JPH102860A - 微小物質検鏡装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、観察対象の蛍光を長時間持続する
ことができる微小物質検鏡装置を提供する。 【解決手段】レーザ発振器２１とプリズム１８との間に
スリット２４１を形成した円板ディスク２４２を設け、
この円板ディスク２４２を回転することにより、プリズ
ム１８内の全反射面に照射されるレーザ光を断続させ、
ディシュ１６内側底面でのエバネッセント励起を断続し
て発生させる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、エバネッセント波
による蛍光を利用して微小物質の検鏡を行う微小物質検
鏡装置に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】従来、例えば、蛋白質やＡＴＰ（アデノ
シン３リン酸）などの１分子を観察する目的で、エバネ
ッセント波による蛋白質やＡＴＰの分子ごとの発蛍光を
観測する蛍光観察が用いられている。

【０００３】この場合、これら蛋白質やＡＴＰなどの試
料は、その試料粒子を蛍光ビーズに結合させてガラス基
板により挟むか、ガラス基板上に固定して２次元（平面
的）に分布した状態を実現し、この状態でエバネッセン
ト波を励起し、蛍光が試料から発せられることを利用し
て、試料粒子の特異性を強調させる蛍光観察を行うよう
にしている。

【０００４】ここで、試料粒子が結合される蛍光ビーズ
は、試料粒子と同等のサイズで、数ｎｍから数１０ｎｍ
のものが用いられる。また、エバネッセント照明は、レ
ーザ光を例えばプリズム内で全反射させると反射面の反
対側に励起される、いわゆるしみだし光を利用したもの
で、入射光の強さや入射角によってエバネッセントの場
の強さを決定しているが、ここでは基板面上から試料粒
子の高さに相当する領域にのみ蛍光励起能力を得られる
ようにしている。

【０００５】ところで、このような微小物質検鏡に用い
られる蛍光観察では、蛍光剤の褪色があり、観察可能な
時間には限界がある。この時間は、蛍光剤の量、励起光
の強さ、観察に用いる顕微鏡の明るさによって決まる
が、特に観察対象である試料粒子のサイズが大きけれ
ば、それだけ多くの蛍光剤で染色することができるの
で、発蛍光も明るく長時間持続できることにもなる。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】ところが、上述したよ
うに試料粒子のサイズが極めて小さいものの場合は、試
料粒子に対する蛍光剤の量は極めて少なく、褪色によっ
て短時間のうちに観察対象の蛍光が失われてしまう。

【０００７】このような場合、観察対象を他のものに変
更し、場合によっては合焦も取り直して観察を続けるよ
うにしているが、これら観察場所の変更や合焦などの準
備をする間にも、励起光の下では、他の観察対象につい
ても蛍光剤の褪色も進んでいるため、安定した蛍光観察
が得られないという問題があった。

【０００８】一方、例えば、筋肉収縮の基本単位の一つ
であるアクトミオシン系の機構では、ミオシン（蛋白分
子）のアクチンフィラメントを動かすエネルギーがＡＴ
Ｐの加水分解によるものとして、このＡＴＰの消費量を
観測することが行われているが、この観測において、ミ
オシン分子をcy5 で染色したような場合、１個のミオシ
ン分子を蛍光観察できる時間は、せいぜい６０秒程度と
されており、これではＡＴＰ消費量の観測には不十分
で、従来よりさらに長く蛍光を発し続ける方法の開発が
望まれている。本発明は、上記事情に鑑みてなされたも
ので、観察対象の蛍光を長時間持続することができる微
小物質検鏡装置を提供することを目的とする。

【０００９】

【課題を解決するための手段】請求項１記載の発明は、
エバネッセント波の照射による蛍光を利用して微小物質
の検鏡を行う微小物質検鏡装置において、前記微小物質
の存在場でのエバネッセント波の励起を断続的に行うよ
うにしている。

【００１０】請求項２記載の発明は、請求項１記載にお
いて、エバネッセント波の断続的な励起の時間間隔を可
変可能にしている。この結果、請求項１記載の発明によ
れば、蛍光寿命の短い１分子程度の観察対象でも、その
蛍光を長時間持続することができる。また、請求項２記
載の発明によれば、観察対象に応じて蛍光の持続時間を
任意に変えることができる。

【００１１】

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態を図面
に従い説明する。 （第１の実施の形態）図１は、本発明の微小物質検鏡装
置を正立型顕微鏡に適用した例を示している。図におい
て、１１は正立型顕微鏡のステージで、このステージ１
１には、エバネッセント照明装置１２を設けている。こ
の照明装置１２は、枠体１３を有し、この枠体１３をス
テージ１１に対しガイド１４により紙面と垂直方向に移
動可能にしている。

【００１２】このエバネッセント照明装置１２の枠体１
３は、その上面をステージ１１面と面一にしていて、後
述する対物レンズ１５に対向する部分に透穴１３１を形
成している。

【００１３】そして、この透穴１３１上にディシュ１６
を載置している。このディシュ１６には、蛋白質やＡＴ
Ｐなどの試料粒子が内側底面に固定または浮遊する水溶
液１７を収容している。この場合、蛋白質やＡＴＰなど
の試料粒子は、１個ごとにcy3 やcy5 などの蛍光剤で標
識されている。

【００１４】このディシュ１６は、ステージ１１のクレ
ンメル３４に保持され、図示左右方向に移動できるよう
にしている。なお、ディシュ１６の代わりに試料粒子を
スライドガラスとカバーガラスで挟むようにしたものを
用いてもよい。

【００１５】照明装置１２の枠体１３内で、透穴１３１
に対応する位置にエバネッセント照明用のプリズム１８
を保持している。この場合、プリズム１８とディシュ１
６との間には、マッチングオイル１９を介在させてい
る。このマッチングオイル１９は、プリズム１８に入射
される後述するレーザ光の全反射をプリズム１８の上面
またはディシュ１６の外側底面で発生させずに、ディシ
ュ１６の内側底面でのみ発生するようにするためのもの
である。

【００１６】また、エバネッセント照明装置１２の枠体
１３内には、支持台２０上に半導体レーザ発振器２１を
設けている。この半導体レーザ発振器２１は、所定のレ
ーザ光を発振するもので、このレーザ発振器２１より出
力されたレーザ光をレンズ２２を通しミラー２３で偏向
させてプリズム１８に入射するようにしている。この場
合、ディシュ１６がガラス製で、その屈折率Nd=1.42 、
水溶液１７の屈折率naq=1.33とすれば、ディシュ１６の
底面に対しプリズム１８を介して与えられるレーザ光の
入射角度をθ＝２０度以下とすれば、全反射を起こすこ
とが可能となり、これによって、ディシュ１６の内側底
面付近にエバネッセント場を生成してエバネッセント照
明をするようにしている。

【００１７】なお、エバネッセント照明装置１２の枠体
１３内部のプリズム１８から出たレーザ光が当たる部分
には、表面処理層３５を形成していて、レーザ光が乱反
射により迷光にならないようにしている。

【００１８】レンズ２２とミラー２３の間のレーザ光路
には、プリズム１８に入射されるレーザ光を断続するた
めの断続手段２４を設けている。この断続手段２４は、
図２（ａ）（ｂ）に示すように円周方向に等間隔に複数
（図示例では２個）のスリット２４１を形成した導電性
の円板ディスク２４２を軸２４４により支持台２４５に
回転自在に支持している。この場合、軸２４４は、先端
を尖らせたハブ２４３により支持台２４５に支持してい
て、円板ディスク２４２に摩擦抵抗の少ない滑らかな回
転が得られるようになっている。また、円板ディスク２
４２には、図２（ｃ）に示すようにディスク２４２面を
挟むようにコ字形の電磁石２４６、２４７を配置し、こ
れら電磁石２４６、２４７より円板ディスク２４２面を
垂直に透過する磁束により生ずるディスク２４２面の渦
電流により円板ディスク２４２に対する回転駆動力を得
るようにしている。

【００１９】そして、このような断続手段２４は、レン
ズ２２とミラー２３の間のレーザ光路に円板ディスク２
４２を配置し、円板ディスク２４２の回転にともなうレ
ーザ光路へのスリット２４１の挿脱動作により、プリズ
ム１８より全反射面に照射されるレーザ光を断続させ、
ディシュ１６内側底面でのエバネッセント場励起を断続
して発生させるようにしている。つまり、ディシュ１６
内側底面でのエバネッセント励起光を断続して発生させ
ることにより、単位時間当たりの励起強度を小さくでき
るようにしている。ちなみに、スリット２４１により９
０％の時間をカットし、１０％の時間のみレーザ光を通
過させれば、連続した場合に比べて、励起強度は１／１
０になる。

【００２０】図３は、レーザ発振器２１および断続手段
２４の制御回路を示している。この場合、レーザ発振器
２１には、コントローラ２５を接続している。このコン
トローラ２５は、電源２５１とレーザドライバ２５２を
有していて、このレーザドライバ２５２によりレーザ発
振器２１を起動してレーザ光を発生させるようにしてい
る。また、コントローラ２５の電源２５１には、周波数
変調器２６を接続し、この周波数変調器２６に断続手段
２４の電磁石２４６、２４７を接続している。

【００２１】この周波数変調器２６は、操作部２７の操
作に応じて出力の周波数を可変できるようにしたもの
で、この時の出力周波数により円板ディスク２４２面を
透過する磁束の時間変化率を可変することで、渦電流に
よる円板ディスク２４２の回転数を可変できるようにし
て、レーザ光の断続周期を変えられるようにしている。

【００２２】ここでは、周波数変調により円板ディスク
２４２の回転数を変えるようにしたが、電磁石２４６、
２４７に供給する電圧（電流）を可変することによって
円板ディスク２４２の回転数を変えることも可能であ
る。

【００２３】図１に戻って、ディシュ１６の水溶液１７
に対応して液浸タイプの対物レンズ１５を設けている。
この対物レンズ１５は、ディシュ１６の内側底面でのエ
バネッセント励起光による試料粒子の蛍光の状態を、透
過照明用光源３０よりコンデンサレンズ３１を通して与
えられる透過照明光により観察像として取り込み、さら
に鏡筒３２を通して撮像部３３に送り込み、試料粒子の
蛍光反応を観察できるようにしている。

【００２４】この場合、対物レンズ１５は、図示しない
レボルバに各種倍率のものが複数個設けられていて、所
望する倍率のものを選択できるようになっている。ま
た、対物レンズ１５は、上下方向に駆動可能にして焦点
を可変し、ディシュ１６の内側底面に合焦できるように
している。なお、合焦を得には、ステージ１１を上下方
向に駆動してもよい。

【００２５】しかして、このようにすれば、レーザ発振
器２１とプリズム１８との間にスリット２４１を形成し
た円板ディスク２４２を設け、この円板ディスク２４２
を回転することにより、プリズム１８内の全反射面に照
射されるレーザ光を断続させ、ディシュ１６内側底面で
のエバネッセント励起光を断続して発生させるようにし
たので、励起光の単位時間当たりの強度を小さくできる
ようになり、これにより、発光時間の短い１分子程度の
観察対象でも、その発蛍光を長時間持続することが可能
になって、長時間に渡っての試料観察を実現できる。

【００２６】また、エバネッセント照明装置１２の枠体
１３は、ステージ１１に対しガイド１４により紙面と垂
直方向に移動可能になっており、さらにステージ１１の
クレンメル３４にディシュ１６が保持され、図示左右方
向に移動できるようになっているので、枠体１３の移動
によりレーザ光のプリズム１８内での全反射位置を、対
物レンズ１５の光軸を含む紙面と垂直な面に沿って存在
させるようにすれば、その後は、クレンメル３４による
ディシュ１６の左右の移動だけで試料を対物レンズ１５
の光軸上に移動できるようになり、試料の観察位置であ
る対物レンズ１５の光軸上への位置出しを簡単にでき
る。

【００２７】なお、上述では、スリット２４１を有する
円板ディスク２４２を回転させるようにしたが、スリッ
ト２４１をレーザ光の光路上に固定し、ミラー２３の反
射面を照射角度が変わるように動かすようにしてもよい
（揺動運動）。この場合、ミラー２３の揺動運動は、揺
動運動機構を用いて自動的に行うようになる。また、ミ
ラー２３の代わりに複数のミラーを外周面に配置したポ
リゴンミラーを用い、各ミラー面が図示のミラー２３と
等価になるようにポリゴンミラーの回転軸を紙面に垂直
にして回転させても同様な効果が得られる。さらに、ス
リット２４１を有する円板ディスク２４２の回転に代わ
るものとしては、液晶シャッタも考えられる。液晶シャ
ッタでは、レーザ光を通過する時間と遮断する時間の比
を変化できるので、単位時間の蛍光強度を制御して蛍光
持続時間を可変できる。 （第２の実施の形態）図４は、第２の実施の形態の概略
構成を示すもので、図１と同一部分には、同符号を付し
ている。

【００２８】この場合、レンズ２２とミラー２３の間の
レーザ光路に、ＡＯＤ（Ａｃｏｕｓｔｉｃ Ｏｐｔｉｃ
ａｌ Ｄｅｖｉｃｅ）４１上に圧電体４２を接着してな
る走査手段４０を設け、圧電体４２を振動させて超音波
を発生させ、ＡＯＤ４１の超音波の場の中でスポット状
レーザ光の光路を曲げるようにすることで、プリズム１
８に入射されるレーザ光を走査するようにしている。

【００２９】この場合、圧電体４２による超音波の強さ
を制御可能とすれば、レーザ光の走査幅を変えることが
できるので、プリズム１８に入射されるレーザ光の断続
周期を変えることができる。また、ＡＯＤ４１上の圧電
体４２に対し直角方向に他の圧電体を接着させ、この他
の圧電体からも超音波を発生させてレーザ光を走査さ
せ、圧電体４２との走査を組み合わせて行うようにすれ
ば、２次元のラスター走査を行うこともできる。

【００３０】このようにしても、プリズム１８へのレー
ザ光を断続させ、ディシュ１６内側底面でのエバネッセ
ント励起光を断続して発生させるようにできるので、エ
バネッセント光の単位時間当たりの励起を短くして蛍光
の褪色を少なくすることができる。また、ＡＯＤ４１を
使用することでレーザ光の走査を、２次元走査で１００
回／秒程度の速さで行うことが可能になるので、試料の
蛍光の高速な変化や高速の移動にも追随することができ
る。

【００３１】従って、このようにしても第１の実施の形
態と同様な効果を期待でき、例えばビデオレート速度の
画像形成でも長時間に渡って観察を行うことができる。
また、ＡＯＤ４０自身の振動が少ないので、このような
ＡＯＤ４０を用いた断続手段４０が試料の近くに配置さ
れても、試料への振動の影響を少なくすことができる。

【００３２】以上、実施の形態について述べたが、本発
明中には以下の発明も含まれる。 （１）エバネッセント波の励起光をスリットを通して断
続させるようにしている。

【００３３】このようにすれば、蛍光寿命の短い１分子
程度の観察対象でも、その発蛍光を長時間持続すること
ができる。 （２）（１）において、スリットは、円板ディスクに設
けられ、該円板ディスクを回転することで励起光を断続
するようにしている。

【００３４】このようにすれば、安価な構成にして励起
光を断続できる。 （３）エバネッセント波の励起光をミラーの反射角度を
変えることで断続させるようにしている。

【００３５】このようにすれば、安価な構成にして励起
光を断続できる。 （４）（３）において、ミラーの反射角度の変更は、揺
動運動機構を用いて自動的に行うようにしている。

【００３６】このようにすれば、安価な構成にして励起
光を断続できる。 （５）（３）において、ミラーはポリゴンミラーで、該
ポリゴンミラーを回転駆動するようにしている。

【００３７】このようにすれば、ミラーの回転機構を簡
単にできる。 （６）エバネッセント波の励起光をスポット光の偏向断
続により断続させるようにしている。

【００３８】このようにすれば、蛍光寿命の短い１分子
程度の観察対象でも、その発蛍光を長時間持続すること
ができる。 （７）（６）において、スポット光の偏向走査にＡＯＤ
を用いるようにしている。このようにすれば、試料への
振動の影響を少なくできる。

【００３９】

【発明の効果】以上述べたように、本発明によれば、蛍
光寿命の短い１分子程度の観察対象でも、その発蛍光を
長時間持続することができる。また、観察対象に応じて
発蛍光の持続時間を任意に変えることができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の第１の実施の概略構成を示す図。

【図２】第１の実施の形態に用いられる断続手段の概略
構成を示す図。

【図３】第１の実施の形態に用いられる制御部の概略構
成を示す図。

【図４】本発明の第２の実施の形態の概略構成を示す
図。

【符号の説明】

１１…ステージ、 １２…エバネッセント照明装置、 １３…枠体、 １３１…透穴、 １４…ガイド、 １５…対物レンズ、 １６…ディシュ、 １７…水溶液、 １８…プリズム、 １９…マッチングオイル、 ２０…支持台、 ２１…半導体レーザ発振器、 ２２…レンズ、 ２３…ミラー、 ２４…断続手段、 ２４１…スリット、 ２４２…円板ディスク、 ２４３…ハブ、 ２４４…軸、 ２４５…支持台、 ２４６、２４７…電磁石、 ２５…コントローラ、 ２５１…電源、 ２５２…レーザドライバ、 ２６…周波数変調器、 ２７…操作部、 ３０…透過照明用光源、 ３１…コンデンサレンズ、 ３２…鏡筒、 ３３…撮像部、 ３４…クレンメル、 ３５…表面処理層、 ４０…走査手段、 ４１…ＡＯＤ、 ４２…圧電体。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 エバネッセント波による蛍光を利用して
   微小物質の検鏡を行う微小物質検鏡装置において、 エバネッセント波の励起を断続的に行うことを特徴とす
   る微小物質検鏡装置。
2. 【請求項２】 エバネッセント波の断続的な励起の時間
   間隔を可変可能にしたことを特徴とする請求項１記載の
   微小物質検査装置。