JPH11503230A

JPH11503230A - 走査型プローブ及び走査型エネルギーが組み合わされた顕微鏡

Info

Publication number: JPH11503230A
Application number: JP8529485A
Authority: JP
Inventors: ケー．ハンスマ、ポール; ウォルターズ、デロン; エー．ヒルナー、パウル
Original assignee: THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CARIFORNIA
Current assignee: THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CARIFORNIA
Priority date: 1995-03-28
Filing date: 1996-03-20
Publication date: 1999-03-23
Also published as: WO1996030927A1; EP0818052A4; US5581082A; CA2213970A1; EP0818052A1

Abstract

(57)【要約】走査型プローブ及び走査型エネルギーの組み合わせ顕微鏡であって、同じ走査システムが走査プローブ画像及び走査エネルギー画像の両方に使用される。試料は走査型プローブ顕微鏡のプローブ（１４）及び走査型エネルギー顕微鏡の対物レンズ（１２）の間又は下のどちらかの水平な平面に沿って実質的に平行移動される。プローブ（１４）は形状的又は他の情報を収集する。対物レンズ（１２）はエネルギーの固定されたビームを試料上の小さな焦点（１６）に集束し、次に同焦点からエネルギーを収集して検出器（１８）に転送する。プローブ（１４）又は試料支持具（１０）に連結された垂直平行移動装置（２２）はこれらを近くに維持するために必要な垂直移動を提供する。２つの顕微鏡により生成された画像は互いに実質的に直接的に位置合わせされる。本発明は、試料を平行移動する原子力及び共焦レーザ走査型組み合わせ顕微鏡によっても例示されている。

Description

【発明の詳細な説明】走査型プローブ及び走査型エネルギーが組み合わされた顕微鏡本発明は、米国国立科学財団によって与えられた許可番号ＤＭＲ−９１２３０４８号、ＤＭＲ−９２２１６３７号及びＤＭＲ−９２２１７８１号のもとに、合衆国政府の援助を得て発明された。合衆国政府は本発明についてある権利を有する。発明の背景本発明は、走査型プローブ顕微鏡（ＳＰＭ）及び走査型エネルギー顕微鏡を組み合わせた顕微鏡に関する。特定の実施の形態において、この組み合わせには、試料の表面のトポグラフィーの２次元画像を得るために使用される原子力顕微鏡、及び試料の表面又は断面からの蛍光放射光又は反射光の２次元画像を得るために使用される共焦レーザー走査型顕微鏡が含まれる。走査型プローブ顕微鏡法は、原子力顕微鏡（ＡＦＭ）（走査力顕微鏡（ＳＦＭ）とも呼ばれる）及び走査トンネル顕微鏡（ＳＴＭ）の使用を含み、前者は力（ force）に依存し、後者は量子トンネル効果に依存して、原子サイズ（０．１ナノメーター）からセルサイズ（２０マイクロメーター）の形質を写像する。両顕微鏡はプローブをモニター及び制御するためのフィードバックシステム、プローブに関して試料をラスタ模様に移動するための機械走査システム（通常圧電式）、及び測定データを画像に変換するディスプレイシステムを使用する。ＡＦＭでは、プローブは柔らかいカンチレバースプリングの上に取り付けられた鋭いチップであり、試料の表面に接触又は非常に接近させられる。カンチレバーの偏向を関知するための手段が提供される。フィードバック増幅器がピエゾに加える電圧は、試料の表面の形質の高さを測定するためのメジャーである。ＡＦＭの一般的な議論として、ルガー（Ｒugar）及びハンスマ（Ｈansma）の“Ａtomic Ｆorce Ｍicroscopy”,Ｐhysics Ｔoday43,23-30(Ｏctober,1990)を参照し、その内容は本明細書中に参考として組み込まれる。光検出スキームは（例えばセグメント光ダイオードへの偏向）ビーム偏向、及び干渉法を含む。他の検出スキームは、ＡＦＭカンチレバーに埋め込まれた圧電抵抗ひずみセンサを使用する（トートネス（Ｔortonese）らの“Ａtomic Ｒesolution with an Ａtomic Ｆorce Ｍicrosco pe Ｕsing Ｐiezoresistive Ｄetection”,Ａppl.Ｐhys.Ｌett.62,(8),834-836( Ｆebruary 22,1993)参照。この内容は、本明細書に参考として組み込まれる）。ＡＦＭは、空気中及び液体中においても操作することができる（ハンスマらの再発行特許第３４，４８９号：“Ａtomic Ｆorce Ｍicroscope Ｗith Ｏptional Ｒeplaceable Ｆluid Ｃell”を参照。当該特許の内容は本明細書中に参考として組み込まれる）。また、全走査サイクルの間に表面をカンチレバーのチップに接触させる代わりに、プローブが試料を走査するときにプローブと試料との間隔を調整して各変調サイクルの極値でのみプローブを表面に軽く当てて摩擦力を最小限にとどめる操作のタップモード（ハンスマらの“Ｔapping Ｍode Ａtomic Ｆorce Ｍicroscopy in Ｌiquids”,Ａppl.Ｐhys.Ｌett.64,(13),1738-1740(Ｍa rch 28,1994)を参照。この内容は本明細書中に参考として組み込まれる）を使用することができる。ＡＦＭは表面を写像するためだけでなく、表面の分子を処理するためにも使用されてきた。カンチレバーのチップの垂直移動は、２セグメントのフォトダイオードを用いて反射ビームの変位を感知することによって検出される。フィードバックループはチップの垂直方向の偏向を維持するので、チップが表面に加える力はｘｙｚ平行移動装置を用いて表面を上下に移動させることによって一定に保たれる（ウィーゼンホーン（Ｗiesenhorn）らの“Ｉmaging and Ｍanipulating Ｍ olecules on a Ｚeolite Ｓurface with an Ａtomic Ｆorce Ｍciroscope”,Ｓc ience,247,1330-1333(Ｍarch 1990)参照）。走査型エネルギー顕微鏡法は、共焦レーザー走査型顕微鏡法（ＣＬＳＭ）などの共焦走査型光学顕微鏡法（ＣＳＯＭ）を含む集束エネルギー及び超音波顕微鏡などの他の集束エネルギー方法を用いたあらゆる走査手段を広く含む。ＣＬＳＭにおいて、試験片はレーザー光の回折制限スポット、及び試験片の焦点内の（焦点の合った、Ｉn-focus）照明体積要素（voxel）により透過若しくは反射された光によって走査されるか、又は、入射光によってその試験片の中で励起した蛍光放射光が光検出器上に集束される。開口（たいていエアリーディスク画像よりわずかに直径が小さい）は検出器の正面の画像平面に配置され、その位置は試験片の焦点内のvoxelに共焦する位置（焦点と呼ぶこともできる）、即ち特に共焦顕微鏡では焦点である。焦点からの光は検出器の開口を通過し、焦平面の上下のあらゆる領域からの光は検出器にほとんど届かないように開口平面で集束をずらされて実質的に共焦画像に何の影響も与えないようにする。焦点外（out of focus）のぶれを減少することによって得られる光学的仕分け法（optical sectioning）によって、３次元の断層撮影が可能になる（ショットン（Ｓhotton）の“Ｃonfo cal Ｓcanning Ｏptical Ｍicroscopy and its Ａpplication for Ｂiological Ｓpecimens”,Ｊ.Ｃell Ｓci.94,175-206(1989)を参照。この内容は本明細書中に参考として組み込まれる）。共焦顕微鏡法は表面の輪郭を測定するために使用されてきた（ハミルトン及びウィルソンの“Ｓurface Ｐrofile Ｍeasurement Ｕsing the Ｃonfocal Ｍicroscope”,Ｊ.Ａppl.Ｐhys.53(7),5320-5322(Ｊuly 1982)を参照。この内容は本明細書中に参考として組み込まれる）。超音波顕微鏡法についての記載については、クオート（Ｑuate）の“Ａcoustic Ｍicroscop y”,Ｐhysics Ｔoday 38,34-40(1985)を参照する。この内容は本明細書中に参考として組み込まれる。走査型プローブ顕微鏡法及び走査型エネルギー顕微鏡法は両方とも、生物学的試料の写像において成功を収めてきた。これらは典型的には試料について異なる情報を収集するので、共焦顕微鏡及び走査型プローブ顕微鏡は生産上組み合わせられてきた。初期の参考としてエンゲル（Ｅngel）らの“Ｓcanning Ｓensor Ｍ icroscopy of Ｂiological Ｍembranes”,Ｐroceedings of the ＸIIth Ｉntern ational Ｃongress for Ｅlectoron Ｍicroscopy,Ｓan Ｆrancisco Ｐress,Ｉnc .,108-109(1990)（この内容は本明細書中に参考として組み込まれる）は、蛍光走査型共焦顕微鏡法のために備えられた高分解能光顕微鏡と組み合わされた走査型センサー顕微鏡について記載している。イオンをピックアップするために絶縁されたＳＴＭチップ及びピペット、並びに窒化シリコンＡＦＭカンチレバーが静止試料毎に使用されていた。共焦顕微鏡にＳＦＭ又はＳＴＭを組み合わたものについては、シャベルト（Ｓchabert）らの“Ｃonfocal Ｓcanning Ｌaser-Ｓcann ing Ｐrobe Ｈybrid Ｍicroscope for Ｂiological Ａpplications”,Ｕltramic roscopy 53,147-157(1994)に記載されており、この内容は本明細書中に参考として組み込まれる。試料は静止している。共焦顕微鏡はＳＦＭ又はＳＴＭから独立しており、反射及び蛍光データを用いて共焦画像を得るために検流計ミラーを用いる。ＡＦＭ及びＣＬＳＭ画像を同時に得るためにＣＬＳＭと組み合わされて空気中及び水中の試料の両用に使用される独立のＡＦＭが、プットマン（Ｐutman）らの“Ａtomic Ｆorce Ｍicroscopy Ｃom bined with Ｃonfocal Ｌaser Ｓcanning Ｍicroscopy:a new look at cells”, Ｂioimaging 1,63-70(1993)に記載されており、この内容は本明細書中に参考として組み込まれる。ここでも試料は静止しており、プローブが移動する。空気中又は液体中のどちらかで操作されるＡＦＭ及び簡単な蛍光顕微鏡の組み合わせが、プットマンらの“Ｐolymerized ＬＢＦilms Ｉmaged with a Ｃombined Ａto mic Ｆorce Ｍicroscope-Ｆluorescence Ｍicroscope”,Ｌangmuir8(10),3014-3 019(1992)に記載されており、この内容は本明細書中に参考として組み込まれる。プットマン（1992）の文献においては、対象物を選択して平行移動ステージを用いてＡＦＭチップに移動し、写像することができる。試料は走査される間静止している。同様の装置がヘンダーソンらの“Ｉmaging Ｆ-Ａctin in Ｆixed Ｇl ial Ｃells with a Ｃombined Ｏptical Ｆluorescence/Ａtomic Ｆorce Ｍicro scope,Ｎeuroimage,1145-1501(1993)に記載されており、この内容は本明細書中に参考として組み込まれる。従来の組み合わせＡＦＭ−ＣＬＳＭ装置において、ＡＦＭは通常“独立型”設計であって、共焦（照明されて検出された）スポットが試料を通して探索し、試料は走査されない。このアプローチの欠点は、焦点内のvoxelがＡＦＭプローブを走査するための手段から独立していることである。焦点内のvoxelを走査するための手段は一般的に、ＡＦＭプローブを走査するための手段とは異なる走査範囲及び異なる非線型性を有する（例えばシャベルトらのsupraの図６を参照）。従って、位置合わせして別々の画像間の特徴を比較することがしばしば困難である。このアプローチの更なる欠点は、ＡＦＭ画像及び共焦画像の両方の走査サイズが限られていることである。例えば光梃子検出を用いた独立型ＡＦＭの走査範囲は、カンチレバーを光学的に追跡するための方法がなければ、１０ミクロンのオーダーで非常に限られている。この問題を回避するために光学追跡を用いた設計が導入された。しかし、個々に走査された焦点内のvoxelの走査範囲は、顕微鏡の対物レンズの視野（倍率１００×の対物レンズでは直径２００μｍの範囲）に厳しく制限される。軸外光学収差は更に対物レンズの全視野の使用を妨げることさえある。発明の概要本発明の走査型プローブ及び走査型エネルギー組み合わせ顕微鏡は、プローブと焦点内のvoxelとを固定させたまま試料を走査方向に移動させることができる試料走査方法を用いて先述の問題を緩和する。光学カンチレバー追跡は必要ではなく、焦点内のvoxelを顕微鏡の対物レンズの中央に置くことができる。走査範囲は走査するハードウェアが許す限り大きくてもよい。例えば圧電中継器は片側で３００μｍ四方まで試料を走査することができる。プローブが焦点内のvoxel に配置されるとき、走査プローブ画像及び共焦画像は直接位置合わせされ、画像特徴が容易に補正することができるようにする。プローブが焦点内のvoxelからわずかに横にずれて配置されても、画像はまだ実質的に位置合わせされた状態であり、簡単な調整のみが必要である。走査プローブ及び共焦画像は同時又は連続的に得ることができる。本発明の走査型プローブ及び走査型エネルギー組み合わせ顕微鏡は、２つの主な動作モード（平面写像及び表面追跡）を提供するので、本発明でなければなしえない主な機会を提供する。平面写像では、試料は各画像毎にのみｘ−ｙ平面で移動する。従って、共焦顕微鏡は従来と同じように、焦点が当てられた特定のｚ値で試料のスライスを写像する。このモードでは、走査型プローブ顕微鏡チップは試料がプローブの下で移動するときにｚ軸に沿って垂直に移動する。走査型プローブ顕微鏡は、画像の各ポイントで試料の高さｚを記録する。試料は異なるｚ値に焦点を合わせられた共焦顕微鏡で再び写像されてもよく、また従来と同様に断層撮影のコンピュータ再成によって３次元画像が構成される。これは、数ある効果のなかでもとりわけ、走査型プローブ顕微鏡より得た高分解能画像に位置合わせされた表面の光学解像画像を提供する。視像は、走査型プローブ顕微鏡を用いた高分解能写像のために、蛍光ラベルを用いて（例えばタンパク質集合の）位置を表すことができる。これは、複雑な表面の走査型プローブ顕微鏡画像において一般的な、何がどこに写像されたかをはっきり識別するという問題を解決するのに役立つ。表面追跡は、走査型プローブ顕微鏡のチップを表面に接触させて一定の高さに保持することによって達成することができる。走査型プローブ顕微鏡は、試料のトポグラフィを決定することができるので、プローブと焦点内のvoxelの両方が試料の表面についていくように試料を移動させることが可能である。これは、走査型プローブ顕微鏡としてＡＦＭを使用し、試料を垂直移動装置に乗せ、写像中に試料をｘ−ｙ平面を水平に移動する時にｚ軸方向に垂直に試料を移動させるスキャナにフィードバック電圧を加えてＡＦＭカンチレバーの一定の偏向を維持することによって達成することができる。共焦顕微鏡の焦点はチップの先端の真下に合わせられる。試料の移動によりチップの下で表面が走査されるときには当該チップは静止しているので、共焦顕微鏡の焦点は表面に常に合わせられる。従って、複数のスライスからの画像を再成する必要なく、１回の通過で表面上にあるものの画像を提供する。トポグラフィ情報は共焦画像から失われるが、走査型プローブ画像により高分解能で得られるであろう。全ての情報を記録する１つのコンピュータは、走査型プローブ顕微鏡からのトポグラフィ画像上にその表面上にあるものについての共焦情報を有する組み合わせ画像を位置合わせして組み合わせた画像を表示することができる。同様に、焦点内のvoxelを用いて走査型プローブ顕微鏡のチップの下の様々な距離Δｚで追加の追跡画像を得ることができる。これらの各画像は、表面の下の距離Δｚのところに何があるかを明らかにする。１群の画像は複雑な物質、例えば生物学的物質の表面の下にあるものについての情報を距離Δｚの関数として提供する。各画像がリアルタイムで現れるので、この情報は複雑な３次元再構成からよりもより直接的に得られ、観察者には例えば特定の層が表面からどれくらい下にあるかが直接分かる。共焦顕微鏡のみを用いて試料の表面を追跡するための他の方法が提唱された（ハミルトン及びウィルソンのsupraを参照）。しかし、本発明の方法は、（ａ）画像の各ポイントでの垂直移動のサイクルを通じて移動することなく走査の移動が表面に直接ついていくことができ、且つ（ｂ）反射試料だけでなく蛍光試料のプローブに使用することができるため、優れている。例えば、この写像方法は、蛍光免疫ラベル方法（fluorescent Ｉmmunolabeling）用いて細胞の表面上のタンパク質の研究をする生物学者にとって非常に価値のあるものである。本発明の走査型プローブ及び走査型エネルギー組み合わせ顕微鏡は、走査されるべき表面を有する試料を支持するための支持具、試料の表面に接触又は非常に近接するように配置されるプローブ、試料の表面上またはその下の空間寸法が１０μｍ未満の焦点にエネルギーを収集するための例えば対物レンズなどの手段、及び焦点から反射、透過、又は蛍光放射されたエネルギーを検出するための手段を含む。プローブと焦点は位置合わせされ、試料はプローブ及び対物レンズに関して水平平面に沿って実質的に平行移動されて、実質的に位置合わせされた走査型プローブ顕微鏡画像及び走査型エネルギー顕微鏡画像を生成する。好適な実施の形態において、走査型プローブ顕微鏡はＡＦＭであり、走査型エネルギー顕微鏡はＣＬＳＭである。特定の実施の形態において、試料はプローブと対物レンズとの間を平行移動する。他の実施の形態においては、例えば試料が集束エネルギーに対して不透明である場合、試料はプローブ及び対物レンズの両方の下を平行移動する。プローブと焦点は、軸上に揃えられるか又は小さなオフセットだけ横に分けられることができる。焦点を試料の表面に合わせて移動させるために、試料の支持具は試料の表面の高さを示すプローブからのフィードバックにより制御されるｚ平行移動圧電部材によって垂直に動かされ、プローブと焦点を試料の表面上又はそのすぐ近くに維持する。焦点を有する平面写像では、プローブは試料の表面の高さを示すプローブからのフィードバックにより制御されるｚ平行移動圧電部材によって垂直に動かされる。オプショナルで、プローブと焦点との垂直方向の距離を調節するために焦点をプローブ及び試料と別個に垂直に平行移動させることができる。また、オプショナルで、プローブ及び焦点を同時に又は縦並びに垂直移動させることもできる。また、オプショナルで、焦点及びプローブを試料の平面に沿って別々に平行移動させることもできる。他の特定の実施の形態において、プローブはプローブと試料との相互作用により摩擦発光エネルギーを生成し、これを共焦走査型エネルギー顕微鏡で検出する。更に他の実施の形態において、走査型エネルギー顕微鏡によって生成されたエネルギーはＡＦＭのカンチレバーにより検出された超音波信号である。或いは、走査型プローブ顕微鏡は走査トンネル顕微鏡であり、当該顕微鏡が検出するエネルギーは走査型エネルギー顕微鏡の焦点より生じた光電流である。図面の説明各図面について以下簡単に記載する。幾つかの要素、特に走査型プローブチップは明確に示すために大げさに記載されている。図１は、本発明の走査型プローブ及び走査型エネルギー組み合わせ顕微鏡の一般的形態の簡略図であり、試料は走査型プローブと対物レンズとの間の平面に沿って走査される。図２は、本発明の好適な実施の形態の原子力及び共焦レーザー走査型組み合わせ顕微鏡の概略図である。図３は、図２の顕微鏡の対物レンズのカンチレバーチップ及び集束端の拡大概略図であり、平面写像モードを示す。図４は、図２の顕微鏡の対物レンズのカンチレバーチップ及び集束端の拡大概略図であり、表面追跡モードを示す。図５は、発明の他の実施の形態の原子力及び共焦レーザー走査型組み合わせ顕微鏡の概略図であり、試料は走査プローブ及び対物レンズの両方の下の平面に沿って走査される。図６は、図５の組み合わせ顕微鏡のチップ及び対物レンズの拡大図である。図７ａ及び図７ｂは、図５の組み合わせ顕微鏡のチップの位置の水平方向に異なる位置、それぞれ軸上及び軸外の位置を表す。図８は、本発明の更に他の実施の形態の原子力及び共焦レーザー走査型組み合わせ顕微鏡の概略図である。図９は、図８の組み合わせ顕微鏡のＣＬＳＭ要素で写像したポリマー化ＰＣＡフィルムの表面を表す。図１０は、図８の組み合わせ顕微鏡のＡＦＭ要素で写像したポリマー化ＰＣＡフィルムの表面を表す。発明の詳細な説明本発明の走査型プローブ及び走査型エネルギー組み合わせ顕微鏡の基本的な要素は、図１の簡略図に描かれている。この実施の形態において、試料をのせた透明試料支持具１０は走査型エネルギー顕微鏡の対物レンズ１２と走査型プローブ顕微鏡のプローブ１４との間に配置されている。圧電中継器などのスキャナは、対物レンズ１２が光（又は他のエネルギー）を試料上のスポット１６に集束しているときｘ−ｙ平面に沿って水平に試料を走査し、放射、反射又は蛍光によって光又はエネルギーをこの焦点１６から放射させる。この放射された光若しくはエネルギーは、同じ対物レンズ１２によって収集され、検出器１８に透過される。走査型プローブ顕微鏡のプローブ1４と試料の表面２０との間を近くに保つために、この近接を制御することができる垂直平行移動装置が２２でプローブに、又は試料支持具１０に、又はこれら両方に取り付けられる。焦点１６を垂直に平行移動する手段を有する必要はないが、２４にこのような手段があれば、この器具のある用途においては価値があるであろう。対物レンズによって集束されたエネルギーは図示されたようなレーザー源２６からの光であってもよく、又は他のエネルギー源からのエネルギーであってもよい。例えば、超音波検出器で検出することのできる超音波信号であってもよい。エネルギー顕微鏡もまた、例えば試料との摩擦発光作用によってプローブが生成するエネルギー信号を検出するために使用されてもよい。また、エネルギー顕微鏡が生成する信号を検出するためにプローブを使用してもよい。例えばＳＴＭはＣＬＳＭの焦点からの光による光電流を検出することができる。例えば圧電管、ピエゾスタック、又は電わい要素を用いてｘ−ｙ平面に沿って水平方向へと同時にｚ軸に沿った方向へも試料を移動することができる。機械的位置決め装置（図示せず）によってだいたいの位置合わせが可能である。オプショナルで、走査型エネルギー顕微鏡はプローブと焦点とをｘ−ｙ平面に沿って水平に走査するための手段を含んでも良い。必要であれば、これにより、走査型プローブ及び走査型エネルギー顕微鏡のコンポーネントは試料を移動することなく、例えば組み合わせ走査の間に使用される試料平行移動手段の可能な制限、例えば走査速度の制限を避けて、画像を得ることができる。図２は、本発明の好適な実施の形態における原子力及び共焦レーザー走査型組み合わせ顕微鏡を表す。透明な支持具１０に含まれる試料は、例えば接着剤で互いに直角に固定されたピエゾスタック３０、３２、３４（それぞれｘ、ｙ及びｚ方向への平行移動を提供する）からなる３軸平行移動装置２８によって走査される。ピエゾスタックの代わりに、圧電管又は電わい要素（これらは全て当技術においてよく知られている）を使用することができる。ピエゾスタック３０、３２及び３４は従来型設計であり、ワイヤで１００ＶのＤＣ電圧源に接続されており、電極によりピエゾスタックに接続されている。ピエゾスタック３０、３２、３４の構造、その配線、及び電圧源への接続は当技術においてよく知られており、それ自体は本発明の部分ではないので、ここには表さない。走査型プローブ顕微鏡は、光梃子としてモジュール３６内に保持されるカンチレバー３８を含むＡＦＭである。カンチレバー３８の偏向は、フォーカスレンズ４４を通してレーザーダイオード４２からのレーザー光４０でこれを照明し、反射光４６を分割フォトダイオード検出器４８上に収集することにより、測定される。カンチレバー３８は、試料の表面に接触するための例えばダイヤモンド、シリコン、又は窒化シリコンでできた硬い先の尖ったチップ５０を保持する、例えば窒化シリコンからできた柔らかいバネである。カンチレバーモジュールの構造及び操作、走査チップ及び光梃子を含むＡＦＭの詳細は当技術においてよく知られており、それ自体は本発明の部分ではないので、ここには表さない。試料及び原子力顕微鏡の両方は、３軸機械平行移動装置５２、５４上にそれぞれ取り付けられており、ｘ軸アジャスター５６、５８、ｙ軸アジャスター６０、６２、ｚ軸アジャスター６４、６６によって位置合わせされる。カンチレバーモジュール３６は、ｚ軸のピエゾ試料スキャナ３４と同じように構成及び配線されることができるピエゾスタック６８によってｚ軸に沿って垂直に平行移動する。追加のピエゾ要素６９（例えばスタック又は二態様（bimorph））は、プローブと試料の間の間隔を調節し、プローブを各変調サイクルの極値でのみ試料と接触させる。このような変調を用いた走査型プローブ顕微鏡の操作は当技術においてよく知られており、それ自体は本発明の部分ではないので、ここには表さない。走査型エネルギー顕微鏡はレーザー源７２からの光ビーム７０を用いたＣＬＳＭであり、この光ビーム７０はレンズ７４によって集束されてピンホール７８を有する光バリヤ７６を介して再コリメートレンズ８０に通過する。ここから光ビームは光学フィルタ８２を通ってビームスプリッタ８４に達し、対物レンズ８６を通って焦点８８を形成する。この焦点８８が当該装置の焦点である。組み合わせ顕微鏡アセンブリのためのハウジングは、試料を保持する支持プレート９０、機械平行移動装置５２及びＡＦＭ機械平行移動装置５４を有し、及び焦点８８を試料上又は試料の中の所望の位置に当てるように対物レンズ８６を調節するための開口９２を有する。試験片の焦点内の照明されたvoxelによって透過又は反射された光ビーム７０（又は入射光ビームによってvoxel内で励起した蛍光放射）は、対物レンズ８６及びビームスプリッタ８４を通って逆戻りして透過する。次にフィルタ９４及びレンズ９６を通ってピンホール１００を有する光バリヤ９８を通過し、検出器１０２まで達する。ピンホール７８及び１００は、対物レンズの焦点８８と共役である。レーザー源７２に関連するバリヤ７６及びピンホール７８は、光ビームの空間強度のプロファイルを向上させる役目を果たす。検出器１０２に関連するバリヤ９８のピンホール１００の直径は、エアリーディスク画像の直径よりも僅かに小さい。このピンホール１００は、検出器１０２の正面の画像平面に、焦点内のvoxelに共焦となるように調節可能な位置で配置される。焦点からの光はピンホール７８を通過し、焦平面の上下のあらゆる領域からの光はほとんどが検出器１０２に達しないようにバリヤ９８で集束をずらされ、これにより共焦画像に実質的に何も影響を与えない。３次元断層撮影を可能にするのは、焦点外のぶれを減少させることにより得られる光学的仕分け法である。レーザー７２に関連するフィルタ８２は、入射レーザー光７０のみを通過させるように選択された帯域通過フィルタである。検出器１０２に関連するフィルター９４はオプショナルであって、これも試料からの適切な蛍光照明のみを通過するように選択された帯域通過フィルタである。ビームスプリッタ８４は、レーザー光ビーム７０の短波を反射し、試料から放射された長波、例えば蛍光照明のみを透過させるダイクロイックビームスプリッタであってもよい。或いは、ビームスプリッタ８４は、部分的に銀被膜鏡であってもよい。共焦顕微鏡がオンであるとき、機械平行移動装置５２及び５４は、ＡＦＭ及びＣＬＳＭ画像が直接位置合わせされて得られるようにカンチレバーのチップ５０を焦点８８に位置合わせして配置するために使用される。カンチレバーのチップ５０と焦点８８との位置合わせを補助するために、オプショナルで接眼レンズ１０４及びプリズム１０６アセンブリが提供される。これらは検出器１０２に関連するホール１００の直前のポイントで反射又は放射された光ビームの光路の内外にスライドすることができる。図示されていないが、ＡＦＭに流体を保持する流体セルを装備することができ、この流体セルはカンチレバー３８を囲んで試料の表面の頂部を覆い、カンチレバーのチップ５０によって試料をプローブする。チップ５０と試料との間に液体を用いてカンチレバーにより試料に加えられる圧力を減少する。異なる液体を用いれば走査型プローブの特徴を変えることができる。図３は、ＡＦＭ及びＣＬＳＭの組み合わせ顕微鏡の操作の平面写像モードを表す。ここでは、共焦顕微鏡がその焦点が合わせられる特定のｚ値で試料１０８のスライスを写像するように、試料１０８は各画像毎にｘ−ｙ平面においてのみ移動する。このモードでは、試料１０８がｘ−ｙ平面に沿ってチップ５０の下を移動するときにカンチレバーのチップ５０はｚ軸に沿って垂直に移動する。ＡＦＭは画像の各ポイントで試料の高さを記録する。試料は、ＣＬＳＭの焦点を異なるｚ値で合わせて断層撮影法の数学的再構成により３次元画像を組み立てて、同時に写像される、又は再写像されることができる。この結果、ＡＦＭからの高分解能画像に表面の光学解像画像が位置合わせされる。図４は、ＡＦＭ及びＣＬＳＭの組み合わせ顕微鏡の操作の表面追跡モードを表している。ここでは、試料が各画像毎にｘ−ｙ平面において移動するのに加えてｚ軸に沿って垂直に移動するときに、カンチレバーのチップ５０は表面に接触して一定の高さに保たれ、プローブと焦点が試料の表面をたどる。ＣＬＳＭの焦点はチップの頂点の真下に合わせられる。試料の移動によって表面がチップの下で走査されるときにチップは静止したままであるため、ＣＬＳＭの焦点は常に同じ Δｚに合わせられる。チップ５０の下の様々な距離にレーザーの焦点を当てて追加の追跡画像を得ることができる。リアルタイムで得た一群の画像は、Δｚの関数として複雑な物質の表面の下にあるものについての情報を提供するであろう。更に、垂直ピエゾ平行移動装置６８（図２）にディザリングａｃ電圧を加えることによって、又はピエゾ要素６９（図２）に変調電圧を加えることによって、ＡＦＭをタッピングモードで操作することができる。チップが試料を走査するときにチップと試料の間隔が変調され、各変調サイクルの極値でのみチップを表面に軽く当てて摩擦力を最小限にとどめる。フィードバック増幅器がピエゾに加える電圧は、試料の表面上の形質の高さを測るためのメジャーである。このような処理は、ハンスマらの supraに記載されている。図５は、図２に似ているが、ＣＬＳＭがＡＦＭと同じ側に配置されていて試料がカンチレバーチップ１１０と対物レンズ１１２との両方の下の平面に沿って走査されるような、本発明の他の実施の形態を図示している。このような同側装置は、不透明な試料に対して有効である。構成要素は図２と同じであるが、試料の上でＣＬＳＭの配置を調整することが必要である。長使用距離の対物レンズが使用され、光梃子は使用されず、ハウジング支持プレート１１４に開口を開ける必要はない。むしろ、ＡＦＭカンチレバー１１６は例えばトートネス（Ｔortonese ）らのsupraに記載されたような圧電抵抗カンチレバーである。圧電抵抗エレメント１１８からのフィードバックは、図２の光梃子より得られたのと同じようなカンチレバーチップ１１０についてのｚ軸情報を提供する。図６、７ａは、図５の同側ＡＦＭ−ＣＬＳＭ装置の対物レンズ／カンチレバー／試料領域の拡大図を表す。図６では、対物レンズ１１２はレーザー光ビーム１２０を試料１２６の表面１２４上の焦点１２２に集束し、カンチレバーのチップ１１０を図７ａにも図示したように焦点１２２の軸上に正確に配置する。図７ｂにおいて、カンチレバーチップ１１０は軸から僅かにずれている、即ち焦点１２２の軸よりオフセットされている。このオフセットによって、ＣＬＳＭに対するカンチレバーチップ１１０による干渉を完全に排除するが、ＡＦＭ画像とＣＬＳＭ画像との間がオフセットされる。しかし、このオフセットは小さくしかも分かるので、これらを補うことができる。この装置のためには、使用距離の長い再帰対物レンズを使用すると効果的である。光軸に沿って光のアクセスを遮断する第二のミラーに一般的な不利益は、いずれにしろカンチレバーがこのアクセスを遮断するので問題ではない。図８を参照すると、更に他の実施の形態が表されている。試料１２８は全長１７．５ｃｍのブーム３２によってｘｙ−圧電管３２スキャナ（Ｊ−スキャナ、デジタルインストルメント、カリフォルニア州サンタバーバラ）に取り付けられている。このブームは、壁の薄いステンレススチール管材より形成され、第二のｚ −圧電管１３４（Ｊ−スキャナより）を組み込んで試料に対して垂直移動を提供する。ｚ−スキャナはＣＬＳＭの対物レンズの残りの部分の上のスライドプレート（図示せず）によって支持され、センタリング調節が可能である。走査電圧は、走査型プローブ顕微鏡コントローラ（ナノスコープIII、デジタルインストルメント）によって提供される。３００μｍまでの領域がアクセス可能である場合、１００μｍの走査サイズが最も有効である。これはセンタリング調節にそれほど困難ではなく、共焦分解能に匹敵するピクセルサイズを提供する。走査速度は、ライン１本についきたいてい１秒である（トレース及び再トレース両方で、２５６本又は５１２本のラインの画像を再現する）。走査速度が速いとブーム１３２の最低強制振動モードが励起して画像を周期的に歪める可能性がある。標準のシリコン窒化物ＡＦＭカンチレバー１４０が試料の上に取り付けられている。このカンチレバー１４０の偏向は、従来技術の走査スタイラスＡＦＭからなる光梃子システム１４２によって測定される。ハンスマらの“ＡＮew Ｏptic al-Ｌever Ｂased Ａtomic Ｆorce Ｍicroscope,”Ｊ.Ａppl.Ｐhys.76,796-799( Ｊuly 15,1994)を参照（この内容は本明細書中に参照として組み込まれる）。このＡＦＭは赤色ダイオードレーザー、ｘ、ｙ、ｚ、ピエゾ及びレンズ系を含み、このレンズ系はカンチレバーがｘ、ｙ、ｚピエゾによって移動されたときでもカンチレバー１４０上に光の焦点を維持する。ここで、ｘ、ｙ、ｚ、ピエゾのｚ部分は、図２の垂直ピエゾ平行移動装置６８の部分で述べたように使用されることができる。前記ｘ、ｙ、ｚ、ピエゾのｘ、ｙ、ｚ、部分は、−２２０〜＋２２０ボルトのｄｃ電圧を加えることによって焦点上にカンチレバーのチップを正確に配置するために使用することができる。光の焦点はカンチレバー１４０の裏に当てられて、２セグメントのフォトダイオード１４４に反射される。ダイオードレーザ及びフォトダイオードでの赤色ポリカーボネイトフィルタは、散光によって生じるＡＦＭ画像のアーチファクト（artifact）を低減する。試料１２８の高さは、ｚ−ピエゾを用いて試料のトポグラフィを追跡して調節される。平らな試料の場合、その効果は“プレインフィット（planefit）”と似ており、ＡＦＭ画像から残った試料の傾斜を取り除き、測定可能な範囲内にカンチレバー１４０の偏向を維持する。試料表面の追跡も、全視野を横切って共焦光学を最も鋭い角度に維持する。ＡＦＭカンチレバーはＣＬＳＭシステムの焦点に位置合わせされる。その光学トレーンは次のようである：偏光１５ｍＷアルゴン−イオンレーザ（オムニクロム（Ｏmnichrome）、カリフォルニア州チノ）；直径２５μｍのピンホールを有する空間周波数フィルター；Ｎ．Ａ．０．０９の可変減衰器を有する再コリメートレンズ；５１２／１０ｎｍの帯域フィルタ（クロマ、ベルモント州ブラットルボロ（Ｂrattleboro））；５２５ｎｍのカット−オフダイクロイックミラー（クロマ）；１００Ｘ／Ｎ．Ａ．１．３０の油浸対物レンズ（ゼイス（Ｚeiss）、ドイツ国ベッツラー（Ｗetzlar））。試料からの蛍光放射は同じ対物レンズによって集束され、ダイクロイックミラーを通過する。この蛍光放射は５６０／６０ｎｍの帯域フィルタ（クロマ）によってクリーニングされ、この帯域フィルタは励起レーザ光及びＡＦＭレーザ光を両方とも除去する。蛍光放射は、次に標準の倍率１０の接眼レンズ（ゼイス）によって写像されて最初の位置合わせがされるか、又は空間周波数フィルター及びＰＭＴ（ハママツ、日本国床岡村）に送られてＣＬＳＭ写像が行われる。空間周波数フィルタはＮ．Ａ．０．０１６のレンズ及び５０μｍのピンホールを含む。ＰＭＴからの信号は差動増幅器（ＰＡＲ、ニュージャージー州プリンストン）によって増幅され、ＡＦＭ画像に関連する走査型プローブ顕微鏡によって記録される。簡単な圧電管スキャナはその端部を平行に保たないので走査された領域が球面状に湾曲する。この球は、試料１２８と圧電管１３０との間のブーム１３２の長さ又は形状にかかわらず、圧電管１３０上にだいたいセンタリングされる。試料が走査曲線の中心１４４からオフセットされた場合、この試料は走査中かなりの垂直移動にさらされる。(ψ)が走査角度であり、ｚ(ψ)が垂直移動距離であり、ｘ(ψ)が水平走査距離であり、ｒが走査曲線の半径であり、ｄが走査曲線と写像軸との間のオフセットであるとすると、となる。走査型プローブ顕微鏡コントローラをｘ(ψ)の項で較正すると仮定するとψを除いてが垂直方向の試料移動として得られる。これはＡＦＭによって完全に平らな試料の上にみられる“試料プロファイル”でもある。この実施の形態において考慮されるこの写像技術は、大きな垂直移動の余裕がない。ＡＦＭカンチレバー１３６の最大測定可能偏向は、２００〜３００ナノメーターであり、焦点の深度は同等である。試料を垂直に移動させてそのトポグラフィを追跡する（μｍ）。実際に使用するときに１００μｍの走査サイズが必要であれば、ｄ／ｒは＜０．０４でなければならい。過度に長いブーム１３２（及び過度に低いその共鳴振動数）を用いずにこれを達成するために、圧電ｘｙ管１３０は、１００μｍの走査では図８の破線１４６によって表された写像軸の９ｍｍ以内にセンタリングされなければならない。レーザー走査サイズがより大きければ、それに比例して正確にセンタリングする必要がある。この発明を用いた結果は、他の方法よりも優れている。これを表すために、１０，１２−ペンタコサジイノイックアシド（pentacosadiynoic acid,ＰＣＡ）のラングミュア・ブロジエットフィルムを使用した。クロロホルム中ＰＣＡ１ｍｇ／ｍｌの溶液を、水（蒸留したＭilliＱ、ミリポア（Ｍillipore）マサチューセッツ州ベッドフォード）の下の底に幾つかのカバーガラス及び顕微鏡スライドを横たわらせたラングミュア−トロフ(ミュンヘントロフ、ドイツ国ミュンヘン)の空気／水の界面で拡散した。ＰＣＡ層を、約25ｍＮ/ｍの圧力に圧縮され、約30 秒間又はＰＣＡフィルムがピンク色に変わってポリマー化されたことを示すまで、4.5ｍＷ/ｃｍ²の短波紫外線を用いて洗浄した。ピンセットを用いてＰＣＡフィルムを通してカバーガラス及び顕微鏡スライドを水平に持ち上げ、空気乾燥した。これらを写像のためにスーパーグルーゲル（Ｓuper Ｇlue Ｇel、デブコン（Ｄevcon）、イリノイ州ウッドデール）を用いてブーム１３０に取り付けた。画像は同時又は連続的に収集することができる。図９及び図１０は、それぞれＣＬＳＭ及びＡＦＭの両方を用いて写像したときのポリマー化されたＰＣＡフィルムを表す。フィルムは多結晶であり、それぞれ異なる方向に一群の平行亀裂を表す各領域を有する。ＡＦＭはこれらの亀裂を非常に良く解析する。事実、その分解能はピクセルサイズ１９５ｎｍよりも良い。走査サイズが小さければ、このより高い分解能を利用することができるであろう。ＡＦＭもまたフィルムの表面上の直径約１μｍのバンプに応答する。ＣＬＳＭは分解能が低い（約300ｎｍ）ので、これはフィルムの光学的性質をプローブする。ポリマー化されたＰＣＡからの蛍光放射の収量は、入射光の偏光とフィルムの多結晶軸との間の角度に依る（ゲットゲン（Ｇoettgen）らの“Ｍolecular Ｏ rder In Ｐolymenzable Ｌangmuir‐Ｂlodgett Ｆilms Ｐrobed by Ｍicrofluor escence and Ｓcanning Ｆorce Ｍicroscopy.”Ｌangmuir ８,1768-1774(1992) を参照）。これは図９の異なる領域の可変輝度で可視化される。最も明るい領域は、先述の結果（プットマンら、1992，supra）と同じように偏光方向に平行に位置合わせされた亀裂を有する。画像の位置合わせは先述の結果より良い。フィルムの左上の穴を比較してみる（両画像の暗い部分）。オフセット（約4.5μｍ）はＡＦＭカンチレバーチップと焦点との間の僅かなずれによるものである。このような僅かなオフセットは、試料の蛍光動作を変えるようにチップが直ぐ近くにあることが期待される場合は実際に有効であろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ウォルターズ、デロンアメリカ合衆国 93117 カリフォルニア州ゴレタエルコレジオナンバー 346エー 6750 (72)発明者ヒルナー、パウルエー. ドイツ連邦共和国デー10115 ベルリンインバリデンシュトラーセ 110 フンボルト−ウニベルスィタートベルリンフィズィクフォンマクロモレケレンインスティテュトフューアフィジク

Claims

【特許請求の範囲】１．走査型プローブ及び走査型エネルギー組み合わせ顕微鏡であって、走査されるべき表面を有する試料を支持するための支持体と、前記試料の表面に接触若しくは非常に近接するように配置されるプローブと、エネルギーを前記試料で焦点に集束して前記焦点から反射若しくは透過されたエネルギーを検出するための手段と、前記プローブと前記焦点とを位置合わせするための手段と、前記プローブ及び前記集束手段に関して水平な平面に実質的に沿って前記試料を平行移動し、実質的に位置合わせされた走査型プローブ顕微鏡画像及び走査型エネルギー顕微鏡画像を生成するための手段と、を含む、走査型プローブ及び走査型エネルギー組み合わせ顕微鏡。２．前記平面が前記プローブと前記収束手段との間にある、請求項１の組み合わせ顕微鏡。３．前記平面が前記プローブ及び前記収束手段の下にある、請求項１の組み合わせ顕微鏡。４．前記プローブ及び前記焦点がほぼ軸上に位置合わせされた、請求項１に記載の組み合わせ顕微鏡。５．前記プローブ及び前記焦点が小さなオフセットにより左右に分離された、請求項１に記載の組み合わせ顕微鏡。６．前記焦点が前記試料において１０マイクロメーター未満の空間寸法を有する、請求項１に記載の組み合わせ顕微鏡。７．前記焦点が前記試料の表面の下にある、請求項１に記載の組み合わせ顕微鏡。８．前記焦点が前記試料の表面上にある、請求項１に記載の組み合わせ顕微鏡。９．前記プローブを前記平面に垂直に平行移動させるための手段を含む、請求項１に記載の組み合わせ顕微鏡。１０．前記焦点を前記平面に平行移動させるための手段を含む、請求項１に記載の組み合わせ顕微鏡。１１．前記プローブを前記平面に平行移動させるための手段を含む、請求項１０に記載の組み合わせ顕微鏡。１２．前記プローブが試料の表面の高さを示す信号を生成し、前記走査中に前記試料の表面の高さの信号に応じて前記プローブ及び焦点を前記試料の表面上又はそのすぐ近くに維持するフィードバック手段を含む、請求項１１に記載の組み合わせ顕微鏡。１３．前記信号応答手段が前記試料を前記平面に垂直に平行移動するための手段を含む、請求項１２に記載の組み合わせ顕微鏡。１４．前記信号応答手段が前記プローブ及び焦点を縦並びに平行移動するための手段を含む、請求項１２に記載の組み合わせ顕微鏡。１５．前記焦点を前記平面に沿って平行移動するための手段を含む、請求項１に記載の組み合わせ顕微鏡。１６．前記プローブを前記平面に沿って平行移動するための手段を含む、請求項１に記載の組み合わせ顕微鏡。１７．エネルギーを集束及び検出するための前記手段が前記プローブにより生成されたエネルギーを検出することが可能である、請求項１に記載の組み合わせ顕微鏡。１８．前記プローブ生成エネルギーが、前記プローブと前記試料との相互作用により生じた摩擦発光エネルギーを含む、請求項１７に記載の組み合わせ顕微鏡。１９．前記プローブが、前記エネルギー集束手段により生成されたエネルギーを検出することが可能である、請求項１に記載の組み合わせ顕微鏡。２０．前記走査型プローブ顕微鏡が原子力顕微鏡であり、前記エネルギーが超音波信号である、請求項１９に記載の組み合わせ顕微鏡。２１．前記走査型プローブ顕微鏡が走査トンネル顕微鏡であり、前記生成されたエネルギーが光電流である、請求項１９に記載の組み合わせ顕微鏡。２２．前記プローブ及び前記集束手段を前記平面に沿った方向及び前記平面に垂直な方向の両方に機械的に移動させることによって前記プローブ及び集束手段の少なくともおよその位置合わせを行うための手段を含む、請求項１に記載の組み合わせ顕微鏡。２３．前記平行移動手段がＸ及びＹの平行移動圧電部材を含む、請求項１に記載の組み合わせ顕微鏡。２４．前記プローブを前記平面に垂直に平行移動するための前記手段が圧電部材を含む、請求項９に記載の組み合わせ顕微鏡。２５．前記焦点を前記平面に垂直に平行移動するための前記手段が圧電部材を含む、請求項１０に記載の組み合わせ顕微鏡。２６．前記試料を前記平面に垂直に平行移動するための前記手段が圧電部材を含む、請求項１３に記載の組み合わせ顕微鏡。２７．前記エネルギーが光であり、前記集束手段が対物レンズである、請求項１に記載の組み合わせ顕微鏡。２８．前記走査型エネルギー顕微鏡が共焦顕微鏡である、請求項２７に記載の組み合わせ顕微鏡。２９．前記走査型プローブ顕微鏡が前記プローブを構成するチップを有するカンチレバーを含む原子力顕微鏡である、請求項１に記載の組み合わせ顕微鏡。３０．前記原子力顕微鏡が、前記カンチレバーの偏向を測定するための光梃子検出手段を含む、請求項２９に記載の組み合わせ顕微鏡。３１．前記プローブ及び前記焦点を位置合わせするための前記手段が正確な位置合わせのための少なくとも１つのピエゾ要素を含む、請求項１に記載の組み合わせ顕微鏡。３２．原子力及び走査型共焦組み合わせ顕微鏡であって、走査されるべき表面を有する試料を支持するための支持体と、前記試料の表面に接触するように配置されるチップを有するカンチレバーを含む原子力顕微鏡と、前記試料でレーザー光を１０マイクロメーター未満の空間寸法の焦点上に集束する対物レンズ及び前記焦点から反射した又は透過した光を検出するための手段を含む共焦レーザー走査型顕微鏡と、前記チップと前記焦点とを位置合わせするための手段と、及び前記チップ及び前記対物レンズに関して水平平面に沿って前記試料を実質的に平行移動することによって実質的に位置合わせされた原子力顕微鏡画像及び共焦顕微鏡画像を生成するための手段と、を含む、原子力及び走査型共焦組み合わせ顕微鏡。３３．前記平面が前記チップと前記対物レンズとの間にある、請求項３２に記載の組み合わせ顕微鏡。３４．前記平面が前記チップ及び前記対物レンズの下にある、請求項３２に記載の組み合わせ顕微鏡。３５．前記チップ及び焦点がほぼ軸上に位置合わせされた、請求項３２に記載の組み合わせ顕微鏡。３６．前記チップ及び焦点が小さなオフセットによって縦に分離された、請求項３２に記載の組み合わせ顕微鏡。３７．前記焦点が前記試料の表面の下にある、請求項３２に記載の組み合わせ顕微鏡。３８．前記焦点が前記試料の表面上にある、請求項３２に記載の組み合わせ顕微鏡。３９．前記チップを前記平面に垂直に平行移動するための手段を含む、請求項３２に記載の組み合わせ顕微鏡。４０．前記焦点を前記平面に垂直に平行移動するための手段を含む、請求項３２に記載の組み合わせ顕微鏡。４１．前記チップを前記平面に垂直に平行移動するための手段を含む、請求項４０に記載の組み合わせ顕微鏡。４２．前記チップが試料の表面の高さを示す信号を生成し、走査中に前記試料の表面の高さの信号に応答して前記チップ及び焦点を前記試料表面上又は非常に近くに維持するためのフィードバック手段を含む、請求項４１に記載の組み合わせ顕微鏡。４３．前記信号応答手段が前記試料を前記平面に垂直に平行移動するための手段を含む、請求項４２に記載の組み合わせ顕微鏡。４４．前記信号応答手段が前記チップ及び焦点を縦並びに平行移動するための手段を含む、請求項４２に記載の組み合わせ顕微鏡。４５．前記平面に沿って前記焦点を平行移動するための手段を含む、請求項３２に記載の組み合わせ顕微鏡。４６．前記平面に沿って前記チップを平行移動するための手段を含む、請求項３２に記載の組み合わせ顕微鏡。４７．前記光検出手段が前記チップと前記試料との相互作用により生じた摩擦発光エネルギーを検出することが可能である、請求項３２に記載の組み合わせ顕微鏡。４８．前記原子力顕微鏡及び前記共焦レーザー走査型顕微鏡を前記平面に沿った方向及び前記平面に垂直方向の両方に機械的に移動することによって前記チップ及び集束手段の少なくともおよその位置合わせを行うための手段を含む、請求項３２に記載の組み合わせ顕微鏡。４９．前記平行移動手段がＸ及びＹ平行移動圧電部材を含む、請求項３２に記載の組み合わせ顕微鏡。５０．前記チップを前記平面に垂直に平行移動するための前記手段が圧電部材を含む、請求項３９に記載の組み合わせ顕微鏡。５１．前記焦点を前記平面に垂直に平行移動するための前記手段が圧電部材を含む、請求項４０に記載の組み合わせ顕微鏡。５２．前記試料を前記平面に垂直に平行移動するための前記手段が圧電部材を含む、請求項４３に記載の組み合わせ顕微鏡。５３．前記原子力顕微鏡が前記カンチレバーの偏向を測定するための光梃子検出手段を含む、請求項３２に記載の組み合わせ顕微鏡。５４．流体を収容するための前記プローブの周りに流体セルを形成するための手段を含み、前記カンチレバーがその中に沈められた、請求項３２に記載の組み合わせ顕微鏡。５５．前記チップと前記焦点とを位置合わせするための前記手段が正確な位置合わせのための少なくとも１つのピエゾ要素を含む、請求項３２に記載の組み合わせ顕微鏡。５６．実質的に位置合わせされた走査型プローブ顕微鏡画像及び走査型エネルギー顕微鏡画像を生成する方法であって、走査されるべき表面を有する試料を支持するステップと、前記試料の表面に接触するように又は非常に近くにプローブを配置するステップと、エネルギー生成手段からのエネルギーを前記試料で焦点に集束し、前記焦点から反射した又は透過した光を検出するステップと、前記プローブと前記焦点とを位置合わせするステップと、及び前記プローブ及び前記集束手段に関して水平平面に沿って前記試料を実質的に平行移動することによって実質的に位置合わせされた走査型プローブ顕微鏡画像及び走査型エネルギー顕微鏡画像を生成するステップと、を含む、実質的に位置合わせされた走査型プローブ顕微鏡画像及び走査型エネルギー顕微鏡画像の生成方法。５７．前記平面が前記プローブと前記集束手段との間にある、請求項５６に記載の方法。５８．前記平面が前記プローブ及び前記集束手段の下にある、請求項５６に記載の方法。５９．前記プローブ及び焦点がほぼ軸上に位置合わせされた、請求項５６に記載の方法。６０．前記プローブ及び焦点が小さなオフセットによって縦に分離された、請求項５６に記載の方法。６１．前記走査型プローブ顕微鏡画像及び走査型エネルギー顕微鏡画像が同時に生成される、請求項５６に記載の方法。６２．前記試料での前記焦点の空間寸法が１０マイクロメーター未満である、請求項５６に記載の方法。６３．前記焦点が前記試料の表面の下にある、請求項５６に記載の方法。６４．前記焦点が前記試料の表面上にある、請求項５６に記載の方法。６５．前記プローブが前記平面に垂直に平行移動される、請求項５６に記載の方法。６６．前記焦点が前記平面に垂直に平行移動される、請求項５６に記載の方法。６７．前記プローブが前記平面に垂直に平行移動される、請求項６６に記載の方法。６８．前記プローブが試料の表面の高さを示す信号を生成し、前記走査動作の間、信号に応答して前記プローブ及び焦点を前記試料の表面上又は非常に近くに維持するステップを含む、請求項６７に記載の方法。６９．前記信号に応答して前記試料を前記平面に垂直に平行移動するステップを含む、請求項６８に記載の方法。７０．前記プローブ及び焦点を前記信号に応答して縦並びに平行移動するステップを含む、請求項６８に記載の方法。７１．前記プローブにより生成されたエネルギーが前記エネルギー走査手段によって検出される、請求項５６に記載の方法。７２．前記検出されたエネルギーが、前記プローブと前記試料との相互作用により生じた摩擦発光エネルギーである、請求項７１に記載の方法。７３．前記エネルギー集束手段により生成されたエネルギーが前記プローブにより検出される、請求項５６に記載の方法。７４．前記走査型プローブ顕微鏡が原子力顕微鏡であり、前記エネルギーが超音波信号である、請求項７３に記載の方法。７５．前記走査型プローブ顕微鏡が走査トンネル顕微鏡であり、前記生成されたエネルギーが光電流である、請求項７３に記載の方法。７６．前記エネルギーが光であり、前記集束手段が対物レンズである、請求項５６に記載の方法。７７．前記走査型エネルギー顕微鏡が共焦顕微鏡である、請求項７６に記載の方法。７８．前記走査型プローブ顕微鏡が前記プローブを構成する走査チップを有するカンチレバーを含む原子力顕微鏡である、請求項５６に記載の方法。７９．前記カンチレバーの偏向が光梃子検出手段によって測定される、請求項７８に記載の方法。８０．前記プローブ及び前記焦点が正確な位置合わせのための少なくとも１つのピエゾ要素を含む手段によって位置合わせされる、請求項５６に記載の方法。８１．実質的に位置合わせされた原子力顕微鏡画像及び走査型共焦顕微鏡画像を生成するための方法であって、走査されるべき表面を有する試料を支持するステップと、前記試料の表面に接触するように又はその非常に近くに原子力顕微鏡のカンチレバーチップを配置するステップと、共焦レーザー走査型顕微鏡の対物レンズを用いてレーザー光を前記試料で焦点に集束し、前記焦点から反射した又は透過した光を検出するステップと、前記チップと前記焦点とを位置合わせするステップと、及び前記チップ及び前記対物レンズに関して水平平面に沿って前記試料を実質的に平行移動することによって実質的に位置合わせされた原子力顕微鏡画像及び共焦顕微鏡画像を生成するステップと、を含む、実質的に位置合わせされた原子力顕微鏡画像及び共焦顕微鏡画像の生成方法。８２．前記平面が前記チップと前記対物レンズとの間にある、請求項８１に記載の方法。８３．前記平面が前記チップ及び前記対物レンズの下にある、請求項８１に記載の方法。８４．前記チップ及び焦点がほぼ軸上に位置合わせされた、請求項８１に記載の方法。８５．前記チップ及び焦点が小さなオフセットにより分離された、請求項８１に記載の方法。８６．前記原子力顕微鏡画像及び共焦顕微鏡画像が同時に生成される、請求項８１に記載の方法。８７．前記試料において前記焦点が１０マイクロメーター未満の空間寸法である、請求項８１に記載の方法。８８．前記焦点が前記試料の表面の下にある、請求項８１に記載の方法。８９．前記焦点が前記試料の表面上にある、請求項８１に記載の方法。９０．前記チップが前記平面に垂直に平行移動される、請求項８１に記載の方法。９１．前記焦点が前記平面に垂直に平行移動される、請求項８１に記載の方法。９２．前記チップが前記平面に垂直に平行移動される、請求項９１に記載の方法。９３．前記チップが試料の表面の高さを示す信号を生成し、前記走査動作の間信号に応答して前記チップ及び焦点を前記試料の表面上又はその非常に近くに維持するステップを含む、請求項９２に記載の方法。９４．前記信号に応答して前記試料を前記平面に垂直に平行移動するステップを含む、請求項９３に記載の方法。９５．前記信号に応答して前記チップ及び焦点を縦並びに平行移動するステップを含む、請求項９３に記載の方法。９６．その走査動作の間に前記チップによって生成されたエネルギーが前記共焦走査型顕微鏡により検出される、請求項８１に記載の方法。９７．前記検出されたエネルギーが前記プローブと前記試料との相互作用により生じた摩擦発光エネルギーである、請求項９６に記載の方法。９８．前記チップ及び前記焦点が正確な位置合わせのための少なくとも１つのピエゾ要素を含む手段によって位置合わせされる、請求項８１に記載の方法。