CN1149336A - 探测短暂受激发光的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用平面介电光学传感器平台测定发光的方法，该平台由其上施加了一层透明波导层(b)的透明基底(a)组成，传感器平台设有一个耦合光栅，用于激励光的输入耦合，所述基底(a)的折射率低于波导层(b)的折射率，使液体样品作为上层与层(b)相接触，用光电方法测量样品中具有发光特性的物质产生的发光，或固定在层(b)上具有发光特性的物质产生的发光。本发明还涉及本方法在定量亲和性测试中的应用，以及将其使用于定量测定光学混浊液中发光成分，以及实施所述方法用的传感器平台。

Description

探测短暂受激发光的方法

本发明涉及采用基于波导的平面介电光学传感器平台探测短暂受激发光的方法。还涉及所述方法在定性亲和性测试(affinity sensing)中的应用，以及用于选择性定量测定光学混浊液中的发光成分。本发明还涉及适宜于实施该方法的传感器平台。

光在波导内传播时，光波不完全限于真正的波导：事实上一部分光波在光学上相邻接的薄介质中传播。该部分称为短暂场，在传感技术中它是光波导多色使用的基础。

利用这种短暂场有可能在光学上薄介质内激励发光。这种激励限于波导的中间介面区域。所以，短暂的发光激励特别有利于应用在分析上。

一种平面传感器最简单情况下由三层体系组成：基底层，波导层和上层，上层通常是由试样构成。尤其在薄波导情况下，其中波导层的厚度小于光波长度，能够传播的光场的可漫射模的数目限于几个离散的波导模。

在厚波导时，可以传导许多模。在这种情况下，常常可以略去基底，例如对于厚度在1/10毫米或更大一些范围的波导。

根据可预以探测的辐射部分的选择，已有技术中探测短暂受激发光的方法是不相同的：

·探测“体积发光”：一部分由导波激励的发光入射到全空间角内；这一部分发光可采用光学方法预以记录，并馈送到探测系统内。

·探测“短暂发光”：对射入空间的发光的补充，这种短暂发光作为导波反向耦合到波导内，传输并经由波导的端面耦合出来。

已知许多探测用发光染料标记的抗体或抗原的短暂受激发光的方法和装置，它们已在US-A-4582809中有过介绍。所要求保护的装置使用一种光纤，并对短暂激励发光进行端面耦合。这种光纤典型的最大直径为1毫米，在将激光耦合其内时可以传导许多模。可以用简单的方式仅通过反向导入光纤的部分光来测量短暂的受激发光。这种装置的尺寸非常大，并且还要求相当大的试样体积，他们都是缺点。实际上，装置其尺寸不可能减小，或者甚至小型化成为集成光学传感器。灵敏度的增加通常相随着装置尺寸的增强。

另一个缺点是由端面输出耦合限制的灵敏度：在激励和荧光发射共线进行时，需用分束器和滤光器将他们分开(例如用截止滤光器或带通滤波器)，而滤光器的鉴别特性限制了探测灵敏度。

由D.Christensen，D.Deyer，D.Fowers，J.Herron在“Analysis ofExcitation and Collection Geometries for Planar WaveguideImmunosensors”，SPIE 1886，2(1993)(在医学诊断中的纤维光学传感器)一文中对原平面多模波导的使用作出描述。文中，激励辐射经过端面耦合到波导内，对进入空间角内的发光进行探测。另外，也可以使用端面输出耦合。在后者情形下，类似于上述装置介绍中提到的由必须的分束器和滤光器所引起的对灵敏度的限制是一个缺点。还有的缺点是大的传感器尺寸和相应的大的试样体积。

在WO 90/06503中，公开一种用薄的平面的最好是单模的波导通过全内反射发光(TIRF)来激励发光的方法。在该方法中，利用波导来增加传感器表面处的光场强度，激励射束从下侧进入，并在传感器全反射。探测射入空间角内的体积发光。在此方法中，受激光与具有发光特性的分子之间的相互作用区受限于传感器，因为仅在光束直径区域发生激励，所以，仅由光束直径来有限地决定传感器的大小，即受到直径的限制和由于非常窄的有限共振角引起的发散的限制。

已有技术使用一个或一个以上耦合光栅，用于对导波的输入-或输出耦合，这种使用已由K.Tiefenthaler和W.Lnkosz在“Sensitivity ofgrating couplers as integrated-optical chemical sensor”，J.Opt，Am.B6，209(1989)，以及由W.LuKosz，Ph.M.Nellen，Ch，Stamm and P.Weiss在“Output Grating Couplers on planar Waveguides as IntegratedOptical ChemicalSensors”，Sensors and Actuators B1,585(1990)，以及由T.Tamir and S.T.Peng，在“Analysis and Design of GratingCouplers”，Appl.phys.14,235-254(1977)的文中作出介绍。Tiefenthaler等人描述的方法通过采用直接探测方法(通过折射率的改变)对于亲和性检测是很有用的。测定由于折射率改变所引起的耦合角共振的位移，这种位移是由分子的吸附或键合所支配的。

已经有过各种设想来增加短暂受激发光的灵敏度，以及制取集成的光学传感器。例如，Biosensors and Bioelectronis 6(1991)，595-607中报导过平面单模或低模波导，它是在二步离子交换方法中制造的，其中，采用棱镜来实现使光耦合成为激励波。所使用的亲合系统是人类免疫球蛋白G/荧光素标记的蛋白质A，抗体固定在波导上，欲探测的在磷酸盐缓冲液中的荧光素标记的蛋白质A加到聚乙烯醇薄膜中，波导测量区涂覆了该薄膜。该方法的主要缺点是，波导层和基底层之间只有很小的折射率差可以获取，从而导致相当低的灵敏度。

在荧光素异硫氰酸酯键合到蛋白质A中时灵敏度是20nm。这时探测微量物仍旧是不满足需要的，必需进一步增加灵敏度。另外，基于耦合系数对棱镜和波导间接触面的大小和质量的相当程度的依赖性，利用棱镜将光耦合成激励波的再现性和实际能力似乎存在困难。

在US-A-508 012中介绍了本发明主张的将光栅用于发光探测，该专利公开了将激励光耦合进波导的光栅结构，以及专用的反射光栅，它能使激励波多次通过波导。利用这种方法据说可以取得增加的灵敏度。体积发光射入空间角内。还有，在经二次通过后由输入耦合光栅耦合出的激励辐射可以用作参比信号。该方法的缺点是，由反射光栅引起背景辐射强度的强烈增加，它与荧光信号一起进入空间角内。所需的滤波器将限制探测灵敏度。

本发明的目的在于，提供一种用一个平面光波导测定发光的方法，该方法简单而且经济可行。实际上只需要小的试样体积。本发明的另一目的是，在平面光波导基础上提供一种小型化的传感器平台用于实现该方法。

上述目的可以采用平面介电光学传感器平台测定发光的方法来实现，该平台由其上涂敷一层透明波导层(b)的透明基底(a)组成，传感器平台设有一个耦合光栅，用于激励光的输入耦合，所述基底(a)的折射率低于波导层(b)的折射率，使液体样品作为上层与层(b)相接触，用光电方法测量样品中具有发光特性物质所产生的光。或固定在层(b)上的具有发光特性的物质所产生的发光，用耦合光栅将激励光耦合到平面波导内，使光渡越波导层，于是，使具有发光性质的物质受到激励，在波导层的短暂场内产生发光。该方法包括利用厚度小于激励辐射波长λ的波导层，该波导层由在激励辐射波长时其折射率≥1.8的材料组成，并用与第一耦合光栅空间上分开的第二耦合光栅从波导层耦合出，并探测反向耦合到波导层(b)内的发光辐射。

优选采用的方法构成权利要求20-23的主题。传感器平台及其优选实施例，即特别适合于实施本发明方法的实施例描述于权利要求24-38。本方法的优选实施例构成权利要求2-19的主题。

在本发明的实施中，采用耦合光栅将激励辐射耦合到波导内，并作为导波在波导层内传播。为有效短暂激励荧光，通过选择波长参数(折射率，厚层)有可能在/或靠近传感器表面处取得高的场强。

很惊奇地发现，为确定下面介绍的波导的尺寸，发光辐射的相当大的部分的光被短暂地反向耦合到波导中，并和激励波一起由波导传送。由此，采用与第一耦合光栅在空间上分开的第二耦合光栅可以将发光辐射从波导中耦合出，并传导到探测系统。这种“光栅探测短暂发光”超越已有的“体积探测”的优点在于使传感器平台和从属的探测系统小型化的简化可能性。

根据平面波导理论，有可能得到最有效发光激励的平面波导的尺寸。下述的尺寸可以结合W.Lukosz″Principles and sensitivities ofintegrated optical and surface plasmon sensors for direct affinitysensing and immunosensing″，Biosensors & Bioelectronics 6,215-255(1991)，D.G.Hall，″Optical waveguide diffraction gratings：couplingbetween guided modes″，in Progress in Optics XXIX，ed.E.Wolf，Elsevier，New York(1991)；等文观察到。

平面波导的短暂场进入上层的穿透深度由下式表示： $\mathrm{\Δ}{z}_{\mathrm{evo}}=\mathrm{\λ}/2\mathrm{\π}\frac{1}{\sqrt{N_{\mathrm{eff}}^2-n_{\mathrm{super}}^2}}$

对有效模式折射率N_eff，上层折射率n_super，工作波长λ。在上式中，z表示垂直于波导表面的座标，x表示波导传播的座标。考虑到在波导表面电场强度的标准化因子f， $f=\frac{n_{\mathrm{film}}^2-N_{\mathrm{eff}}^2}{n_{\mathrm{film}}^2-n_{\mathrm{sub}}^2}$

其中，n_film是波导折射率，n_sub是基底折射率，在波导上短暂场的强度曲线I_E正比于：

垂直于波导表面的激励短暂场的强度曲线确定量度层厚度和波导折射率的主要比例因子。在分析时，为探测靠近波导层的发光分子，就需考虑在确定波导尺度时分子离波导表面的距离。

对发光探测，现已发现，发光的短暂反向耦合对于薄的、高折射平面波导是一种有效的探测方法。层厚度和折射率的选择对于(可计算的)激励效率以及短暂反向耦合均有影响。在后一种情况下，在靠近波导表面的键合分子辐射部分的输入耦合与从试样体积未键合分子的输入耦合之间存在着竞争。

为了用本发明的方法有效探测在靠近波导表面具有发光特性的分子，已发现，波导参数必须在下述范围内：

·对激励波长λ的折射率n_film≥1.8。

·对激励波长λ，层厚度t_film≤λ，优选t_film≤λ/2。

本方法特别优越的实施例是，层厚度选择在40-160nm范围内，同时光栅的调制深度在3-60nm时，调制深度与层厚的比＜0.5。

这些波长也可表征为，它们一般只允许波导模数m低于或等于3的可传播。

短暂反向耦合到波导的发光在波导内传输；所以其特性是用导波的衰减系数「表征。如果有一个低的Stokes′位移，可以假设对激励和光辐射具有相同的衰减数据(波导衰减的可能原因是，在波导介面的散射损耗，以及在波导层内的吸收，或者在基底或上层内的吸收)。如果没有显著的窄吸收带，则对于散射和吸收两者，可以预料由典型的10-50nm的Stoke′s位移引起的衰减变化不明显。这种光谱窄带吸收效应必须在选择传感器平台材料时予以避免。

在波导内传输的发光辐射必须耦合出来，并导入探测系统。不宜采用端面输出耦合；一方面，这种耦合需要高质量的波长边缘，在某些情况下需经浸液体或胶接触光学探测器，另一方面，不能使传感元件与液池结合成整体。

使用与输入耦合激励辐射的耦合光栅空间分开的第二耦合光栅将发光辐射耦合出，这样能完全避免端面的问题。另一优点是，在X方向光栅距离A(即在导波方向)可以随意选择。因此，可提供调节距离A来对每一波长的衰减最佳化，而不需要改变传感器和液池的外部尺寸。还有的优点是，传感元件的外边缘不需要满足任何光学性能的要求，他们的结构可以调整以与液池匹配，尤其是与采用的密封结构液池匹配。

光栅距离B的最佳值是B＝X_1/e，B值在B≈(0.2-3)*X_1/e的范围内可变动(X_1/e：表示在X方向传导的激励波的强度下降至波长的1/e)。

(Conversion.Γ[dB/cm]→X_1/e[1/mm]：X_1/e＝100/(ln10^*Γ))

对于较大的距离，激励光以及传导的发光受到明显衰减，导致强信号下降。首先，不用激励和反向耦合表示下限，还需要加上光栅和在输入耦合光栅上激励辐射的位置来确定。这里的间距不能小于100um，还要依据下面将介绍的输入耦合光栅的宽度大小以及在输入耦合光栅边缘上激励辐射的光直径大小而定。

下面将参照附图更为详细描述本发明。图1表示尤其适用于实施具有一种可能的辐射曲线的本发明方法的光学传感器平台的侧视图。图2表示图1所示传感器平台的顶视图。

在图1中，1是传感器平台，2是用于耦合激励光的耦合光栅，3是用于耦合出发光的耦合光栅，4是波导层，5是基底。

图1表示激励和发光辐射输入耦合进和输出耦合出传感器平台的可能光路。在X方向传播的导波受到传感器平面内的耦合光栅2激励，此时涉及波矢×分量的共振条件得到满足：k_WL＝k_ein±m*k_G±m*2π/A_G，m是整数，K_G是光栅倒易矢量k_WL＝2π/λ*N_eff＝k₀*N_eff

具有有效模折射率N_eff的波矢-导波。

在图1中，负角θ表示k_in＝k_o*cosθ    的输入耦合(ko：在图平面内的波矢幅度)，从而导波在与激励“相反方向”内运行(所谓“后向耦合”)。选择正角将激励波耦合出来(K_out)，同时将发光辐射(K_out)耦合出来。

用对反射的入射光和耦合出的光有明显不同方向的输入和输出构形来取得高的背景自由度。不同辐射部分的空间分隔可保证发光探测的最佳信噪比：耦合出的激励辐射和发光辐射不在共同光路内运行，这样滤光器(截止或带通滤光器，图1未示出)只用于抑制散射光，但不用于耦合出激励辐射的整个强度。

使用输出耦合光栅的另一优点是，发光辐射不同的光谱成分在不同的方向上耦合出来。所以，借助本发明也可探测弱的发光试样介质中的分子，如果欲探测分子的发光和试样介质的发光在光谱上是不同的，甚至可以不用附加滤光器进行探测。

通过选择光栅常数∧₁和∧₂，可以调节输入和输出耦合光栅的角度。如图1所示的优选情况，输入和输出光栅之间具有一个方向间隔，必须选择明显不同的光栅常数。

另一方式，为简化传感器的制造，可以使光栅2和3具有相同的光栅常数，这对尽可能低费用加工传感器是很重要的，如果采用全息光栅结构，则许多步骤可以省略。耦合输出的激励和发光辐射的方向的空间分开在使用相同光栅常数时仍可以确保。只是忽略了反射输入耦合辐射方向的可靠的区分。因此，需要对反射发光屏进行附加测量，例如使用孔径或光挡来测量。

可以在|θ|≈1°-50°  (对角度的辐度)范围内选择光栅常数来确定耦合角。考虑到Bragg反射，应避免采用较小的角度值，否则至甚在传感器的水平度或调节的低容限时会出现这种反射，使输入和输出耦合不出现。大至几乎达90°的角度是可能的，但是为了光路的合理调试，应避免该角度超过传感器的面法线。

光栅深度的大小可以按照已有技术所述( T.Tamir，S.T Peng″Analysis  and  Design  of Grating  Couplers″，Appl.phys.14,235-254(1979)；T.Tamir，″Beam and waveguide Couplers″in″IntegratedOptics″，ed，T.Tamir，Springer，Berlin(1979)。所谓“漏参数”α在此作为一个特征：α表示在界面具有深度为t_grating的耦合光栅的波导内导波的强度下降1/e。因此，1/α是辐射能量从导波转移到自由传播的波，或相反情况的特征长度。所以，选择输入耦合光栅深度的重要性，首要的不是漏参数的绝对值，而是调节漏参数和入射光的辐射参数(光束直径和发散度)。为了在空间有限的光栅上取得最佳的具有高斯形激光束的输入耦合，就需满足下述的漏参数条件，光束直径和相对于光栅边缘的光束位置：

·α*w_o＝1.36

·x_o/w_o＝0.733

值Xc表示光点中心朝向光栅边缘位置的位移。这种位移发生在远离从边缘至光栅结构区的地方。按照该条件，可取得输入耦合效率大于80％。

一个对输出耦合的模拟观察，其结果是可以取得80％或更高的高耦合效率。前提是，光栅在X方向的横向展开明显地大于漏参数。然而，由于导波通过光栅的衰减耦合出来的自由传播光束的强度分布是非对称的。

在设定输入耦合的漏参数时需考虑下述方面：·确定光斑相对于光栅边缘的位置·使传感元件小型化

虽然小的漏参数(α＜＜1/mm)和相应的大的光束直径使定位简化，但是在光栅宽度大于A＝3mm情况下，使传感器小型化的可能性明显地受到限制。对实现完全耦合，光栅宽度应该是A＞3*Wo。此外，光栅和波导的不均匀性对耦合效率具有负效应。而大的漏参数(α＞10/mm)和光束直径Wo＜10μm将允许非常小的光栅尺寸，并且允许定位精度为＜＜100μm。还有，在这种情况下，耦合效率尤其受到光束发散度明显超过耦合共振角度范围这一事实的限制。

已发现，漏参数范围α＝( 0.2-5)/1mm正好兼顾了调节要求，定位容限和小型化。对于上述波导层厚度，t_grating＝3-60nm，尤其是3-40nm的范围，对于光栅深度来说，在基底-波导界面使用正弦波调制时，通常与该范围相当。由于漏参数非常依赖于光栅的表面分布形状，对于传感器功能的重要量度不是几何深度而是漏参数。

传感器平台的基底必须在激励和发射波长是透过的。基底也可以是一种塑料，如在EP-A-0533074中所述的。

基底也可以是不同材料的复合系统，例如在一个支承板上的层系统，或类似物。在这种情况下，只需要使直接相邻于波导层的材料的折射率小于波导层的折射率就可。

在可以使用微结构的聚合物用作波导层的基底时，就可以使低费用制造传感器平台成为可能。在这种情况下，激励基底-本征发光限制了探测灵敏度。这种本征发光的激励和短暂的反向耦合以类似于上述在波导-上层界面处的机制出现在波导基底材料界面处。这种基底-发光可以采用在波导涂层之前将一种低折射率的非发光中间层涂在基底上予以避免(这种低折射率中间层其折射率低于或等于波导的折射率)。一种特别合适的中间层材料是SiO₂，或者基本由具有组分SiO_xH_yC_z的SiO₂组成，该组合物可以另外插入低级烃基。选择中间层的厚度t_buffer，以便由基底侧上导波的短暂场传输的能量局限在中间层内。如果t_buffer大于短暂场的光穿透深度值Z_eva的六倍，上述条件实际上得到满足。在短暂发光探测中，对于最佳信噪比，5倍的值是适宜的。该条件完全满足于t_buffer≤2000nm。

利用中间层的另一优点在于减小基底表面的不平度。于是，伴随对信噪比的正面影响降低了短暂发光探测中的波导衰减「。

只有基本上平行的光适用于发光激励。本发明中，应明白“基本平行”所表示的是光束发散度小于5°。这意味着，光可以是稍有发散或会聚。较大的发散度可以简化对输入耦合角度的调节，但是降低了荧光信号，由于输入耦合共振的宽度明显由于发散角，因此只有小部分的用于发光激励的入射能量可以获取。

在本发明范围内，平面的介电光学传感器平台表示所述的平台是条带状的，平板状的，圆盘状的或者任何其它几何形状的，只要用肉眼看是平面的。如果导波能够在波导层内传播，以及能实现如图1那样的输入和输出耦合则平面度的偏差要求不十分严格。可以根据内设置传感器平台的整个装置的结构来统盘考虑所选择的几何形状。优选的布置应满足小型化要求。

除上述的使用有机微结构基底外，也可以使用无机基底，例如玻璃或石英。他们相对于聚合物的优点在于低的本征发光。然而，对于低费用加工传感器平台，对这些基底涂以低折射率的涂层是适宜的，在该涂层中插入了耦合光栅的光栅结构这描述于EP-A-0533074中。

另外，耦合光栅可以位于波导/上层界面处。

制造这种耦合光栅的方法是已知的。在它们的生产中主要应用光刻，或全息照相方法和蚀刻技术。这尤其描述于Chemical，Biochemicaland Enviromental Fiber Sensors V.proc，SPIE，vol.2068，1-13，1994。

可以在基底上制作光栅结构，再转移至波导层，在波导层内使光栅结构成象，或者就在波导内制作光栅

光栅周期可以是200-1000nm，而最好光栅只有一种周期性，即是单色衍射。

在本发明范围内，“试样”一词是指欲测试的整个溶液，它包含欲探测的物质-被分析物。这种探测可以一步或多步方式进行，在探测过程中，传感器平台的表面与一种或多种溶液接触。至少所用溶液的一种包含具有本发明可测的发光特性的物质。

如果具有发光特性的物质已经在波导层(b)上被吸收，那么试样也可以无发光成分。试样可以包含其它的成分，典型的是PH缓冲剂，盐，酸，碱，表面活性物质，影响粘度的调节剂或染料。生理盐水溶液尤其可以用作溶剂。如果荧光成分本身是液体，则可以不用添加溶剂。在这种情况下，试样可包含高至100％的具有发光特性的成分。

试样还可包含生物介质，例如蛋黄，体液或其成分，尤其是血液、血清、血浆或尿液。另外，试样可由表面水、天然或合成介质的土壤、植物部分的提取溶液，生物工艺的发酵液或合成发酵液等组成。

试样可以是不稀释的，或添加溶剂的。

合适的溶剂是水，水质缓冲液，蛋白质溶液和有机溶剂。适合的有机溶剂是醇、酮、脂族烃，最好使用水，水质缓冲液，或者水和水溶有机溶剂的混合液。

然而，试样也可包含不溶于溶剂的组分，例如色素粒子，分散剂，天然或合成低聚体或聚合物。在这种情况下，试样是以光学混浊分散液或乳液的形式存在。

合适的发光化合物是在波长330nm-1000nm范围内具有发光的发光染料，典型的是若丹明，荧光素衍生物，香豆素衍生物，联苯乙烯联苯(distyryl biphenyls)，茋衍生物，酞菁、萘菁，聚吡啶-钌配合物，例如氯化三(2，2′联吡啶)合铑，氯化三(1，10-菲咯啉)合钌，氯化三(4，7-二苯基-1，10) 菲咯啉)合钌和聚吡啶-吩嗪-钌配合物，铂-卟啉配合物，例如辛乙基-铂-卟啉，长寿命的铕和铽配合物或菁染料。最适合血或血清分析的是在600-900nm范围具有吸收和发射波长的染料。

最合适的发光化合物是诸如荧光素衍生物的染料，其所含的功能基团可以使其共价键合，例如荧光素异硫氰酸酯。

非常合适的功能荧光染料可以从生物检测系统公司( BiologicalDetection System Inc.)获取，例如在Clinical Chemistry 40(9)：1819-1822，1994中介绍的单官能和双官能Cy5.5^TM染料。

优选的发光是荧光，优选用相干光激励，由此在输入耦合光栅的共振条件伴随高效率得到满足。所以选用的激光光源应根据发光或荧光分子的吸收波长来选择。

最好使用激光二极管或超发光二极管作为光源，因为使用这些光源有可能使具有所设计传感器平台的探测系统高度小型化。

适用的发光染料也可以是化学键合到聚合物，或键合到生物亲和系统中的结合配偶体上，例如抗体，或抗体片段，抗原，蛋白质，肽，受体或他们的配体，激素或激素受体，低核苷酸，DNA链和RNA链，DNA和RNA类似物，结合蛋白质，如蛋白质A和G，抗生物素蛋白或生物素，酶，酶辅因子或抑制剂，外源凝集素或碳水化合物。共价荧光标记最后提及者优选用于可逆的或不可逆的(生物)化学亲和性分析。还可使用发光标记的类固醇，脂质和螯合剂。嵌入发光染料对于用DNA链或低核苷酸的杂交分析尤为有意义，尤其如果-类似不同的钌的配合物-他们在嵌入时可增加发光。如果这些发光标记的化合物与固定在传感器平台表面上的亲合配偶体相接触，则这种结合可以从测量发光强度来定量测定。也可以在试样与发光体相互作用时测量发光的改变来对分析物作定量测定，例如用氧猝灭发光的形式，或通过蛋白质的形态改性来使发光增加的方式来测定。

适宜制造波导层的材料典型的是无机材料，最好选用无机金属氧化物，如TiO₂、ZnO、Nb₅O₅、Ta₂O₅、HfO₂或ZrO₂。最好选用Ta₂O₅和TiO₂。

在本发明方法中，试样可以在不动状态，以及在波导层上连续经过的状态与波导层相接触，该循环可以是连续的或不连续的。

本方法的具体实施例在于在波导层(b)的表面上固定具有发光特性的用于检测分析物的物质。具有发光性质的物质，例如可以是与蛋白质键合的发光体，于是可以用这种方式在波导层的表面上使发光体受激发光。如果对蛋白质具有亲和性的配偶体(partner)被引导经过这一不运动的层时则发光可以改变，可用这种方式测量配偶体的量。尤其，也可用发光体标记亲和性配偶物的二个配偶体，则就能从二个配偶体之间的能量转移，例如以发光猝灭的形式，实现浓度的测定。

本发明方法用于进行化学或生化亲和性检测的其它优选实施例在于：在传感器平台的表面固定一种特殊的结合配偶体作为化学或生化探测物质用于被分析物其自身或结合配偶体之一。在该分析过程中，测定可以是一步或多步进行，在相继的步骤中，引导一种或多种含有用于固定在传感器平台表面上的探测物质的结合配偶体的溶液，使被分析物在某一分步骤中受到结合。通过在亲和性测试中的结合发光标记的参与物来进行被分析物的探测。所用的发光标记物可由一个或多个亲和性测试的结合配偶体组成，或者也可以由配有发光体的被分析物的类似物组成。唯一的准则是，分析物的存在选择性地导致发光信号，或者有选择地导致发光信号的改变。

探测器物质的固定可以采用在波导层上疏水吸收，或直接共价结合，或例如硅烷化或加聚合物层对表面化学改性后来实现。另外，例如由SiO₂构成的薄的中间层可以作为促进粘结层直接加到波导层上，以便于探测器物质直接固定在波导上。中间层的厚度应该不超过50nm，最好为20nm。

合适的探测器物质典型的是多种抗原用的抗体，结合蛋白质，例如用于免疫球蛋白的蛋白质A和G，配体的受体，低核苷酸和用于RNA和DNA互补链的RNA和DNA的单链，生物素的抗生物素蛋白，用于酶基质的酶，酶辅因子或抑制剂，用于碳水化合物的外源凝集素。将各个亲和性配体中，那一个固定在传感器平台的表面上还得取决于检测的体系结构。

检测本身可以是一个单步的复杂过程，例如竞争性的测定，也可以是多步过程，例如多层的测定。

在最简单的竞争性测定情况下，含有未知浓度的被分析物和已知量的化合物(与被分析物类似，除发光标记外)的试样与传感器平台相接触，在此，发光标记的和未标记的分子在他们的固定探测物上竞争结合位置。在试样不包含被分析物时，在这种测定构形中取得一个最大的发光信号。随着欲测物质的浓度增加，受到观察的发光信号逐渐下降。

在竞争免疫测试中，不一定需要不动的抗体：抗原也可以作为探测物被固定在传感器平台上。通常，在化学或生化亲和性检测中固定那一个配体是不重要的。这是基于发光的检测比其它方法，例如表面细胞质粒基因组共振或干涉测量法所具有的基本优点，后者的方法是基于在波导层的短暂场内吸收的质量的改变进行的。

另外，在竞争检测中，这种竞争并不需要限制在传感器平台的表面上的结合位置。例如，也可以将已知量的抗原固定到传感器平台的表面上，  然后使它与试样接触，这种试样包含欲测的未知量的与被测物相同抗原的以及发光标记的抗体。在这种情况下，固定在表面上的和在溶液中的抗原之间产生对结合抗体的竞争。

多步检测的最简单情况是一种夹心免疫检测，其中初级抗体在传感器平台的表面上被固定不动。待探测抗原以及用于检测的发光标记的次级(secondary)抗体对抗原的第二表位的结合可通过将含抗原的溶液与含发光标记的抗体的第二溶液连续接触或通过将上述两种溶液合并来进行，最终由抗原和荧光标记的抗体组成的部分复合物受到结合。

亲和性的测试还包括其它附加的结合步骤。例如在夹心免疫检测的情况下，蛋白质A(其专门结合面可以在相继夹心检测中起初级抗体作用的免疫球蛋白，这种结合在他们的所谓F_c部分如上所述进行)可以在第一步就被固定在传感器平台的表面上

存在着许多类型的亲和性测试，典型的是利用抗生物素蛋白-生物素亲和性系统来测试。

展开的亲和性测试的例子记载在J.H.Rittenburg的“免疫检测的基础”(Fundamentals of Immunoassay)中；以及在J.H.Rittenburg(Ed)，Elsevier，Essex 1990的“食物分析用的免疫测试的发展和应用”(Development and Application of Immunoassay for Food Aanlysis)中，或者在R.H.Burdon，P.H.van Knippenberg(Eds)，Elsevier，Amsterdam 1985的“酶免疫分析的实践和理论”(Practice and Theoryof Enzyme Immunoassays)中。

还可以使传感器平台的表面不仅使用一次，也可再生使用。在适合的条件下，例如低的pH值，升高温度，使用有机溶剂或所谓离液序列高的试剂(盐)，有可能不用明显削弱固定探测物的结合能力就能有选择地离解亲和性复合物。这种精确的条件强烈取决于特殊亲和性的系统。

本方法其它基本的实施一方面在于将信号的产生限于波导的短暂场中，在反向耦合的情况下，这也适用于信号检测，另一方面在于在平衡过程中亲和性复合物形成的可逆性。在连续流动系统中利用合适的流动速率，就可能实时监测在短暂场中结合的发光标记的亲和性配偶体的结合、解吸附或离解。所以，本方法适用于对确定不同的结合或离解常数的动力学研究，也可用于替代检测。

可以采用已知的方法进行探测短暂的受激发光。光二极管，光电池，光电倍增管，CCD摄象机和探测器阵列，例如CCD光电元件均适用。可以用光学元件，例如平面镜，棱镜，透镜，菲尼耳透镜，折射率梯度透镜使发光成象。为选择发射波长，可以使用已知的元件，例如滤光片，棱镜，单色滤光片，双色镜和衍射光栅。

本方法的一个优点是，除了探测发光外，也可测定受激发射光的吸收。与光纤或平面结构的多模波导相比较，在这种情况下可以取得好得多的信噪比。发光和吸收的同时测量将使得高灵敏度测定发光猝灭效应成为可能。

在本发明的一个简单实施例中，该方法可以采用以连续波方式(CW)的激励光辐射进行，即，用恒定的光强进行激励。

然而，本方法也可用脉冲长度为如1皮秒-100秒的计时脉冲形式的光作为激励光辐射，并通过时间分辨的发光的探测，即在短脉冲长度的情况下，或在几秒至几分钟时间间隔的情况下来进行。本方法在需要例如分析监测结合形成的速率，或阻止由于用短的曝光时间所致的光化学消失(fading)所引起的发光信号的下降，均具有特殊的优点。利用适宜的短脉冲长度和合适的探测时间分辨，还可以从标记分子的发光(在这种情况下优选长寿)中区分散射光，拉曼发射和试样和传感材料的任何所不希望的发光成分中的短寿命的发光，只需在短寿命的辐射衰减之后探测被测物的发射就可确定。另外，时间分辨的发光探测允许在脉冲激励之后，如同调制激励和探测一样，进行被分析物的结合对分子发光衰减的影响的研究。除了用固定的探测物质对被测物进行特殊的识别和将信号的产生空间上限于波导的短暂场，可以利用分子发光的衰减时间作为选择性的进一步判据。

本方法也可以用强度受到调制的一个或多个频率的输入耦合激励光来实现，同时探测试样发光的最后相位移和调制。

本发明还涉及用创造性的方法在化学或生化亲和性检测中对被测物的定量测定，其中使用已知亲和性配偶体和分析结构，和探测能产生发光的标记结合配偶体的发射，或者探测与被分析物相互作用的固定的发光标记的亲合性配体的发光特性的改变来实现定量测定。

由于信号的产生和探测限于波导上的化学或生化探测表面，由介质产生的干涉信号被区分，因此结合到固定探测元件上的物质可以被实时监测。所以，通过在连续流动系统中以合适的流动率来直接探测结合和离解率，有可能把本发明的方法用于亲和性的筛选、或置换检测，尤其用于药物制品开发。

其它方面，本发明涉及将本发明的方法用于抗体或抗原的定量测定。

本发明方法的其它利用在于，定量测定受体或配体，低核苷酸，DNA和RNA链，DNA或RNA的类似物，酶，酶基质，酶辅因子或抑制剂，外源凝集素和碳水化合物。

其它方面，本发明还涉及将本发明方法用于在光学混浊液中选择性定量测定发光的成分。

典型的光学混浊液体可以是生物液体，如蛋黄，体液如血，血清，血浆，以及从环境分析中来源的样品，包括表面水，溶解的土壤提取物，溶解的植物提取物。合适的流体也可以是在化学生产中获取的反应液，尤其是染料溶液或从荧光增白剂生产中出来的反应液。还包括各种类型的用在纺织工业中典型的分散体和制剂，只要它们具有一种或多种发光成分。因此本发明方法还用于质量的安全监测。

本发明通过下述的举例作更详细的说明，其中浓度M为每升摩尔浓度。举例：光学系统

光源采用一个输出波长λ＝670nm(OZ光学)的激光二极管。调节在传感器平面上的光点直径为0.4nm，垂直于耦合光栅刻线而平行于光栅刻线的光点直径为2.5nm，这可利用成象光学系统来取得。

相对于光栅边缘调节输入耦合角并对光点定位，这种调节由机械调节机构完成。

选择在传感器芯片上的激光功率在P＝0-3mw范围内；而对于下述光栅特性实验用的功率则选择P＝1.2mw，用于荧光测量的P＝0.2mw。具有TE或TM取向的线偏振光可以利用旋转偏振元件预以输入耦合。

用O形密封圈使流动液池相对传感器密封，该液池安装在传感器平台的顶侧。液池的试样体积是约8μl。利用喷射泵和转向阀可以将不同的溶液引入液池内。

如图1所示，在传感器平台的下侧进行激励和探测。

三个测量通道用于探测、用于在输出耦合光栅耦合出的激励光和荧光(图1中K′_out和K_out方面)，以及经由分束器的入射激励光(图1未示出)。

使用单光子计数方式的具有脉冲形成电子线路(Hamamatsu C3866)的放大器(Hamamatsu R 4632 SEL)作为荧光辐射的探测器。他的TTL输出信号由常用的脉冲计数器计数(Hewlett-Packard 53131A)。利用聚焦透镜系统可以将角扇区的荧光辐射聚焦到探测器上。压缩散射光的干涉滤光片( band-pass at λ＝725nm with half-width25nm，Omega)放置在探测器的前面。

串联的带有测量放大器(UDU 101C)的硅二极管(UDT PIN10D)用作入射和耦合出的激励辐射的参比探测器。

在利用常规的数据输入系统进行下述的检测时，可以对所有的三通道同时估测。传感器平台

以下述方式微结构化的具有输入和输出耦合光栅的聚碳酸酯用作基底：

输入耦合光栅，其周期∧₁＝(299.5±0.7nm )，深度t₁＝6.9nm-12.3nm；输入耦合光栅，其周期A₂＝(489.5±0.6nm)，深度t₁＝8.2nm-12.8nm，二个光栅具有近似Sin⁴分布。

按照图2所示使上述光栅布置在传感器上，并具有下列几何值：光栅距离A＝4mm，光栅宽度(垂直于刻线)B₁＝B₂＝2mm，光栅高度(平行于刻线)4mm，传感器平台的尺寸是12×20mm²。

为了抑制聚碳酸酯的自荧光，该基底用折射率n＝1.46，厚度为t_buffer＝(100-±10nm)的SiO₂中间层涂覆，之后形成TiO₂波导层，其在λ＝670nm处具有高折射率n_film＝2.35，层厚t_film＝(170±5nm)。

利用激励先，模式级数为m＝0可以在光栅-波导结合的波导内受到激励：在角度θ＝(-10±1.6)°时，对TE₀输入耦合有效果，而在θ(-22.7±3.7)°时，对TM₀有效果。

具有TE偏振的荧光辐射，在角范围θ＝31°-40°，激励光的角度为θ＞42°时被耦合出来。光谱范围λ约685nm-715nm。对于TM偏振，对荧光的输出耦合角范围为θ=1 7°-25°，对激励辐射θ＞27°。对于TE偏振，在输出耦合充栅之后探测到入射激光强度P＝1.2mw的光效率P＝30-50μw。探测Cy5.5^TM-标记的免疫球蛋白：

用Cy5.5^TM染料标记免疫球蛋白：

利用双官能的菁染料Fluorolink^TMCy5.5^TM按制造者(BiologicalDetection Systems，Pittsburgh PA 15238，USA)介绍的方法标记Rabbit免疫球蛋白(rabbit IgG，Sigma Chemicals)。1.在1mi染料中含有2.5mg rabbit IgG的溶液，温育45分钟，每10分钟摇动溶液。2.该溶液加入1ml染料中，静置45分钟，每10分钟摇动溶液。3.在一个Sephadex R G25分离柱( Pharmacia LKB，BiotechnologyAB，Uppsala，Sweden)上分离结合蛋白质的和未结合蛋白质的染料，分离柱已事先用50ml PH＝7的磷酸盐缓冲液平衡过：-去掉1ml，-收集多个馏分4.从678nm(染料吸收带)的光密度和280nm(蛋白质吸收带)的光密度，测量染料/蛋白质比值。由此测定1染料分子与2蛋白质分子的比值。所用的溶液：1)缓冲液由(0.041M的Na₂HPO₄+0.028M的KH₂PO₄)、0.151M的NaCl，200mg/l的迭氮化钠，50ml甲醇，用蒸馏水加到1升；2)免疫蛋白质A的溶液(Sigma Chemicals)：1mg/ml蒸馏水；3)中和溶液：缓冲液1)+10mg/ml牛血清蛋白(BSA Sigma Chemicals)；4)清洗液：用于测定本底信号，缓冲液1)+1mg/ml的BSA；5)试样液：Cy5.5^TM-标记的免疫球蛋白，在含有1mg/ml BSA的缓冲液1中有不同的浓度10^-8M，10^-9M；3·10^-10M，1·10^-10M：6)再生液：甘氨酸缓冲液，PH2.5应用蛋白质A的生化指示层

光学传感器平台用溶液2)温育10小时，以固定蛋白质A。为中和任何仍未吸附的位置，将传感器平台用蒸馏水清洗，然后再用含10g/lBSA的中性溶液温育1小时。测量步骤/检测

在整个测量步骤中，在活化的传感器表面上保持0.25ml/分钟的液流流动：

本方法由下列各个步骤组成。-用清洗液4)清洗4分钟，记录背景信号；-在4分钟内添加试样溶液5)；-用清洗液4)清洗4分钟；-在4分钟内添加再去溶液6)；-用清洗液4)清洗4分钟。

在整个方法中予以测量由第二光栅耦合出来的荧光信号。在不同的浓度，记录在添加试样的结束时的以下信号改变，并与初始的背景信号作比较(信噪比每秒在50和100脉冲之间(CPS)：〔Cy5.5-tgG〕    荧光信号〔CPS〕10^-8M                 700010^-9M                  8503·10^-10M              300

由光栅耦合输出探测荧光的探测限很明显低于3·10^-10M，相当于Cy5.5标记的IgG的被测物浓度为3·10^-13mol。

Claims (37)

1.一种利用平面介电光学传感器平台测定发光的方法，该平台由其上涂敷一薄层透明波导层(b)的透明基底(a)组成，传感器平台设有一个耦合光栅，用于激励光的输入耦合，所述基底(a)的折射率低于波导层(b)的折射率，使液体样品作为上层与层(b)相接触，用光电方法测量样品中具有发光特性的物质所产生的发光，或固定在层(b)上的具有发光特性的物质所产生的发光，用耦合光栅将激励光耦合到平面波导内，使光渡越波导层，于是，使具有发光性质的物质受到激励，在波导层的短暂场内产生发光，该方法包括利用厚度小于激励辐射波长λ的波导层，该波导层由在激励辐射波长时的其折射率≥1.8的材料组成，并用与第一耦合光栅空间上分开的第二耦合光栅从波导层耦合出，并探测反向耦合到波导层(b)内的发光辐射。

2.根据权利要求1的方法，其特征是，该方法包括利用具有厚度小于λ/2的波导层。

3.根据权利要求1的方法，其特征是，波导层的厚度是40-160nm。

4.根据权利要求1的方法，其特征是，光栅的调制深度是3-60nm。

5.根据权利要求1-4中任一项的方法，其特征是，在不同于发光辐射的角度下耦合出激励辐射。

6.根据权利要求1-5中任一项的方法，其特征是，在反向把激励辐射耦合到波导内，在正向把由波导传输的激励光和在波导内传送的发光耦合出。

7.根据权利要求1-6中任一项的方法，其特征是，在约1至-50°的角度范围内将激励辐射耦合到波导内。

8.根据权利要求1-7中任一项的方法，其特征是，反向耦合到波导中的发光辐射在近似于1-50°的角度范围内被耦合出来。

9.根据权利要求1-8中任一项的方法，其特征是，基底的发光受到抑制。

10.根据权利要求1-9中任一项的方法，其特征是，使用基本上平行的光激励发光。

11.根据权利要求1-10中任一项的方法，其特征是，用于探测被分析物的能发光的物质被直接固定在波导层的表面上。

12.根据权利要求1-11中任一项的方法，其特征是，该方法包括，将作为用于被分析物自身或者结合配偶体中的一种的化学或生化探测物的特殊结合配偶体固定在多步检测中的传感器平台的表面上，在这个过程中，在其中一个分步骤中被分析物受到结合。

13.根据权利要求1-12中任一项的方法，其特征是，同时测定辐射激励光的吸收。

14.根据权利要求1-13中任一项的方法，其特征是，激励光以连续波(CW)的方式被耦合到波导中。

15.根据权利要求1-13中任一项的方法，其特征是，包括以计时脉冲形式输入耦合激励光，并探测时间分辨的发光。

16.根据权利要求15的方法，其特征是，脉冲长度调节到1皮秒-100秒之间。

17.根据权利要求1-16中任一项的方法，其特征是，在一个或多个频率输入耦合具有调制的强度的激励光，并探测试样发光的最终相移和调制。

18.根据权利要求1-17中任一项的方法，其特征是，欲探测的试样是，蛋黄，血液，血清，血浆或尿液。

19.根据权利要求l-18中任一项的方法，其特征是，欲探测的试样是，表面水，土壤或植物提取物，  生物工艺发酵液或合成发酵液。

20.根据权利要求1-19的任一项方法的应用，该方法用于在亲和性测试中定量测定生化物质。

21.根据权利要求1-19的任一项方法的应用，其特征是，定量测定抗体或抗原。

22.根据权利要求1-119的任一项方法的应用，用于定量测定受体或配体，低核苷酸，DNA或RNA链，DNA或RNA类似物，酶，酶基质，酶辅因子或抑制剂，外源凝集素和碳水化合物。

23.根据权利要求1-19中任一项的方法的应用，用于选择性地定量测定光学混浊液中的发光成分。

24.根据权利要求1-23中任一项的方法测定发光辐射用的光学传感器平台(1)，其特征是，该平台基本上包括，一个平面光学透明的基底(5)，在基底上加上一层薄的波导层(4)，所述的传感器平台(1)设置用于输入耦合激励辐射的耦合光栅(2)，基底的折射率小于波导层(4)的折射率，其中所述波导层(4)的厚度小于激励辐射的波长λ，所述的波导层(4)由在激励光波长时折射率为＞1.8的材料组成，和传感器平台(1)，包括一个与第一耦合光栅(2)在空间上分开的第二耦合光栅(3)，用于把反向耦合到波导层内的荧光耦合出。

25.根据权利要求24的传感器平台，其特征是，波导层(4)的厚度上于λ/2。

26.根据权利要求24的传感器平台，其特征是，波导层(4)的厚度为40-160nm。

27.根据权利要求24的传感器平台，其特征是，光栅的调制深度为3-60nm。

28.根据权利要求24-27中任一项的传感器平台，其特征是，用于输入耦合激励辐射的第一耦合光栅(2)的光栅常数不同于用于耦合出发光辐射的第二耦合光栅(3)的光栅常数。

29.根据权利要求22-24中任一项的传感器平台，其特征是，光栅距离是B≤′X_1/e，其中，X_1/e是入射辐射的强度I0下降到I_o/e时的长度。

30.根据权利要求29的传感器平台，其特征是，光栅距离是B≥0.2·X_1/e。

31.根据权利要求24-30中任一项的传感器平台，其特征是，用于抑制基底发光的低折射率的中间层设置在基底(5)和波导层(4)之间。

32.根据权利要求31的传感器平台，其特征是，低折射率的中间层基本上由SiO₂或SiO_xC_YH_z组成。

33.根据权利要求31或32的传感器平台，其特征是，中间层的厚度是≤1000nm。

34.根据权利要求24-33中任一项的传感器平台，其特征是，采用有机微结构的基底。

35.根据权利要求24-34中任一项的传感器平台，其特征是，采用具有微结构有机涂层的有机基底。

36.根据权利要求22-35中任一项的传感器平台，其特征是，平面透明波导层(4)是由Ta₂O₅或TiO₂组成。

37.根据权利要求24-36中任一项的传感器平台，其特征是，在波导层(4)和试样之间存在粘合促进层。

38.根据权利要求37的传感器平台，其特征是，粘合促进层厚度为≤50nm。

Images