CN114994892A - 激光共聚焦显微成像系统和方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种激光共聚焦显微成像系统和一种激光共聚焦显微方法，激光共聚焦显微成像包括激光共聚焦扫描装置、显微物镜、荧光探测装置和控制装置，激光共聚焦扫描装置用于产生激光源，其具有基于MEMS驱动的扫描镜，显微物镜用于接收激光共聚焦扫描装置的出射光并引导该出射光照射到待测样品上，激发待测样品产生荧光信号；荧光探测装置用于将荧光信号转化为电信号并成像。扫描镜通过微机电系统实现出射光偏转角的调整，相较于传统的机械式扫描镜，MEMS扫描镜具有尺寸小、成本低、扫描频率高、响应速度快和功耗低等优点，可大幅提高扫描速度。解决了机械式光学扫描方式中振镜组旋转速度较慢，难以实现两维扫描的问题。

Description

激光共聚焦显微成像系统和方法

技术领域

本发明涉及显微镜技术领域，尤其涉及一种激光共聚焦显微成像系统。本发明还涉及一种激光共聚焦显微成像方法。

背景技术

本部分提供的仅仅是与本公开相关的背景信息，其并不必然是现有技术。

当今生命科学中的显微成像研究大约80％仍然使用光学显微镜，可以说生命科学的进步伴随着光学显微镜的发展。随着免疫荧光技术在生物学领域发挥着日益重要的作用，对于显微镜分辨率的需求也日益增加。传统的宽场照明荧光显微镜使用宽场光源，由于非焦面杂散光的存在，使得细微结构成像不够清晰。为排除非焦面杂散光对成像效果的干扰，进一步提高成像分辨率，激光聚焦显微成像技术应运而生。激光共聚焦显微镜利用激光束通过针孔形成点光源，在荧光标记标本的焦平面上逐点扫描，各采集点的光信号通过探测针孔到达光电倍增管，再经信号处理，在计算机上重构图像。

激光共聚焦显微成像技术依赖于扫描技术。最初激光共聚焦技术中使用的扫描技术是通过样品台的平行移动实现逐点扫描。该技术不改变照明光束入射的倾角，成像质量较好。但由于其扫描速度较慢，在激光共聚焦显微成像技术中已应用较少。目前激光共聚焦显微成像技术中应用较多的是光束扫描技术。光束扫描技术是指对激光光束方向精确控制以及定位的技术。传统的光束扫描一般采用机械式，如：复杂万向节、旋转平面反射镜、三棱镜等。该方式具有扫描效率高、视场广等优点。然而受限其体积和质量，该方式的定位精度差、扫描速度慢。目前在激光共聚焦显微成像领域应用较多的依然是机械式光束扫描技术，即通过振镜组的机械驱动式旋转，使得照明光束和扫描光斑的运动轨迹覆盖整个视野区域，但是在机械式光学扫描方式中振镜组旋转速度较慢，而且难以实现两维扫描，并且结构复杂，体积较大。

发明内容

本发明的目的是至少解决激光共聚焦显微成像系统扫描效率低、精度差并且结构复杂的问题。该目的是通过以下技术方案实现的：

本发明的第一方面提出了一种激光共聚焦显微成像系统，所述激光共聚焦显微成像包括：

激光共聚焦扫描装置，包括激光器、扫描镜和透镜组件，所述扫描镜包括扫描镜本体和微机电单元，所述扫描镜本体设置在所述激光器的出射光路上，所述微机电单元用于驱动所述扫描镜本体二维转动以改变所述扫描镜本体的出射光偏转角，所述透镜组件设置在所述扫描镜本体的出射光路上，所述透镜组件用于接收所述扫描镜的出射光并调制成平行光束照射到显微物镜的后口上；

显微物镜，用于接收所述平行光束并汇聚成光斑照射到待测样品上，激发待测样品产生荧光信号；

荧光探测装置，用于获取所述荧光信号，并将所述荧光信号转化为电信号并成像；

控制装置，分别与所述激光共聚焦扫描装置和所述荧光探测装置电连接。

根据本发明的激光共聚焦显微成像系统基于MEMS(微机电系统)，激光共聚焦显微成像系统的扫描镜通过微机电系统实现出射光偏转角的调整，相较于传统的机械式扫描镜，MEMS扫描镜具有尺寸小、成本低、扫描频率高、响应速度快和功耗低等优点，可大幅提高扫描速度。解决了机械式光学扫描方式中振镜组旋转速度较慢的问题，难以实现两维扫描的问题，加快了图像扫描速度。

另外，根据本发明的激光共聚焦显微成像系统，还可具有如下附加的技术特征：

在本发明的一些实施例中，所述微机电单元还包括多个静电驱动式微电机，所述静电驱动式微电机用于驱动所述扫描镜本体在二维方向旋转。

在本发明的一些实施例中，所述激光共聚焦扫描装置还包括扩束镜，所述扩束镜设置在所述激光器的出射光路上，并且所述扩束镜位于所述激光器和所述扫描镜之间。

在本发明的一些实施例中，所述透镜组件包括：扫描透镜和套筒透镜，所述扫描透镜设置在所述扫描镜的出射光路上，所述套筒透镜设置在所述扫描透镜的出射光路上，所述扫描透镜与所述套筒透镜组合使用，将所述扫描镜的平行出射光调制到显微物镜的后口。所述显微物镜将上述平行光束汇聚成光斑，照射到待测样品上。

在本发明的一些实施例中，所述扫描透镜的视场范围与所述扫描镜的出射光的照射范围相适应。

在本发明的一些实施例中，所述套筒透镜的视场范围与所述扫描透镜的出射光的照射范围相适应。

在本发明的一些实施例中，所述荧光探测装置包括光电探测器，所述光电探测器用于接收所述待测样品产生荧光信号。

本发明的第二方面提出了一种激光共聚焦显微成像方法，根据本发明第一方面提出的激光共聚焦显微成像系统实施，所述激光共聚焦显微成像方法包括以下步骤：

控制激光器发射激光；

控制微机电单元控制扫描镜接收所述激光并调节扫描镜的出射光偏转角；

控制荧光探测装置接收待测样品上产生的荧光信号，所述激光经所述扫描镜反射以及透镜组件入射至显微物镜的后口并汇聚成光斑，所述光斑照射到样品台的待测样品上，并激发待测样品产生所述荧光信号；

控制所述荧光探测装置将所述荧光信号转化成电信号并成像。

本发明第二方面提出的激光共聚焦显微成像方法，通过控制基于MEMS的激光共聚焦显微成像系统，实现对扫描镜的出射光偏转角的快速调整，进而实现对视野区域的快速扫描，避免使用机械方法改变照明光斑和扫描光斑的位置，加快了扫描的速度。

在本发明的一些实施例中，所述控制微机电单元调节扫描镜的出射光偏转角包括：

控制微机电单元调节扫描镜的出射光偏转角，使所述光斑沿成像要求的模式移动扫描样品。

附图说明

通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。而且在整个附图中，用相同的附图标记表示相同的部件。在附图中：

图1示意性地示出了根据本发明实施方式的激光共聚焦显微成像系统(荧光探测装置未示出)的结构示意图；

图2示意性地示出了根据本发明实施方式的经由扫描镜控制的照明光斑的扫描轨迹示意图；

附图标记如下：

10：激光器、20：扩束镜、30：扫描镜、40：扫描透镜、50：套筒透镜、60：显微物镜。

具体实施方式

下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。

应理解的是，文中使用的术语仅出于描述特定示例实施方式的目的，而无意于进行限制。除非上下文另外明确地指出，否则如文中使用的单数形式“一”、“一个”以及“所述”也可以表示包括复数形式。术语“包括”、“包含”、“含有”以及“具有”是包含性的，并且因此指明所陈述的特征、步骤、操作、元件和/或部件的存在，但并不排除存在或者添加一个或多个其它特征、步骤、操作、元件、部件、和/或它们的组合。文中描述的方法步骤、过程、以及操作不解释为必须要求它们以所描述或说明的特定顺序执行，除非明确指出执行顺序。还应当理解，可以使用另外或者替代的步骤。

尽管可以在文中使用术语第一、第二、第三等来描述多个元件、部件、区域、层和/或部段，但是，这些元件、部件、区域、层和/或部段不应被这些术语所限制。这些术语可以仅用来将一个元件、部件、区域、层或部段与另一区域、层或部段区分开。除非上下文明确地指出，否则诸如“第一”、“第二”之类的术语以及其它数字术语在文中使用时并不暗示顺序或者次序。因此，以下讨论的第一元件、部件、区域、层或部段在不脱离示例实施方式的教导的情况下可以被称作第二元件、部件、区域、层或部段。

为了便于描述，可以在文中使用空间相对关系术语来描述如图中示出的一个元件或者特征相对于另一元件或者特征的关系，这些相对关系术语例如为“内部”、“外部”、“内侧”、“外侧”、“下面”、“下方”、“上面”、“上方”等。这种空间相对关系术语意于包括除图中描绘的方位之外的在使用或者操作中装置的不同方位。例如，如果在图中的装置翻转，那么描述为“在其它元件或者特征下面”或者“在其它元件或者特征下方”的元件将随后定向为“在其它元件或者特征上面”或者“在其它元件或者特征上方”。因此，示例术语“在……下方”可以包括在上和在下的方位。装置可以另外定向(旋转90度或者在其它方向)并且文中使用的空间相对关系描述符相应地进行解释。

如图1和图2所示，本发明的第一方面提出了一种激光共聚焦显微成像系统，激光共聚焦显微成像包括：激光共聚焦扫描装置、显微物镜60和荧光探测装置和控制装置，激光共聚焦扫描装置包括激光器10、扫描镜30和透镜组件，扫描镜30包括扫描镜30本体和微机电单元，扫描镜30本体设置在激光器10的出射光路上，微机电单元用于驱动扫描镜30本体转动以改变扫描镜30本体的出射光偏转角，透镜组件设置在扫描镜30本体的出射光路上，透镜组件用于接收扫描镜30的出射光并调制成平行光束照射到显微物镜后口上；显微物镜60用于接收平行光束并汇聚成光斑照射到待测样品上，激发待测样品产生荧光信号；荧光探测装置用于将荧光信号转化为电信号并成像；控制装置分别与激光共聚焦扫描装置和荧光探测装置电连接。

可以理解的是，激光器10可选用常规的激光共聚焦显微成像系统的激光器10，扫描镜30是一种基于微机电系统(MEMS，Micro-Electro-Mechanical System)技术制作而成的微小可驱动反射镜；镜面直径较小，与传统的光学扫描镜30相比，具有重量轻，体积小，易于大批量生产，生产成本较低的优点，扫描镜30通过调整出射光偏转角来调节光路实现对待测样品的扫描，扫描镜30本体为镜体，在本发明中，微机电单元可采用静电驱动或者电磁驱动，控制装置通过微电机单元驱动扫描镜30本体转动，实现出射光偏转角的调整。透镜组件可根据实际需要设置多个透镜，以接收扫描镜30的出射光，并将出射光引导至显微物镜60的入射后口射入显微物镜60，进而汇集在待测样品上产生光斑，实现对待测样品进行扫描。

本发明的显微物镜60和荧光探测装置可选用常规荧光共聚焦显微物镜和常规荧光探测装置，荧光共聚焦显微镜的工作原理是采用点光源照射标本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜收集，并沿原照射光路回送到由二向色镜构成的分光器。分光器将荧光直接送到荧光探测装置。激光共聚焦扫描装置和荧光探测装置前方都各有一个针孔，分别称为照明针孔和探测针孔。相对于焦平面上的光点，两者是共轭的，即光点通过一系列的透镜，最终可同时聚焦于照明针孔和探测针孔。这样，来自焦平面的光，可以会聚在探测孔范围之内，而来自焦平面上方或下方的散射光都被挡在探测孔之外而不能成像。以激光扫描样品，荧光探测系统是激光共聚焦扫描装置的逆光路。成像的光斑被光电探测器接收，经过信号处理在计算机屏幕上聚合成清晰的待测样品的共聚焦图像。

根据本发明的激光共聚焦显微成像系统基于MEMS(微机电系统)，激光共聚焦显微成像系统的扫描镜30通过微机电系统实现出射光偏转角的调整，相较于传统的机械式扫描镜30，MEMS扫描镜30具有尺寸小、成本低、扫描频率高、响应速度快和功耗低等优点，可大幅提高扫描速度。解决了机械式光学扫描方式中振镜组旋转速度较慢的问题，难以同时实现两维扫描的问题，加快了图像扫描速度。

在本发明的一些实施例中，微机电单元还包括多个静电驱动式微电机，静电驱动式微电机用于驱动扫描镜30本体在二维方向旋转。静电驱动的原理是利用带点导体之间产生的静电吸引力，该力作用到扫描镜30本体上，在力矩的作用下进行扭转运动。静电驱动可通过平行板结构或者梳齿电极结构实现，平行板结构是在两个相距很近的平行金属板中间设置一层绝缘物质，实际应用中，上电极可移动，下电极固定。当驱动电压加载在两极板之间后，在库仑力的作用下，两极板相互吸引，可动电极向固定电极移动，当驱动电压消失后，可动电极恢复至平衡位置，可动电极的运动带动扫描镜30本体，实现驱动。

在本发明的一些实施例中，激光共聚焦扫描装置还包括扩束镜20，扩束镜20设置在激光器10的出射光路上，并且扩束镜20位于激光器10和扫描镜30之间。通过设置扩束镜20调节激光器10发出的激光的直径和发散角，使得激光被扫描镜30接收后能够通过一系列调制在待测样品上形成光斑。

在本发明的一些实施例中，透镜组件包括：扫描透镜40和套筒透镜50，扫描透镜40设置在扫描镜30的出射光路上，套筒透镜50设置在扫描透镜40的出射光路上，扫描透镜40与套筒透镜50组合使用，将扫描镜30的平行出射光调制到显微物镜60的后口。显微物镜60将入射光束汇聚成光斑照射到待测样品上。

具体地，为将扫描镜30的反射光束全部收集，扫描透镜40的视场范围与扫描镜30的出射光的照射范围相适应。

具体地，为将扫描透镜40的出射光斑全部收集，套筒透镜50的视场范围与扫描透镜40的出射光的照射范围相适应。

在本发明的一些实施例中，荧光探测装置包括光电探测器，光电探测器用于接收所述待测样品产生荧光信号。通过设置光电探测器提高对荧光信号的采集能力，加强检测的精度。

在本发明的一些实施例中，激光器10发射的激光波长与荧光待测标本所需波长相匹配，以激发样品发射荧光。

本发明的第二方面提出了一种激光共聚焦显微成像方法，根据本发明第一方面提出的激光共聚焦显微成像系统实施，激光共聚焦显微成像方法包括以下步骤：

控制激光器10发射激光；

控制微机电单元控制扫描经接收所述激光并调节扫描镜30的出射光偏转角；

控制荧光探测装置接收待测样品上产生的荧光信号，所述激光经所述扫描镜30反射以及透镜组件入射到显微物镜60的后口并汇聚成光斑，所述光斑照射到样品台的待测样品上，并激发待测样品产生所述荧光信号；

控制所述荧光探测装置将所述荧光信号转化成电信号并成像。

本发明第二方面提出的激光共聚焦显微成像方法，通过控制基于MEMS的激光共聚焦显微成像系统，实现对扫描镜30的出射光偏转角的快速调整，进而实现对视野区域的快速扫描，避免使用机械方法改变照明光斑和扫描光斑的位置，加快了扫描的速度。

在本发明的一些实施例中，控制微机电单元调节扫描镜30的出射光偏转角包括：

控制微机电单元调节扫描镜30的出射光偏转角，使所述光斑沿成像要求的模式移动扫描样品。

例如，如图2所示，图2中横竖坐标是位移距离，实线是照明光斑路径，扫描时先控制扫描镜30旋转以调整出射光偏转角，使待测样品上的光斑从(0,0)移动到(-0.1,-0.1)，然后沿Z字形移动，最后从(-0.1,0.1)回到(0,0)。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。

Claims (9)

1.一种激光共聚焦显微成像系统，其特征在于，所述激光共聚焦显微成像系统包括：

激光共聚焦扫描装置，包括激光器、扫描镜和透镜组件，所述扫描镜包括扫描镜本体和微机电单元，所述扫描镜本体设置在所述激光器的出射光路上，所述微机电单元用于驱动所述扫描镜本体转动以改变所述扫描镜本体的出射光偏转角，所述透镜组件设置在所述扫描镜本体的出射光路上，所述透镜组件用于接收所述扫描镜的出射光并调制到显微物镜的后口上成平行光束；

显微物镜，用于接收所述平行光束并汇聚所述平行光束形成光斑照射到待测样品上，并激发待测样品产生荧光信号；

荧光探测装置，用于获取所述荧光信号，并将所述荧光信号转化为电信号并成像；

控制装置，分别与所述激光共聚焦扫描装置和所述荧光探测装置电连接。

2.根据权利要求1所述的激光共聚焦显微成像系统，其特征在于，所述微机电单元包括多个静电驱动式微电机，所述多个静电驱动式微电机用于驱动所述扫描镜本体在二维方向旋转。

3.根据权利要求1所述的激光共聚焦显微成像系统，其特征在于，所述激光共聚焦扫描装置还包括扩束镜，所述扩束镜设置在所述激光器的出射光路上，并且所述扩束镜位于所述激光器和所述扫描镜之间。

4.根据权利要求1所述的激光共聚焦显微成像系统，其特征在于，所述透镜组件包括：扫描透镜和套筒透镜，所述扫描透镜设置在所述扫描镜的出射光路上，所述套筒透镜设置在所述扫描透镜的出射光路上，所述扫描透镜与所述套筒透镜组合使用，将所述扫描镜的平行出射光调制到所述显微物镜的后口。

5.根据权利要求4所述的激光共聚焦显微成像系统，其特征在于，所述扫描透镜的视场范围与所述扫描镜的出射光的照射范围相适应。

6.根据权利要求4所述的激光共聚焦显微成像系统，其特征在于，所述套筒透镜的视场范围与所述扫描透镜的出射光的照射范围相适应。

7.根据权利要求1至6任一项所述的激光共聚焦显微成像系统，其特征在于，所述荧光探测装置包括光电探测器，所述光电探测器用于接收所述待测样品产生的荧光信号，并将其转换为电信号。

8.一种激光共聚焦显微成像方法，根据权利要求1至7任一项所述的激光共聚焦显微成像系统实施，其特征在于，所述激光共聚焦显微成像方法包括以下步骤：

控制激光器发射激光；

控制微机电单元控制扫描镜接收所述激光并调节扫描镜的出射光偏转角；

控制荧光探测装置接收待测样品上产生的荧光信号，所述激光经所述扫描镜反射以及透镜组件入射至显微物镜的后口并汇聚成光斑，所述光斑照射到样品台的待测样品上，并激发待测样品产生所述荧光信号；

控制所述荧光探测装置将所述荧光信号转化成电信号并成像。

9.根据权利要求8所述的激光共聚焦显微成像方法，其特征在于，所述控制微机电单元调节扫描镜的出射光偏转角包括：

控制微机电单元调节扫描镜的出射光偏转角，使所述光斑沿成像要求的模式移动扫描样品。

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