JP2012503798A - 構造物の光刺激およびイメージングを提供するためのデバイス、装置、および方法 - Google Patents

Abstract

本発明の開示の例示的な実施態様に従って、ビーム多重化とともに、感光性化合物、例えば、ＭＮＩ−グルタメートおよび／またはＲｕＢｉ−グルタメートの二光子アンケージングを用いて、任意の時空間パターンで、脳切片中の個々のニューロンを刺激する、方法、システム、構成、コンピューターがアクセス可能な媒体、および装置が提供できる。このような例示的な方法および装置は、単一細胞および３次元精度をもつことができる。例えば、大量の潜在的シナプス前ニューロンにまでおよぶ連続的刺激により、この例示的なアプローチを全光法において、二光子カルシウムイメージングと組み合わせて、回路活性を画像化して操作する。本発明の開示のさらなる例示的な実施態様は、多種多様な用途における使用を提供する、軽量の、小型の携帯用デバイスを含む。
【選択図】 図６

Description

（関連出願の表示）
本発明は、２００８年９月２５日出願の米国特許出願第６１／１９４，１４５号、２００９年４月１７日出願の米国特許出願第６１／２１２，９２４号、２００９年５月１１日出願の米国特許出願第６１／１７７，２３９号の優先権を主張するものであり、それらの出願のすべての開示は引用することにより本明細書の一部である。

（連邦政府の支援による研究または開発であることの表示）
本発明の開示は、連邦政府による資金提供を受けた、国立眼研究所（ＮＥＩ）および国立衛生研究所（ＮＩＨ）の国立神経疾患および発作研究所（ＮＩＮＤＳ）からの助成金番号ＮＩＨ ＲＯＩ ＥＹＩ １７８７のもとでなされた。従って、米国政府が、本発明について、一定の権利を有する。

本発明の開示の例示的な実施態様は、構造物の光活性化およびイメージング、より詳しくは神経回路の光活性化およびイメージングを提供するための、デバイス、装置、および方法に関する。

神経回路は、大きな多様性をもつ細胞種類からなっており、各細胞種は、特別の機能を果たしている（P. Sterling, "The Synaptic Organization of the Brain," edited by G. M. Shepherd, Oxford University Press, Oxford, 1990参照）。それゆえ、回路の機能を理解する前提として、ニューロンの異なる種類間でのシナプス結合をマッピングすること、またはＣｒｉｃｋの文献において提案されているように、所与の細胞上に作られたすべての結合をマッピングすることが必要と思われる。（FH. Crick, ScL Am. 241 (3), 219 (1979)参照）。

蛍光の膜プローブの使用を記載した知見（I. C. Farber and A. Grinvald, Science 222, 1025 (1983)参照）に続いて、ケージ（caged）ドグルタメートを用いたニューロンの光刺激（E. M. Callaway and L.C. Katz, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 7661 (1993)参照）は、本研究プログラムを大きく進展させ、脳切片中のニューロンの高解像度入力マップ（同上、M. B. Dalva and L. C. Katz, Science 265 (5169) 255 (1994); G. M. Shepherd, T. A. Pologruto, and K. Svoboda, Neuron 38 (2), 277 (2003); C. Boucsein, M. Nawrot, S. Rotter et al., Journal of neurophysiology 94 (4), 2948 (2005); R. Kotter, D. Schubert, J. Dyhrfjeld-Johnsen et al., J Biomed Opt 10 (1), 11003 (2005); H. U. Dodt, A. Schierloh, M. Eder et al., Neuroreport 14 (4), 623 (2003); および S. Shoham, D. H. O'Connor, D. V. Sarkisov et al., Nature methods 2 (11), 837 (2005)参照）を生み出した。この方法では、グルタメートアンケージング（uncaging）が、紫外線光を切片の特定の位置に焦点を当て、一方同時に異なった位置におけるニューロンからの細胞内応答を記録することにより達成できる。アンケージングビームを、系統的に切片を横断するように動かすことにより、記録された細胞内での興奮応答または阻害応答を生じる領域をマッピングできる。有用である一方、この方法は、生きた組織内での固有の光の散乱および一光子励起により生じる大きなアンケージング領域のせいで、刺激された領域が１以上のニューロンを含むという問題を受けやすい。従って、一光子光刺激は、細胞間のシナプス結合を示さず、代わりに複数の領域と記録されたニューロン間の結合を示す。

P. Sterling, "The Synaptic Organization of the Brain," edited by G. M. Shepherd, Oxford University Press, Oxford, 1990 FH. Crick, ScL Am. 241 (3), 219 (1979) I. C. Farber and A. Grinvald, Science 222, 1025 (1983) E. M. Callaway and L.C. Katz, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 7661 (1993) M. B. Dalva and L. C. Katz, Science 265 (5169) 255 (1994) G. M. Shepherd, T. A. Pologruto, and K. Svoboda, Neuron 38 (2), 277 (2003) C. Boucsein, M. Nawrot, S. Rotter et al., Journal of neurophysiology 94 (4), 2948 (2005) R. Kotter, D. Schubert, J. Dyhrfjeld-Johnsen et al., J Biomed Opt 10 (1), 11003 (2005) H. U. Dodt, A. Schierloh, M. Eder et al., Neuroreport 14 (4), 623 (2003) S. Shoham, D. H. O'Connor, D. V. Sarkisov et al., Nature methods 2 (11), 837 (2005) R. Yuste, Pflugers Archiv - Eur. J. Physiol. 441 (2-3), 398 (2000) Watson, Brendon O., Nikolenko, Volodymyr, and Yuste, Rafael, Frontiers in Neural Circuits, 3, 1 (2009) Y. Yoshimura, J. L. Dantzker, and E. M. Callaway, Nature 433 (7028), 868 (2005) JV. Le Be and H. Markram, Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 13214 (2006) Rafael Yuste and Lawrence C. Katz, Neuron 6, 333 (1991) Y. Kawaguchi, J Neurosci 15 (4), 2638 (1995); J. Kozloski, F. Hamzei-Sichani R. Yuste, Science 293 (5531), 868 (2001) Y. Wang, M. Toledo-Rodriguez, A. Gupta et al., J Physiol 561 (Pt 1), 65 (2004) T. Badea, J. Goldberg, B.Q. Mao et al., J. Neurobiol. 48, 215 (2001) A. J. Trevelyan, D. Sussillo, B. O. Watson et al., The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience 26 (48), 12447 (2006) J. J. Hopfield, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 2554 (1982) F. Zhang, L. P. Wang, M. Brauner et al., Nature 446 (7136), 633 (2007)) E. S. Boyden, F. Zhang, E. Bamberg et al., Nature neuroscience 8 (9), 1263 (2005) R. Cossart, D. Aronov, and R. Yuste, Nature 423, 283 (2003)) V. Nikolenko, B. Nemet, and R. Yuste, Methods 30, 3 (2003) Z.A. Peterlin, J. Kozloski, B. Mao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (7), 3619 (2000) A. Nimmerjahn, F. Kirchhoff, J. N. Kerr et al., Nat Methods 1 (1), 31 (2004) A. Oliva, Jr., M. Jiang, T. Lam et al., J Neurosci 20 (9), 3354 (2000) Canepari, M., Nelson, L., Papageorgiou, G., Corrie, J.E. & Ogden, D. J Neurosci Methods 112, 29-42 (2001) Nikolenko, V., Ellis-Davies, G.C.R. & Yuste, R. , in Society for Neuroscience Annual Meeting (Society for Neuroscience, New Orleans, 2003) Shoham, S., O'Connor, D. H., Sarkisov, D.V, & Wang, S. S. Nature methods 2, 837-843 (2005) Majewska, A., Yiu, G. & Yuste, R. Pflugers Archiv - Eur. J. Physiol. 441, 398- 409 (2000)

従って、ここに記載の欠点の少なくともいくつかを解決するための努力が必要である。

少なくともこのような制限を克服するために、二光子光刺激の方法、システムおよびデバイスの例示的な実施態様が提供できる。

本発明の開示の一つの例示的な実施態様に従って、少なくとも一つの放射をもたらすデバイスおよび方法が提供できる。例えば、少なくとも一つの試料の少なくとも一つの部分の、光活性化、光不活性化、および／または光化学効果を誘発する放射をもたらすように構造化されたまたは構成された、少なくとも一つの特定の構成が提供できる。放射は、少なくとも一つのビームを含むことができ、そして特定の構成が、少なくとも一つのビームが複数のビームレットに分割されて、その内の少なくともいくつかが試料に激突するようにさらに構造化されたまたは構成されうる。試料は、生物試料、化学組成物、セミコンダクター構造、および／または薬物送達構造でありうる。

一つの例示的な実施態様に従って、特定の構成は、少なくとも一つの回折光学構造を含むことができる。特定の構成および／または回折光学構造は、少なくとも一つの空間光変調（ＳＬＭ）構造を含むことができる。加えて、特定の構成は、少なくとも一つの放射を非線形様式で励起することにより、前記少なくとも一つの放射をもたらすことができる。少なくとも一つの放射のシグナル対ノイズ比は、単一放射システムからのシグナルの約１．９４倍より大きくできる。

本発明の開示の他の例示的な実施態様に従って、前記少なくとも一つの達成された放射と関連したデータを受け取り、そしてデータの写像として、少なくとも一つの試料の部分のイメージを作り出すように構成されうる、少なくとも一つのさらなる構成が提供でき、そしてイメージは、約１００ｍｓより小さいイメージングサイクルの持続時間で作り出されうる。さらに、特定の構造が、前記少なくとも一つの達成された放射を生物試料への提供し、光力学作用を提供するために構成されまたは構造化されうる。達成された放射は、少なくとも一つの試料上で、ネットで１００ミリワットより高い平均力をもつことができる。例えば、特定の構成の少なくとも一つの部分が、内視鏡構造中に提供されうる。

本発明の開示のさらに他の例示的な実施態様では、照射を用いて試料中の微小な構造物に光を当てる、および／または試料に激突して少なくとも一つの深さ情報を得るために放射の層を調整するために、さらに構成されたまたは構造化された特定の構造が提供されうる。ＳＬＭ構造が、放射を用いて試料内の微小な構造物を照射するために、および／または試料に激突して少なくとも一つの深さ情報を得るために構成または構造化されうる。特定の構造が、少なくとも一つのスキャンレスの空間光変調（ＳＬＭ）に基づいた顕微鏡構造中に含まれうる。ＳＬＭ構造は、微小な構造に照射するために構成または構造化されうる。スキャンレスＳＬＭに基づいた顕微鏡構造が、照射のコヒーレント光をもたらすことができ、コヒーレント光はレーザーを含むことができる。

本発明の開示のさらなる例示的な実施態様に従って、ＳＬＭ構造は、少なくとも一つのイメージに対する少なくとも一つの試料と関連した少なくとも一つの収差を修正するための構成または構造化されうる。放射は、少なくとも一つの光放射を含むことができ、そしてＳＬＭ構造は、特定の実行強度で、約１ｍｍより大きい深さにおいて試料の部分に対して光放射を提供するために構成または構造化されうる。光放射は、光放射の少なく一つの波長に基づく部分においてその深さで提供されうる。さらなる構造は、少なくとも一つのマルチモード手段に基づいてイメージを作り出すことができる。ＳＬＭ構造はさらに、放射に対して斜めに交差するビームレットのセットを作り出すように構造化または構成されうる。ＳＬＭ構造は、放射が、（ｉ）少なくとも一つの試料内での、２つまたは３つの光子吸収、（ｉｉ）放射と関連したセカンドハーモニックスジェネレーション（第二高調波発生：ＳＨＧ）、（ｉｉｉ）さらなる構造がイメージングを作り出すための、コヒーレントアンチストロークラマン分光イメージング（ＣＡＲＳ）手順、および／または（ｉｖ）さらなる構造がイメージを作り出すための、フォーウェーブミキシングイメージング（Four-wave mixing imaging：ＦＷＭ）手順を達成する放射を生み出すように構造化または構成されうる。

さらに他の例示的な実施態様に従って、ＳＬＭ構造は、放射ビームの少なくとも一つの形状、大きさまたは流れ方向を修正して、少なくとも一つの試料内において、２つおよび／または３つの光子吸収が達成されるように、構造化または構成されうる。さらに、ＳＬＭ構造は、位相のみのＳＬＭ構造、例えば、放射の実質的な強度の減少を防ぐことができる構造を含むことができる。例えば、ＳＬＭ構造は、単一の光学的構成要素を含むことができ、それは、（ｉ）放射を送信しまたは反射し、およびさらに修正する、（ｉｉ）放射の強度を減少する、および（ｉｉｉ）少なくとも一つの放射を少なくとも部分的に遮断するために単独で構成または構造化されうる。

本発明の開示のさらなる例示的な実施態様では、さらなる構造が、試料の部分の少なくとも一つの３次元イメージを作り出し、そして３次元データとして、３次元イメージと関連したさらなるデータを保存するために構成されうる。加えて、ＳＬＭ構造は、標的方法にて、例えば、試料上または中の特定の位置に対する放射の強度を制御することによって、放射の配送を制御するために構成または構造化されうる。さらに、特定の構造が、複数の特定の位置において同時に、部分の光活性化を引き起こすために構成または構造化されうる。ＳＬＭ構造は、試料のイメージ面上に放射の特定された空間プロファイルを提供できる。

本発明の開示のさらに他の例示的な実施態様に従って、少なくとも一つの放射を生じるための装置が提供されうる。例えば、少なくとも一つの空間光変調（ＳＬＭ）構造が、放射を用いて少なくとも一つの試料内の微小な構造物を照射するため、および／または試料に激突して少なくとも一つの深度情報をえるために放射の位相を調整するために、構造化または構成されうる。さらに、ＳＬＭ構造は、少なくとも一つのスキャンレス空間光変調（ＳＬＭ）に基づいた顕微鏡構造に含まれうる。

本発明の開示のさらに他の例示的な実施態様に従って、時空間的ビーム多重化二光子レーザーが、ニューロンからニューロンへと移動し、グルタメートをアンケージングし、そして連続的に各ニューロンを発火することができ、一方、特定の細胞中の残余のシナプス電位は、同時に記録される。この例示的な構造は、一つのシナプスによって連結された細胞の検出および単一細胞分解能を用いて作り出される入力マップを容易にすることができる。このような例示的な方法／手順はまた、回路活性を操作しそして同時に記録するために、二光子カルシウムイメージングと組み合わされる。

本発明の開示の例示的な実施態様のこれらおよび他の目的、特性および利点は、添付の番号が付されたパラグラフとの関連において、本発明の開示の例示的な実施態様の以下の詳細な記載により明らかとなろう。

本発明のさらなる目的、特性および利点は、本発明の実例となる実施態様を示す添付の図面との関連において、以下の詳細な記載から明らかとなろう。

Ｆｉｇ１（ａ）−１は、本発明の開示の例示的な実施態様に従った、顕微鏡の光学システムおよび顕微鏡システム／構造の略図である。 Ｆｉｇ１（ａ）−２は、本発明の開示の例示的な実施態様に従った、顕微鏡の光学システムおよび顕微鏡システム／構造の略図である。 Ｆｉｇ１（ｂ）は、本発明の例示的な実施態様に従った、回折光学素子を用いることができる例示的なビーム分割構造を含む構造の略図である。 Ｆｉｇ１（ｃ）は、本発明の開示に従った顕微鏡の光学システムおよび顕微鏡システム／構造の他の例示的な実施態様の略図である。 Ｆｉｇ１（ｄ）は、本発明の開示に従った光学システムおよび顕微鏡システム／構造のさらなる例示的な実施態様の略図であり、焦点を試料上で動かすために、励起したビームがどのように動くかを示している。 Ｆｉｇ１（ｅ）は、ＳＬＭを用いた、本発明の開示に従った顕微鏡の光学システムおよび顕微鏡システム／構造のさらに他の例示的な実施態様の略図である。 Ｆｉｇ１（ｆ）は、ＳＬＭを用いた小型軽量でポータブルな顕微鏡の本発明の開示に従った、光学システムおよび顕微鏡システム／構造のさらに他の例示的な実施態様の説明図である。 Ｆｉｇ２（ａ）は、ビーム多重化を用いたＭＮＩ−グルタメートの例示的な二光子光刺激を用いた、一時的ビーム多重化を用いたアンケージングの例示的な説明図およびその結果である。Ｆｉｇ２（ｂ）は、ビーム多重化を用いたＭＮＩ−グルタメートの例示的な二光子光刺激を用いた、アンケージングの空間分解能の例示的な説明図およびその結果である。Ｆｉｇ２（ｃ）〜（ｅ）は、回折格子素子（ＤＯＥ）空間ビーム多重化を用いたアンケージングの例示的な結果であり、一方、Ｆｉｇ２（ｃ）の説明図は、ビーム多重化を用いた、ＭＮＩ−グルタメートの例示的な二光子光刺激と関連する。Ｆｉｇ２（ｆ）は、ビーム多重化二光子アンケージングの深度分解能の例示的な結果である。 Ｆｉｇ２（ｇ）および（ｈ）は、本発明の開示の、ある例示的な実施態様に従った、横方向の回折光学素子（ＤＯＥ）モードでの二光子イメージングを増幅するためのＤＯＥの利用についての概略図である。Ｆｉｇ２（ｉ）および（ｊ）は、本発明の開示の、ある例示的な実施態様に従った、縦方向のＤＯＥモードでの二光子イメージングを増幅するためのＤＯＥの利用についての概略図である。 Ｆｉｇ２（ｋ）〜（ｏ）は、本発明の開示の、ある例示的な実施態様に従った、横方向のＤＯＥモードを用いたラインスキャンの例示的な結果である。 Ｆｉｇ２（ｐ）および（ｑ）は、本発明の開示の、ある例示的な実施態様に従った、ＤＯＥを用いた増幅フレームスキャンの例示的な結果である。 Ｆｉｇ２（ｒ）は、本発明の開示の、ある例示的な実施態様に従った、横方向のＤＯＥモードを用いた走査の例示的な結果である。 Ｆｉｇ２（ｓ）〜（ｔ）は、本発明の開示の、ある例示的な実施態様に従った、横方向のＤＯＥモードを用いた走査の例示的な結果である。 Ｆｉｇ２（ｕ）および（ｖ）は、本発明の開示の、ある例示的な実施態様に従った、ＤＯＥを用いたサブミクロンビーズのイメージ化の例示的な結果である。 Ｆｉｇ２（ｗ）および（ｘ）は、本発明の開示の、ある例示的な実施態様に従った、スピードアップした横方向のＤＯＥスキャンモードでの走査の例示的な結果である。 Ｆｉｇ３（ａ）は、樹枝状の、層５錐体ニューロンおよび多層形態再現のための単一細胞分解能を用いた、例示的な二光子インプットマップである。Ｆｉｇ３（ｂ）は、Ｆｉｇ３（ａ）の同一のニューロンの疑陽性シグナルの単一細胞分解能を用いた例示的な二光子マップである。 Ｆｉｇ３（ｃ）は、真陽性シグナルが単一シナプス結合であることを示している例示的なグラフィック結果である。Ｆｉｇ３（ｄ）は、単一シナプス結合を明らかにしている、２つの例示的なニューロンからの例示的な二重記録である。Ｆｉｇ３（ｅ）および（ｆ）は、２つのさらなる実験における、例示的な単一シナプスが結合した真陽性細胞のグラフである。 Ｆｉｇ３（ｇ）は、本発明の開示の例示的な実施態様に従った、真陽性および擬陽性応答の例示的な分析を説明した例示的な表である。 Ｆｉｇ４（ａ）は、切片の表面に焦点を当てた平面（０μｍ）で検出された、すべてのｍａｇ−Ｉｎｄｏ−１ＡＭを負荷させた細胞（ｎ＝６３５）の同時に取得された入力マップの例示的な図である。Ｆｉｇ４（ｂ）は、Ｆｉｇ４（ａ）の例示的なマップの４５μｍ下における、負荷させた細胞（ｎ＝６３５）から取得された入力マップの例示的な図である。Ｆｉｇ４（ｃ）は、Ｆｉｇ４（ａ）およびＦｉｇ４（ｂ）の例示的なマップの重複によって、２つの例示的な焦点を当てた平面における細胞間の違いを説明したグラフである。Ｆｉｇ４（ｄ）は、Ｆｉｇ４（ａ）の例示的なマップの焦点を当てた平面で刺激されている間、パッチした細胞中での真陽性応答を生じる位置（ｎ＝２０）において同時に取得された例示的な入力マップを説明する図である。Ｆｉｇ４（ｅ）は、Ｆｉｇ４（ｄ）で用いられたのと同じ３００の座標を用いて、Ｆｉｇ４（ｂ）の例示的なマップの焦点を当てた平面で真陽性応答を生じる位置（ｎ＝１７）において同時に取得された例示的な入力マップである。Ｆｉｇ４（ｆ）は、２つの隣接する焦点平面における選択的マッピングの入力の可能性を示している、たった２つの位置において重複している、入力マップの重複を用いて同時に取得された例示的な入力マップの説明図である。 Ｆｉｇ．４（ｇ）〜（ｌ）は、例えば、４つのニューロンから、同時に取得された入力マップの例示的な説明図である。 Ｆｉｇ．５（ａ）〜（ｇ）は、約１時間にわたって連続的に得られた同一ニューロンからの連続の例示的な入力マップである。Ｆｉｇ５（ｈ）は、各々のマップ中で生じた真陽性応答を生じる例示的な場所である。 Ｆｉｇ．６（ａ）は、すべての光刺激を用いて、そしてネットワーク活性をイメージングする、応答のアンケージングの光検出の例示的な実施態様の説明図である。Ｆｉｇ６（ｂ）は、同時のイメージングを用いての、連続する刺激の例示的な実施態様の説明図である。 Ｆｉｇ．６（ｃ）は、他の同時の刺激およびイメージングの例示的な実施態様の説明図である。 Ｆｉｇ．７（ａ）は、例示的な神経集団の標的イメージングのための、細胞検出手段および走査パス最適化の例示的な結果の説明図である。Ｆｉｇ．７（ｂ）は、例示的な神経集団の標的イメージングのための、カルシウムイメージング標的ニューロンの例示的な結果の説明図である。Ｆｉｇ．７（ｃ）は、例示的な神経集団の標的イメージングのための、カルシウムイメージングの単動式電位感受性の例示的な略図および例示的な図である。 Ｆｉｇ．８は、ｍａｇ−Ｉｎｄｏ−１ＡＭを用いて、皮質切片に負荷をかけた例示的なイメージである。 Ｆｉｇ．９（ａ）〜９（ｄ）は、殆どのニューロンへのｍａｇ−Ｉｎｄｏ−１ＡＭ負荷のイメージである。ニューロンがある切片は、ｍａｇ−Ｉｎｄｏ−１ＡＭおよびスルホローダミン（Sulforhodamine）（例えば、ＳＲＩＯＩ、２０μＭ）で同時に負荷がかけられ、そして各例示的な波長でイメージ化されている。 Ｆｉｇ．１０は、処理装置によって実行されうる、本発明の開示の、ある実施態様に従った、例示的な光刺激手順のフロー図である。 Ｆｉｇ．１１は、本発明の開示に従ったＳＬＭ位相マスクフォーメーションのための方法の例示的な実施態様のフロー図である。 Ｆｉｇ．１２（ａ）〜１２（ｄ）は、本発明の開示の例示的な実施態様に従った、例示的な実験の結果を得るための、例示的なＳＬＭ光パターン化および深度焦点化イメージおよびシークエンスである。 Ｆｉｇ．１３は、本発明の開示の、ある例示的な実施態様に従って構成されたシステムまたは装置のブロック図である。

図面においては、同じ参照番号及び符号は、特に断りのない限り、図解された実施態様の、同様の特徴、要素、構成要素又は部分を示すために用いられる。さらに、本発明の開示は、図面を参照して詳細に記載されるが、それは、図解の実施態様と関連してなされる。添付の特許請求の範囲で定められた本発明の開示の本来の範囲及び精神から離れることなしに、記載された例示的な実施態様に対して変更及び修正することができると、意図されている。

大きな神経集団の活性の光刺激およびイメージ化を容易とする、本発明の例示的な実施態様に従って実施されるシステム、デバイスおよび装置が、提供され、それは、本発明の開示のいくつかの例示的な実施態様に従った単一の二光子レーザーを用いている。

（二光子顕微鏡の例示的な光学デザインおよび実施態様）
本発明の開示の例示的な実施態様に従った処理装置によって実行される例示的なソフトウエアは、個々のニューロン上で、視野内の任意のポイントでのレーザービームの位置決め、および、例えば、Ｉｎｄｏ−１ＡＭの二光子カルシウムイメージ化とＭＮＩケージドグルタメートの二光子アンケージング（M. Canepari、前掲、G. C. R. Ellis-Davies、前掲参照）間の素早い切替を容易にでき、それらが作動電位を発するようにすることができる。電気工学的モジュレータは、２つのレベルのレーザー強度（イメージ化のために低い強度および光刺激／アンケージングのための高いレベル）間の切り換えのために用いられうる。従って、レーザービーム（例えば、約２５ｎｍ）は、３次元の精度で、回路活性を誘発しそしてモニターするために用いられうる。

例えば、本発明の開示に従ったシステムおよびデバイスの例示的な実施態様は、二光子蛍光（２ＰＦ）および第二高調波発生（ＳＨＧ）顕微鏡を改変できる（V. Nikolenko, supra; A. Majewska, G. Yiu、およびR. Yuste, Pflugers Archiv - Eur. J. Physiol. 441 (2-3), 398 (2000) 参照）。

Ｆｉｇ．Ｉ（ａ）は、本発明の開示に従った顕微鏡の光学システムおよび顕微鏡システムの例示的な実施態様の概略図を示している。

例えば、ある例示的な実施態様に従って、Ｆｉｇ．Ｉ（ａ）に示されるような例示的な顕微鏡は、これらに限定されるわけではないが、以下の例示的な要素、Ｔｉ：サファイアレーザー１０１、電気光学モジュレータ（ポッケルセル）１０２、ビーム成形光学部（テレスコープ／空間フィルター）１０３、ＤＯＥ１０４およぶＤＯＥテレスコープ１０５を含む回折光学素子（ＤＯＥ）光学部、ペリスコープミラー１０６、スキャナー１０７、縦型顕微鏡１０８、および２ＰＦ ＰＭＴ １０９を含む光電子増倍管（ＰＭＴ）ベース２ＰＦ／ＳＨＧ検出システム、ＰＭＴシグナル増幅器１１０、データ取得モジュール１１１、および明視野照射のためのランプまたは２ＰＦ／ＳＨＧ１１２のための第二のＰＭＴ、を含むことができる。例示的なビーム成形光学部１０３は、焦点レンズ１０３、ピンホール１０３ｂおよびレンズ１０３ｃを含むことができる。例示的なＤＯＥテレスコープ１０５は、レンズ１０５ａ、ビーム選択アイリス１０５ｂおよび他のレンズ１０５ｃを含むことができる。例示的なスキャナー１０７は、ＩＲ反射ミラー１０７ａ、ガルバノメーターミラー１０７ｂ、およびピューピルトランスファー（pupil transfer）レンズ１０７ｃを含むことができる。例示的な縦型顕微鏡１０８は、ショートパス２色性素子１０８ａ、チューブレンズ１０８ｂ、対物レンズ１０８ｃおよびコンデンサー１０８ｄを含むことができる。例示的な２ＰＦ ＰＭＴ １０９は、ＩＲ遮断ブロードまたはバンドパスフィルター１０９ａ、ＰＭＴレンズ１０９ｂおよび高速シャッター１０９ｃを含むことができる。

ある例示的な実施態様に従って、１またはそれ以上の以下の要素を用いることができる：Ｔｉ：サファイアレーザー（例えば、Chameleon; Coherent, Santa Clara, CA）、モデル２７５線形増幅器によって駆動されるモデル３５０−１６０ポッケルセル（Conoptics, Inc Danbury, CT）、中間誘導体反射鏡（例えば、BB1-E02 from Thorlabs, Newton, NJ）、および回折光学素子（例えば、溶融石英、SLH-505Xa-(0.23)-(780) Stocker Yale Canada Inc., Dollard-Des-Ormeaux, Quebec, Canada）。光学装置の他の要素も、例えば、規格部品から取り付けることができる。縦型の顕微鏡（例えば、Olympus BX50WI）は、浸水対物レンズ（例えば、オリンパスからのレンズ）が備えられている。

例えば、LUMPlanFI/IR 40x 0.8NAレンズ（ＩＲ２コーティング）が、少数のニューロンの、パッチクランピング、および高分解能二光子イメージングおよび光刺激のために、ＤＩＣ中の細胞を標的とするために用いられ、一方、低倍率対物レンズ（例えば、UMPlanFI 20x 0.5NA, XLUMPlanFI 20x 0.95NAおよびUMPlanFI 10x 0.3NA）は、ニューロン集団のイメージング／光刺激のために用いられうる。ショートパスの２色性ミラー（例えば、650DCSP; Chroma Technology, Rockingham, VT）は、例示的な顕微鏡の３眼顕微鏡チューブの内部に配置することができる。ＩＲ遮断フィルター（例えば、BG39、Chroma Technology）は、ＰＭＴの前に配置されて、励起パスから散乱した残余の赤外光を除去することができる。検出器として、冷却したＧａＡｓＰＭＴ（例えば、H7422P-40、Hamamtsu Corp., 日本）が、追加の増幅器（例えば、PE 5113; Signal Recovery AMETEK Advanced Measurement Technology, Wokingham U.K.）とともに用いられうる。高速機械式シャッター（例えば、LS6T2; driven by a VCM-Dl; Vincent Associates, Rochester, NY）が、同時のイメージング／アンケージング実験における過負荷からＰＭＴを保護するために用いられうる。

ＰＭＴシグナルは、例えば、ラスターモードのフルオビュー（Fluoview）によってまたはベクターモード（例えば、NI PCI-6052E National Instruments, Austin, TX）の外部のＡ／Ｄボードによってデジタル化されうる。本発明の開示のいくつかの例示的な実施態様に従って、カスタムソフトウエアからのアナログ出力に従って、このボードはまた、ポッケルセルを通して、レーザー強度を調節できる。同じ例示的なソフトウエアは、もとのライブラリファイル（例えば、gbx.dll; FV200 Olympus Fluoview Basic）中の直接呼び出し機能を通じて走査ミラーの位置を制御できる（参照、V. Nikolenko, 前掲）。本発明の開示に従った例示的なソフトウエアは、処理装置（例えば、プロセッサー、コンピューター、等）によって実行され、それは、例えば、a LabView programming environment (National Instruments) 中に提供されることができ、そして計算上集中的な手順、例えば、細胞の外形の検出または移動セールスマンの経路計算（例えば、MATLAB; The Mathworks, Natick, MA）のような手順のために、総合ソフトルーチンと連携しうる。

Ｆｉｇ．１（ｂ）は、本発明の開示に従った例示的な構成の実施を示した略図１２０を示しており、それは、本発明の開示の例示的な実施態様に従ってＤＯＥ１２１を用いてビーム分割を容易にする。ＤＯＥ１２１は、例えば、Ｆｉｇ．１（ａ）との関連で示されそして上記しているように、例えばＤＯＥ１０４でありうる。ビーム１２２は、ガルバノメーターミラー１２３上で一緒になることができ、試料を刺激するために走査し、およびビーム１２４を伝える。例示的なテレスコープ１２５は、出力するビームレット１２６の大きさを変更し、プレサイズジングテレスコープ１２７は、ＤＯＥテレスコープ複合体１２８の前で用いられる。イメージ収集は、例えば、光電子倍増管（ＰＭＴ）１２９および／またはＣＣＤカメラ１３０のいずれかを用いて達成される。

Ｆｉｇ．１（ｃ）は、本発明の開示に従った顕微鏡の、光学システムおよび顕微鏡システムの他の例示的な実施態様の概略図を示している。例えば、このような例示的な光学システムおよび顕微鏡システムは、例えば、出力（超高速レーザー）１３１、ポッケルセル１３２、ビームサイジングテレスコープ１３３，半波長プレート１３４、ペリスコープ１３５，低速機械的安全シャッター１３６、ＤＯＥ１３７，ＤＯＥイメージングテレスコープ１３８，任意の０次（0-order）ビームブロック１３９、走査ミラー１４０，走査（または、ピューピルトランスファー）レンズ１４１、縦型顕微鏡１４２，検出システム１４３，ＰＭＴ検出のための電流／電圧変換器／シグナル増幅器、データ収集ユニット１４５、任意の第二の検出器（ＣａｍｅｒａまたはＰＭＴ）１４６，およびデータ保存のためのＰＣおよび装置コントローラー１４７、を含みうる。

本発明のある例示的な実施態様に従って、ポッケルセル１３２が、電圧入力によって制御されて励起レーザー強度を調節し、そして、本質的には高速シャッターとして働くことができる。ビームサイジングテレスコープ１３３は、ＤＯＥ１０８と組み合わさって、顕微鏡の入力ポートにて、慣用の大きさのビームを提供し、顕微鏡の対物レンズの後の開口を適当に満たすことができる。用いたＤＯＥのタイプに応じて、半波長プレート１３４は、回折効率を変更し、そしてゼロ回折次ビームレットの強度を他のビームレットと同じにするために用いられうる。ペリスコープ１３５は、縦型顕微鏡の入力ポートにレーザービームを配信するためにミラーを含みうる。ＤＯＥイメージングテレスコープ１３８は、ＤＯＥ１３７表面のイメージを、スキャンニングミラー１４０の略平面に伝える。その代わりにまたはそれに加えて、例えば、光学ゼロ次ビームブロック１３９を用いて、このような例示的な目的のために薄い金属ロッドを用いることが可能となり、中心位置ではビームレット無しにパターンを生じるように設計されまたは構造化されたＤＯＥと共に用いることができ、そして意図したものではないゼロ次のビームレットを生じる。

例示的な縦型顕微鏡１４２は、二光子蛍光検出のための標準２色素子１４２ａ、チューブレンズ１４２ｂ、顕微鏡対物レンズ１４２ｃ、および顕微鏡明視野照明コンデンサー１４２ｄを含むことができる。検出システム１４３は、短波長光を検出し、そして、放射波長光のみを含むための、例えば、バンドパスフィルター１４３ａ、イメージングポート（一つのポートは、従来の全てがファイルされたＰＭＴ検出のために用いることができ、一方、他のポートは、カメラを用いて高速イメージングのために用いることができる）間の切り替えのための標準顕微鏡３眼顕微鏡チューブ１４３ｂ、冷却したＣＣＤカメラ、および従来の低速のスキャンニングイメージング１４３ｄのための任意のＰＭＴを含むことができる。任意の第二の検出基（例えば、カメラまたはＰＭＴ）１４６は、順方向での光学シグナル（例えば、二光子励起蛍光または第二高調波発生（ＳＨＧ）シグナル）を集めるために用いることができる。

回折空間光モジュレータを用いるという前提は、多くの複雑な光学システム（例えば、生物イメージングに用いることができるレーザー走査顕微鏡の励起光学装置）が、多くの異なった画像診断技術の目的のために、例えばレンズ、スキャンニングシステム等の組合せで実施されている、波面モジュレータとして考えられうる。例えば、非線形現象（例えば、二光子蛍光または第二高調波発生イメージング等）に基づいた複雑な光学システムのために、励起経路は、もし従来の走査アプローチがとられた場合に刺激された試料の位置を特定するものでありうる。顕微鏡対物レンズは、モジュレータのタイプとして操作でき、そしてレーザー源（例えば、平面電磁波）からの平行ビームを球面電磁波へと変換する。球面電磁波は、焦点に集光して、その点からの光学シグナルを生じる。

Ｆｉｇ．１（ｄ）は、励起ビーム１５２、１５３を動かし（例えば、平面波長１５２の伝搬の方向を変更する）、従って試料平面上の焦点１５４が動いて試料の異なったポイントから光学シグナルを集める、例えばスキャンニングシステム１５１（ａ）（例えば、ガルバノメーターミラーを含む）を含む、本発明の開示に従った顕微鏡１５１の例示的な実施態様を示している。用いられる画像診断法に依存して、光学シグナルはまた、例えば、光電子増幅管またはカメラ等のイメージング光学要素を用いて検出されうる電磁波でもありうる。

本明細書中に記載した基本的光学的変換（例えば、対物レンズ１５１（ｂ）による、平面波１５２の球面波１５３への変換）に加えて、レンズが、もっと一般的な光学フーリエオペレーターの機能を果たすことででき、レンズから離れて平面上に配置された出力源（例えば、平面波）により生じる電磁気波の空間周波数の、焦点面上に配置された仮想ポイント出力源の位置への変換、そして、レンズの後の波面（例えば、球状波）に対応する。光学フーリエ変換の追加の情報および実施例は、例えば、Lehar, Steven, "An Intuitive Explanation of Fourier Theory（http://sharp.bu.edu/~slehar/fourier/fourier.html, 最後のアクセスは、２００９年９月２３日）で見ることができる。

従って、顕微鏡は、イメージ化を達成するために、出力源からの光の波面を種々の方法で試料中の波面へと変化させうる、満足のいく光学モジュレータである。従って、本発明の開示に従った顕微鏡構造のある例示的な実施態様では、全ての励起光学経路（または、少なくとも、ビームを動かすその動力部分）は、新しい複雑なイメージング計画、例えば、同じ時間においていくつかの点を励起すること、を実施するために、単一の要素回折光学モジュレータによって置き換えられうる。例えば、ほぼ普遍的な光学波面の変換が可能であるこのような例示的なモジュレータは、回折空間光モジュレータ（ＳＬＭ）と呼ばれうる。

本発明の開示の、ある例示的な実施態様に従って用いられうるＳＬＭの例は、ネマチック液晶の２次元マトリックスに基づいており、そこでは、各々のピクセルは、波面を局所的に遅らすために用いられる。例示的なＳＬＭの一つの例示的な特性は、それが可動部を排除しうることである。従って、ビームスキャンニング、例えば、単に異なったパターンをモジュレータに送るのみによって達成されうる。例示的なＳＬＭはまた、超高速パルスの分散が無視できると考えられるので、非線形のイメージ化に適している。

Ｆｉｇ．１（ｅ）は、他の例示的な実施態様であって、ＳＬＭを用いた本発明の開示に従った光学システムおよび顕微鏡システム／構成の設計の略図を示している。例えば、この例示的な光学システムおよび顕微鏡システムは、例えば、レーザー源１６１、光ファイバー１６２，平行レンズ１６４、ＳＬＭ１６５、コンピューター１６６，カメラ１６７、ファイルター１６８、レンズ１６９，２色（レンズ）１７０、およびその下に試料１６０を置くことができる対物レンズ１７１を含みうる。

本明細書中で述べたように、ハードウエア（例えば、光学スキーム）の複雑性をソフトウエア（例えば、位相マスク計算）に移すことにより、本発明の開示に従った例示的なＳＬＭに基づいた顕微鏡が作られ、それは、最少の数の従来の光学要素（例えば、レンズ）を持ち、そしてそれ故光学的に簡単でありうる。

Ｆｉｇ．１（ｆ）は、本発明の開示の、ある例示的な実施態様に従ったＳＬＭに基づいた顕微鏡の説明図を示している。例えば、Ｆｉｇ．１（ｆ）に示されるように、例示的な光学システムおよび顕微鏡システム／構成は、平行レンズ１８４，ＳＬＭ１８５、カメラ１８７、フィルター１８８、レンズ１８９、２色（レンズ）１９０、およびその下に例えば試料を置くことができる対象（レンズ）１９１を含む。Ｆｉｇ．１（ｆ）で図解されている例示的な顕微鏡は、Ｆｉｇ．１（ｅ）の例示的な構成と同じでもよくまた異なってもよい。

これらの例示的な顕微鏡は、例えば、出力効率を改善でき、小さくそして軽量で、手で持って操作できる。それらはまた、比較的高価でなく、従来の顕微鏡で可能であったより、より広い種々の使用用途においてより大きな利用を提供でき、ならびに、本発明の開示のある例示的な実施態様に従った、より大きな例示的な顕微鏡も提供できる。例えば、使用および用途は、例えば、ＳＬＭ 二光子（２Ｐ）光刺激および／またはイメージ化（例えば、出力制限）、例えば、インビボおよび／または他の医薬用途のための１光子（１Ｐ）光刺激、薬物送達および／または送達、およびインビボ２Ｐ顕微鏡を、含みうる。本発明はまた、従来存在する技術の知られている技術的複雑性のため、一般に２Ｐおよびイメージングを用いないであろうユーザーに対してもまた魅力である。

光学的性能に対するゴール（例えば、エンドユーザーのゴール）は異なり得るので、励起と検出の問題を分けることも可能である。例えば、励起パスは、例えば光刺激（例えば、光活性化化合物、一般には、修飾ニューロン他）の目的のため、または複数点でのイメージングのために、出力供給を提供できる。光活性化化合物は、例えば、電磁波によって活性化される化合物の殆どが含まれうる。活性化に加えて、光刺激（または、光活性化）は、例えば、細胞等の内での、阻害、非活性化および生物学的代謝工程の変化を含みうる。

本発明の開示の、ある例示的な実施態様に従って、ＳＬＭそれ自体が、上記したようにして、複雑な光学装置の機能を実行するために構造化または構成されうる。例えば、例示的な仮想レンズは、例えば、約０．１ＮＡ（例えば、ＨＤＴＶ分解能をもつ所与の開口／大きさの例示的なＳＬＭのための）の開口数をもつ、例示的なＳＬＭによって提供されうる。さらにあるＳＬＭの例示的な実施態様に従って、開口数はもっと大きくできる。２Ｐの用途に適用できるか否かについては、開口部の大きさと数は、ＩＰ用途に比べてより重要でないであろう。例えば、より大きな数の開口数は、ある種の用途（例えば、大きな作業距離が好ましい場合の、ＩＰインビボ光刺激）には有利でありえる。

従って、ＩＰ用途（例えば、Ｒｕ化合物を用いた）のためには、または２Ｐ発色団が利用できない場合は（ＣｈＲ−２）、顕微鏡は、出力眼１６１（例えば、ブルーレーザーまたは通常の可視光ファイバー）および例示的なＳＬＭ１６５のみのように単純であることができる。光学要素に関しては、例えば、励起パスが、例示的な伝達性ＳＬＭ１６５およびシングルモードファイバー１６２を含むことができる。ある実施例では、ＳＬＭ１６５のために偏光を維持することが好ましい。従って、ファイバーから広がる非回折光が焦点外であることができるので、ゼロオーダーを遮断する必要がないことが可能である（例えば、中心を外れているが軸面中に配置のアナログとして考えることができる）２Ｐ用途のためには、例えば、より良い焦点調節を得るために、ＳＬＭ１６５の後に通常の顕微鏡対物レンズを用いることができる。

単純化および本発明の開示に従った例示的な顕微鏡を軽量かつコンパクトサイズにするためには、超高速パルスを伝えることができる光結晶バンドギャップファイバーを用いることができ、それは、真にポータブルな二光子顕微鏡を提供することを助けることができる。本発明の開示に従った例示的な顕微鏡をよりポータブルにするために、カメレオン（Chameleon）を、幾分より小さな、例えば、コンパクト超高速ファイバーレーザーに置換することができる。例えば、ＩＭＲＡからのレーザーは、本発明の開示のある種の実施態様に適しており、それらは非常に小さいと考えられており、現在、７８０ｎｍと８００ｎｍのモデルが入手できる。コンパクトな超高速ファイバーレーザーを選択する際に考えられる他の要素は、例えば、出力、コスト等でありえる。

放出経路（イメージングのための）の実施例：
純粋な光刺激用途でさえ、最初に光刺激の領域を標的とする（例えば、細胞本体の位置を決める）ことが有用で有り得る。このタイプの標的化は、完全に分離したシステム（例えば、コンパクトなＬＥＤの広視野照射および小さなカメラ）によって達成できる一方、本発明の開示に従った、ある例示的な実施態様は、例えば、本明細書で記載したＳＬＭが用いられうる他の機能性の全てに加えて、このタイプの標的化にＳＬＭを用いることができる。もし目的が較正イメージをえることのみである場合は、一般に一度しか行わないので、スピードは重要でないかもしれない。例えば、光検出器（例えば、光電子倍増管（ＰＭＴ）、または小型アバランシェフォトダイオード）を用いて、本発明の開示のある例示的な実施態様に従って、ＳＬＭを用いて視野を走査することが可能である。高分解能２Ｄイメージを得るためには、他に比べて長時間必要であるが、この例は、実施が便利であると考えられうる（複雑な計算に直接依存するのとは対照的に、ソフトウエアは、位相パターンを計算するために用いることができる）。２Ｄ検出器は、本発明の開示の、ある例示的な実施態様において、高速イメージングのために用いることができる。例えば、マイクロチャンネル平面画像増倍管に連結した小型カメラもまた用いることができる。

本発明の開示の例示的な実施態様に従った２Ｄ検出器を実施する例示的な段階は、例えば、
１．光が透過するＳＬＭの取得、ハンドヘルドＳＭＬのみのＩＰ顕微鏡の組み立て、複雑なイメージングをすることなしにＩＰ刺激のための試験、
２．ＳＬＭのみ＋ポイント光検出器を用いてイメージングを試験、
３．対物レンズの追加−２Ｐ出力放出
４．光検出器による２Ｐイメージ化の試験、
５．２Ｄ検出器の追加、高速イメージングプロトコールの開発
６．２Ｐモデルポータブルを作成するために超高速ファイバーの導入、および
７．カメレオンをコンパクトなファイバーレーザーと置換
を含むことができる。

本発明の開示の、ある例示的な実施態様に従って、２Ｄ検出器中で用いることができる例示的な要素は、例えば、
１．光透過性ＳＬＭ
２．全てを一緒に保持する小さな実験用回路板
３．ホルダー／アダプター／レンズ（例えば、Ｔｈｏｒｌａｂｓより）、
４，検出器：アバランシェフォトダイオード／マイクロチャンネル２Ｄ検出器（科学的グレードまたはナイトゴーグルから）、
５．ファイバー、例えば、
約４７２ｎｍのＩＰブルーレーザー、および、約７００ｎｍまたは８００ｎｍ ２Ｐのための１〜１．５ｍの超高速フィルター（例えば、結晶ファイバーより）、
６．ファイバー配置構成（例えば、Ｔｈｏｒｌａｂｓより）、
７．ＩＭＲＡレーザー
を含むことができる。

追加の例示的な利点および／または有利な点は、例えば、ＩＰイメージングセットアップをＩＰアンケージング（例えば、新たに開発したＲｕｂｉケージド化合物、例えば、Ｒｕｂｉ−グルタメートおよびＲｕｂｉ−ＧＡＢＡのファミリーを用いて）および／または一般的に修飾した細胞および２Ｐアンケージング／空間選択イメージングを用いた光刺激、ただし広範囲の用途に用いることができるポータブルなアンケージャー（例えば、Ｒｕｂｉ−ケージドは、例えば光線力学療法に有用でありうる）へとアップグレードできるアドオンモジュールを構築することができることを含みうる。考え得る追加の要因は、例えば、液晶ＳＬＭの時間分解能（光刺激および／または構造的照射イメージングにとっては受容でないと考えうる）、動力伝達（動力効率の良いレーザーが、動力懸念を相殺する）、および高速イメージングおよび位相パターン計算を実行するための単一のコンピューターの使用である。

（例示的な多重レーザーアンケージング）
ニューロンを、ケージドグルタメートを用いて確実に発火させることを容易にするための、本発明の開示の例示的な実施態様に従った光学方法およびシステムが提供できる。二光子励起の点広がり関数（ＰＳＦ）は、ニューロンを作動電位閾値へと効果的に消極するためには、十分量の遊離のグルタメートを放出するには余りに小さい。ニューロンを作動電位へと確実に発火させるために、同時起こる光刺激とカルシウムイメージングのために、標的細胞である体細胞上にアンケージング位置を置くことができる。

例えば、Ｆｉｇ．２（ａ）〜（ｃ）は、ビーム多重化を用いた例示的なＭＩＮＩ−グルタメートの二光子光刺激と関連した例示的な説明図を示している。

特に、Ｆｉｇ．２（ａ）は、時間的ビーム多重化を用いたアンケージングで起こりうる例示的な結果の説明図を示している。特に、イメージ２１０は、例示的なパッチ（patched）細胞および円を形成する３セットの１２アンケージング標的２１１の位置を提供しており、それらは引き続いて刺激される（点あたり２．５ｍｓ）。Ｆｉｇ．２（ｂ）中のドット２１２は、イメージング標的を表している。スケールは、約１０μｍである。

Ｆｉｇ．２（ｂ）は、アンケージングの空間分解能の例示的な結果のグラフを示している。例えば、上部出力２２１は、Ｆｉｇ．２（ａ）で示される位置においてアンケージングしている間のニューロンの例示的な電気生理学的記録を示している。この例示的な図に示されるように、位置１中のアンケージングは、作動電位の爆発を誘発できる。保持電位は、例えば、約−６５ｍＶでありうる。下部出力２２２は、例示的なレーザーパルスを示している。Ｆｉｇ．２（ｂ）の例示的な位置２および３に示されるように、作動電位閾値は、いつも達成されるわけではない。

さらに、Ｆｉｇ．２（ｃ）〜（ｅ）は、回折光学素子（ＤＯＥ）空間ビーム多重化を用いたアンケージングの例示的な結果を示している。特に、Ｆｉｇ．２（ｃ）は、線形ＤＯＥパターンによって刺激された例示的なニューロンを用いて得ることができる例示的な結果の説明図である。ドット２３１は、アンケージング標的およびイメージ標的を示しているドット２３２を示している。スケールは約１０μｍである。

Ｆｉｇ．２（ｄ）は、ＤＯＥ２４０がレーザービーム２４１を空間的に分割し、同時に５つの点を照射できるパターン２４２を作り出し、従って作動電位閾値に達するために要求されるアンケージング時間を短くしている、実施例の図を示している。例えば、ＤＯＥ２４０および連続多重化は、組み合わされて、Ｆｉｇ．２（ｃ）の例で示されるように、全部で２０の点２４２が、１回に５つで、照射される。Ｆｉｇ．２（ｅ）は、ＤＯＥ光刺激の実施例のグラフを示しており、スパイク２５２によって説明されるようにスパイキングを生じるための、線２５１に示されるように素早いアンケージング時間を説明している。Ｆｉｇ．２（ｅ）と関連した例示的なパネルは、Ｆｉｇ．２（ｂ）と関連したものと同様でありえる。

Ｆｉｇ．２（ｆ）は、ビーム多重化二光子アンケージングの深度分解能の例示的な結果のグラフを示している。例えば、カーブ２５４は、異なった深度においてアンケージングパルスにより誘導される作動電位の数を示しており、誘導されうる作動電位の最大数に対して標準化している。曲線２５５は、各焦点面の二光子蛍光を示しており、対応する体細胞の最大蛍光に対して標準化している。示されているように、これらの曲線２５４および２５５の間の密接な対応が見られうる。従って、二光子光刺激の軸分解能は、二光子蛍光イメージングの３Ｄセクショニング特性に密接に従いうる。例示的なアンケージングは、例えば、例示的な４ｘ３ｍｓ、20x 0.5 NA対物レンズで、５ビームレットＤＯＥプロトコールにて実施することができる。エラーバー２５６は、平均（ＳＥＭ）の標準誤差でありうる

Ｆｉｇ．２（ａ）の例示的な説明図に戻り、例示的な「複合」刺激標的（S. Shoham、前掲、参照）２１１は、例示的な刺激されたニューロン２１０のそれと同様の直径をもち、そしてそれらのアンケージング応答の空間分解能はまた、細胞本体の平均直径に匹敵しうる。同時のイメージングおよびアンケージングのために、例示的なイメージング標的２１２が例示的な刺激標的２１１の中心であるように、単一のイメージング標的を刺激標的の中心に位置決めできる。

アンケージングの時間分解能を改善し（例えば、作動電位発火閾値に達するまでに必要な時間を減少する）そして可能なレーザー動力をもっと有効に利用するために、任意に、レーザービーム２４１を、体細胞の周りの異なる空間位置の同時のアンケージングのために、近接して間隔を空けたいくつかのビームレット２４３に分割できる。Ｆｉｇ．２（ｄ）の例示的なグラフに示されているように、このことは、例示的なＤＯＥ（Froner E Sacconi L, Antolini R, Taghizadeh MR, Choudhury A, Pavone FS., Opt Lett. 28 (20), 1918 (2003)参照）２４０を用いて実行され、それは、例えば、非線形顕微鏡に適した効率的な単一要素ビーム分割器でありうる。このような例示的なＤＯＥ２４０は、例示的な左右対照の線形５スポットパターン２４２を、遠視野（第一の回折次数）内に作り出すことができる。例示的なＤＯＥ２４０は、例えば、Ｆｉｇ．７（ａ）〜７（ｃ）を参照して以下に記載されるように、走査ミラーの平面と光学的に共役させた平面の光テーブル上に置かれうる。中間のテレスコープの倍率は、例えば、ニューロン体細胞２４４の大きさをほぼ覆う、例えば５ビームレット２４３のパターンを出現するために、顕微鏡の対物レンズに従って調整できる。

複雑な標的２３１と組み合わせた、例示的なＤＯＥモード２４０の使用は、より短いアンケージングパルスの使用を容易にする。多くのニューロンは、１０〜１３ｍｓのアンケージングパルスによって刺激されて、約３〜７の作動電位の短い爆発を生じることができ、そしてＦｉｇ．２（ｅ）中の、例示的なパルス２５３によって示されるようにして、５ｍｓという短いアンケージングパルスを用いて個々の作動電位を誘発することが可能である。例示的なＤＯＥ２４０は、ＰＭＴは、例えば、分離したビームレットによって同時に照射される５つの空間的に異なる体細胞位置２１０をサンプリングすることができるので、アンケージングの効率を上昇させるばかりでなく、ベクターモードイメージングのための点測定のシグナル−ノイズ比を改善する。

ニューロンの作動電位応答および二光子蛍光の両者をモニターし、一方、アンケージングレーザーの焦点面を体系的に変化させることにより、これらの例示的なビーム多重化アンケージング方法の軸分解能を測定することが可能である。例えば、約３０μｍの軸の位置ずれは、Ｆｉｇ．２（ｆ）の例示的なグラフの例示的なトレース２５４に示されているように、アンケージングパルスに対するニューロンの応答を効果的に防ぐことができる。二光子蛍光プロファイルはまた、Ｆｉｇ．（ｆ）の例示的なトレース２５５によって示されているように、焦点面に依存しうる。これらの例示的な結果は、本発明の開示に従った例示的なアンケージング方法の光学セクショニング能力を示しており、例えば、二光子励起の固有の性質である。

（回折光学素子を用いた二光子イメージング）
Ｆｉｇ．２（ｇ）および（ｈ）は、本発明の開示のある例示的な実施態様に従った、水平ＤＯＥモードでの二光子イメージングを強化するための、回折光学素子（ＤＯＥ）の例示的な実施を示した概略図である。

例えば、Ｆｉｇ．２（ｇ）は、従来のレーザースキャンイメージングが、励起ビームが視野を横切って走査するためのミラーシステムのために時間がかかること、および光ダメージが起こりうる前の可能な励起量に関してある上限がありうることを示している。Ｆｉｇ．２（ｈ）は、回折光学素子（ＤＯＥ）２６０を用いてビーム２６１を複数のビームレット２６２に分割できることを説明している。水平方向に広がったビームレット２６２を用いて、各ピクセルにて、試料によって励起されたシグナルの総和が、より大きなシグナルでかつ増加したシグナル対ノイズ比を生じることを可能とする方法にてイメージできる。水平ＤＯＥモードモードまたは「励起ブースト」の本発明の開示に従った例示的な実施態様は、例えば、ラインスキャンまたは全分野のフレームスキャンのために用いることができ、それは、例えば、空間分解能の経費である。

Ｆｉｇ．２（ｉ）および（ｊ）は、本発明の開示のある例示的な実施態様に従った、垂直ＤＯＥモードにて二光子イメージングを強化するために回折光学素子（ＤＯＥ）を用いた代表的な概略図を示している。

垂直ＤＯＥモードまたは「スピードブースト」の本発明の開示に従った例示的な実施態様は、従来のレーザー走査に比べてより大きな走査スピードを達成できる。間隔をあけて視野の垂直面上に広範囲にわってＤＯＥ作成ビームレットをおき、そして個々のビームレットを同時に水平方向に視野の狭いストリップを横切って走査することにより、１／（ビームレット数）で、単一のビームに要求される時間と同じ時間にて、全視野を励起できる。例えば、それぞれ、視野２６５および２６６の各図の左側の矢印２６３および２６４によって示されるように、標準のレーザースキャンモードにおいては、単一のビームは、下の全高に沿って、水平方向にラインスキャンしなければならない（例えば、矢印２６３）。これに対して、例示的なスピードブーストモードでは、各ビームレットは、視野の垂直面の部分を同時にスキャンできる（例えば、矢印２６４）。少なくとも複数のビームレットを同様の分解能をもった、カメラまたは他の同様の広視野光（または電磁気）収集装置（例えば、フォトダイオードアレイまたは多陽極光電子増倍管）は、１以上の領域が同時に励起されるので、この例示的な方法で用いることができる。

Ｆｉｇ．２（ｋ）〜（ｏ）は、本発明の開示のある例示的な実施態様に従った、水平回折光学素子（ＤＯＥ）モードでのラインスキャンニングの例示的な結果を示している。

Ｆｉｇ．２（ｋ）は、Ｆｕｒａ２ペンタポタジウム塩で満たされたニューロン２７０の、例示的なフルフレームレーザースキャンイメージ２７１および２７２を示しており、従来の単一ビーム励起（イメージ２７１）および例示的な５つのビームレット励起（イメージ２７２）を用いて得た。示されているように、複数のビームレットを用いて、ニューロンのイメージは、僅かに不明瞭となっている。しかしながら、狭い間隔は、細胞が明らかに区別できる程度までこの不明瞭を最小化できる。これらのイメージは、ラインスキャンニングのレベル（例えば、それぞれのイメージの、白の水平ライン２７３および２７４）を選択するために用いることができる。

Ｆｉｇ．２（ｌ）は、単一ビーム（イメージ２７５）およびマルチビーム（イメージ２７６）励起を用いて秒当たり８０スキャンにて得られたラインスキャンの例示的な結果を示している。示されるように、時間は、水平軸に示され、各垂直カラムは、１回のスキャンを示しうる。体細胞を含むラインスキャンの例示的な限定された間隔の程度は、表示するために示したものである。ニューロンは、パッチクランプされ、光学記録中、発火作動電位まで駆動された。

Ｆｉｇ．２（ｍ）は、Ｆｉｇ．２（ｌ）に示された例示的なラインスキャンの強度対時間プロファイルの例示的なグラフを示している。示されるように、生の輝度強度は、変化する輝度ユニットの各グラフがほぼ同じスケールで描かれうる。カルシウム一過性が、例えば、Ｆｉｇ．２（ｏ）で示されるように、ホールセルパッチクランプ電流クランプトレース中に示される、作動電位発火の回数に対応して目で確認できる。この実験では、細胞は、１から始まり５で終わる、作動電位の増加した数が発火するために誘導された。カルシウム一過性は、両方のイメージ中の作動電位の数に対応して単調に大きくなっているが、５つのビームレットの例示的な実施態様ではより鮮明に見ることができる。Ｆｉｇ．２（ｎ）に示された結果は、Ｆｉｇ．２（ｍ）の実施態様からのものと同じデータからであるが、ベースライン（ＤＦ／Ｆ）からのパーセントの変化が、トレース２７７および２７８で同じになるように再プロットしてある。確認されるように、所与の数のスパイクによって誘導されたカルシウム一過性は、ノイズは５つのビームレット実験で減少しているが、両方の条件でほぼ同じ振幅であり、このことは、ＤＯＥイメージングで、より大きなシグナル対ノイズ比となりうることを示している。この実験では、単一ビームイメージングに比べて、シグナル対ノイズ比は、例示的な励起ブーストＤＯＥイメージング結果にて、約１．９１±０．２４倍（ｎ＝５シグナル）に改善された。

Ｆｉｇ．２（ｐ）および（ｇ）は、本発明の開示のある例示的な実施態様に従って、回折光学素子（ＤＯＥ）を用いて強化されたフレームスキャンの例示的な結果を示している。

Ｆｉｇ．２（ｐ）は、従来の単一ビーム励起（イメージ２７９）および５ビームレット励起（イメージ２８０）を用いて得られた、Ｆｕｒａ２−ＡＭカルシウム指示薬染料を負荷された、大量のニューロンの集団のフルフレームレーザースキャンイメージを示している。この実験は、水平ＤＯＥモードは、僅かに空間分解能が減少しているが、一般的な単一細胞の分解能を考慮した場合には問題となる程度ではないことを示した。イメージ２７９および２８０は、平均ピクセル幅撮影の産物である。Ｆｉｇ．２（ｑ）は、Ｆｉｇ．２（ｐ）の矢印２８２で示された細胞２８１の視野の、低速度撮影の強度対時間プロファイルを示している。スケールは、グラフ２８３および２８４で同じであるが、輝度単位は垂直軸、秒単位は水平軸である。目的のニューロン２８１は、パッチクランプされて駆動され、光学記録の間３つの作動電位のセットを発火した。カルシウム一過性は、作動電位発火（矢印２８５と垂直ライン２８６で示される）の回数に対応して観察できる。シグナル対ノイズ比は、この実験では、単一ビームイメージングに対して、励起ブースト複数ビーム励起ブーストフレームスキャンモードでは、平均１．９５±０．７２倍に改善された

Ｆｉｇ．２（ｒ）〜２（ｔ）は、本発明のある例示的な実施態様に従って、垂直回折光学素子（ＤＯＥ）モードを用いてスキャンした例示的な結果を示している。

Ｆｉｇ．２（ｒ）は、視野にわたって垂直に広がった複数のビームを用いたペーパー試料の進行性の全視野スキャンニングおよびＣＣカメラでの捕捉の結果を示している。イメージ２８７ａは、「ラインスキャン」であり、ビームレットの数と同じ、複数のラインの励起を生じている。イメージ２８７ａからイメージ２８７ｂ〜ｄへの移動に伴い、本システムによって実施されたスキャンニングの実証の結果が確認できる。ビームレットは、各イメージ２８７ａ〜ｄでより長い時間にわたってスキャンでき、その結果、カメラにより各フレーム捕獲で、完全な視野をカバーできた。

Ｆｉｇ．２（ｓ）は、ＰＭＴ検出を備えた従来の単一ビームを用いたパッチクランプしたニューロンのフルフレームスキャンニングの結果を示している。実験的な動画像が、１秒当たり１フレームで取得できた。グラフは、矢印２８８ａで示される細胞２８８の強度対時間プロファイルおよびパッチクランプ記録を示しており、細胞は、作動電位の増加した数の爆発（burst）へと駆動される（例えば、爆発当たりの作動電位の数は、トレース２８９の下に示され、そしてそのタイミングは、点線の垂直線２８９ａのイメージングトレース中に示される）。輝度トレースの垂直軸は、輝度単位であり、そして水平軸は秒である。

Ｆｉｇ．２（ｔ）は、１１ビームレット励起およびＣＣＤカメラでのイメージングを用いた、ニューロン集団の垂直ＤＯＥスキャンニングの例示的な結果である。実験的な動画像は、秒当たり１０フレーム収集した。トレース２９０中のスパイク２９０ａに示されるように、２または３の作動電位の爆発の回数に対応するカルシウム一過性は、例えば、ＤＯＥベースのイメージングにより生じるカルシウム指示薬トレース中で、単一ビームラスタースキャンに比べて、より容易に確認できる。さらに、爆発あたり９から１１の作動電位によって生じるカルシウム一過性は、いずれの場合においても容易に区別でき（例えば、スパイク２９０ｂ）、それらは、スピードブーストイメージングのこの例示的な実施態様において約２．１５倍大きいシグナル対ノイズ比を持つことが見出された。

Ｆｉｇ．２（ｕ）および（ｖ）は、本発明の開示のある例示的な実施態様に従って、回折光学素子（ＤＯＥ）を用いたサブミクロンビーズのイメージングの例示的な結果を示している。この実験では、０．５μｍの蛍光ビーズが、単一ビーム２９２（イメージ２９１、Ｆｉｇ．２（ｕ））およびフレームスキャンモードの５ビームレット２９４ＤＯＥ（イメージ２９３、Ｆｉｇ．２（ｖ））を用いてイメージ化された。ビーズは、試料の全駆動の３０ｍＷで、約８００ｎｍとしてイメージ化された。イメージングソフトウエアにて、１０倍ズームで２０x 0.95NA対物レンズを用いて、ビーム当たり約５〜７ｍＷが用いられた。この実験では、１．５μｍのビームレット間距離および７．５μｍの全５ビーム展開で、ピクセル当たり０．２μｍであった。

Ｆｉｇ．２（ｗ）および２（ｘ）は、本発明の開示のある例示的な実施態様に従ったスピードブースト垂直回折光学素子（ＤＯＥ）スキャンニングモードかつスピードブーストモード装置同期化でのスキャンニングの例示的な結果を示している。

この実験例では、スキャンニングのタイミングと調整に向けるために、スピードブーストモード垂直ＤＯＥスキャンニングモードの間のカメラ露光とレーザー強度、ＣＣＤカメラ露出およびガルバノメーターミラーベースのスキャン回数での取得が同期化された。Ｆｉｇ．２（ｗ）に示されるように、例示的なスキャンニングソフトウエアが活性スキャンニングを示している出力を送っている限りの間ＣＣＤチップが単純に露光されているので、対角線２９６（斜め矢印２９６ａによって示されている）のアーティファクトが現れる。全強度のレーザーパルスの時間の長さが特異的に制御されそしてレーザー動力が０に下げられていたので、このアーティファクトは、イメージ２９５ｂに見られるように除かれうる。

この影響は、「フライバック」（例えば、Ｆｉｇ．２（ｘ）のフライバック２９６参照）または次のスキャンのための準備における最終位置からもとの位置へのガルバノメーターミラーの移動によると考えられる。この実験においては、ガルバノメータースキャンニングシステムが独立して動き、そしてカメラフレームタイミングおよびレーザー強度がシステムのタイミングに従うことが、逆の、本実験にて用いられた特定のイメージングおよびスキャンニングシステムの、所与のそれぞれの応答時間に比べてシステムがより良く動作することがわかった。レーザー出力を制御する電圧パルスは、ポッケルセルを介して設置され、スキャンの詳細に依存して特定の数のミリ秒まで続いた。さらに、例示的なカメラ露光制御は、フレームスキャン出力の終わりによって停止され、そして引き続くスキャンの開始を失敗しないように、即座に再開した。

回折光学素子をもった二光子イメージングの追加の例および実験例は、Watson, Brendon O., Nikolenko, Volodymyr, and Yuste, Rafael, Two-photon imaging with diffractive optical elements, Frontiers in Neural Circuits, 3, 1 (2009)を参照できる。

（単一細胞分解能をもったシナプス入力の例示的な二光子マッピング）
Ｆｉｇ．３（ａ）〜（ｆ）は、本発明の開示の例示的な実施態様に従った、単一細胞分解能をもった二光子入力マッピングの本発明の開示の例示的な結果の説明図を示している。

特に、Ｆｉｇ．３（ａ）は、層５ピラミッドニューロンおよび樹状突起３１１の重ね合わせた形態的再構築の例示的な入力マップの説明図を示している。この実施例では、Ｆｉｇ．３（ａ）の上部パネル３１０に示されるように、領域３１２は、刺激されたニューロンの輪郭を示すことができる。他の領域は、全て、「真陽性」として説明され、例えば、ピークＥＰＳＰ振幅に従ってコードされうる。スケールは、約１００μｍである。点線輪郭３１４は、例示的なパッチピペットを示している。下部パネル３１５は、アンケージングの間、パッチ細胞からの例示的な電圧記録３１６（上部トレース）を示しており、矢印３１８によって標識される位置のレーザーパルス３１７（下部トレース）に対応している。保持電位は、例えば約−６５ｍＶでありうる。

Ｆｉｇ．３（ｂ）は、同じニューロンからの擬陽性シグナル３２１の例示的なマップ３２０の説明図を示している。この実施例に示されるように、例示的な樹状突起３１１の形態が追跡されうる。下部パネル３２５は、それぞれ、矢印３２８、３２９として標識された対応する位置のアンケージング中の擬陽性シグナル３２６および３２７の記録を示している。この例示的な説明図に示されるように、真陽性および擬陽性シグナル間の異なった動力学および振幅が提供されうる。

Ｆｉｇ．３（ｃ）は、真陽性シグナルが、単一のシナプス結合であることを示している例示的な結果の説明図を示している。矢印３３２によって示された例示的なシナプス後のニューロン３３１は、接続され、そしてドット３３３によって標識された全てのニューロンが、連続的に刺激されうる。この実施例に示されるように、ドット３３４によって標識されたニューロンは、真陽性シグナルを与えることができ、そして引き続いてパッチクランプされる。示されるように、ニューロン３３１と３３４の間には、著しい距離がありうる。スケールは、約５０μｍでありうる。

Ｆｉｇ．３（ｄ）は、２つのニューロン３３１、３３４からの例示的な二重の記録のグラフを示しており、単一のシナプス結合が明らかにできる。Ｆｉｇ．３（ｄ）中に示されるように、作動電位は、推定上のシナプス前のニューロン３３４中の電流注入によって有春され、それは、トレース３４１によって示されうる、そしてトレース３４２によって示されるようにシナプス後の細胞３３１中の時間固定されたＥＰＳＰを引き起こしうる。Ｆｉｇ．３（ｄ）の拡大図３４３中に示されるように、作動電位のオンセットおよびＥＰＳＰ間の対応が提供されうる。両方のニューロンは、例えば、−６３ｍＶに保持されうる。

Ｆｉｇ．３（ｅ）および（ｆ）は、２つのさらなる実施例の、単一のシナプス結合真陽性細胞の本発明の開示に従った例示的な実施態様のグラフを示している。

例えば、異なったニューロンへのシナプス入力のマッピングは、選択されたニューロンからの電流クランプ中で電気生理学的記録を実施し、そして本明細書に記載されているように、マウスの体性感覚および視覚皮質の切片の周辺領域の殆どのまたは全ての標識されたニューロンを光刺激する（例えば、Ｆｉｇ．３（ａ）、ｎ＝１６９マップ）ことにより実行できる。１光子アンケージングマッピング、例えば、赤外線ガイド顕微鏡で今まで用いられてきたニューロン／層／皮質の確認のための他の方法に対して、標識皮質ニューロンへのＡＭ−ｄｙｅ負荷を用いることも可能である。（H. U. Dodt、前掲、参照）。典型的に例示的な実施態様では、１０倍の対物レンズおよび１．５倍のスキャンニングズームを用いて、例示的な方法で、Ｆｉｇ．８を参照して以下により詳細に記載されるがそのようにして、例えば、単一の焦点面中に、約７００〜１０００の標識細胞を検出できる。これらのパラメーターは、例えば、単一視野の全ての皮質層を可視化するために便利である。全ての単一細胞を刺激し、合理的時間内でプロトコールを完了することが可能であるが、刺激されるニューロンの数は、例えば、約５００に制限され、特定のまたは疑似ランダム様式にてニューロンが標的とされる。対照として、パッチされた（接続された）細胞は、例えば、光刺激プロトコールの終わりに、アンケージングによって刺激されうる。

本明細書に記載された例示的なマッピング手順および結果において、シナプス後の応答の２つの区別できるクラスに遭遇でき、それらは、例えば、それぞれ、Ｆｉｇ．３（ａ）、（ｂ）の実施例によって示されたように、アンケージングパルス３１７，３２７に対して時間固定されている（また、例えば、Ｆｉｇ．３（ｇ）の表３６１参照）。これらの例示的な事象は、１光子グルタメートアンケージングの間の記載された２つのタイプの事象と非常に似ており、化合物である単一シナプスＥＰＳＰは、シナプスの前の光刺激された細胞中の作動電位の短い爆発によって誘導化されうる（例えば、例示的な説明図Ｆｉｇ．３（ａ）として示された「真陽性」３１３）、およびより短い待ち時間をもった、より大きいそしてより遅い消極、それは、パッチクランプ細胞の遠位の樹状突起上への直接のアンケージングにより引き起こされうる（例えば、Ｆｉｇ．３（ｂ）中で閉めあれた「擬陽性」３２１）。樹状は、例示的な負荷条件では見えないかもしれず、そして細胞本体のみが、刺激プロトコールによって標的とされうるかもしれないが、樹状突起が刺激された領域の近くを横切り、そして従って、直接刺激されるようになる。アンケージングパルスに対するそれらの異なったオンセット動力学および待ち時間に基づいて真陽性と擬陽性間の区別が可能であり、そしてこれらの測定値にわたって統計的な著しい違いがありうる（表３６１参照）。加えて、パッチクランプしたニューロンの樹状の形態再構築を入力マップと重ね合わせることは、Ｆｉｇ．３（ｂ）に示すように、擬陽性シグナルがシナプス後の細胞の樹状３１１をトレースできることを示すことができ、一方、真の陽性シグナル３１３は、Ｆｉｇ．３（ａ）に示すように、同じでないであろう。

真陽性および擬陽性応答のソートは、ナトリウムチャンネル遮断剤ＴＴＸ（１μＭ）を適用して、切片における作動電位発生をし、従って全ての誘発されたシナプス性の放出を防ぐことにより確認できる。ＴＴＸ内の試料のマッピングを実施することにより、擬陽性シグナルのマップを得て、そしてそれらを、ＴＴＸの不存在での擬陽性をマニュアルでソートした結果と比較することができる。これらの例示的な制御された実施例は、擬陽性シグナルを真陽性シグナルと不正確にカウントする可能性は小さいようである（例えば、平均で０．４５％、ｎ＝１７）。これに対して、手動のソート基準を用いた場合は、擬陽性のＴＴＸ定義よりより厳しくできる。例えば、ＴＴＸ擬陽性の９９．３％がまたこのような手動で識別できる一方、手動で標識した擬陽性のたった８４％が、後に、ＴＴＸでのマッピングで確認できないであろう。

さらに、ＥＰＳＰは、作動電位が推定上のシナプス前のニューロンで誘発された後に生じ、それは短いシナプス遅延を持ち得るので（例えば、０．７９±０．４ｍｓ、ピークＥＰＳＰ振幅、１．６８±０．１ ｌｍＶ、３／３対記録）、二重のホールセル記録を用いて、アンケージングによって刺激された後に真陽性シグナルを生じるニューロンが、確かに、パッチクランプされたシナプス後にニューロンに単一のシナプス結合したものであるということが確認できる（例えば、Ｆｉｇ．３（ｃ）参照）。

（シナプス特性の例示的な機能マップ）
本発明の開示に従った方法および装置の例示的な実施態様は、推定上のシナプス前のニューロンの同定ばかりでなく、それらシナプスの性質、例えば、単一のシナプスＥＰＳＰのオンセット／オフセット動力学や振幅の測定と容易にでき、そしてシナプス前および後のニューロンの体細胞の部位に従ってそれらの分布の例示的なマップを作ることができる（例えば、振幅マップ、例えば、Ｆｉｇ．３（ａ）および９（ａ）〜９（ｄ）参照）。アンケージングは刺激された細胞中の作動電位のいくつかの短い爆発を生じたので、例えば、各入力細胞のために、より複雑なシナプス特性、例えば円滑化／低下比、可能物ＥＰＳＰの全振幅、光刺激パルス後の調節等を測定することがまた可能である。

（３次元の例示的な入力マップ）
アンケージングの光学切片性能および例示的な入力マップの制作性を証明するために、４５μｍで分離された２つの異なった焦点面での例示的なマッピングを、図解のようにして、例えば、３次元での例示的なマッピング入力を図解しているＦｉｇ．４（ａ）〜４（ｆ）に示される図解のようにして実施した。

特に、Ｆｉｇ．４（ａ）は、例示的な切片４１２（標識済 ０μｍ）の表面の焦点面で検出されうる、全てのｍａｇ−Ｉｎｄｏ−１ＡＭが負荷された細胞４１１（ｎ＝６３５）の例示的なマップ４１０の図解を示している。これらの６３５のうちの３００位置が、電位結合性のために刺激された。例示的なパッチピペット４１３は、この図中に輪郭（アウトライン？）で示されている。例示的なスケールは、約１００μｍでありうる。Ｆｉｇ．４（ｂ）は、Ｆｉｇ．４（ａ）で示される例示的なマップの４５μｍ下でありうる、負荷された細胞４１１（ｎ＝５４６）の例示的なマップ４２０を示している。これら２つの例示的な焦点面での細胞位置間の差異は、Ｆｉｇ．４（ｃ）の例示的なマップ４３０の重複によって示される。Ｆｉｇ．４（ｄ）は、例示的なマップ４４０を示しており、そこでは、位置４４１（ｎ＝２０）は、Ｆｉｇ．４（ａ）の例示的なマップ４１０の焦点面で刺激される一方、パッチ細胞の真陽性応答を生じうる。Ｆｉｇ．４（ｅ）は、例示的なマップ４５０の説明図を示している。Ｆｉｇ．４（ｅ）に示されるように、例示的な位置４５１（ｎ＝１７）は、Ｆｉｇ．４（ｂ）の例示的なマップ４２０の焦点面において、真陽性応答を生じうる。テストされうる３００の座標は、Ｆｉｇ．（ｄ）で用いられたそれらと同一である。Ｆｉｇ．４（ｆ）は、入力マップの重複を利用するための例示的なマップ４６０を説明している。Ｆｉｇ．４（ｃ）の例に示されているように、たった２つの位置４６１での重複が可能であり、２つの隣接する焦点面での選択的マッピング入力の可能性を示している。

このような例示的な分離は、隣接する焦点面のニューロンを刺激しないことを容易とするために実行されうる。示されるように、２つの異なる焦点面の接続性マップの間の、無視して良い重複を得ることができる。例えば、３００の標的座標のうちのたった２つが、一つの焦点面上に選択され、両方の焦点面で真陽性応答生じうる。本発明の開示に従ったこの例示的な二光子アンケージングプロトコールの光学切片能力がこのことを可能としている。従って、独立した入力マップが、例えば、ニューロン細胞本体の平均大きさに匹敵する深度分解能をもって作成できる。

（隣接細胞の例示的な入力マップ）
Ｆｉｇ．４（ｇ）〜（ｌ）は、例えば、４つのニューロンＡ４７６、Ｂ４７７，Ｃ４７８およびＤ４７９からの、同時取得入力マップ４１７〜４７６の例示的な説明を提供する。示されている様に、本発明の開示に従い、いくつかの例示的なプロトコールまたは手順の効率を改善するために、例示的なマッピングは、いくつかのニューロンからの同時記録により実行できる。この例に示されているように、いくつかの入力マップは、この例示的なプロトコールの１回の実行中に得られうるので、効率性のこのような改善が達成できる。

例えば、一つの実験に従って、２６の単一細胞マップ、ニューロンのペアの１６の同時マップ、ニューロン３つの２５マップ、ニューロン４つの９マップ、全部で１６９マップが記録されうる。Ｆｉｇ．４（ｇ）〜（ｌ）の例示的な説明図に示されるように、同じクラスの非常に近い位置のニューロン（例えば、大きな層５ピラミッド）でさえ、非常に異なった入力マップをもちうるという興味深い結果がえられ、例えば、皮質ニューロンの機能的に独立したネットワークは、同じ皮質領域にて重ねあうことができる（Y. Yoshimura, J. L. Dantzker, and E. M. Callaway, Nature 433 (7028), 868 (2005)参照）。

（入力マップの例示的な再現性）
本発明の開示に従った例示的な入力マップの安定性、および例示的な刺激プロトコールおよび分析の再現性の実証が、例えば、各入力マップの取得の間に例えば約５〜８分の間隔を空けた、短くした例を用いてまた可能である。

Ｆｉｇ．５（ａ）〜（ｈ）は、例示的な入力マップの再現性の例示的なイメージであり、そこでは、本発明の開示の例示的な実施態様の実施から得られた、ｎ＝７のシナプス後ニューロンが示されている。

例えば、Ｆｉｇ．５（ａ）〜（ｇ）は、同じニューロン５００（例示的なピペットのチップ輪郭５０９によってマークされている）からの連続した例示的な入力マップ５０１〜５０７の説明図を示しており、それは約１時間にわたって連続して得ることができる。明るい領域は、全ての刺激された細胞５１０を示しており、そしてくらい領域は、真陽性を生じる刺激された細胞５１１を示している。Ｆｉｇ．５（ａ）〜５（ｇ）の下のパネル５１２〜５１８は、それぞれ、上部トレース５１９〜５２５によって示される、例示的なＥＰＳＰを示している。例示的なＥＰＳＰは、約−６５ｍＶの例示的な保持電位をもって、矢印５３５によって確認されるブラック細胞５３４をアンケージング（下部のトレース５２６〜５３２、レーザーパルス５３３）することにより生じうる。Ｆｉｇ．５（ｈ）は、全ての例示的なマップにおいて真陽性応答を生じうる例示的な位置を説明する、例示的なイメージ示す。スケールは、例えば、１００μｍでありうる。

Ｆｉｇ．５（ａ）〜（ｈ）のこれらの例示的なマップ５０１〜５０８は、例えば、選択された細胞からのＥＰＳＰの再現性および形状は、繰り返される試験において同様である。例えば、全ての真陽性細胞５１１の７７．１±１２％が、全てのマップにおいて真陽性としてスコアされる（平均±ＳＤ、ｎ＝７細胞、各＞７マップ）ことを実証している。この例は、本発明の開示に従った例示的なプロトコールが、信頼できるマップを作れることを実証している。加えて、この例は、このような例示的なアンケージング法および／または手順が、刺激されたニューロンの健全性を傷つけていないであろう。

さらに、例示的なマップ５０１〜５０７の比較によって示されるように、入力マップの小さな程度のばらつきもえられうる。この小さな程度のばらつきは、例えば、アンケージングパルスによって生じる作動電位の数の不一致によるためであろう（例えば、Ｆｉｇ．２（ｂ）および６（ａ）の解説図参照）。小さな程度のばらつきはまた、シナプスの重量またはシナプスの再配線の自然変動を反映しているであろう（JV. Le Be and H. Markram, Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 13214 (2006) 参照）。従って、本発明の開示のある例示的な実施態様に従った例示的な方法およびデバイスは、例えば、長期の例における皮質可塑性を決定するために用いられることができる。

（例示的な同時二光子刺激およびイメージング）
さらに、回路のカルシウムイメージングと、光刺激方法およびデバイスの例示的な実施態様の組合せが、実施されうる（Rafael Yuste and Lawrence C. Katz, Neuron 6, 333 (1991)参照）。Ｆｉｇ．１（ｃ）に示されそして上記されたように、例えば、単一のスパイクが、例示的なパッチクランプニューロンへの電流パルスの注入によって作動電位が誘発されたときに、ベクターモードカルシウムイメージングで検出されうる。同様な感受性が、作動電位が、ＭＮＩグルタミン酸の二光子アンケージングによって誘発された際に検出されうる。Ｉｎｄｏ−１ＡＭが負荷されているがパッチされていない、光刺激された細胞によって示されるカルシウム一過性の振幅を比較することにより、アンケージング事象が、パッチされていないニューロンにおいて、同様の数の作動電位を誘発したことを推定することが可能である。

例えば、光刺激細胞中での作動電位によって生じたものと同様のカルシウム一過性に加えて、いくつかのニューロンにおけるアンケージングの際には、同様の光学シグナルが、光刺激を受けていない細胞中で検出できる。

Ｆｉｇ．６（ａ）〜（ｃ）は、全ての光学刺激およびネットワーク活性のイメージングのある例示的な結果の、例示的な説明図を示している。

特に、Ｆｉｇ．６（ａ）は、本発明の開示に従った、アンケージング応答の光学検出の例示的な実施態様の説明図およびグラフを示している。Ｆｉｇ．６（ａ）の最上部パネル６０１は、ベクターモードで同時にイメージ化されながら連続的に光刺激される例示的な暗いニューロン６０２を示している。下部パネル６０３は、例示的なニューロン１ ６０５からの電気生理学的記録６０４（）Ｆｉｇ．６（ａ）の上部トレース）、および細胞本体（下部トレース６１１は、レーザーパルス６１２を示す）上でのアンケージングの間の、ニューロン１ ６０５、ニューロン２ ６０６およびニューロン３ ６０７（中間のトレース、△Ｆ／Ｆ）からの蛍光カルシウム測定６０８〜６１０を示している。挿入図６１３は、どのようにしてアンケージングが、ニューロン１ ６０５（パッチピペットを通じて、Ｉｎｄｏ−Ｉ−Ｋ ５０μＭを負荷）中の作動電位を誘発し、そして容易に検出可能なカルシウムシグナルを生じるかを示している。ニューロン２ ６０６および３ ６０７（パッチされておらず、Ｉｎｄｏ−１ＡＭが負荷されていない？？）上でのアンケージングは、ニューロン１ ６０５中のシグナルに対して同様の振幅のカルシウムシグナルを生じ、それは、例えば、作動電位活性による。イメージングおよびアンケージングは、例示的な複雑なＤＯＥモード標的、例えば、５ｍｓ／ニューロンで、アンケージングは、４ｘ２．５ｍｓｅｃ／ニューロンで実行されうる。スケールは、例えば、約５０μｍでありうる。

Ｆｉｇ．６（ｂ）は、同時イメージングの、連続的刺激の例示的な実施態様の説明図およびグラフを示している。最上部パネル６２１に示されるように、例えば、５０の例示的なニューロン６２２（暗い影で示されている）は、連続的光刺激の間、継続してイメージ化される。中央のパネル６２３は、例示的な工程の例示的なプロトコールを示しており、そこでは、それぞれのニューロンがイメージ化され（水平線６２４）、垂直バー６２５でマークされたニューロンが刺激されている。下部パネル６２６には、他のニューロンの刺激によってあるニューロンが活性化される例が示されている。上部トレース６２７は、例示的な蛍光測定である、下部トレース６２８は、例示的なレーザーパルスを表している。この例に示されるように、ニューロン１ ６０５上のアンケージングパルス６２９は、カルシウムシグナル６３０を生じ、それは、ニューロン１ ６０５中の作動電位によるであろう。一方、ニューロン２ ６０６上のアンケージングは、例示的なニューロン６０６（例えば、スパイク６３２）ばかりでなく例示的なニューロン１ ６０６（例えば、スパイク６３１）中でもカルシウムシグナルを生じることができる。この例に従って、ｍａｇ−Ｉｎｄｏ−１ＡＭおよびＩｎｄｏ−１ＡＭの例示的な共同の負荷が用いられうる。例えば、スケールは、約５０μｍでありうる。

Ｆｉｇ．６（ｃ）は、同時刺激およびイメージングの例示的な実施態様お説明図およびグラフを示している。最上部パネル６４１は、Ｆｉｇ．６（ｄ）に示された例と同様の例を示している。しかしながら、Ｆｉｇ．６（ｃ）では、異なったセットの５ニューロン６４２（矢印６４３で示されている）が、同時に刺激され、一方全ての５０ニューロン６２２は、例えば、イメージ化されている。中央のパネル６４２は、この例の例示的なプロトコールが、垂直線６４５で示されるように、５つのニューロン６４２の例示的なセットの連続的活性化をどのように示すかを示しており、一方、全ての他のニューロンは、垂直線６４５とそれぞれ交差することなしに、水平線６４５によって示されるようにしてイメージ化されている。下のパネル６４７は、この例の例示的な分析を示している。ｙ軸上に示された各例示的な細胞にとって、暗いチェックマーク６４８は、例示的な検出されたカルシウム一過性を示しており、そしてドット６４９は、例示的な刺激されたニューロンを示している。示されているように、同期刺激は、例示的な刺激された細胞において、確実にカルシウム一過性を誘発でき。興味があることに、それは、ネットワーク活性（例えば、黒線６５０の垂直配列）を生じうる、いくつかのケースでは、星６５１に示されるように、イメージ化された細胞のほとんどが同期活性を引き起こす。この例の例示的なマップは、より高い分解能で再印刷でき、そしてＦｉｇ．５（ａ）〜（ｈ）を参照した上記の記載および参照して示されたようにして用いることができる。この例従って、本発明の開示に従って、ｍａｇ−Ｉｎｄｏ−１ＡＭおよびＩｎｄｏ−１ＡＭの例示的な共同の負荷が用いられうる。例えば、スケールは、約１００μｍでありうる。

カルシウム一過性は、Ｆｉｇ．６（ｂ）に示されるアンケージングパルス６２９に対してタイムロックされうる。例えば、カルシウム一過性を示すニューロンは、刺激細胞から遠くに位置され、光シグナルを誘発する作動電位は、シナプス後ニューロンの樹状突起の非特異的な直接の刺激の結果ではないようである。従って、離れた細胞のこのような機能シグナルは、光刺激されたニューロンからの強力な興奮結合によって誘発される作動電位に起因しているであろう。確かに、シナプス気細胞を発火できる、協力に促進する単一シナプス結合は、例えば、ピラミッド興奮細胞および低閾値スパイク内部ニューロン間において示されてきた（Y. Kawaguchi, J Neurosci 15 (4), 2638 (1995); J. Kozloski, F. Hamzei-Sichani、R. Yuste, Science 293 (5531), 868 (2001)、および、Y. Wang, M. Toledo-Rodriguez, A. Gupta et al., J Physiol 561 (Pt 1), 65 (2004) 参照）。

さらに、ネットワーク応答を同時にモニターしながら（例えば、Ｆｉｇ．６（ｃ）最上部パネルおよびＦｉｇ．６（ｃ）中央パネル、参照）、複数の細胞の準同時刺激（例えば、５ニューロン、６０ｍｓ〜９０ｍｓの全アンケージング時間）のために、本発明の開示の例示的な実施態様を用いることが可能である。さらなる実施例において、ニューロンのある組合せの刺激によって、アンケージングパルスに対してタイムロックされた、多くのニューロンで刺激性カルシウム一過性を誘発することが可能である（Ｆｉｇ．６（ｃ）下部パネル参照）。これらの広範囲の活性化は、てんかん様事象のいくつかのタイプ下で観察されうるものと似ている（T. Badea, J. Goldberg, B.Q. Mao et al., J. Neurobiol. 48, 215 (2001)、およびA. J. Trevelyan, D. Sussillo, B. O. Watson et al., The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience 26 (48), 12447 (2006)参照）。従って、発作性脱分極シフトが、同時電気生理学的記録によって観察されうる。同様のてんかん様事象が、このような事象は、例示的なニューロンの特定のセットの光刺激に対してタイムロックでありうるので、ＭＮＩ−グルタメートで灌流された例示的な切片において自然発生的に起こる。従って、非常に少ないニューロンの刺激が、本発明の開示に従った例示的な実施態様において、切片でのてんかん様事象を誘発するためには十分でありうる。

（例示的な実施態様のさらなる考察）
本明細書中に記載したように、神経回路の二光子光刺激は、本発明の開示のある例示的な実施態様に従って、カルシウムイメージングとの組み合わせで提供されうる。二光子アンケージングの優れた空間分解能の利点を用いかるビーム多重化光学装置を用いて、このような例示的な技術および装置が、１光子光刺激のある種の今までの問題、例えば、シナプス入力のマッピングにおける単一細胞分解能の不足を克服できる。目的の細胞の細胞内活性を記録しながら、系統的に、数百のニューロンの体細胞上でグルタメートをアンケージングすることにより、切片中の興奮結合の単一細胞分解能マップを得ることが可能である。

例えば、ニューロンは、自動的にかつンピュータ制御下での例示的なマッピング手段を用いて検出することができ、従って、比較的素早く（例えば、約３０分）、大量のニューロン（例えば、１０００までの）をサンプリングでき、それらが記録された細胞と結合しているか否かが試験できる。確かに、二重ホールセル記録を用いて、推定上の細胞を記録されたニューロンと単一シナプス結合できる。真陽性入力のマップを、記録された細胞に対するシナプス前ニューロンのマップとして解釈することが可能である。加えて、このような例示的な実施態様マップは、三次元で得ることができ、一つが、原理上は、組織中の全ての細胞のサンプルとなり得るので、いずれかの任意の細胞に対してシナプス前であるか否かを試験でき、その結果、その細胞上への全ての結合を明らかにするクリックスドリームに近づける（FH. Crick、前掲、参照）。

解剖学的マッピングでの使用に加えて、本発明に開示の方法、システム、構造、コンピューターがアクセス可能な媒体およびデバイスある例示的な実施態様は、マップ機能性シナプス特性に使用できる。多くのシナプス接触が、シナプス応答の振幅から推定または決定でき、そして他の特性、例えば障害またはシナプス動力学がさらなる分析によってえられうる。加えて、本明細書に示されたものと同様の例示的なマップが、電圧クランプモードで得ることができ、従って、例えば、異なったシナプス前ニューロンからのシナプス結合の生物物理学分析が可能となる。さらに、いくつかのニューロンは、同時にパッチできるので、同時機能マップを得て比較することができる（例えば、Ｆｉｇ．４（ｇ）〜（ｌ）参照）。加えて、これらの入力マップは、Ｆｉｇ．４に示されそして本明細書の対応する記述に記載の如く、素早くそして再現性良く得ることができ、この例示的な技術およびデバイスは、例えば、シナプス結合性の変化をモニターするために用いることができる（JV. Le Be、参照）。さらに、阻害応答を検出するこが可能であり、従って、本発明の開示に従った技術およびデバイスの例示的な実施態様は、マップ阻害結合に拡張することができ、そして例えば、ニューロンのシナプス重量のマトリックスを明らかにできるであろう（J. J. Hopfield, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 2554 (1982) 参照）。

例えば、インターネット、イントラネット、エクストラネット、バーチャルプライベートネットワーク、ダイレクト接続等を介しての、オンラインでの例示的な入力マップの分析および可視化が可能であるので、例示的な方法、システム、構造、コンピューターがアクセアス可能な媒体および装置の他の用途への、例示的な実施態様の使用を容易にすることができる。例えば、真陽性を検出した後、シナプス前ニューロンからの電気生理学的に標的とし記録すること、そしてそれらを解剖学的にそして生理学的に特徴づけることができる。次いで、所与のシナプス前細胞からの入力マップを引き続き得ることができ、この方法は、特には、例示的な方法および装置のスピードが、本発明の開示のある例示的な実施態様に従って、高速スキャンニングを用いて最適化されている場合は、引き続き、例えば光学トレース回路に用いることができる。

本発明の開示に従ったビーム多重化方法および装置例示的な実施態様はまた、例えば、単一細胞を用いて他の神経活性化合物を光開放するために用いることができる。また、いくつかの例示的な実施態様を、チャンネルロドプシンアプローチ（E. S. Boyden, F. Zhang, E. Bamberg et al., Nature neuroscience 8 (9), 1263 (2005)、およびF. Zhang, L. P. Wang, M. Brauner et al., Nature 446 (7136), 633 (2007))参照）と組み合わせて、例えば、単一細胞分解能を維持しながら、インビボで方法の拡張することもできる。

さらに、Ｆｉｇ．６（ａ）〜６（ｃ）に示されそして上記明細書中で記載されているように、本発明の開示に従った技術およびデバイスのいくつかの例示的な実施態様は、二光子カルシウムイメージングと組み合わされうる。それ故、本発明の開示に従った技術およびデバイスのいくつかの例示的な実施態様は、回路の接続性および例えば異なったニューロングループが活性化される機能レジームを迅速に試験するための、全光学刺激および記録法およびデバイスとして用いることができる。このような例示的なアプローチは、例えば、生物学的回路における個々のニューロンの役割、それらの移送機能のリバースエンジニアおよび判読等を決定するために用いることができる。

（例示的な細胞検出、カルシウムイメージングを用いた作動電位の高速スキャンニングおよび検出、およびニューロンの標識化）
Ｆｉｇ．７（ａ）は、例示的な細胞検出手順および走査パス最適化の例示的な結果の例示的な説明図を示している。もとの二光子イメージ７１０（Ｆｉｇ．７（ａ）の左パネル）は、オンラインで分析でき、イメージ７１０に示されたように、細胞７１１を示す。細胞カウンター７１３は、例えば、イメージ７１２（Ｆｉｇ．７（ａ）の中央パネル）に示されるように、自動的に検出されうる。例示的な凸包巡回セールスマンアルゴリズムが、例えば、イメージ７１４（Ｆｉｇ．７（ａ）の右パネル）に示すように、全ての細胞７１１間の最短走査パス７１５を計算できる。例示的なＰＩ３新皮質切片は、Ｉｎｄｏ−１ＡＭで負荷をかけ、そして７３０ｎｍ励起および4Ox 0.8NA対物レンズでイメージ化できる。スケールは、約５０μｍでありうる。

Ｆｉｇ．７（ｂ）は、標的ニューロンのカルシウムイメージングの例示的な結果の説明図を示している。この例示的な説明図に示されるように、例示的なＰ１４新皮質切片は、Ｉｎｄｏ−１ＡＭで負荷をかけ、そしてニューロン７２１のグループがベクターモードイメージングのために選択されうる。矢印７２３で示されるパッチクランプ細胞７２２は、５０μＭのＩｎｄｏ−Ｉ−Ｋで満たされうる。負荷された細胞中の蛍光レベルは、パッチクランプ細胞７２２の蛍光と同じでありうる。この例に示されるように、例示的なイメージは、７３５ｎｍ励起、40x 0.8NA対物レンズにて得ることができる。スケールは、約５０μｍでありうる。

Ｆｉｇ．７（ｃ）は、カルシウムイメージングの単一の作動電位感受性の例示的な概略図および例示的なグラフ結果を示している。このような説明図に示されるように、Ｆｉｇ．７（ｃ）の例示的なグラフ７３０を参照して、電圧記録７３３および保持電位−６５ｍＶと対応する、作動電位７３２は、Ｆｉｇ．７（ｃ）の挿入図７３１中のトレース７３５によって示されるように、電流パルス７３４の注入によって誘導され、そして下部の光学トレース７３７（△Ｆ／Ｆ）で表現された、１又はそれ以上のスパイク７３８に対して明らかな応答を示したパッチニューロンからの、カルシウムシグナル７３６に対応しうる。作動電位７３２の数７３９は、光学トレース７３７の下に示している。

切片に負荷がかけられそしてイメージが取得された場合、例えば、５００〜４０００のニューロンの位置が自動的に検出できる、例えば、Ｆｉｇ．７（ａ）イメージ７１２に示すように、二光子蛍光イメージからの全ての確認できるニューロンの質量座標の中心を検出する手順（R. Cossart, D. Aronov, and R. Yuste, Nature 423, 283 (2003)) 参照）を用いることができる。次いで、例示的なソフトウエア（V. Nikolenko, B. Nemet, and R. Yuste, Methods 30, 3 (2003) 参照）を用いて、所定のスキャンニングレジーム、例えば、「ベクターモード」レジームを実行して、同時イメージングおよび光活性化を実施することが可能である。ラスタースキャンニングに対して、ベクターモードでは、レーザーは、連続的にユーザーが選択した興味位置のセット（「標的」は、このケースでは、神経細胞体である）を訪れ、蛍光および／または光活性化光感受性化合物のポイント測定を前もって決めた長さおよびレーザー強度にて実施する。スキャンニングパターンを最適化し、スキャンニングポイント間の遅れを減少し、ガルバノメータースキャンミラーの付属品を最少化するために、標的の配列は、巡回セールスマン問題に対する近−最適解を見つけ出せる高速アルゴリズムを用いて順序付けされうる（例えば、「凸包」手順）。

例示的なベクターモードを用いて、作動電位によって生じ、電流注入によって誘導されるカルシウムシグナルを測定することができる。例えば、ニューロンに、パッチクランプピペットを介して、５０μＭのＩｎｄｏ−Ｉ−Ｋ塩を注入することが可能である。この細胞内濃度は、Ｆｉｇ．７（ｂ）の実施例で示されるように、おおよそ、ＡＭ−ｄｙｅの負荷から得られる指示薬の細胞内濃度に対応している（Z.A. Peterlin, J. Kozloski, B. Mao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (7), 3619 (2000)参照）。これらの例示的な条件下で、例えば、Ｆｉｇ．７（ｃ）に示されるように、許容されるシグナル対ノイズ比（例えば、細胞当たり５ｍｓレーザー暴露）と共に、個々の作動電位により起こるカルシウムシグナルを検出することが可能である。

ニューロンの細胞体を視覚化しそしてそれらの座標を検出するために、急性新皮質切片に、膜浸透ＡＭ−ｄｙｅカルシウム指示薬を用いて負荷をかけることが可能である。７００〜７３５ｎｍ光が、ＭＮＩケージドＬ−グルタメートの二光子アンケージングに要求されるので、Ｉｎｄｏ−１ＡＭがカルシウム指示薬として用いられうる。Ｉｎｄｏ−１ＡＭは、ニューロンの負荷によいと示されてきており（R. Yuste and J. MacLean, in Imaging Neurons: a laboratory manual, edited by R. Yuste, F. Lanni, and A Konnerth (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, 2005)参照）、Ｆｉｇ．７（ａ）〜７（ｃ）の実施例に示されているように、作動電位に対する応答において適当なカルシウム感受性をもつ。加えて、低親和性カルシウム指示薬ｍａｇ−Ｉｎｄｏ−１ＡＭが、Ｉｎｄｏ−１ＡＭ比べてより効率よく新皮質切片に負荷されうる。ｍａｇ−Ｉｎｄｏ−１ＡＭは、（カルシウムに対する低親和性のために）作動電位の光学モニターリングに適していないかもしれないが、それは、神経体細胞の蛍光標識として非常に有用でありえる。Ｍａｇ−Ｉｎｄｏ−１ＡＭ負荷は、カルシウムイメージングを要求しない（例えば、例示的な入力マッピング）例示的な実施態様において、ニューロンを確認するために用いることができる。組み合わされた例示的なイメージングおよび／またはアンケージングのために、両方のＩｎｄｏ−１指示薬を用いた共同標識が可能であり、ｍａｇ−Ｉｎｄｏ−１ＡＭによるニューロンの標識を強固にすることができるとともに、Ｉｎｄｏ−１ＡＭの機能性カルシウム感受性からの利点も維持できる。

Ｉｎｄｏ−１ＡＭおよびｍａｇ−Ｉｎｄｏ−１ＡＭは、例えば、殆どのニューロンに提供できるが、スルホローダミン７０１を用いた二重標識によって決定されるように、グリアを著しく染色しないであろう（A. Nimmerjahn, F. Kirchhoff, J. N. Kerr et al., Nat Methods 1 (1), 31 (2004)参照）。例えば、ｍａｇ−Ｉｎｄｏ−１ＡＭが負荷された細胞の５．７±１．５６％（１４５／２５５５、ｎ＝４切片）が、スルホローダミンで負荷されることができ、スルホローダミン負荷細胞のたったの８．１±２．５９％（１４５／１７８６、ｎ＝４切片）がｍａｇ−Ｉｎｄｏ−１ＡＭで負荷されうる。

（例示的な切片調整および負荷）
冠状新皮質切片を、例えば、P 12- 15 C57/BL6 miceまたはsomatostatin-GFP mice（A. A. Oliva, Jr., M. Jiang, T. Lam et al., J Neurosci 20 (9), 3354 (2000)参照、例えば、Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME）から、バイブレーター（例えば、VTlOOOS; Leica, Nussloch, Germany）を用いて調整できる。３００μｍ厚の切片を、氷冷含酸素改変ＡＣＳＦ中で切断した。改変ＡＣＳＦは、１ｍＭ ＣａＣｌ₂および３ｍＭ ＭｇＳＯ₄を含有し、ＮａＣｌは等モル濃度のスクロースで置き換え、さらに２７ｍＭ ＮａＨＣＯ₃、１．５ｍＭ ＮａＨＰＯ₄、２２２ｍＭ スクロース、２．６ｍＭ ＫＣｌで含む。切片は次いで、含酸素標準ＡＣＳＦ中に、３７℃で３０分間置いた。ＡＭ負荷のために、切片を、２ｍｌのＡＣＳＦを満たした小さなペトリ皿（３５ｘ１０ｍｍ）の底に置き、９５％Ｏ₂／５％ＣＯ₂条件で通気し、３７℃にてスライドウオーマー（Fisher Scientific, Waltham MA）中に置いた。５０μｇ量のＩｎｄｏ−１ＡＭまたはｍａｇ−Ｉｎｄｏ−１ＡＭ（Molecular Probes, Eugene, OR）を１０μｌＤＭＳＯおよび２μｌのＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−１２７（Molecular Probes）中に調整した。組み合わせた負荷のために、５０μｇのＩｎｄｏ−１ＡＭおよび２μｇのｍａｇ−Ｉｎｄｏ−１ＡＭを用いた。次いで、染料の一定量をペトリ皿の中にいれ、切片を暗闇で、約３５〜３７℃で、約６０分までインキュベートした。例えば、ｍａｇ−Ｉｎｄｏ−１ＡＭおよびＳＲＩＯＩ（ＳＲＩＯＩ：２０μＭ）を用いた二重標識のために、約１５分間標識を行った。次いで、切片を室温に、少なくとも、例えば約３０分間置いた後、記録チャンバーへと移動した。９５％Ｏ₂、５％ＣＯ₂条件での通気を続けながら、例えば、１２３ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＫＣｌ、２６ｍＭ ＮａＨＣＯ_2、１ｍＭ ＮａＨ₂ＰＯ₂、１０ｍＭ ｄｅｘｔｒｏｓｅ、１ｍＭ ＣａＣｌ₂、および３ｍＭ ＭｇＳＯ₂を含む標準ＡＣＳＦをマッピング実験および負荷に用いた、またはその代わりに、３ｍＭ ＣａＣｌ₂、および１ｍＭ ＭｇＳＯ₂を用いた。

（例示的なグルタメートの二光子アンケージング）
ＭＮＩケージドグルタメート（２．５ｍＭ、Tocris Cookson, UK）を槽に添加し、そして、Lambda （Bioptechs, Butler, PA）またはDynamax RP-I （Rainin Instrument, Oakland, CA）ペリスタマイクロポンプを、例えば、槽の撹拌を制御し、全槽容量を最小とするために用いた。電気生理学的記録は、Matlab（例えばThe Mathworks, Natick, MA）で書かれている特注ソフトウエアを用いて分析できる（検出のためには、例えば、アンエージングレーザーパルスに対してタイムロックされたＥＰＳＰ様事象）。短いレーザーパルスを用いての効果的なアンケージングのために、例えば２５までの分離されたビームレットを用いることができる。また、本発明の例示的な実施態様に従って、より大きな多重ビームを提供することも可能である。

本発明の開示に従ったある例示的な実施態様は、ＲｕＢｉ−グルタメート、ルテニウム光化学に基づいたケージドグルタメート化合物を用いることができる。ＲｕＢｉ−グルタメートは、可視波長で励起されて、１または二光子励起後にグルタメートを放出する。それは、例えば、高量子効率を持っていると考えられ、そして低濃度にて用いることができ、他のケージド化合物とともに存在しうるＧＡＢＡ性送信の封鎖を部分的に避けることができる。ＲｕＢｉ−グルタメートの二光子アンケージングは、高い空間分解能を持ち、個々の樹状突起棘において生理動力学に基づいた興奮応答を生じる。レーザービーム多重化をもちいて、二光子ＲｕＢｉ−グルタメートアンケージングはまた、例えば、ピラミッドニューロンを単一細胞分解能にて、消極化または発火させるために用いられうる。それ故、ＲｕＢｉ−グルタメートは、可視または二光子光源を用いてニューロン樹状突起および回路の光活性化を可能とし、単一細胞、または単一の棘や精度に達する。

ＲｕＢｉ−グルタメートおよび関連する使用例に関する情報のために、Fino、Elodie Araya、 Roberto、 Peterka、 Darcy S.、 Salierno、 Marcelo、 Etchenique、 Roberto and Yuste, Rafael, RuBi-Glutamate: two-photon and visible-light photoactivation of neurons and dendritic spines, Frontiers in Neural Circuits, 3, 1 (2009). 参照。また、選択的にニューロンを光り阻害する、ルテニウムケージング化学に基づいて、他の方法にて他の化合物（ＲｕＢｉ−ＧＡＢＡ）を用いた例として、Rial Verde EM, Zayat L, Etchenique R, Yuste R. Photorelease of GABA with Visible Light Using an Inorganic Caging Group. Front Neural Circuits. 2008;2:2. Epub 2008 Aug 13. 参照。

例示的な複合標的アンケージング技術／手順
（作動電位を誘発する複合体中のグルタメートアンケージング）
樹状突起棘に関する前記アンケージング実験において、二光子励起によって誘発されるグルタメートの光放出の有効半径は非常に小さい（全て次元でおおよそ２〜３μＭ、Matsuzaki, M., et al. Dendritic spine geometry is critical for AMPA receptor expression in hippocampal CAl pyramidal neurons. Nat Neurosci 4, 1086-1092. (2001)、および、Araya, R., Jiang, J., Eisenthal, K.B.& Yuste, R. The spine neck filters membrane potentials. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103, 17961-17966 (2006) 参照）。従って、ニューロンを作動電位閾値までもたらすために、グルタメート受容体を十分に活性化することは難しい。確かに、個々の樹状突起棘の二光子アンケージングが起こると、記録されている体細胞事象の平均大きさは、２ｍＶ（例えば、２〜１０ｍｓパルス）より小さい。これらの事象の大きさは、多くの因子、例えば、アンケージングパルスの期間、ＭＮＩ−グルタメートの濃度、レーザー強度、グルタメート受容体の局所密度等、に依存しうる。レーザー強度は、光損傷閾値によって制限されうる（例えば、例示的な実施態様において、0.8-0.95NA対物レンズを用いて、試料上で約２５〜３５ｍＶを越えないことがこのましい）。

レーザー強度はまた、ケージド神経伝達物質の濃度によって制限され、それは、水中の化合物の溶解度（例えば、局所適用（「パフィング（puffing）」）の場合に１０〜５０ｍＭのＭＮＩ−グルタメート）、ならびに化合物の純度によって制限されうる。ケージドグルタメートは、典型的には、微量の遊離のグルタメートをもち、一般的に、槽用途の場合は、５ｍＭのＭＮＩ−グルタメートより大きいものは使用に適さない。従って、アンケージングそのものの化学反応は、ＭＮＩ−グルタメートの照射領域への拡散によって非常に早いので（Canepari, M., Nelson, L., Papageorgiou, G., Corrie, J.E. & Ogden, D. Photochemical and pharmacological evaluation of 7-nitroindolinyl-and 4-methoxy-7- nitroindolinyl-amino acids as novel, fast caged neurotransmitters. J Neurosci Methods 112, 29-42 (2001) 参照）、消極化の速度および振幅は、グルタメート受容体へと向かう、光放出された遊離のグルタメートの拡散によって、効果的に制御されうる。

樹状神経体細胞を樹状突起棘の代わりに標的にすることによって、皮質ニューロン中の作動電位を誘発するために、ＭＮＩ−ケージドグルタメートの二光子アンケージングを用いることが可能である（Nikolenko, V., Ellis-Davies, G.C.R. & Yuste, R. Simultaneous optical stimulation and two - photon imaging of neocortical circuits, in Society for Neuroscience Annual Meeting (Society for Neuroscience, New Orleans, 2003) 参照）。体細胞に近い位置における長いレーザーパルス（例えば、約１０〜５０ｍｓ）を用いて、おおよそ５−１０ｍＶによって、細胞を消極することが可能であるが、作動電位の閾値に達することが単純ではないかもしれない。加えて、例えば、長いアンケージング期間は、光損傷を誘発しうるし、また、これらの期間にスピル・オーバー効果を生じることによって空間分解能を落とすかもしれない。

ニューロンをより確実に発火させるために、例えば、いくつかのアンケージング位置を用いる、およびより大きな量のグルタメートをより大きな領域上に光り放出することが可能である。従って、「複雑な標的」（例えば、Ｆｉｇ．２（ａ）の解説図を参照）は、同時の光刺激およびカルシウムイメージングのために提供されうる。複雑な標的は、ニューロンの集団の検出された中心上に中心を置く、いくつかのアンケージング「刺激サブ標的」および一つの「イメージングサブ標的」を含みうる。ビームは、高レーザー強度で、各刺激位置に連続的に置かれうる。次いで、イメージングのために、レーザー強度は、より低いレベルまで減少され、そしてレーザービームは、イメージング標的の上に位置決めされる。高ＮＡ対物レンズを用いた効率的なアンケージングのために、例えば、おおよそ３０ｍＷのレーザー出力レベルが、試料上に用いられうる。例えば、試料上のおおよそ５ｍＷは、良好なシグナル対ノイズ比をもちかる検出可能なアンケージングがないので、蛍光シグナルのポイント測定に十分でありうる。

（複雑な標的アンケージングの例示的な空間分解能）
Ｆｉｇ．２（ａ）の説明図に示されそして本明細書で既に記載されているように、刺激標的が円状配置の場合は、刺激標的パターンの直径は、典型的な神経体細胞の大きさにおおよそ対応しうる。この例示的な配置は、例えば宅３０〜５０ｍｓのアンケージングパルス（全ての刺激サブ標的の全期間）でもって、特に全ての刺激されたニューロン中の作動電位の繰り返し可能な誘発を提供でき、そして光刺激の良好な空間分解能（例えば、Ｆｉｇ．２（ａ）および２（ｂ）に示される説明図、および対応する明細書中に記載を参照）を提供できる。複雑な標的の実際の例示的なパラメーター（例えば、刺激サブ標的の数、円形パターン直径、各サブ標的のための期間、アンケージング出力等）は、本発明の開示の例示的な実施態様に従って、例えば、異なったタイプの特定の使用、用途、対物レンズ倍率等のために個々に調整できる。

（例示的な入力マッピングプロトコール）
個々のニューロンを刺激するために構成されうる、二光子アンケージング技術およびデバイスの例示的な実施態様が提供されるので、１光子グルタメートアンケージング光刺激を用いて実施されてきたようにして、ニューロン上に入力結合をマッピングするためにこのような例示的な方法、手順および／またはデバイスを利用することが可能である（I. C. Farber、前掲; E.M. Callaway、前掲、M. B. Dalva、前掲、G. M. Shepherd、前掲、C. Boucsein、前掲、R. Kotter、前掲、 H. U. Dodt、前掲、S. Shoham, 、前掲、M. Canepari、前掲 参照）。１光子アンケージングの例示的な制限は、横方向、特には軸上の空間分解能の不足でありうる。あるレベルの空間分解能は、高ＮＡ対物レンズを用いて達成可能であるが（R. Kotter前掲、参照）、アンケージングＵＶビームの筒状プロファイル（M. B. Dalva、前掲、 G. M. Shepherd、前掲、; C. Boucsein参照）が、２次元マップを作成するために用いられうる。従って、一般には、そのように作成できるマップは、単一細胞分解能をもたす、むしろ、小さな領域の活性化を反映している。

本発明の開示のある例示的な実施態様に従った例示的な二光子アンケージングの非線形性は、少なくとのこれらの限定を克服するために用いることができ、そして単一の細胞の精度をもってマッピングが成される。

本発明の開示の例示的な実施態様に従った例示的な光刺激方法および／または手順は、以下の工程を含むことができる：
１．急性切片にＡＭ−ｄｙｅ（例えば、ｍａｇ−Ｉｎｄｏ−１ＡＭ）を負荷する。
２．目的の範囲および／または領域を特定する。
３．１またはそれ以上のニューロンを、ホールセルモードで、パッチクランプする（例えば、電流クランプ）。
４．対物レンズをより低い倍率に切り替える（例えば、単一の視野内に全ての皮質層を見えるようにする）。
５．２Ｄラスターモードイメージを取得する。
６．イメージを分析し、個々のニューロンを検出し、そして質量座標の中心を決定する。
７．例えば、連続光刺激のためのソフトウエアプログラムを含む処理装置へと取り込む（取り込みは、例えば、疑似ランダム次元にて実行されうる）。
８．光刺激プロトコールを開始し、各ニューロンを例えば約３〜６レーザーパルスで、パルス間におおよそ０．５秒のインターバルを空けて刺激する（例示的なプロトコールの全時間は、例えば、約５００ニューロンを刺激した時はおおよそ２５分で有り得る）。
９．電気生理学的記録を確認する。
１０．電気生理学的記録を分析し、光刺激された細胞からシナプス性ＥＰＳＰに似ている事象を特定する（例えば、アンケージングパルスに対してタイムロックする）。および
１１．電気生理学歴記録の特定および分析と関連した情報に基づいて、入力接続のマップを作成する。

（例示的な電気生理学的方法および／または手法）
本発明の開示のある例示的な実施態様に従って、ニューロンは、パッチクランプされ、そして細胞内電位が、イメージングおよび／またはアンケージングの間、同時にモニターされうる。ホールセル電流クランプ記録は、例えば、ＢＶＣ−７００（Dagan Corp., Minneapolis, MN）またはＡｘｏｃｌａｍｐ ７００Ｂ（Axon Instruments, Foster City, CA）増幅器を用いて行うことができる。６−１０ＭΩμピペットは、例えば、１３０Ｋ―メチルスルフェート、１０ ＫＣｌ、１０ Ｎａ−ＨＥＰＥＳ、２．５ＡＴＰ−Ｍｇおよび０．３ＧＴＰ−Ｎａ（これらの単位はｍＭ）、および０．３５％ビオシチン、ｐＨ７．４（２９４−６ｍＯｓｍ）、および約５０μＭ蛍光色素Ｉｎｄｏ−Ｉ−Ｋペンタカリウム塩（キャリブレーション試料用）またはＡｌｅｘａ−５９４（例えば、マッピングのために、ＰＭＴの前で追加の６００ｎｍロングパスファイルターを用いて樹状突起を可視化するため；両方の染料ともMolecular Probes, ORより入手できる）で満たすことができる。例えば、ニューロンは、記録および処理、例えば形態学的同定の間、ビオシチンで満たすことができる。

同時の光刺激およびカルシウムイメージングの例示的な方法および／または手順は、生理学的状態とできる限り近づけたシステムのネットワーク活性を調べるために、生理学的な温度にて行うことができる。ホールセル記録の期間を改善するために、例えば、例示的なマッピングを室温にて実施することができる。

（例示的な組織学的方法）
切片は、例えば、０．１２Ｍリン酸緩衝液（ＰＢ）中の４％パラホルムアルデヒド溶液を用いて固定する。イメージング／アンケージング例に従って、切片は、室温の固定剤中に浸すことができ、そして約４℃で一晩固定する。次いで、切片は、０．１２Ｍ ＰＢで３回リンスし、０．１２Ｍ ＰＢ中の約２０％スクロースで約１２〜１６８時間抗凍結し、そして組織凍結培地（H-TFM, Triangle Biomedical Sciences, Durham, NC）中にてドライアイス上で凍結する。融解した後、切片は、１２Ｍ ＰＢで３回リンスしてから、０．１２Ｍ ＰＢ中の１％過酸化水素で、例えば、室温で撹拌しながら、約３０分間、前処理する。組織は次いで、０．０２Ｍ リン酸カリウム生理食塩水（ＫＰＢＳ）でリンスして、アビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体（カタログ番号PK-6100, Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA）中で、室温にて撹拌しながら一晩インキュベートする（１ｍｌの０．０２Ｍ ＰＢＳおよび０．３％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ当たり、１０μｌ溶液Ａおよび１０μｌ溶液Ｂ）。切片は、０．０２Ｍ ＫＰＢＳで約３回リンスし、約０．７ｍｇ／ｍｌの３，３’−ジアミノベンジジン、０．２ｍｇ／ｍｌ過酸化尿素、０．０６Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（D- 4293, Sigma- Aldrich, St. Louis, MO）、０．０２Ｍ ＫＰＢＳ中で、約５〜１５分間インキュベートする。３，３’−ジアミノベンジジン反応を完了するために、切片は、０．０２Ｍ ＰＢＳでリンスし、ベクタシールドマウンティング（Vectashield mounting medium）培地（H- 1000, Vector Laboratories, Inc.）中で、マウントする。染色した細胞は、オリンパス縦型顕微鏡（ＢＸ５１）を用いたＤＩＣ光学装置で目で見えるようにでき、７１ニューロンが、例えば、ニューロルシダ（Neurolucida） ワークステーション（例えば、MicroBrightField Inc., Williston, VT）を用いて３次元にて再構築されうる。全ての再構築は、例えば、100x, 1.40 NA objective対物レンズのもとで行うことができる。

Ｆｉｇ．７（ａ）〜（ｃ）に戻りそれを参照する。それは、本明細書中で上記してあるように、本発明の開示に従ったシステムの例示的な実施態様を示しており、種々の改変が例示的に先に記載した特注の二光子蛍光発光（２ＰＦ）および第二高波長発生（ＳＨＧ）顕微鏡に対して成すことができる。（Shoham, S., O'Connor, D. H., Sarkisov, D.V, & Wang, S. S. Rapid neurotransmitter uncaging in spatially defined patterns. Nature methods 2, 837-843 (2005、およびMajewska, A., Yiu, G. & Yuste, R. A custom-made two-photon microscope and deconvolution system. Pflugers Archiv - Eur. J. Physiol. 441, 398- 409 (2000) 参照）。例えば、ＮＩＲパルスモードロックＴｉ：サファイアレーザー７０１からのビーム強度は、ポッケルセル７０２によって制御できる。平行なビームは、次いで、平凸レンズ７０３ａによって、空間フィルターとして機能するピンホール７０３ｂ上に焦点され、そして後に第二のレンズ７０３ｃによって再び平行とされる。ＤＯＥ４は、レーザービームを、複数の、例えば５つの、個々のビームレットに分割でき（Ｆｉｇ．２（ｂ）の説明図に示すようにして）、それは、約０．２３°内部ビームレット角度にて分散される。

Ｆｉｇ．７（ａ）に戻って、この角度は、第二のテレスコープ（２つの平凸レンズ７０５ａおよび７０５ｃ）によって減少でき、それらはまた、個々のビームレットを平行に保ちながら、走査ミラー７０７ｂの光学面の上にＤＯＥをイメージできる。アイリス７０５ｂは、レンズ７０５ａと７０５ｃの間に配置されて、単一ビームレーザーモードイメージング（閉じたときは、中央のビームレットが通過するのを容易にできる）と５ビームレットＤＯＥモードベクターモードイメージング／光刺激（アイリス７０５ｂは完全に開放される）間を切り替えることができる。例えば、約７００ｎｍロングパスフィルター７０６ａは、レーザーからの残存可視光放射を除くことができ、そしてペリスコープミラー７０６は、光学テーブル面からのビームを、ＩＲ反射ミラーまたは二色ミラー７０７ａおよびガルバノメーター走査ミラー７０７ｂを含むことができる走査ユニット７０７へと送ることができる。

Ｆｉｇ．７（ａ）に示されるスキャンレンズ（または「ピューピルトランスファー（pupil-transfer）レンズ」７０７ｃは、機械的に走査ユニット７０７を縦型顕微鏡７０８に連結させ、顕微鏡７０８ｂのチューブレンズをもったテレスコープを形成し、平行ビームを対物レンズ７０８ｃの背開口へと伝える。それはまた、光学的に走査ミラーおよび対物レンズに結合している。二光子蛍光（２ＰＦ）シグナルは、同一の対物レンズによって収集され、ショートパスの２色レンズ７０８ａによって励起光から分離され、そして、追加のカラーフィルター７０９ａを通してフィルターにかけられて、追加レンズ７０９ｂによってＰＭＲ７０９の小さな活性領域にフォーカスされた後ＰＴＭ７０９によって検出されうる。高速シャッター７０９ｃは、アンケージングパルスの間、過負荷からＰＭＴ７０９を保護することができる。或いは、２ＰＦまたは第二高長波発生（ＳＨＧ）シグナルは、顕微鏡コンデンサー７０８ｄを介して収集され、そして第二のＰＭＴアセンブリ７１２によって検出されうる。ＰＭＴ７０９、７１２からの電気的シグナルは、プレ増幅器７１０によって増幅されそしてデータ取得ボード７１１によってデジタル化される。

Ｆｉｇ．８では、二光子蛍光イメージ８０１の例が示されている。それは、ｍａｇ−Ｉｎｄｏ−１ＡＭが負荷された、ＰＩ３体知覚（ＳＩ）新皮質切片８０２から提供されたものある。イメージは、10x 0.3NA 対物レンズを用いて、ラスターモード（７２５ｎｍ励起）で得ることができ、そして軸（Ｚ）方向の単一の光学的断面が、追加の走査ズーム無しに示されている。この例のスケールは、２００μｍである。軟膜表面８０３は上部に示されており、全ての皮質層が目で見える。

Ｆｉｇ．９（ａ）および９（ｂ）は、同じ例示的なＦｉｇ．８の切片８０２の例示的なイメージを示しており、１０倍（０．３ＮＡ）のｍａｇ−Ｉｎｄｏ−１ＡＭ（例えば、７２５ｎｍ励起、４８０／５４０ｎｍフィルター）およびＳＲＩＯＩ（例えば、Ｆｉｇ．９（ｂ）−８５０ｎｍ、５９５／６１５ｎｍ フィルター）にて全ての皮質層を横切って、撮影された。

Ｆｉｇ．９（ｃ）および９（ｄ）は、それぞれ例示的なイメージ９０３および９０４を示しており、例示的な切片８０２からの例示的な細胞９０５を高倍率（60x 0.9NA）で図示している。Ｆｉｇ．９（ｄ）のＳＲＩＯＩ−ポジティブ細胞に比べて、高密度のｍａｇ−Ｉｎｄｏ−１ＡＭ−ポジティブ細胞９０６が、Ｆｉｇ．９（ｃ）中に提供され、全体として低程度の重複である。Ｆｉｇ．９（ｄ）の矢印９０７は、ＳＲＩＯＩ標識細胞９０８（例えば、星状膠細胞）を示しており、それもまたｍａｇ−Ｉｎｄｏ−１ＡＭが負荷されている。これらの例示的な図のスケールは１０μｍである。

上記したＦｉｇ．４（ｇ）〜４（ｌ）に示されたイメージにおいては、これらの例示的なイメージ４７０〜４７５は、隣接するニューロンからの４重記録を用いてシナプス性入力をマッピングした実施例の例示的な説明である。例えば、Ｆｉｇ．９（ａ）に示されるのと同様に、４層５ピラミッド細胞がパッチされて（白矢印４８０は、対応する細胞体４７６〜４７９の位置を示している）、４つの対応する入力マップが、例示的な刺激プロトコールの単回の操作の間にえられうる。ニューロンＡ４７６、Ｂ４７７およびＤ４７９の、樹状突起の形態学的再構成を重ね合わすことができる。この実施例の例示的なスケールは、約１００μｍである。特に、Ｆｉｇ．４（ｇ）〜４（ｊ）に示すように、入力コード化マップが、例えば、全ての４つのニューロンのために提供されうる。例示的なコード体系は、例えば、ＥＰＳＰの振幅と比例するが、例えばＦｉｇ．９（ａ）に対しては反比例するカラーのコード体系であることができ、暗い背景の視覚性を強化するために、例えば、大きなピーク振幅に対応する明るい陰を示めしえる。Ｆｉｇ．４（ｋ）および４（ｌ）は、それぞれ、ニューロンＡ４７６およびＢ４７７、およびニューロンＡ４７６，Ｂ４７７およびＣ４７８間の、第二および第三次元での重複の例示的で代表的なマップのイメージを示している。

Ｆｉｇ．１０は、本発明の開示のある例示的な実施態様に従った、光刺激手順または方法の例示的なフロー図を示しており、処理装置（例えば、コンピュータープロセッサーまたはプロセッサーの集合体）によって実行されうる。Ｆｉｇ．１０に示すように、例示的な手順は、処理装置１０００（例えば、１またはそれ以上マイクロプロセッサーまたはそれの集合体）上でおよび／またはそれによって実行されうる。１００１から始まり、例示的な手順は、急性切片をＡＭ−ｄｙｅ（例えば、ｍａｇ−Ｉｎｄｏ−１ＡＭ）で負荷する。１００２において、例示的な手順は、対象範囲および／または領域を確認する。１００３において、例示的な手順は、１またはそれ以上のニューロンをホールセルモード（例えば、電流クランプで）にてパッチクランプできる。１００４において、例示的な手順は、対物レンズを低倍率（例えば、全ての皮質層が、単一の視野で見えるように）に切り換えできる。１００５において、例示的な手順は、２Ｄラスターモードイメージを取得し、そのイメージを分析し、次いで、このニューロンを検出して、１００６にて質量座標の中心を決定する。

１００７において。例示的な手順は、例えば、連続光刺激のためのソフトウエアを含む処理装置内にロード（ローディングが、例えば疑似乱数オーダーで実行されうる）され、次いで、光刺激プロトコールがスタートし、各ニューロンを、例えば３〜６レーザーパルスで、約０．５秒のパルス間隔でもって、刺激する（例示的なプロトコールの全期間は、例えば、約５００ニューロンを刺激したときは、約２５分でありうる。）−１００８．１００９において、例示的な手順は、電気生理学的記録を確認し、次いで、１０１０において、その電気生理学的記録を分析し、光刺激された細胞からのシナプス性ＥＰＳＰに似ている事象（例えば、アンケージングパルスに対するタイムロック）を確認する。１０１１において、例示的な手順は、電気生理学的記録の確認および分析を関連した情報に基づいて、入力結合マップを作成する。

（例示的なＳＬＭを用いたレーザー多重化法および結果）
Ｆｉｇ．１１は、本発明の開示に従った、ＳＬＭ位相マスク情報のための方法または手順の例示的な実施態様を示している。

例示的な実施態様ＳＬＭ手順は、光学フーリエ変換の光学装置の基本的特性故に、任意パターンを作成できる。透過性の対象物を薄いレンズの前の一つの焦点距離に正確に置くために、その対象物のフーリエ変換が、レンズの後に一つの焦点距離が形成されうる。従って、もしfocal_frontにおける入来領域が複雑な振幅Ｅ_κによって表される場合は、focal_backにおける領域はＦ_κであり、ここで、Ｅ_κおよびＦ_κはフーリエ変換対である。例示的な顕微鏡において、光学装置（光路？）はリレーレンズのシステムによってより複雑になるが、ＳＬＭは、focal_frontに位置することができ、試料面は、focal_backに位置できる。位相のみのＳＬＭは、領域の位相の上で役目を果たし、振幅ではない。ＳＬＭによって作用されたら、電界は、Ｅ_κ＝Ａ₀ｅｘｐ（ι・φ_κ）であり、ここでｅｘｐ（ι・φ_κ）は、もとの振幅であり、そしてφ_κは、ＳＬＭによって入った位相である。位相、φ_κは、所望の強度パターンが離れた領域（試料面）において産生されるように計算される。位相マスクは、例えば、Ｈｏｌｅｅｙｅからの、ならびに標準の繰り返し適用できる手段に基づいたカスタム開発ソフトウエアからのソフトウエアを用いて計算されまたは決定されうる。

Ｆｉｇ．１１に示されるように、例示的な手順／方法は、１１０１においてレーザーの知られた強度分布からスタートし、次いで、１１０２においてランダム位相（スピード収束）が加えられ、１１０３において、Ｅ_κ＝Ａ₀ｅｘｐ（ι・φ_κ）を生じる。１１０４において、例示的な手順／方法は、次いで、ＦＦＴ、Ｆ_κ＝Ｂ_κｅｘｐ（ι・θ_κ）を計算または決定し、そして１１０５にて、コンピューターで計算したイメージを所望のイメージと比較する。もしエラーが閾値を超えていた場合は、次いで、１１０６において、振幅、しかし位相ではない、が所望のイメージとより合うように改変される。１１０７において、逆変換が実施され、そして１１０８において、位相量子化などの制約が適用され、１１０９において新しい入力フィールドへとあがり、再びサイクルが始まる。ステップ１１０５において、もしエラーが閾値を超えなかった場合は、次いで、例示的な手順は、１１１０へと進み、そこで位相マスクがセットされる。

Ｆｉｇ．１２（ａ）〜１２（ｄ）は、本発明の開示に従った例示的な実験からの結果を得るための、例示的なＳＬＭ光パターン化および深度焦点調節イメージおよび反復を示している。例えば、二光子励起の効率性を試験するために、Ａｌｅｘａ４８８蛍光指示薬で飽和させたアガロースゲルの試料をイメージ化した。例示的なイメージは、60x 0.9NA対物レンズを用いて得た。スケールは、約２０μｍである。Ｆｉｇ．１２（ａ）は、単純な例示的な２値ビットマップパターンを示しており（例えば、テキスト「ＣＯＬＵＭＢＩＡ」として示されている）、最初おパネル１２０１に示されるように、例示的なＳＬＭソフトウエア中にアップデートされた。得られた位相マスクは、第二のパネル１２０２に示されている。グレースケールは、０から２πへの位相シフトに対応する。試料（記録室）から、顕微鏡ＣＣＤカメラで取得された二光子蛍光イメージの結果を、右側パネル１２０３に示す。図に示すように、計算されたパターンと得られたイメージの間には、良好な対応がある。このデータはまた、液晶ベースの回折ＳＬＭが、パワフルなパルスモードロック超高速レーザーによる照射に耐えうること、および構造非線形照射に有効に用いられうることを示している。

Ｆｉｇ．１２（ｂ）は、ＳＬＭをプログラムするために用いることができる例示的な複雑なグレースケールパターンを示している。歴史的写真に基づいた、Santiago Ramon y Cajalの定形化された写真を用いることができる。この実験における例示的なパネル１２０４〜１２０５は、Ｆｉｇ．１２（ａ）のパネル１２０１〜１２０４と同様である。

Ｆｉｇ．１２（ｃ）は、ＳＬＭを用いた例示的な焦点調節を示している。示されているように、ＳＬＭソフトウエアの例示的な実施態様は、位相マスク（phase mask）の表面において、追加の光学機能の適用を容易にできる。この実施例では、軸面における励起の焦点をシフトさせるためにレンズ機能を用いることができる。例示的なパネル１２０７〜１２１１は、もとのイメージを示しており、そして例示的なパネル１２１２〜１２１６は、対応する位相マスクを示している。さらに、例示的なレンズ位相機能のみ、およびそれがもとの位相マスクに追加されたものを示している。−１０、−１００、＋１０および＋１００は、例示的なソフトウエアによって用いられる例示的な単位を示しており、対応するネガティブ／ポジティブレンズおよび相対光学的強度を示している。

Ｆｉｇ．１２（ｄ）は、例示的な左パネル１２１７に、二光子蛍光イメージを示しており、ＣＣＤカメラによって取得したテストパターンである。パネル１２１８〜１２２５に示されるように、仮想焦点面は、強度に対応するレンズ機能を用いて、もとの面から両方向に移動される。40x 0.8 NA の対物レンズを用いた。スケールは、約５０μｍである。この例示的なデータは、ＳＬＭが、物理的な移動部品を要求しない「ユニバーサルスキャナー」として用いることができることを示している。

Ｆｉｇ．１３は、本発明の開示のある例示的な実施態様に従って構成されたシステムまたは構造のブロック図であり、それは、例示的な手順、方法および処理を実行するようにプログラムされるまたは構成されることができる、

Ｆｉｇ．１３に示すように、例えば、コンピューターがアクセス可能な媒体１３０３（例えば、上記したように、ハードディスク、フロッピーディスク（登録商標）、メモリースティック、ＣＤ−ＲＯＭ、ＲＡＭ、ＲＯＭ等のストレージデバイス、またはそれらの集合体）が（処理装置１３０１と連絡するようにして）提供されうる。コンピューターがアクセス可能な媒体１３０３は、実行指令１３０５をその中に含むことができる。加えてまたは代わりに、ストレージ装置１３０７が、コンピューターがアクセス可能な媒体１３０３とは別に提供されることができ、それは、処理装置が、上記したある例示的な手順、処理および方法を実行するように、処理装置１３０１に指示を与えることができる。

本明細書に記載の例示的な技術は、プロセッサーまたはプロセッサーグループを用いて実行されうる。加えて、本明細書中に記載の例示的な手段は、コンピューターがアクセス可能な媒体中（例えば、少なくとも一つの、ハードドライブ、フロッピーディスク（登録商標）、メモリースティックまたはカード、ＲＡＭ、ＲＯＭまたは他のコンピューター保存デバイス）に保存されうるコンピューターソフトウエアを用いて実行されうる。

上記は、本発明の開示の例示的な実施態様の原理を単に説明するものである。記載された実施態様に対しての、種々の変更及び置換は、本明細書に記載された教示より当業者にとって明らかである。従って、本技術分野の当業者は、本明細書に明白に示され又は記載されてはいないが、本発明の原理を具現化する多数のシステム、構成及び方法を考えることができるということが理解され、それらは本発明の範囲に含まれる。加えて、本明細書中に明示的に引用されていない従来技術の知識も、ここにおいて、それらのすべての開示は本明細書に明示的に引用される。本明細書で参照された上記すべての公報及び文献の開示のすべては、引用されることにより本明細書の一部である。本発明の開示と引用される公報および文献の間に矛盾がある場合は、本発明の開示の教示である。

Claims (51)

1. 少なくとも一つの試料の少なくとも一つの部分において、少なくとも一つの光活性化、光不活性化、または光化学効果を誘発する、少なくとも一つの放射をもたらすように構造化されたまたは構成された少なくとも一つの特定の構造、を含む少なくとも一つの放射をもたらすための装置。
2. 前記少なくとも一つの放射が、少なくとも一つのビームを含み、かつ
   前記少なくとも一つの特定の構造が、さらに、少なくとも一つのビームを複数のビームレットに分割するように構造化または構成されている、ここで、該ビームレットの少なくともいくつかは前記少なくとも一つの試料に衝突する、
   請求項１に記載の装置。
3. 前記少なくとも一つの試料が生物試料である請求項１または２に記載の装置。
4. 前記少なくとも一つの試料が化学組成物である請求項１〜３のいずれか一つに記載の装置。
5. 前記少なくとも一つの試料がセミコンダクター配置である請求項１〜４のいずれか一つに記載の装置。
6. 前記少なくとも一つの試料が薬物輸送構造である請求項１〜４のいずれか一つに記載の装置。
7. 前記少なくとも一つの特定の構造が少なくとも一つの回折光学構造を含む、請求項１〜６のいずれか一つに記載の装置。
8. 前記少なくとも一つの回折光学構造が少なくとも一つの空間光モジュレータ（ＳＬＭ）構造を含む、請求項７に記載の装置。
9. 前記少なくとも一つの特定の構造が少なくとも空間光モジュレータ（ＳＬＭ）を含む、請求項１〜８のいずれか一つに記載の装置。
10. 前記少なくとも一つの特定の構造が回折光学素子（ＤＯＥ）を含む、請求項１〜９のいずれか一つに記載の装置。
11. 前記少なくとも一つの特定の構造が、前記少なくとも一つの放射を非線形様式にて励起することによりもたらす、請求項１〜１０のいずれか一つに記載の装置。
12. 前記少なくとも一つの放射のシグナル対ノイス比が、単一放射システムからのシグナルに比べて約１．９４倍よりも大きい、請求項１〜１１のいずれか一つに記載の装置。
13. さらに、前記少なくとも一つの達成された放射に関連したデータを受領し、かつ該データの機能として前記少なくとも一つの試料の少なくとも一つの部分の少なくとも一つのイメージを作成するように構成されているさらなる構造、を含む請求項１〜１２のいずれか一つに記載の装置、
    ここで、該少なくとも一つのイメージは、約１００ｍｓより小さいイメージングサイクルの期間にて作成される。
14. 少なくとも一つの特定の構造が、前記少なくとも一つの達成された放射を生物試料に提供して光力学作用を与えるように構成または構造化されている、ここで、少なくとも一つの達成された放射は、少なくとも一つの試料の上で、ネットで１００ミリワットよりも高い平均出力をもつ、
    、請求項１〜１３のいずれか一つに記載の装置。
15. 前記少なくとも一つの特定の構造の少なくとも一つの部分が内視鏡構造として提供される、請求項１〜１４のいずれか一つに記載の装置。
16. 前記少なくとも一つの特定の構造が、さらに、前記少なくとも一つの放射を用いて、前記少なくとも一つの試料内の微小な構造を照射するように構成または構造化されている、請求項１〜１５のいずれか一つに記載の装置。
17. 前記少なくとも一つの特定の構造が、さらに、前記少なくとも一つの放射を調節して前記少なくとも一つの試料に衝突するように、かつ該試料のための少なくとも一つの深度情報を得るように構成または構造化されている、請求項１〜１６のいずれか一つに記載の装置。
18. 前記ＳＬＭ構造が、前記少なくとも一つの放射を用いて、前記少なくとも一つの試料内の微小構造を照射するように構成または構造化されている、請求項９に記載の装置。
19. 前記ＳＬＭ構造が、前記少なくとも一つの放射を調節して前記少なくとも一つの試料に衝突するように、かつ該試料のための少なくとも一つの深度情報を得るように構成または構造化されている、請求項９に記載の装置。
20. 前記少なくとも一つの特定の構造が、少なくとも一つのスキャンレス空間光モジュレーション（ＳＬＭ）顕微鏡構造に含まれる、請求項１〜１９のいずれか一つに記載の装置。
21. 前記少なくとも一つのスキャンレスＳＬＭ顕微鏡構造が、前記少なくとも一つの放射のコヒーレント光をもたらす、請求項２０に記載の装置。
22. 前記コヒーレント光がレーザーを含む請求項２１に記載の装置。
23. さらに、前記少なくとも一つの達成された放射に関連したデータを受領し、かつ該データの機能として前記少なくとも一つの試料の少なくとも一つの部分の少なくとも一つのイメージを作成するように構成されているさらなる構造、を含む請求項９に記載の装置、
    ここで、前記少なくとも一つのＳＬＭ構造は、該少なくとも一つのイメージのために前記少なくとも一つの試料を関連した少なくとも一つの収差を修正するように構成または構造化されている。
24. 前記少なくとも一つの放射が、少なくとも一つの光放射を含み、かつ前記少なくとも一つのＳＬＭ構造が、前記少なくとも一つの光放射を、特定の有効強度にて約１ｍｍより大きい深度にて、前記少なくとも一つの試料の少なくとも一つの部分に提供するように構成または構造化されている、請求項９または２３に記載の装置。
25. 少なくとも一つの光放射が、前記少なくとも一つの光放射の少なくとも一つの波長に基づいて、前記少なくとも一つの部分内で前記深さにて提供される、請求項２４に記載の装置
26. 少なくとも一つの光放射が、下記式で記載される強度より大きい強度にて、前記少なくとも一つの部分内で前記深度にて特定の標的に、提供される、請求項２４または２５に記載の装置、
    Ｉ＝Ｉ_０ｅｘｐ（−σ_wlｚ）、
    ここで、Ｉ_０は、前記少なくとも一つの試料の表面の元の強度であり、ｚは、前記少なくとも一つの放射の浸透深度であり、そしてσ_wlは、有効減衰定数であり、バルク物資の波長依存平均吸収と波長散乱係数の合計である。
27. さらに、前記少なくとも一つの達成された放射に関連したデータを受領し、かつ該データの機能としてかつ少なくとも一つのマルチモード手順に基づいて、前記少なくとも一つの試料の少なくとも一つの部分の少なくとも一つのイメージを作成するように構成されている少なくとも一つのさらなる構造を含む、請求項９、２３または２４のいずれかに記載の装置。
28. 前記少なくとも一つのＳＬＭ構造が、さらに、前記少なくとも一つの放射から、角度をもって交差するビームレットのセットを生じるように構造化または構成されている請求項２７に記載の装置。
29. 前記少なくとも一つのＳＬＭ構造が、前記少なくとも一つの試料内で二光子吸収を達成するために前記少なくとも一つの放射をもたらすように構造化または構成されている、請求項９、２３、２４または２７のいずれかに記載の装置。
30. 前記少なくとも一つのＳＬＭ構造が、前記少なくとも一つの試料内で三光子吸収を達成するために前記少なくとも一つの放射をもたらすように構造化または構成されている、請求項９、２３、２４、２７または２９のいずれかに記載の装置。
31. 前記少なくとも一つのＳＬＭ構造が、前記少なくとも一つの放射を用いて、関連した第二光波長発生（ＳＨＧ）を達成するために前記少なくとも一つの放射をもたらすように構造化または構成されている、請求項９、２３、２４、２７、２９または３０のいずれかに記載の装置。
32. さらに、前記少なくとも一つの達成された放射に関連したデータを受領し、かつ該データの機能として前記少なくとも一つの試料の少なくとも一つの部分の少なくとも一つのイメージを作成するように構成されている少なくとも一つのさらなる構造、を含む請求項９、２３、２４、２７、または２９から３１のいずれかに記載の装置、
    ここで、前記少なくとも一つのＳＬＭ構造は、前記少なくとも一つのさらなる構成が前記少なくとも一つのイメージを生じるように、コヒーレントanti-Stokes Raman分光イメージング（ＣＡＲＳ）手順を達成するために前記少なくとも一つの放射をもたらすように構造化または構成されている。
33. さらに、前記少なくとも一つの達成された放射に関連したデータを受領し、かつ該データの機能として前記少なくとも一つの試料の少なくとも一つの部分の少なくとも一つのイメージを作成するように構成されている少なくとも一つのさらなる構造、を含む請求項９、２３、２４、２７、または２９から３２のいずれかに記載の装置、
    ここで、前記少なくとも一つのＳＬＭ構造は、前記少なくとも一つのさらなる構成が前記少なくとも一つのイメージを生じるように、４波ミキシングイメージング（ＦＷＭ）手順を達成するために前記少なくとも一つの放射をもたらすように構造化または構成されている。
34. 前記少なくとも一つのＳＬＭ構造が、前記少なくとも一つの試料内で二光子吸収を達成するために、前記少なくとも一つの放射のビームの形、大きさまたは流れ方向の少なくとも一つを変更するように構造化または構成されている、請求項９、２３、２４、２７、または２９から３３のいずれかに記載の装置。
35. 前記少なくとも一つのＳＬＭ構造が、前記少なくとも一つの試料内で三光子吸収を達成するために、前記少なくとも一つの放射のビームの形、大きさまたは流れ方向の少なくとも一つを変更するように構造化または構成されている、請求項９、２３、２４、２７、または２９から３４のいずれかに記載の装置。
36. 前記少なくとも一つのＳＬＭ構造が、位相のみのＳＬＭ構造である請求項９、２３、２４、２７、または２９から３５のいずれかに記載の装置。
37. 前記位相のみのＳＬＭ構造が、前記少なくとも一つの放射の強度の実質的減少を防ぐ請求項９、２３、２４、２７、または２９から３６のいずれかに記載の装置。
38. 前記少なくとも一つのＳＬＭ構造が、単独で、（ｉ）前記少なくとも一つの放射を伝えまたは反射し、かつさらに変更する、（ｉｉ）前記少なくとも一つの放射の強度を減少し、かつ（ｉｉｉ）前記少なくとも一つの放射を少なくとも部分的に遮断する、ように構成または構造化されている単一の光学要素を含む、請求項９、２３、２４、２７、または２９から３７のいずれかに記載の装置。
39. さらに、前記少なくとも一つの達成された放射に関連したデータを受領し、かつ該データの機能として前記少なくとも一つの試料の少なくとも一つの部分の少なくとも一つの三次元イメージを作成するように構成されている少なくとも一つのさらなる構造、を含む請求項９、２３、２４、２７、または２９から３８のいずれかに記載の装置、
    ここで、該少なくとも一つのさらなる構造は、さらに、三次元イメージに関連したさらなるデータを三次元データとして保存するように構成または構造化されている。
40. 前記少なくとも一つのＳＬＭ構造が、標的様式で、前記少なくとも一つの放射の配送を制御するように構造化または構成されている、請求項９、２３、２４、２７、または２９から３９のいずれかに記載の装置。
41. 前記少なくとも一つのＳＬＭ構造が、前記少なくとも一つの放射の強度を制御することにより、前記少なくとも一つの試料上または中の特定の場所への、前記少なくとも一つの放射の配送を制御するように構造化または構成されている、請求項４０に記載の装置。
42. 前記少なくとも一つの特定の構造が、複数の特定された場所にて、前記少なくとも一つの部分の光活性化が同時に誘発されるように構成または構造化されている、請求項１〜４０のいずれか一つに記載の装置。
43. 前記少なくとも一つのＳＬＭ構造が、前記少なくとも一つの試料のイメージ平面上に、前記少なくとも一つの放射の特定された空間プロファイルを提供するように構成または構造化されている、請求項９、２３、２４、２７、または２９から４０のいずれかに記載の装置。
44. 少なくとも一つの光放射が、所定の照射条件下で期待された結果とは異なる変調された強度にて、前記少なくとも一つ部分内で特定の深度にて特定の標的に提供される、請求項２４に記載の装置。
45. 少なくとも一つの放射を用いて、少なくとも一つの試料内の微小構造物を照射するように構造化または構成されている少なくとも一つの空間光モジュレーション（ＳＬＭ）構造、を含む少なくとも一つの放射をもたらすための装置。
46. 少なくとも一つの放射を調節して、少なくとも一つの試料に衝突するように、かつ該試料のための少なくとも一つの深度情報を得るように構造化または構成されている少なくとも一つの空間光モジュレーション（ＳＬＭ）構造、を含む少なくとも一つの放射をもたらすための装置。
47. 少なくとも一つの放射を達成し、かつ少なくとも一つのスキャンレス空間光モジュレーション（ＳＬＭ）顕微鏡構造中有に含まれるように構造化または構成されている少なくとも一つの空間光モジュレーション（ＳＬＭ）構造、を含む少なくとも一つの放射をもたらすための装置。
48. 少なくとも一つの試料の、光活性化、光不活性化または光化学効果の少なくとも一つを誘発するために少なくとも一つの放射をもたらすことを含む、少なくとも一つの放射をもたらすための装置。
49. 少なくとも一つの空間光モジュレーション（ＳＬＭ）構造とともに少なくとも一つの放射を用いて、少なくとも一つの試料内の微小構造物の照射を引き起こすことを含む、少なくとも一つの放射をもたらすための装置。
50. 少なくとも一つの空間光モジュレーション（ＳＬＭ）構造を用いて、少なくとも一つの試料に衝突させるためにかつ該試料のための少なくとも一つの深度情報を得るために、少なくとも一つの放射の位相の調節を引き起こすことを含む、少なくとも一つの放射をもたらすための装置。
51. 少なくとも一つのスキャンレス空間光モジュレーション（ＳＬＭ）顕微鏡構造に含まれる少なくとも一つの空間光モジュレーション（ＳＬＭ）構造を用いて、少なくとも一つの放射を達成することを含む、少なくとも一つの放射をもたらすための装置。

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