JP2006133499A - 共焦点スキャナ及び共焦点顕微鏡 - Google Patents

Abstract

【課題】 複数光束の同時走査を行う際の振動の問題を解消するとともに、観察したい領域のみに光を照射することで蛍光色素の劣化等を軽減する。
【解決手段】 光源１からの出射光は集光光学系２により波長選択フィルタ３及びダイクロイックミラー４を介して、多数のマイクロミラーが２次元状に配列されたＭＥＭＳミラーアレイ５に集光される。各マイクロミラーの角度に応じて複数の特定箇所の反射光のみが対物レンズ６に送られ試料８に集光されるから、マイクロミラーをピンホールとして利用することができる。各マイクロミラーの傾斜角度が順次変化するように走査することにより、試料８上で複数の光ビームの照射位置が移動するように走査を行うことができる。
【選択図】 図１

Description

本発明は、試料を極小のスポットで照明するとともにそのスポットの位置を走査する共焦点スキャナ、及び該共焦点スキャナを具備する共焦点顕微鏡に関し、更に詳しくは、共焦点スキャナ及び共焦点顕微鏡の光学系に関する。

共焦点顕微鏡は従来の一般的な光学顕微鏡と比べて、観察像のコントラストが良好で鮮明な画像が得られる、分解能が高い、試料の断面像等３次元方向の画像が得られる、といった特徴を有している。共焦点顕微鏡の基本的な構成としては、光源から出射した光を小径のピンホールを通すことでその光径を制限し、対物レンズを介して試料上の一点に集光させる。その集光位置で発生した反射光や蛍光は入射光の光路を逆に辿るように対物レンズを通り、ビームスプリッタやダイクロイックミラーなどで折り曲げられて観察側のピンホールに集光される。そして、そのピンホールを通過した光が検出器に導入され、検出器は試料上の焦点位置付近のごく狭い範囲の情報のみを検出信号として出力する。

試料上の所定領域の画像情報を得るためには、試料上で光の当たる位置を走査（スキャン）する必要がある。走査方法として、従来一般的には、試料を載置したステージ自体を移動させる方法と、試料の位置は固定して例えばガルバノミラー等を用いて光束を走査する方法とが知られている。後者の方法は前者の方法に比べて機構的には複雑であるが、高速走査が可能である。

しかしながら、このような従来の光走査方法は、基本的に１つの光束を２次元の試料面上に順次走査するものであるため、所定面積の観察領域全体を走査するには時間が掛かる。そこで、光走査を高速化するため、複数のピンホールを渦巻き状に穿孔した円板を高速で回転させ、ピンホールを通過した多数の光束を同時に試料に照射しながら走査するニポウ(Nipkow)ディスク方式と呼ばれる方法が知られている（特許文献１、非特許文献１など参照）。この方法では試料に照射された多数の光束がニポウディスクの回転に伴って一斉に走査されるので、所定面積の観察領域全体を高速で走査することができるという利点がある。

しかしながら、ニポウディスク方式では、ニポウディスクがモータにより高速で回転駆動されるため、回転軸の摩擦により振動が発生し易く、振動が発生した場合には、長期的な連続使用についての信頼性に問題が生じる場合や画像の分解能等に悪影響を与える場合がある。

また、位置が固定された回転軸を中心にニポウディスクが回転されるため、常に試料面上の全領域が走査され、試料上の必要な一部の領域を限定的に走査したり不要な領域の走査の頻度を下げたりすることはできない。そのため、試料に余分な光が照射されることになる。例えば顕微蛍光測定などでは光照射による蛍光色素の劣化が問題となるケースが多く、本来は試料上で測定に必要な領域のみに選択的に光を照射し、それ以外の領域には光が当たらないようにすることが望ましい。しかしながら、ニポウディスク方式ではこうした要求に対応できない。

特開平８−３３８９４８号公報 "Ｍｏｄｅｌ ＣＳＵ１０／２２ フルフレーム高速共焦点スキャナ ＣＳＵの原理"、［online］、横河電機、［平成１６年１０月２６日検索］、インターネット、〈URL : http://www.yokogawa.co.jp/SCANNER/genri2.html〉

本発明は上記課題に鑑みて成されたものであり、その目的とするところは、振動が生じ得るような機械的な駆動機構を使用することなく、複数の光束による同時走査を行うことにより高速走査を達成するとともに、試料面上で測定に必要な領域のみに選択的に光を照射することができる共焦点スキャナ及び共焦点顕微鏡を提供することにある。

上記課題を解決するために成された本発明に係る共焦点スキャナは、試料を極小のスポットで照明するとともにそのスポットの位置を走査する共焦点スキャナにおいて、
a)照射光を放出する光源と、
b)該光源と試料との間に配置された、光束を絞るための対物レンズと、
c)前記光源と前記対物レンズとの間に配置され、それぞれの角度が可変である複数のマイクロミラーがアレイ状に配列されて成る光反射手段と、
d)前記複数のマイクロミラーの中の所定位置のマイクロミラーで反射された光が前記対物レンズを介して試料に照射され、他のマイクロミラーで反射された光が前記対物レンズに入射しないように各マイクロミラーの角度を制御し、且つ、試料に照射される光を反射するマイクロミラーの位置が時間経過に伴って変化するように走査を行うミラー駆動制御手段と、
を備えることを特徴としている。

また上記課題を解決するために成された本発明に係る共焦点顕微鏡は、上記発明に係る共焦点スキャナを具備し、前記対物レンズを通して試料に照射された光に応じた反射光又は蛍光を該対物レンズを通して前記光反射手段に戻し、該光反射手段の前記所定位置のマイクロミラーで前記光源に向かうように反射された光を取り出して検出手段に導入するようにしたことを特徴としている。

本発明における光反射手段としては、具体的にはマイクロマシン（ＭＥＭＳ＝Micro Electro Mechanical System）の一つであるＭＥＭＳミラーアレイを利用することができる。これは微細なマイクロミラーをアレイ状に多数配列して反射面を構成したものであり、各マイクロミラーはそれぞれ独立にその傾斜角度を変え得る。ミラー駆動制御手段は、各マイクロミラーの傾斜角度を所定状態に制御することにより、複数のマイクロミラーの中の適宜の位置に在る複数個のマイクロミラーで反射された光が対物レンズを介して試料に照射されるようにし、それ以外のマイクロミラーで反射された光は対物レンズに入射しないようにする。試料に光を入射するために制御されるマイクロミラーの位置は、共焦点の条件を満たすように適宜の間隔離間される。これにより、試料上で適宜の間隔離れた位置に複数の極小の光スポットを同時に照射することができる。

さらにミラー駆動制御手段は、時間経過に伴って各マイクロミラーの傾斜角度を順次変化させることにより、試料上に照射される複数の光スポットの位置を一斉に移動させる。これにより、試料上で複数の光スポットが走査される。また、試料上の所定の観察領域のみを走査したい場合には、その領域の大きさ及び位置に応じてマイクロミラーの傾斜角度の制御を変えればよく、基本的には試料上の任意の位置の任意の大きさの領域内のみに複数の光束を当てて走査を行うことができる。

各マイクロミラーはそれぞれ静電力又は電磁力によって傾斜角度が制御されるので、従来のニポウディスク方式と異なりモータ等の機械的駆動源が不要であり、高速走査を行っても振動が発生するおそれがない。そのため、本発明に係る共焦点スキャナによれば、精度良く試料の所定位置及び所定深さに光を集光させることができる。それによって、本発明に係る共焦点スキャナを採用した共焦点顕微鏡によれば、装置自体が発生する振動に起因する分解能の低下を回避して高精細な画像を得ることができるとともに、長期間の連続使用時の信頼性を向上させることができる。

また、光スポットを走査するに際し、一般に各マイクロミラーを所定角度（通常大きくても１０°程度の比較的小さな角度）だけ振ればよいので、ニポウディスク方式よりも高速の走査が可能となる。

また、本発明に係る共焦点スキャナでは、任意の位置のマイクロミラーの角度を制御できるので、試料上の任意の位置、任意の大きさの測定領域を限定的に走査することができる。それによって、測定領域以外には光を照射せずに済むので、そうした範囲における光の照射による蛍光色素等の劣化や変性などを防止して、良好な測定を行うことができる。

さらに本発明に係る共焦点スキャナの一態様として、前記光反射手段と前記対物レンズとの間に配置され、該光反射手段から到来する光束を前記試料の２次元面内で又は１次元方向に移動するための光束移動手段をさらに備える構成としてもよい。

ここで光束移動手段とは例えばガルバノミラー等を利用したスキャナミラーである。即ち、ＭＥＭＳミラーアレイ等を利用した走査では、その走査の分解能はマイクロミラーの密度に依存し、しかも離散的であるが、光束移動手段を併用することにより、より高い位置分解能での走査が可能となる。したがって、この構成の共焦点スキャナを利用した共焦点顕微鏡では、より一層高精細で鮮明な画像を得ることができる。

さらにまた本発明に係る共焦点スキャナの一態様として、前記対物レンズを通して試料に照射される光束の焦点の深さが試料の２次元面内で異なるように、該試料に対する前記光反射手段の配置を定める構成としてもよい。

この構成によれば、複数の光束が試料に照射されている状態で、各光束は深さ方向に異なる位置に焦点を有する。したがって、その状態で上記光束移動手段により光束を振れば、様々な焦点深さの光束が試料上で移動するため、試料の２次元面内の画像情報とともに深さ方向の画像情報も同時に得ることができる。即ち、この構成の共焦点スキャナを利用した共焦点顕微鏡によれば、試料を載置したステージを移動させることなく３次元画像情報を高速に収集することができる。

［第１実施例］
以下、本発明に係る共焦点スキャナを用いた共焦点顕微鏡の一実施例（第１実施例）について、図１〜図３を参照して説明する。図１は本実施例による共焦点顕微鏡の光学系を中心とした要部の構成図、図２はこの共焦点顕微鏡に用いられるＭＥＭＳミラーアレイの概念図、図３は本実施例の共焦点顕微鏡のスキャン動作を説明するためのＭＥＭＳミラーアレイの平面図である。

図１において、光源１は例えばタングステンランプ、キセノンランプ、発光ダイオード又はレーザー光源（各種レーザーと光束を拡大・集束する光学系とレーザー光の位相をランダム化する拡散回転板とを用いたもの）であり、光源１から出射した光は集光光学系２によりＭＥＭＳミラーアレイ５に集光される。集光光学系２とＭＥＭＳミラーアレイ５との間には波長選択フィルタ３及びダイクロイックミラー４が配置されており、ＭＥＭＳミラーアレイ５に到達する光は波長選択フィルタ３により蛍光を励起するための励起光の波長が選択されたものである。図１では図面が煩雑になるため一部の光束の光路しか記載していないが、集光光学系２はＭＥＭＳミラーアレイ５の２次元面全体にほぼ一様均一に光が当たるように構成されている。

ＭＥＭＳミラーアレイ５は、図２に示すように基板５２内に多数のマイクロミラー５１が２次元アレイ状に配列された構成を有し、各マイクロミラー５１は軸を中心に回動可能となっている。例えばＭＥＭＳミラーアレイ５には、上記のようなマイクロミラー５１が５００×５００個配置されている。各マイクロミラー５１にはそれぞれに対応して基板５２上にヨークを含む電磁駆動部（図示しない）が設けられており、外部から電磁駆動部に供給される電流に応じて各マイクロミラー５１の反射面の傾斜角度が変化する。なお、ＭＥＭＳミラーアレイ５としては直交する２軸を中心にそれぞれ回動可能な２自由度型、３軸を中心にそれぞれ回動可能な３自由度型などを用いてもよく、駆動方式も電磁型でなく静電型等の他の方式でもよい。

この実施例の共焦点顕微鏡では、各マイクロミラー５１の傾斜角度は基本的に２つの状態のいずれかに制御される。即ち、図２に示すように、基板５２の延在方向に略平行、つまり基板５２との成す傾斜角度がほぼ０°である場合と、基板５２との成す傾斜角度が所定のθ（例えば１０°）である場合とである。或るマイクロミラー（図２、図３では５１（ＯＮ）と記載）の傾斜角度がθであるとき、光源１側から入射して来てそのマイクロミラー５１（ＯＮ）に当たった光は対物レンズ６に向かって進行する。一方、或るマイクロミラー（図２、図３では５１（ＯＦＦ）と記載）の傾斜角度が０°であるとき、光源１側から入射して来てそのマイクロミラー５１（ＯＦＦ）に当たった光は対物レンズ６には向かわず光トラップ１２に向かって進行する。即ち、従来の共焦点顕微鏡で考えると、光径を制限しつつ光を通過させるピンホールに相当するのが傾斜角度θであるマイクロミラーであり、光を通さない遮光部分に相当するのが傾斜角度０°であるマイクロミラーである。ここでは、前者の場合をマイクロミラー５１がオン（ＯＮ）状態である、後者の場合をマイクロミラー５１がオフ（ＯＦＦ）状態であると定義することとする。

ＭＥＭＳミラーアレイ５において傾斜角度がθに設定されているマイクロミラー５１（ＯＮ）に当たった光は反射して対物レンズ６に向かって進み、対物レンズ６によりステージ７上に載置された試料８に集光される。一方、ＭＥＭＳミラーアレイ５において傾斜角度が０°に設定されているマイクロミラー５１（ＯＦＦ）に当たって反射した光は光トラップ１２に入射して吸収される。それによって、迷光が試料８に入射することを極力防止することができる。

試料８上で光の照射点に存在する蛍光性分子は励起されて蛍光を放出する。この蛍光は先の励起光と逆の方向に進行する。つまり、図１では下方から対物レンズ６に入射し、対物レンズ６によりＭＥＭＳミラーアレイ５に集光される。そして、オン状態にあるマイクロミラー５１（ＯＮ）に当たって反射した光は光源１に向かって進むが、励起光よりも波長の長い蛍光はダイクロイックミラー４を透過せずに反射される。そして、この蛍光は集光光学系９で集光され、波長選択フィルタ１０で蛍光のみの波長が選択された後に２次元ＣＣＤ１１の受光面に入射する。

上記光学系の構成において、ＭＥＭＳミラーアレイ５の各マイクロミラー５１の傾斜角度は、制御部２０の制御の下にＭＥＭＳミラー駆動部２１により制御される。上述したように各マイクロミラー５１はそれぞれ独立にオン／オフ状態にする（つまり傾斜角度をθ／０°に設定する）ことが可能であり、オン状態のマイクロミラー５１（ＯＮ）はピンホールであるとみなすことができる。したがって、複数のマイクロミラー５１を同時にオン状態とすることは複数のピンホールを設けることに相当するが、共焦点ピンホールの効果を得るためには、オン状態である１個のマイクロミラーの周囲の所定範囲内はマイクロミラーが全てオフ状態である必要がある。この制約によって、同時にオン状態にできるマイクロミラー５１の間隔が決まる。例えば、図３（ａ）に示すように、或るマイクロミラー５１Ｃについてその周囲の範囲５４では遮光を行う必要がある場合について考えると、同時にオン状態とするマイクロミラー５１の間隔を２個空けるものとする。

例えばＭＥＭＳミラーアレイ５が図３（ａ）に示すようなオン／オフパターンであるとき、試料８上の平面的な光スポットのパターンは図３（ｂ）に示すようになる。即ち、オン状態であるマイクロミラー５１（ＯＮ）に対応した箇所にそれぞれごく小径の光スポットＳが形成される。各光スポットＳにおける蛍光が２次元ＣＣＤ１１の受光面上にそれぞれ集光されるから、２次元ＣＣＤ１１では、同時に試料８上の複数点の蛍光を検出することができる。

制御部２０は上記のような適切なオン／オフパターンを記憶しておき、そのオン／オフパターンを維持したまま、オン状態とするマイクロミラー５１を図３（ａ）中に示すようにＸ方向及びＹ方向に順次切り替える。このときに、試料８上の光スポットＳ１は図３（ｂ）に示すように走査され、各光スポットが一斉に同様に走査されることで、全領域の走査が遂行される。同時に複数の光スポットが形成されているため、１個の光スポットの移動範囲は狭くても、つまり走査時間は短くても全領域を漏れなく且つ一様に走査することができる。

なお、マイクロミラー５１のオン状態の移動方向つまり光スポットの走査方向は原理上ほぼ任意に設定することができるから、上記のような走査は一例である。図３の例は試料８の全体を走査する場合であるが、一部の領域のみを限定的に走査したい場合には、その領域の位置及び大きさに応じて上記のオン／オフパターンを変更すればよい。予め多様なオン／オフパターンを用意しておき走査領域の位置や大きさが設定されたならば適当なものを選択してもよいし、走査領域の位置や大きさが設定された後に計算により適切なオン／オフパターンを作成するようにしてもよい。

［第２実施例］
次に、他の実施例（第２実施例）による共焦点顕微鏡を図４により説明する。図４において上記第１実施例の共焦点顕微鏡と同一の構成要素には同一の符号を付して説明を省略する。この第２実施例の共焦点顕微鏡では、ＭＥＭＳミラーアレイ５と対物レンズ６との間に例えばガルバノミラー等から成るスキャンミラー１３を介挿し、ＭＥＭＳミラーアレイ５のマイクロミラー５１で反射した光をスキャンミラー１３で反射させて対物レンズ６に導入している。スキャンミラー１３は制御部２０の制御の下にスキャンミラー駆動部２２によりその角度が走査される。

即ち、上記第１実施例の共焦点顕微鏡における光スポットＳの走査の粗さはＭＥＭＳミラーアレイ５におけるマイクロミラー５１の密度（１個のマイクロミラーの大きさ及び配置間隔）に依存するが、密度が高い場合であっても走査は離散的である。そこで、この第２実施例では、その走査の粗さを補うためにスキャンミラー１３による光束の走査を併用している。これにより、第１実施例よりも稠密に走査が行え、分解能の高い画像を得ることができる。

また、この第２実施例の構成の場合、ＭＥＭＳミラーアレイ５を図３（ａ）に示したように２次元的に配置してもよいが、例えば図５に示すように１次元方向（Ｘ方向）にマイクロミラー５１が配列されたＭＥＭＳミラーアレイ５を使用し、Ｘ方向の走査はマイクロミラー５１のオン／オフによって行い、これに直交するＹ方向の走査はスキャンミラー１３によって機械的に行うようにしてもよい。この構成によれば、ＭＥＭＳミラーアレイ５の構成が簡単になる。

［第３実施例］
続いて、他の実施例（第３実施例）による共焦点顕微鏡を図６により説明する。図６において上記第１及び第２実施例の共焦点顕微鏡と同一の構成要素には同一の符号を付して説明を省略する。この第３実施例の共焦点顕微鏡の基本的な構成は第２実施例と同じであるが、試料８上でＸ−Ｙ面内での位置によって深さ方向（Ｚ方向）に異なる位置に焦点を結ぶように、ＭＥＭＳミラーアレイ５を意図的に角度αだけ傾けて配置している。共焦点顕微鏡では、試料８で焦点を結んだ位置の画像情報が２次元ＣＣＤ１１により得られるから、スキャンミラー１３を或る角度に固定し、且つＭＥＭＳミラーアレイ５の各マイクロミラー５１のオン／オフを所定状態に固定したときには、試料８のＸ−Ｙ面内での位置によって深さ方向に異なる位置の画像情報が得られることになる。

この状態のまま、ＭＥＭＳミラーアレイ５のオン／オフ動作の走査を行いつつスキャンミラー１３による走査を行うと、或る深さ位置の情報が得られる箇所がＸ−Ｙ平面内で移動することとなり、３次元の走査を行ったことに相当する。通常の３次元走査は例えばステージ７自体をＺ方向に移動させる必要があるため時間が掛かるが、この第３実施例による共焦点顕微鏡によれば通常の３次元走査に比べて格段に高速に３次元走査を行うことができる。

なお、上記実施例はいずれも試料上の画像を観察するための共焦点顕微鏡であるが、それ以外の用途の共焦点スキャナとしても利用することができる。例えば、図７に示すように複数点の試料４１がスポットされた試料プレート４０の各試料４１について、同時に光を照射して反射吸光度を測定したり蛍光強度を測定したりする用途に適用することが可能である。この場合でも、全ての試料４１では無く幾つかの試料４１に対し選択的に測定を行ったり、所定の順序で順番に測定を行ったりする等、任意の走査が可能である。

また、上記実施例はいずれも一例にすぎず、本発明の趣旨の範囲で適宜変形や修正、追加を行なえることは明らかである。

本発明の一実施例（第１実施例）による共焦点顕微鏡の光学系を中心とした要部の構成図。 第１実施例の共焦点顕微鏡に用いられるＭＥＭＳミラーの概念図。 第１実施例の共焦点顕微鏡のスキャン動作を説明するためのＭＥＭＳミラーの平面図。 本発明の他の実施例（第２実施例）による共焦点顕微鏡の光学系を中心とした要部の構成図。 第２実施例の変形例による共焦点顕微鏡のスキャン動作を説明するためのＭＥＭＳミラーの平面図。 本発明の他の実施例（第３実施例）による共焦点顕微鏡の光学系を中心とした要部の構成図。 本発明に係る共焦点スキャナを利用した測定対象の試料の外観図。

符号の説明

１…光源
２…集光光学系
３…波長選択フィルタ
４…ダイクロイックミラー
５…ＭＥＭＳミラーアレイ
５１…マイクロミラー
６…対物レンズ
７…ステージ
８…試料
９…集光光学系
１０…波長選択フィルタ
１１…２次元ＣＣＤ
１２…光トラップ
１３…スキャンミラー
２０…制御部
２１…ＭＥＭＳミラー駆動部
２２…スキャンミラー駆動部

Claims (4)

1. 試料を極小のスポットで照明するとともにそのスポットの位置を走査する共焦点スキャナにおいて、
   a)照射光を放出する光源と、
   b)該光源と試料との間に配置された、光束を絞るための対物レンズと、
   c)前記光源と前記対物レンズとの間に配置され、それぞれの角度が可変である複数のマイクロミラーがアレイ状に配列されて成る光反射手段と、
   d)前記複数のマイクロミラーの中の所定位置のマイクロミラーで反射された光が前記対物レンズを介して試料に照射され、他のマイクロミラーで反射された光が前記対物レンズに入射しないように各マイクロミラーの角度を制御し、且つ、試料に照射される光を反射するマイクロミラーの位置が時間経過に伴って変化するように走査を行うミラー駆動制御手段と、
   を備えることを特徴とする共焦点スキャナ。
2. 前記光反射手段と前記対物レンズとの間に配置され、該光反射手段から到来する光束を前記試料の２次元面内で又は１次元方向に移動するための光束移動手段をさらに備えることを特徴とする請求項１に記載の共焦点スキャナ。
3. 前記対物レンズを通して試料に照射される光束の焦点の深さが試料の２次元面内で異なるように、該試料に対する前記光反射手段の配置を定めることを特徴とする請求項２に記載の共焦点スキャナ。
4. 請求項１〜３のいずれかに記載の共焦点スキャナを具備し、前記対物レンズを通して試料に照射された光に応じた反射光又は蛍光を該対物レンズを通して前記光反射手段に戻し、該光反射手段の前記所定位置のマイクロミラーで前記光源に向かうように反射された光を取り出して検出手段に導入するようにしたことを特徴とする共焦点顕微鏡。
   

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