en la misma se pueden utilizar típicamente como sefialadores de luz ópticos integrados, pero no se hace referencia a una luminescencia que se vaya a detectar.

Si se desea utilizar estas gulas de anda planas con cuadriculas de acoplamiento integradas para mediciones de luminescencia, entonces las características esenciales para su utilidad para alcanzar una alta sensibilidad, son una eficiencia de acoplamiento de entrada suficientemente grande, un campo evanescente tan fuerte como sea posible, y una baja atenuación de la onda guiada. Estas características son crucialmente reguladas por la combinación del Índice de refracción de la capa de guia de onda y del material del sustrato, y de cualesquiera intercapas presentes, el espesor de la capa de la gula de onda, la estructura, la modulación de profundidad, y el periodo de la cuadricula de acoplamiento. En adición, existe una calidad óptica requerida de las superficies y su estructura plana o rugosidad. Ahora se ha descubierto que es posible, de una manera simple y sin una cuadricula de reflejo adicional, realizar un proceso para la excitación evanescente y detección de luminescencia con una alta sensibilidad, mediante la combinación de las características cruciales anteriormente mencionadas, tales como el Índice de refracción, el espesor de la capa, y la modulación de profundidad. Normalmente, la atenuación de la onda de luz guiada es entonces menor de 3dB/cm, dando como resultado de esta manera una larga distancia del haz guiado, y una baja dispersión de la onda guiada hacia el medio circundante. En particular, se prefiere, bajo estas condiciones, guiar el modo TEO y TMO. La distancia de conducción es suficiente para, en adición a medir la luminescencia, poder medir con gran precisión la absorción de la luz de excitación en la presencia de una muestra absorbente. Estas guias de onda planas, en donde solamente se gula un modo o unos cuantos modos, se distinguen por una sensibilidad particularmente alta y una construcción miniaturizada. Normalmente, esta sensibilidad no se logra con las gulas de onda de múltiples modos de una construcción plana o fibrosa, o si se logra, entonces esto solo es posible con dimensiones geométricas sustancialmente más grandes. La eficiencia de acoplamiento de entrada de la cuadricula de acoplamiento es alta, de tal manera que la intensidad de la onda de luz acoplada en la guia de onda de la misma manera es alta, dando como resultado, en conjunto con la baja atenuación, una sensibilidad ya buena. La sensibilidad se mejora adicionalmente mediante el campo evanescente que es sorprendentemente fuerte, y mediante las altas fuerzas del campo electromagnético producidas por lo mismo, que contribuyen a una mejora adicional de la sensibilidad. Por consiguiente, se proporciona la posibilidad de detectar inclusive cantidad mínimas de material luminescente en la superficie de la capa de guia de onda. De acuerdo con lo anterior, en uno de sus aspectos, la invención se refiere a un proceso para detectar luminescencia con una plataforma de sensor óptica dieléctrico plana, que consiste en un sustrato transparente (a) al cual se le aplica una capa de guía de onda delgada transparente (b) , cuya plataforma de sensor está provista con una cuadrícula para el acoplamiento de entrada de la luz de excitación, y el índice de refracción del sustrato (a) es más bajo que el índice de refracción de la capa de guía de onda (b) , poniendo una muestra de liquido en contacto con la capa (b) , y midiendo la luminescencia producida por sustancias que tengan propiedades de luminescencia en la muestra, o por sustancias que tenga propiedades de luminescencia inmovilizadas sobre lá capa (b) , de una manera optoelectrónica, en donde: (A) la luz de excitación se acopla en la guia de onda plana, y atraviesa la capa de guia de onda, mediante lo cual, se excitan los sustratos que tienen propiedades de luminescencia, hasta la luminescencia en el campo evanescente de la capa de guia de onda, (B) la cuadrícula tiene una modulación de profundidad de 3 a 60 nanómetros, (C) el espesor de la capa (b) es de 40 a 160 nanómetros, y (D) la proporción de la modulación de profundidad al espesor de la capa (b) es menor de 0.5.

Dentro del alcance de esta invención, una plataforma de sensor óptico dieléctrico plano significa que la plataforma está en la forma de una tira, una placa, un disco redondo, o cualquier otra forma geométrica, con la condición de que pueda ser vista por el ojo desnudo como plana. La forma geométrica seleccionada intrínsecamente no es crucial, y se puede regular mediante la construcción de todo el aparato en donde se integre la plataforma del sensor. Sin embargo, se puede utilizar también como un elemento independiente, espacialmente separado de la fuente de luz de excitación y del sistema de detección optoelectrónico. Las configuraciones preferidas son aquellas que permitan una miniaturización sustancial. Un sustrato adecuada es normalmente cualquier clase de vidrio o cuarzo. Se prefiere utilizar un vidrio que tenga un Indice de refracción óptica tan bajo como sea posible, y una luminescencia intrínseca tan baja como sea posible, y que se pueda tratar ópticamente de una manera tan simple como sea posible, por ejemplo, mediante grabado, corte, y pulido. El sustrato debe ser transparente, cuando menos a la longitud de onda de excitación y de emisión. El sustrato también puede ser un material de plástico, como se describe, por ejemplo, en la Patente Europea Número EP-A-0,533,07a. El sustrato también puede estar provisto con una capa delgada que tenga un Indice de refracción menor que, o idéntico a, aquel del sustrato, y que tenga un espesor de, o menor que, 10 mieras. Esta capa puede servir para reducir la rugosidad superficial del sustrato, y puede consistir en un plástico termoplástico, termofraguable, o estructuralmente reticulado, o también en un material inorgánico, tal como SiO^. Solamente la luz esencialmente paralela es adecuada para la excitación de luminescencia . Dentro del alcance de esta invención, la expresión "esencialmente paralela" se entenderá que significa una divergencia menor de 5 grados. Esto significa que la luz puede ser débilmente divergente o débilmente convergente. Se prefiere utilizar luz coherente para la excitación W de luminescencia, más particularmente luz de láser de una longitud de onda de 300 a 1,100 nanómetros, más particularmente todavía de 450 a 850 nanómetros, y muy preferiblemente de 480 a 700 nanómetros. Los dispositivos de láser que se pueden utilizar adecuadamente son dispositivos de láser de colorante, dispositivos de láser de gas, dispositivos de láser sólidos, y # dispositivos de láser semiconductores. Cuando sea necesario, la longitud de onda de emisión también se puede duplicar mediante óptica de cristal no lineal. El haz también se puede enfocar todavía más mediante elementos ópticos, polarizados o atenuados por filtros de gris. Los dispositivos de láser particularmente adecuados son dispositivos de láser de ion de argón y dispositivos de láser de helio-neón, que emiten en longitudes de onda entre 457 nanómetros y 514 nanómetros y, respectivamente, entre 543 nanómetros y 633 nanómetros. Los dispositivos de láser muy particularmente adecuados son dispositivos de láser de diodo o dispositivos de láser de diodo de frecuencia duplicada, de un material semiconductor que emita en una longitud de onda fundamental entre 630 nanómetros y 1100 nanómetros, ya que estos ¦permiten una miniaturización sustancial de todo el sistema sensor favoreciendo sus pequeñas dimensiones y su bajo consumo de energía. Dentro del alcance de esta invención,- el término "muestra" se tomará para significar toda la solución que se va a ensayar, la cual puede contener una sustancia que se va a detectar - el analito. La detección se puede hacer en un ensayo de un solo paso o de múltiples pasos, en el curso del cual la superficie de la plataforma del sensor se pone en contacto con una o más soluciones. Cuando menos una de las soluciones empleadas puede contener una sustancia que tenga propiedades de luminescencia, que se pueda detectar en la práctica de la presente invención. Si ya se adsorbió una sustancia que tenga propiedades de luminescencia, sobre la capa de guía de onda (b) , entonces la muestra también puede estar exenta de componentes luminescentes. La muestra puede contener otros constituyentes, normalmente reguladores del pH, sales, ácidos, bases, sustancias de actividad superficial, modificadores que tienen influencia sobre la viscosidad, o colorantes. En particular, se puede utilizar una solución de suero fisiológico como el solvente. Si el constituyente luminescente mismo es liquido, entonces se puede evitar la adición de un solvente. En este caso, la muestra puede contener hasta el 100 por ciento del componente que tenga propiedades de luminescencia. La muestra puede contener además un medio biológico, por ejemplo, yema de huevo, un fluido corporal o constituyentes del mismo, en particular sangre, suero, plasma, u orina. Además, la muestra puede consistir en agua de superficie, soluciones de extracto de medios naturales o sintéticos, tales como suciedad o partes de plantas, caldos de bioproceso, o caldos de síntesis. La muestra además puede no diluirse, o se puede utilizar adicionalmente con un solvente. Los solventes adecuados son agua, un regulador del pH acuoso, y soluciones de proteína y solventes orgánicos. Los solventes orgánicos adecuados son alcoholes, cetonas, ásteres, e hidrocarburos alifáticos. Se prefiere utilizar agua, reguladores del pH acuosos, o una mezcla de agua y un solventé orgánico miscible en agua. Sin embargo, la muestra también puede contener constituyentes que sean insolubles en el solvente, por ejemplo, partículas de pigmento, dispersantes, oligómeros o polímeros naturales y sintéticos. En este caso, la muestra está en la forma de una dispersión o emulsión ópticamente turbia. Los compuestos luminescentes adecuados son colorantes luminescentes que tengan una luminescencia en la escala de longitud de onda de 330 nanómetros a 1,000 nanómetros, incluyendo típicamente rodaminas, derivados de fluoresceína, derivados de cumarina, bifenilos diestirllicos, derivados de estilbeno, ftalocianinas, naftalocianinas, complejos de colipiridilo-rutenio, tales como cloruro de tris(2,2*-bipiridil)rutenio , cloruro de tris(l , 10-fenantrolina) rutenio , cloruro de tris(4,7-difenil-1 , 10-fenantrolina)rutenio, y complejos de polipiridilo-fenacina-rutenio , complejos de platino-porfirina tales como octaetilo-platino-porfirina, complejos de europio y terbio de larga vida, o colorantes de cianina. Son particularmente adecuados para los análisis en sangre o en suero, los colorantes que tengan longitudes de onda de adsorción y de emisión en la escala de 600 a 900 nanómetros. Los compuestos luminescentes particularmente adecuados son los colorantes, tales como derivados de fluoresceína , que contengan grupos funcionales con los cuales se puedan enlazar de una manera covalente, por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína. También son muy adecuados los colorantes fluorescentes funcionales disponibles en Biological Detection Systems, Inc., MR por ejemplo, los colorantes Cy5.5 mono y bi-funcionales , entre otros, en Clinical Chemistry 40 (9): 1819-1822, 1994. La lumihescencia preferida es la fluorescencia. Los colorantes luminescentes elegibles para utilizarse también se pueden enlazar químicamente con los polímeros o con uno de los socios de enlace en los sistemas de afinidad bioquímica, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, antigenos, proteínas, péptidos, receptores o sus ligandos, hormonas o receptores de hormonas, oligonucleótidos, cadenas de AON, cadenas de ARN, análogos de ADN o de A N, proteínas de enlace tales como proteína A y G, avidina ó biotina, enzimas, cofactores o inhibidores de enzimas, lectinas, o carbohidratos. La etiquetación luminescente covalente mencionada es la utilidad preferida para los ensayos de afinidad (bio)qulmica reversibles o irreversibles. Además, es posible utilizar esteroides, lípidos, y queladores etiquetados con luminescente. También es de un interés particular la intercalación de colorantes luminescentes para los ensayos de hibridización con cadenas de ADN y oligonucleótidos, especialmente si - como los diferentes complejos de rutenio - exhiben una mejor luminescencia en la intercalación. Si estos compuestos etiquetados con luminescente se ponen en contacto con sus socios de afinidad inmovilizados sobre la superficie de la plataforma del sensor, entonces el enlace se puede determinar cuantitativamente a partir de la intensidad medida de luminescencia. También es posible una determinación cuantitativa del analito mediante la medición del cambio en la luminescencia cuando la muestra interactúa con los luminóforos, por ejemplo, en la forma de luminescencia que se apaga con oxígeno, o de una mejora de luminescencia mediante modificaciones de conformación de proteínas. El índice de refracción de la capa de gula de onda debe ser mayor que aquel del sustrato y de cualesquiera intercapas empleadas. De preferencia, la capa de guía de onda transparente plana consiste en un material que tiene un índice de refracción mayor de 2. Los materiales adecuados son típicamente materiales inorgánicos, de preferencia óxidos inorgánicas de metal tales como Ti02, ZnO, Nb 5, Ta 5, HfO^ ó Zr02- Se prefieren a^g y TiO^. El espesor de la capa de guía de onda transparente es de preferencia de 80 a 160 nanómetros. Lá modulación de profundidad de la cuadricula para el acoplamiento de la luz de excitación en la capa de guia de onda es, de preferencia de 5 a 30 nanómetros. La cuadrícula de preferencia tiene una proporción de la línea al espacio de 0.5-2. Proporción de la línea al espacio significa normalmente en una cuadrícula rectangular, la proporción del ancho de las líneas al ancho de los espacios. La cuadricula para el acoplamiento de la luz de excitación tiene la configuración de una cuadrícula de difracción óptica, de preferencia de una cuadrícula en relieve. La estructura del relieve puede ser de diferente forma. Por ejemplo, son adecuadas las estructuras senoidales, rectangulares, o de diente de sierra. Los métodos para fabricar estas cuadrículas son conocidos. Se emplean principalmente métodos fotolitográficos u holográficos y técnicas de grabación para fabricarlas, por ejemplo, los métodos descritos en Chemical, Biochemical and Environmental Fiber Sensors V. Proc. SPIE, Volumen 2068, 1-13, 1994. La estructura de la cuadrícula se puede producir sobre el sustrato, y después se puede transferir a la capa de guía de onda, en donde entonces se forma la imagen de la estructura de cuadrícula, o la cuadrícula se produce en la capa de guía de onda misma. El período de la cuadrícula puede ser de 200 a 1000 nanómetros, y la cuadrícula convenientemente exhibe sólo una periodicidad, es decir, es de monodifracción. En el proceso de ésta invención, la muestra se puede poner en contacto con la capa de guía de onda en el estado inmóvil, así como se puede guiar continuamente sobre ella, y el ciclo se puede abrir o cerrar. Una modalidad especifica del proceso consiste en inmovilizar las sustancias que tengan propiedades luminescentes utilizadas para detectar el analito directamente en la superficie de la capa de guía de onda (b) . La sustancia que tenga propiedades luminescentes puede ser, por ejemplo, un luminóforo que se enlace con una proteína, y que por consiguiente, se pueda excitar hasta la lu inescencia de esta manera en la superficie de la capa de guía de onda. Si se guía un socio que tenga afinidad para la proteína sobre esta capa inmovilizada, entonces la luminescencia se puede modificar, y se puede determinar la socio de esta manera. En particular, ambos socios de de afinidad también se pueden etiquetar con luminóforos para poder efectuar la determinación de las concentraciones a partir de la transferencia de energía entre los dos, por ejemplo, en la forma de apagado de luminescencia. Otra modalidad preferida del proceso para realizar ensayos de afinidad química o bioquímica, consiste en inmovilizar sobre la superficie de la plataforma del sensor un socio de como la sustancia detectora química o analito mismo, o para uno de los socios del enlace. El ensayo puede ser un ensayo de un solo paso o de múltiples pasos, en el curso del cual, en pasos sucesivos, se guia a una o más de una solución que contenga socios de enlace para las sustancias detectoras inmovilizadas sobre la superficie de la plataforma del sensor, llegando el analito a enlazarse en uno de los pasos parciales. La detección del analito se efectúa mediante el enlace de los participantes etiquetados con luminescente en el ensayo de afinidad. Las sustancias etiquetadas con luminescente utilizadas pueden consistir en uno o más de un socio de enlace del ensayo de afinidad, y también, en un análogo del analito provisto con un luminóforo. El único criterio es que la presencia del analito conduzca selectivamente a una señal de luminescencia, o selectivamente a un cambio en la señal de luminescencia.

La inmovilización de las sustancias detectoras normalmente se puede realizar mediante adsorción hidrofóbica o enlace covalente directamente sobre la capa de gula de onda, a después de la modificación química de la superficie, por ejemplo, mediante silanación, o mediante la aplicación de una capa polimérica. En adición, se puede aplicar una intercapa delgada consistente, por ejemplo, en SiQ^, como la capa promotora de adhesión directamente a la capa de guia de onda, para facilitar la inmovilización de las sustancias detectoras directamente sobre la guía de onda. El espesor de esta intercapa no debe exceder de 50 nanómetros, de preferencia de 20 nanómetros. Las sustancias detectoras adecuadas son normalmente anticuerpos para antígenos, proteínas de enlace, tales como proteina A y G para inmunoglobulinas , receptores para ligandos, oligonucleótidos y cadenas sencillas de ARN y ADN para sus cadenas complementarias, avidina para biotina, enzimas para sustratos de enzima, cofactores o inhibidores de enzima, lectinas para carbohidratos. Cuál de los socios de afinidad respectivos se inmovilice sobre el sustrato de la plataforma del sensor, dependerá de la arquitectura del ensayo. El ensayo mismo puede ser un proceso complejante de un solo paso, por ejemplo, un ensayo competitivo, o también un proceso de múltiples pasos, por ejemplo, un ensayo de emparedado. En el caso más simple del ensayo competitivo, la muestra que contiene al analito en una concentración desconocida, asi como una cantidad conocida de un compuesto que es similar, excepto por la etiquetación luminescente, se pone en contacto con la superficie de la plataforma del sensor, en la cual las moléculas etiquetadas con luminescente y no etiquetadas compiten por los sitios de enlace en sus sustancias detectoras inmovilizadas. Se alcanza una máxima señal de luminescencia en esta configuración de ensayo, cuando la muestra no contiene analito. Al incrementar la concentración de la sustancia que se va a detectar, las señales de luminescencia bajo observación se hacen más bajas . En un inmunoensayo competitivo, no tiene que ser necesariamente el anticuerpo el que se inmovilice: el antígeno también se puede inmovilizar sobre la superficie de la plataforma del sensor como la sustancia detectora. Normalmente, es insustancial cuál de los socios se inmovilice en los ensayos de afinidad química o bioquímica. Esta es una ventaja básica de los ensayos basados en luminescencia sobre los métodos tales como resonancia de plasmón superficial o interferometrla, que se basan en el cambio en la masa adsorbida en el campo evanescente de la capa de guia de onda. Además, en el caso de los ensayos competitivos, la competencia no necesita limitarse a los sitios de enlace en la superficie de la plataforma del sensor. Por ejemplo, se puede inmovilizar una cantidad conocida de un antigeno sobre la superficie de la plataforma del sensor, y luego se puede poner en contacto con la muestra que contenga una cantidad desconocida que se vaya a detectar del mismo antigeno como analito, así como anticuerpos etiquetados con luminescente. En este caso, la competencia entre los antígenos que se inmovilizan sobre la superficie y están presentes en la solución, tiene lugar por el enlace de los anticuerpos. El caso más simple de un ensayo de múltiples pasos, es un inmunoensayo de emparedado, en donde se inmoviliza un anticuerpo primario sobre la superficie de la plataforma del sensor. El enlace del antigeno que se va a detectar y del anticuerpo secundario etiquetado con luminescente utilizado para realizar la detección, con uh segundo epítopo del antígeno, se puede efectuar ya sea mediante contacto sucesivo con la solución que contenga al antígeno y una segunda solución que contenga al anticuerpo etiquetado con luminescente, o mediante la combinación de estas dos soluciones de antemano, de tal manera que, finalmente, se enlace el complejo parcial consistente en antígeno y anticuerpo etiquetado con luminescente. Los ensayos de afinidad también pueden comprender otros pasos de enlace adicionales. Por ejemplo, en el caso de los inmunoensayos de emparedado, la proteína A, que se enlaza específicamente con las inmunoglobulinas, que entonces actúan como anticuerpos primarios en un ensayo de emparedado subsecuente, que se realiza como se describió anteriormente, en su llamada parte se puede inmovilizar sobre la superficie de la plataforma del sensor en un primer paso. Hay una gran cantidad de tipos adicionales de ensayos de afinidad, que utilizan normalmente el sistema de afinidad conocido de avidina-biotina. Los ejemplos de los tipos de ensayos de afinidad se encontrarán en J. H. Rittenburg, Fundamentáis of Immunoassay; in Development of Immunoassay for Food Analysis, J.H. Rittenburgh (Ed.), Elsevier, Essex 1990, o en P. Tijssen, Practice and Theory ?f Enzyme Immunoassays , R.H. Burdon, P.H. van Knippenberg (Eds) , Elsevier, Amsterdam 1985. Además, es posible utilizar la superficie de la plataforma del sensor, no solamente para un solo uso, sino también para regenerarla. Bajo condiciones adecuadas, por ejemplo, un bajo pH, una temperatura elevada, utilizando solventes orgánicos o los llamados reactivos caotrópicos (sales) , es posible disociar los complejos de afinidad selectivamente sin ' perjudicar de una manera sustancial la capacidad de enlace de las sustancias detectoras inmovilizadas. Las condiciones exactas dependen mucho del sistema de afinidad particular. Otra modalidad esencial del proceso consiste, por una parte, en limitar la producción de la señal - en el caso de un acoplamiento de retorno, esto también se aplica a la detección de señal - al campo evanescente de la guia de onda, y por otra parte, en la reversibilidad de la formación del complejo de afinidad como un proceso en equilibrio. Utilizando velocidades adecuadas de flujo en un sistema de flujo continuo, es posible supervisar en tiempo real el enlace o la desorción o la disociación de los socios de afinidad etiquetados con luminescente enlazados en el campo evanescente. Por consiguiente, el proceso es adecuado para estudios de cinética, para determinar las diferentes constantes de asociación o de disociación, o también para los ensayos de desplazamiento. La detección . de la luminescencia excitada evanescentemente excitada se puede hacer mediante métodos conocidos. Se pueden utilizar adecuadamente fotodiodos, fotoceldas, fotomultiplicadores, cámaras CCD y conjuntos de detectores, por ejemplo, celdas de CCD. La luminescencia se puede formar en imágenes en elementos ópticos tales como espejos, prismas, lentes, lentes de Fresnel, y lentes de índice de gradiente sobre los mismos. Para seleccionar la longitud de emisión de onda, es posible utilizar elementos conocidos tales como filtros, prismas, filtros monocromáticos, espejos dicromáticos, y cuadriculas de difracción. Una modalidad del proceso de esta invención consiste en detectar la luminescencia excitada evanescentemente, isotópicamente emitida. Otra modalidad del proceso de esta invención comprende detectar, en las orillas de la plataforma del sensor, la luminescencia excitada evanescentemente acoplada de retorno en la plataforma del sensor. Esta intensidad de fluorescencia acoplada de retorno es sorprendentemente alta, de tal modo que de la misma manera se puede lograr una muy buena sensibilidad por medio de este procedimiento. Otra modalidad del proceso de esta invención consiste en detectar la luminescencia excitada evanescentemente, isotrópicamente emitida, asi como la luminescencia acoplada de retorno en la guia de onda, independientemente una de la otra, pero de una manera simultánea. Debido a la diferente selectividad de los dos métodos de detección de luminescencia, que depende de la distancia de los luminüforos desde la capa de guia de onda, se puede obtener información adicional sobre la distribución espacial de los luminüforos en esta modalidad. Por consiguiente, esto da lugar a la posibilidad de distinguir entre el desvanecimiento fotoquímico de los luminüforos y la disociación de los complejos de afinidad que llevan los luminüforos. Una ventaja del proceso de esta invención es que, además de la detección de luminescencia, también se puede determinar la absorción de la luz de excitación irradiada. Comparándose con las guias de onda de múltiples modos de fibra óptica o de una construcción plana, en este caso se logra una proporción sustancialmente mejor de señal a ruido. La medición simultánea de la luminescencia y la absorción, hace posible determinar los efectos del apagado de luminescencia con una alta sensibilidad . El proceso se puede realizar irradiando con luz de excitación en un modo de onda continua (oc) , es decir, la excitación se efectúa con una alta intensidad, que es constante en el tiempo. Sin embargo, el proceso también se puede realizar mediante irradiación con luz de excitación en la forma de un pulso cronometrado con una longitud de pulso, por ejemplo, de un picosegundo hasta 100 segundos, y mediante la detección resuelta en el tiempo de la luminescencia - en el caso de longitudes de pulso cortas - o a intervalos de segundas a minutos. Este método es particularmente conveniente siempre que se desee, por ejemplo, supervisar la velocidad de formación de un enlace analíticamente, o impedir una disminución en la señal de luminescencia debido al desvanecimiento fotoquimico, utilizando tiempos de exposición cortos. Mediante la utilización de una corta longitud de pulso apropiada, y una resolución de tiempo adecuada de la detección, es posible además distinguir la luz dispersada, la emisión de Raman, y la luminescencia de vida corta de cualesquiera constituyentes luminescentes indeseados de la muestra y del material sensor, de una luminescencia de la molécula etiquetadora, que en este caso de preferencia es de larga vida, mediante la detección de la emisión del analito solamente después de que haya decaidD esta radiación de corta vida. Más aún, la detección de luminescencia resuelta en el tiempo permite, después de la excitación pulsada - justo como la excitación y la detección moduladas - la investigación de la influencia del enlace del analito sobre el decaimiento de la luminescencia molecular. En adición al reconocimiento especifico del analito mediante las sustancias detectoras inmovilizadas y la limitación espacial de la producción de señal para el campo evanescente de la guía de onda, se puede utilizar el tiempo de decaimiento de luminescencia molecular como un criterio adicional de selectividad. El proceso también se puede realizar mediante el acoplamiento de entrada de la luz de excitación en una o más de una frecuencia con intensidad modulada, y detectando el cambio de fase resultante y la modulación de la luminescencia de la muestra. La invención se refiere además al uso del proceso de la invención para la determinación cuantitativa de analitos en ensayos de afinidad química o bioquímica con socios de afinidad y arquitecturas de ensayo conocidos, mediante la detección de la emisión de los socios de enlace etiquetados capaces de tener luminescencia, o mediante la detección de los cambios en las propiedades de luminescencia de los socios de afinidad etiquetados con luminescente inmovilizados, mediante su interacción con el analito. Ya que la producción y la detección de la señal están limitadas a la superficie de detección química o bioquímica sobre la guía de onda, y se discriminan las señales de interferencia del medio, se puede supervisar en tiempo real el enlace de las sustancias con los elementos detectores inmovilizados. Por consiguiente, también es posible utilizar el proceso de la invención para la selección por afinidad o para ensayos de desplazamiento, especialmente para el desarrollo de productos farmacéuticos, mediante la detección directa de las velocidades de asociación y de disociación en los sistemas de flujo continuo con velocidades de flujo adecuadas. En otro de sus aspectos, la invención se refiere al uso del proceso de la invención para la determinación cuantitativa de anticuerpos o antigenos. Todavía otro uso del proceso de la invención es para la determinación cuantitativa de receptores o ligandos, oligonucleótidos, cadenas de ADN o ARN, análogos de ADN ó ARN, enzimas, sustratos de enzimas, cofactores o inhibidores de enzimas, lectinas, y carbohidratos. En un aspecto adicional, la invención se refiere al uso del proceso de la invención para la determinación cuantitativa selectiva de constituyentes luminescentes en fluidos ópticamente turbios. Los fluidos ópticamente turbios pueden ser normalmente fluidos biológicos, tales como, yema de huevo, fluidos corporales tales como, sangre, suero, o plasma, y también muestras que emanen del análisis del medio ambiente, incluyendo agua de superficie, extractos de suciedad disueltos, y extractos de planta disueltos. Los fluidos adecuados también son las soluciones de reacción obtenidas en la producción química, en particular soluciones de colorante, o soluciones de reacción que se originen de la producción de agentes blanqueadores fluorescentes. También son adecuados todos los tipos de dispersiones y formulaciones normalmente utilizadas en la industria textil, ya sea que contengan uno o más de un componente luminescente . Por consiguiente, el proceso también se puede emplear para salvaguardar la calidad.

La Figura 1 muestra esquemáticamente una sección transversal de una configuración del aparato para realizar el proceso de la invención. La Figura 2 muestra, esquemáticamente una sección amplificada de la guia de onda óptica.

Estas modalidades de la invención son, en detalle: Optica de excitación y guia de onda: 1 haz de láser de excitación, la modo guiado, 2 ángulo de acoplamiento, 3 cuadrícula (profundidad de 4 a 5 nanómetros, periodo de 750 nanómetros, forma rectangular) , 4 plataforma de sensor óptico consistente en 4a y 4b, 4a capa de guía de onda (Ta 5, n = 2.317 a 488 nanómetros) , 4b sustrato (Corning glass, n = 1.538 a 488 nanómetros) .

Optica de detección para la luminescencia isotrópicamente emitida: 5 lente de enfoque de una longitud focal adecuada, 6 filtro de interferencia adecuado para el máximo de luminescencia con un ancho de intensidad media de, por ejemplo, 30 nanómetros, 7 lente de enfoque de una longitud focal adecuada, 8 detector (fotodiodo) .

Optica de detección para la luminescencia acoplada de regreso en la plataforma del sensor:^ 9 haz de fibra de vidrio de una sección transversal rectangular , 10 filtro de interferencia adecuado para el máximo de luminescencia con un ancho de intensidad media de, por ejemplo, 30 nanómetros, 11 fotodiodo.

Detección de la luz transmitida: 12 haz de fibra de vidrio de una sección transversal rectangular, 13 filtro de interferencia adecuado para el máximo de luminescencia con un ancho de intensidad media de, por ejemplo, 30 nanómetros, 14 fotodiodo.

Celda de muestra (giratoria) : 15 parte superior, la cual - comprimida contra la plataforma del sensor - junto con ésta forma la celda de flujo, 16 anillo de sello 0, 17 compuerta de entrada para fluido, 18 compuerta de salida para fluido, 19 compuerta de entrada para control termostático , 20 compuerta de salida para control termostático.

Los elementos individuales utilizados para la configuración son conocidos y están comercialmente disponibles. Los siguientes ejemplos ilustran la invención. La concentración en todos los ejemplos denota moles/litro.

Ejemplo 1 1.1. Construcción Optica La luz de excitación de un dispositivo de láser de ion de argón (longitud de onda de excitación de 488 nanómetros) se dirige sobre la cuadricula de la capa de gula de onda por medio de un espejo giratorio, desde la parte posterior del sustrato.

Sellada mediante anillos 0, una celda de flujo termostáticamente controlada se comprime desde arriba contra la cara de la capa de guía de onda. La celda tiene un volumen de aproximadamente 0.07 mililitros. La luminescencia de la muestra excitada en el campo evanescente y la transmisión de la luz de excitación se registran simultáneamente . mediante tres detectores en diferente con iguración espacial. La configuración se ilustra esquemáticamente en la Figura 1. El detector 8 consiste en un fotodiodo (UDT UV-50, Detector United Technology, Hawthorne, CA, EUA) , sobre el cual se enfoca la luminescencia isotrópicamente emitida a través de filtros de interferencia y lentes de enfoque. El detector 14 consiste en un fotodiodo (SR 1133, Hamamatsu) sobre el cual se guia la luminescencia acoplada de retorno en la capa de guia de onda y observada bajo 90° para la dirección de propagación del modo continuo, por medio de fibras de vidrio ópticas, y se pasa a través de un filtro de interferencia. La señal se mejora por medio de un amplificador de trans-impedancia. La luz de transmisión. se gula de una manera análoga mediante el detector 11 en la dirección de la propagación del modo, mientras que se pasa a través de un filtro de interferencia, sobre un fotodiodo (UDT UV-50, United Detector Technology, Hawthorne, CA, EUA) , y se mejora. 1.2 Caracterización de los Materiales del Sensor y del Resultado del Acoplamiento 1.2.1 Plataforma de sensor óptico geometría: 16mm x 48mm x 0.5mm. capa de guia de onda: Ta^Dg, n = 2.317 a 488 nanómetros, espesor de 100 ± 5 nanómetros. sustrato: Corning glass C7059, n = 1.538 a 488 nanómetros.

Cuadricula: cuadricula rectangular con una modulación de profundidad de 4 a 5 nanómetros, periodo de la cuadricula de 750 nanómetros. 1.2.2 Resultado del acoplamiento con una excitación a 633 nanómetros. ángulo de acoplamiento: 4-5 (segundo orden de refracción) eficiencia del acoplamiento: 7% en el sitio de la cuadricula atenuación: 2.5dB/cm. 1.3 Detección de Inmunoglobulina Etiquetada con Fluorescelna Sobre Protelna A Inmovilizada Solución de muestra: 1 x 10-8 M de inmunoglobulina etiquetada con fluorescelna (Sigma Chemicals, F-IgG) ; 0.5 litros de regulador del pH de fosfato, consistente en 0.041 M de a^lPO^ y 0.028 M de KH^O^; 1 mililitro de P0E-(20)-monolaurato de sorbitol (Tween 20, ICI); 200 miligramos de azida de sodio, 50 mililitros de metanol, llevado hasta 1 litro con agua destilada. El sensor se incuba durante 10 horas en una solución acuosa de proteina A (Sigma Chemicals, 1 miligramo/mililitro). Para neutralizar cualesquiera sitios de adsorción todavia libres, el sensor se lava con agua destilada, y luego se incuba nuevamente durante 1 hora en una solución de regulador del pH de fosfato, que contiene 10 gramos/litro de albúmina de suero bovind (Sigma Chemicals) . La solución de muestra se hace fluir continuamente durante 9 minutos sobre la superficie del sensor, sobre la cual se adsorbe la proteína A. La fluorescencia isotrópicamente emitida, la fluorescencia evanescentemente acoplada de retorno, y la transmisión, se miden durante estos 9 minutos de acuerdo con la descripción dada en el 1.1. Se logra una sensibilidad de aproximadamente 1 x 10-10 M, basándose en F-IgG.

En todos los siguientes Ejemplos de Aplicación, se utiliza la plataforma de sensor descrita en el Ejemplo 1, y la configuración óptica descrita en el mismo.

Ejemplo 2 Detección de Inmunoglobulina Etiquetada con Fluoresceina Sobre Protelna A Inmovilizada: Soluciones utilizadas: 1) Solución reguladora del pH: consistente en 0.05 litros de regulador del pH de fosfato (0.041 de Na^HPO^ + 0.028 M de ??^?^ , 0.151 M de NaCl, 250 miligramos/litro de azida de sodio, 50 mililitros de metanol, 1 gramo/litro de albúmina de suero bovino (ASB) ; 0.5 mililitros de POE- (20) -monolaurato de sorbitol (Tween 20, ICI), llevado hasta 1 litro con agua destilada; 2) Solución para inmovilizar la proteina A (Sigma Chemicals) : 1 miligramo/mililitro de agua destilada; 3) Solución de neutralización: solución reguladora del pH 1) + 10 miligramos/mililitro de albúmina de suero bovino (ASB, Sigma Chemicals) ; 4) Solución de enjuague: solución reguladora del pH 1) ; 5) Soluciones de muestra: inmunoglobulina etiquetada con fluoresceina, 10-8 M en solución reguladora del pH 1; 6) Solución de regeneración: regulador del pH de glicina, con un pH de 2.

Proceso: La plataforma del sensor óptico se incuba durante 10 horas con la solución 2) para inmovilizar la proteína A. Para neutralizar cualesquiera sitios de adsorción todavía libres, la plataforma del sensor se lava con agua destilada, y luego se incuba nuevamente durante 1 hora en la solución de neutralización que contiene 10 gramos/litro de albúmina de suero bovino. El proceso consiste en los siguientes pasos individuales, los cuales se realizan en una celda de flujo (velocidad de flujo de 1 mililitro/minuto) : lavar durante 5 minutos con solución reguladora del pH 1), seguido por registro de la señal de fondo; agregar la solución de muestra 5) durante 9 minutos; lavar durante 5 minutos con la solución reguladora del PH 1); agregar durante 5 minutos la solución de regeneración 6) ; lavar durante 5 minutos con solución reguladora del pH 1). La fluorescencia isotrópicamente emitida, y la fluorescencia acoplada de retorno con la plataforma del sensor, asi como la transmisión, se miden durante todo el proceso de acuerdo con el Ejemplo 1. En adición a una señal fuerte de la fluorescencia isotrópicamente emitida, se miden las señales fuertes desde la fluorescencia acoplada de retorno, así como una transmisión notablemente disminuida en la presencia del analito. Las señales I 36 de fluorescencia se incrementan durante la adición del analito fluorescente, y muestran la forma tipica de una curva de adsorción. La señal para la fluorescencia acoplada de retorno, es al mismo tiempo más baja que la fluorescencia isotrópicamente emitida solamente por un factor de 2. La señal de transmisión tiene una forma que es virtualmente una inversión de espejo de las señales de fluorescencia. Hasta que se obtiene la máxima fluorescencia, la señal de transmisión disminuye por el 25 por ciento. La señal de transmisión se incrementa nuevamente por la misma cantidad a medida que disminuye la fluorescencia después del paso de regeneración.

Ejemplo 3: Detección de Inmunoglobulina Etiquetada con Fluorescelna Sobre Protelna A Inmovilizada: Soluciones utilizadas: 1) Solución reguladora del pH: consistente en 1/3 de regulador del pH de fosfato (0.041 de Na¿lP0a + 0.028 de KH^Oq) , 0.151 M de NaCl, 200 miligramos/litro de azida de sodio, 50 mililitros de metanol , llevado hasta 1 litro con agua destilada; 2) Solución para inmovilizar la proteina A (Sigma Chemicals): 1 miligramo/mililitro de solución reguladora del pH i); 3) Solución de neutralización: solución reguladora 10 miligramos/mililitro de albúmina de suero bovino Chemicals) ; 4) Solución de enjuague: también se utiliza para detectar la señal de fondo, solución reguladora del pH l + l miligramo/mililitro de albúmina de suero bovino; 5) Soluciones de muestra: inmunoglobulina M etiquetada con fluoresceína en diferentes concentraciones (10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M) en la solución reguladora del pH 1) con 1 miligramo/mililitro de albúmina de suero bovino; 6) Solución de regeneración: regulador del pH de glicina, con un pH de 2.5.

Proceso: La plataforma del sensor óptico se incuba durante 2 horas con la solución para inmovilizar la proteína A. Para neutralizar cualesquiera sitios de adsorción todavía libres, el sensor se lava con agua destilada, y luego se incuba nuevamente durante 1 hora en una solución de regulador del pH de fosfato que contiene 10 gramos/ litro de albúmina de suero bovino. El proceso consiste en los siguientes pasos individuales: lavar durante 2 minutos con solución de enjuague 4) (0.1 mililitros/minuto), registrar la señal de fondo; aspiración simultánea de la muestra (1 mililitro) en un ciclo por medio de un muestreador automatizado; luego pasar la muestra durante aproximadamente 7 minutos sobre la plataforma del sensor mediante la descarga del ciclo (0.1 mililitros/minuto, entre el impulso inicial y el final) ; después de enjuagar con la solución 4) ; después de la aplicación de la solución de regeneración, enjuagar nuevamente con la solución 4)..

La fluorescencia isotrópicamente emitida y la transmisión se miden durante todo el proceso de acuerdo con el Ejemplo 1. Se observa una señal de fluorescencia distinta adicional en una concentración de 10"^ M de i'nmunoglobulina A etiquetada con fluoresceína. Los cambios en la transmisión se determinan en contracciones de hasta 10 °M. Después de promediar los datos (promedios de 9 puntos) , todavía se puede encontrar una concentración de analito de 10" 1 M. A las diferentes concentraciones, se registran los siguientes cambios de señal al final de la adición de la muestra, comparándose con la señal de fondo inicial (proporción de la señal al ruido. entre 1 y 4 mV) : [F-IgG] Cambio de la señal de fluorescencia (Y), de la señal de transmisión. 10"ß ? 1.0 -10 por ciento * 10-9 ? 0.2 no determinado 10"10 ? 0.039 no determinado 10"11 ? 0.008 no determinado (después de promediar) .

El límite de detección es menor de 10-11 M, que corresponde a una concentración de analito de 10"14 moles de IgG ^etiquetada con fluoresceina.

Ejemplo 4 1.4 Detección de Oliaonucleótidos Etiquetados con Fluoresceina, con Cadenas Complementarias Twmo ilizadas en un Ensayo de Hibridización Soluciones utilizadas: 1) Regulador del pH de hibridización (pH de 7.75), consistente en 0.069 M de regulador del pH de fosfato (0.041 M NaH2P04 + 0.028 M MaH2P04) , 0.176 M de KC1, 1 mililitro de POE- (20) -monolaurato de sorbitol (Tween 20, ICI) , l gramo de ácido poliacrílico PAA 5100, 500 miligramos/litro de azida de sodio, llevada a 1 litro con agua destilada; 2) Soluciones de muestra: oligómero etiquetado con fluoresceina complementario para el oligómero inmovilizado sobre la plataforma del sensor, y consistente en 16 pares de bases (fluoresceína -5 ' -GTTGTGTGGAATTGTG-3 ' (10-12 M/l) en el regulador del pH de hibridización 1); 3) Solución de regeneración: 50 por ciento (G/G) de urea en una solución acuosa.

Proceso: La sonda de captura se sintetiza con un sintetizador de oligonucleótido (Applied Biosystems 394B) 3'CAACACACCTTAACAC-5' directamente sobre una plataforma del sensor silanado con 3-glicidi loxipropi ltrimetoxisi laño mediante un proceso convencional, tal como se emplea para la síntesis del oligonucleótido sobre partículas (por ejemplo, en M. J. Gait, Oligonucleotide Synthesis. A practical approach. Oxford University Press, NY 1990). Pero a diferencia de la síntesis convencional , se uti liza ácido 4 - ( 4 , 4 ' -dimetoxitritil)hidroxibutirico como un grupo de enlace estable para anclarse sobre la superficie del extremo 3' , para impedir una separación posterior de la superficie del sensor. Después de lavar con agua, las plataformas del sensor se utilizan con las cadenas de detección inmovilizadas en el método de detección. El método consiste en los siguientes pasos individuales: lavar durante 8 minutos con el regulador del pH de hibridización 1) (0.05 mililitros/minuto), registrar la señal de fondo; m agregar la solución de muestra 2) (0.05 mililitros/minuto) durante 26 minutos (después de 5 segundos de inundación de 5 mililitros/minuto; enjuagar durante minutos con regulador del pH de hibridización 1) (0.5 mililitros/minuto); agregar la solución de regeneración 3) durante 4 minutos (0.5 mililitros/minuto); enjuagar durante 4 minutos con el regulador del pH de hibridización 1) (0.5 mililitros/minuto).

La fluorescencia isotrópicamente emitida y la transmisión se miden durante el proceso de acuerdo con el Ejemplo 1. Después de la adición de la muestra durante 10 minutos, que corresponde a una cantidad de 500 átomos moles de ADN rastreador etiquetado con fluoresceina, se observa una señal de fluorescencia de 20 mV en un ruido de señal de aproximadamente 1 m .

Claims (1)

1X2 REIVINDICACIONES 1. Un proceso para detectar luminescencia con una plataforma de sensor óptico dieléctrico plano que consiste en un sustrato transparente (a) al cual se le aplica una capa de guia de onda delgada transparente (b) , dicha plataforma de sensor está provista con una cuadricula para el acoplamiento de entrada de la luz de excitación, y el Índice de refracción del sustrato (a) es más bajo que el indice de refracción de la capa de guia de onda (b) , poniendo una muestra de líquido en contacto con la capa (b) , y midiendo la luminescencia producida por sustancias que tengan propiedades de luminescencia en la muestra, o por . sustancias que tenga propiedades de luminescencia inmovilizadas sobre la capa (b) , de una manera optoelectrónica, en donde: (A) la luz de excitación se acopla en la guia de onda plana, y atraviesa la capa de guia de onda, mediante lo cual, se excitan los sustratos que tienen propiedades de luminescencia,' hasta la luminescencia en el campo evanescente de la capa de guia de onda, (B) la cuadrícula tiene una modulación de profundidad de 3 a 60 nanómetros, (C) el espesor de la capa (b) es de ¿10 a 160 nanómetros, y (D) la proporción de la modulación de profundidad al espesor de la capa (b) es menor de 0.5. 2. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el sustrato consiste en cuarzo, un vidrio inorgánico, o un material de plástico. 3. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el sustrato consiste en un vidrio inorgánico. H. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el sustrato consiste en policarbonato o metilmetacrilato de pol imetilo . 5. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde se proporciona una intercapa que consiste en S1O un plástico termoplástico , termofraguable , o estructuralmente reticulado, entre el sustrato y la capa de guía de onda, dicha intercapa tiene un índice de refracción más bajo que, o idéntico a, aquel del sustrato. 6. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 5, en donde la intercapa tiene un espesor de, o menor que, 10 mieras. 7. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde se utiliza luz esencialmente paralela para excitar la luminescencia. 8. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde se utiliza luz de láser de una longitud de onda de 300 a 1,100 nanómetros para excitar la luminescencia. 9. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde se utiliza luz de láser de una longitud de onda de ¿150 a 850 nanómetros para excitar la luminescencia. 10. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde se utiliza luz de láser de una longitud de onda de 480 a 700 nanómetros para excitar la luminescencia. 11. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la capa de gula de onda transparente plana consiste en un material que tiene un Indice de refracción mayor de 2. 12. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la capa de gula de onda transparente plana consiste en ó Ti02. 13. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la capa de guia de onda transparente plana tiene un espesor de 80 nanómetros a 160 nanómetros. 14. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la cuadricula para el acoplamiento de entrada de la luz de excitación es una cuadrícula de refracción óptica. 15. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 14, en donde la cuadrícula de refracción óptica es una cuadricula en relieve . 16. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 14, en donde la cuadrícula tiene la forma de una curva senoidal, de diente de sierra, o rectangular. 17. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 14, en donde la cuadricula tiene un período de cuadricula de 200 a 1000 nanómetros. 18. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 14, en donde la cuadricula tiene upa modulación de profundidad de 5 a 30 nanómetros . 19. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 14, en donde la cuadricula tiene una proporción de la línea a espacio de 0.5 a 2. 20. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde está presente una capa promotora de adhesión entre la capa de guía de onda y la muestra. 21. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 20, en donde la capa promotora de adhesión tiene un espesor de, o menor que, 50 nanómetros. 22. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde las sustancias capaces de tener luminescencia utilizadas para detectar el analito, se inmovilizan directamente sobre la superficie de la capa de guia de onda. 23. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, el cual comprende inmovilizar un socio de enlace específico como una sustancia detectora química o bioquímica para el analito mismo, o para uno de los socios de enlace en la superficie de la plataforma del sensor, en un ensayo de muítiples pasos en el curso del cual el analito llega a enlazarse en uno de los pasos parciales. 24. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la plataforma del sensor se puede regenerar, y se puede utilizar repetidamente. 25. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, el cual comprende detectar la luminescencia excitada evanescentemente, isotrópicamente emitida. 26. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, el cual comprende detectar en las orillas de la plataforma del sensor, la luminescencia excitada evanescentemente acoplada de retorno en la plataforma del sensor. 27. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, el cual comprende detectar la luminescencia isotrópicamente emitida, asi como la luz evanescentemente excitada que se acopla de regreso, independientemente una de la otra, pero de una manera simultánea. 28. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, el cual comprende de terminar simultáneamente la absorción de la luz de excitación acoplada en la guia de onda. 29. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la luz de excitación se acopla en la gula de onda en un modo de onda continua (oc) . 30. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, el cual comprende acoplar en la entrada la luz de excitación, en la forma de un impulso cronometrado, y detectar la luminescencia con resolución de tiempo. 31. Un proceso de acuerdo con la. reivindicación 30, en donde la longitud de pulso se ajusta desde 1 picosegundo hasta 100 segundos. U7 32. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, el cual comprende acoplar en la entrada la luz de excitación con una intensidad modulada en una o más de una frecuencia, y detectar el cambio de fase resultante y la modulación de la luminescencia de la muestra. 33. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la muestra que se va a detectar es yema de huevo, sangre, suero, plasma, u orina. 3¿l. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la muestra que se va a detectar es agua de superficie, un extracto de suciedad o planta, un caldo de bioproceso, o un caldo de sintesis. 35. El uso de un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, para la determinación cuantitativa de sustancias bioquímicas en la detección de afinidad. 36. El uso de un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, para la determinación cuantitativa de anticuerpos o antigenos. 37. El uso de un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, para la determinación cuantitativa de receptores o ligandos, oligonucleótidos, cadenas de ADN ó ARN, análogos de ADN ó ARN, enzimas, sustratos de enzima, cofactores o inhibidores de enzima, lectinas, y carbohidratos. 38. El uso de un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, para la determinación cuantitativa de componentes lumi-nescentes en fluidas ópticamente turbios.