WO2023068241A1 - 条件付けに用いる刺激の付与方法、試験の方法、方法を実施する装置、及び、脳灌流液 - Google Patents

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WO2023068241A1
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drosophila
feeding
brain
conditioning
stimulus
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PCT/JP2022/038678
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晃 櫻井
基二郎 吉原
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国立研究開発法人情報通信研究機構
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers

Definitions

  • the present invention relates to a method for imparting stimuli used for conditioning Drosophila, a test method, an apparatus for carrying out the method, and a cerebral perfusate.
  • Drosophila has been used as a model organism for more than 100 years as an experimental material, and many discoveries have contributed to the understanding of the life phenomena of Honyu, including humans.
  • the molecular mechanism of the biological clock that causes jet lag in humans was clarified by research using Drosophila melanogaster, and was awarded the Nobel Prize in Physiology or Medicine in 2017.
  • Drosophila over other model organisms such as mice is that it is inexpensive to breed and suitable for large-scale screening, and that it reproduces quickly, so genetic manipulation that would take multiple generations can be performed in a short period of time. be.
  • cAMP-PKA signal plays an important role in common between Porphyria and Drosophila melanogaster. In this way, the important molecular mechanisms involved in survival are well conserved evolutionarily, and research using Drosophila as a model is expected to contribute to the elucidation of the molecular mechanisms of human memory.
  • memory is measured as "behavioral changes" of the animal. Changes in animal behavior are believed to be due to changes in connections between individual nerve cells (neurons) that make up the brain. In other words, memory is considered to be a phenomenon in which changes in brain cells change brain function and change animal behavior. Therefore, memory research includes an approach of observing changes in animal behavior and an approach of observing changes in cerebral nerve cells.
  • T-maze In Drosophila melanogaster, a method called “T-maze” is most commonly used as a method for measuring memory (Patent Document 1).
  • two types of odorants temporaryly referred to as “smell 1" and “smell 2"
  • 100 flies are given an electric shock or food while smelling "smell 1".
  • the flies are then placed in a T-shaped maze, with 'smell 1' coming from one side of the fork and 'smell 2' coming from the other, and the flies choose which way to go. .
  • Flies tend to avoid "smell 1" and move toward "smell 2" when paired with an electric shock.
  • T-maze is a method of evaluating this as a memory score.
  • Non-Patent Documents 1 to 3 describe the following cerebral perfusate.
  • Non-Patent Document 1 Name An adult hemolymph like (AHL) saline Composition (mM): NaCl, 108; KCl, 5; MgCl 2 , 4; CaCl 2 , 2 ; NaHCO 3, 4; 7.5, 265 mOsm).
  • Non-Patent Document 2 Composition (mM ) : NaCl, 103; KCl, 5; MgCl2 , 4 ; CaCl2 , 1.5; NaHCO3, 26; , 10 (pH 7.3, 270-275 mOsm).
  • Non-Patent Document 3 Name Na-Mg external solution Composition (mM): NaCl, 140; KCl, 2; MgCl2 , 4.5; CaCl2 , 1.5; HEPES-NaOH, 5 (pH 7.1, 284 mOsm).
  • Non-Patent Documents 1 to 3 when the brain is exposed for observation, the animals stop behaving in about 30 minutes. In order to track brain changes associated with memory formation, it is necessary to expose the brain to behavioral tests, then train the fruit flies to repeat the behavioral tests at regular intervals to observe memory retention. . Retention of memory cannot be observed within the limited time of 30 minutes.
  • the present invention includes, for example, the following aspects. 1) A method of imparting a conditioned stimulus to Drosophila, wherein the conditioned stimulus is imparted by pulling a limb away from an object grasped by the Drosophila with the limb. 2) A brain perfusate for insects, which is an aqueous solution containing at least one selected from trehalose and glucose, and a salt, and has an osmotic pressure in the range of 225 mOsm or more and 261 mOsm or less. 3) A method of feeding a bait solution to fruit flies through paper, wherein the feeding and absorption of the bait solution are performed on the paper before feeding the bait solution to the fruit flies. and repeating the method.
  • the present invention it is possible to provide a learning method that can be performed in Drosophila with the brain exposed for observation. According to another aspect of the present invention, it is possible to provide a cerebral perfusate capable of keeping Drosophila alive for a long time with the brain exposed.
  • FIG. 2 shows a novel Pavlovian conditioning experimental system.
  • A Schematic representation of a newly designed behavioral experiment using a single head-exposed fly individual for Pavlovian reflex conditioning. Left: shows an adult fly with its head exposed for saline perfusion and microscopy and placed in a recording chamber. Right: shows the flow of conditioning and testing. A 1M sucrose solution was applied to a piece of paper soaked to induce feeding behavior such as proboscis extension.
  • B Conditioning time schedule. In conditioning, after rod removal stimulation, stimulation with 1 M sucrose solution was performed five times at intervals of 30 seconds.
  • C Continuous changes in response to CS of the same fly individual to show how proboscis extension was measured in DF of FIG.
  • Wild type, dnc 1 mutant, rut 2 mutant were compared by Kruskal-Wallis test at each observation time point between these three groups after 10 min (**p ⁇ 0.01), after 30 min (** *p ⁇ 0.001), 40 minutes (*p ⁇ 0.05), 50 minutes (***p ⁇ 0.001), 60 minutes (**p ⁇ 0.01) A significant difference was observed.
  • Difference between wild-type and dnc1 mutants were observed after 10 minutes (**p ⁇ 0.01), 30 minutes (**p ⁇ 0.01) and 40 minutes (*p ⁇ 0.01).
  • FIG. 2 shows activity of feeding neurons before and after Pavlovian conditioning, measured by calcium imaging with GCaMP.
  • a upper row Schematic diagram of the experimental setup for simultaneous observation of feeding behavior and GCaMP fluorescence in the fly brain.
  • (A, lower left) Top view of the dissected brain in the chamber.
  • the Subesophageal zone (SEZ) is outlined with a dotted line.
  • (A lower right) shows the location of the feeding neurons in the SEZ.
  • the images are Z-stack images of 8 optical sections (2.25 ⁇ m per section) of a GMR81E10-GAL4>GFP expressing individual by two-photon microscopy.
  • the white square frame indicates the region corresponding to the figure showing GCaMP fluorescence in (B).
  • the branches of each feeding neuron are shown in red and black on the left and right respectively in the lower row.
  • a navy blue rectangular frame (4.97 ⁇ m ⁇ 9.93 ⁇ m) indicates the area where the fluorescence intensity of GCaMP shown in (B) was measured.
  • the outline of the head is shown because the fly glows brightly due to the excitation light irradiation for observing the GCaMP fluorescence.
  • the lower trace showing changes in fluorescence intensity is the 10 second recording within the navy blue box in (A) and is shown as a ratio of the original fluorescence intensity ( ⁇ F/F0).
  • the timing of rod removal for 7.6 seconds as CS is indicated by a black horizontal bar below the trace.
  • the green horizontal bar indicates the timing at which proboscis extension was observed.
  • C Time course changes in feeding neuron activity and feeding behavior with Pavlovian conditioning. (Upper row) The average value of ⁇ F/F0 during rod removal for 7.6 seconds was obtained for each experimental individual at each time point for seven individuals, and the average value of these seven individuals is shown.
  • FIG. 4 shows the effect of inactivation of feeding neurons with halorhodopsin on conditioned reflexes.
  • A Shows the timetable for experiments to suppress feeding neuron activity. The dorsal dendrites of bilateral feeding neurons were irradiated with a 588 nm laser.
  • FIG. 2 shows a new experimental system for Pavlovian conditioning and is related to FIG. 1; Animated snapshots demonstrating the conditioning procedure.
  • a fly individual grasps a wooden rod (2 mm diameter).
  • BC A stepping motor was moved under the control of LabView to pull the fly's grasping rod downward (arrows).
  • DE A piece of paper impregnated with sucrose solution was brought into contact with the fly's proboscis (arrowhead) immediately after the stick was pulled away from the fly.
  • sucrose solution was delivered to the strip through a needle connected to an injector.
  • the sucrose solution was supplied to the strip of paper immediately before stimulation, droplets were formed on the strip of paper, and then returned to the injection needle.
  • rice field. The individual fly reacted with the sucrose solution and extended its proboscis as a feeding behavior (arrowhead).
  • G Comparison of responses to US (1 M sucrose solution) and responses to CS (rod removal) that became evoked after conditioning. The upper row shows time-lapse photographs of natural feeding behavior observed when a piece of paper impregnated with a sucrose solution is brought into contact with the proboscis (arrowhead) of a wild-type individual.
  • FIG. 3 shows calcium imaging of feeding neuron responses to stimulation with water as US, expression pattern of GMR81E10-GAL4, and sucrose solution, and is related to FIG. (A) Mann-Whitney U test was used to compare the response to US during conditioning between 1M sucrose solution and water, and a significant difference was observed between the two (***P ⁇ 0.001). Eight individuals were used for the experiment for each group. Proboscis extension is shown in % of maximum.
  • Arrowheads indicate feeding neuron cell bodies, and arrows indicate feeding neuron dendrites.
  • D Z-stack images of 15 optical sections (2.25 ⁇ m thick) of the posterior SEZ of the same individual into the ventral posterior region of the SEZ as part of the nerve fiber bundles (arrows) projecting from the proboscis to the brain. Reaching (arrowheads) indicate neurons.
  • the dashed line indicates the position on the dorsal-ventral axis of the branch to which the left and right feeding neurons co-project. Scale bar indicates 20 ⁇ m.
  • E An example of GCaMP live imaging before and after stimulation with 100 mM sucrose solution.
  • FIG. 4 shows that conditioning-induced plastic changes are suppressed by feeding neuron deactivation during conditioning.
  • FIG. 4 shows that conditioning-induced plastic changes are suppressed by feeding neuron deactivation during conditioning.
  • AC Schematic representation of information flow through feeding neurons. The US and CS information are merged.
  • A It is also possible that changes in feeding neuron reactivity result from changes occurring in neurons upstream of the feeding neuron rather than the feeding neuron itself. For example, sweet-sensitive neurons that receive sucrose stimuli used as US and send downstream signals leading to eating behavior.
  • One aspect of the present invention is a method of imparting, as a conditioned stimulus, a Drosophila withdrawing a limb from an object that has been held by the limb.
  • Drosophila refers to insects belonging to the family Drosophila, more preferably belonging to the genus Drosophila. Although the type thereof is not particularly limited, Drosophila melanogaster is preferred.
  • the fruit fly is decapitated. Also, due to the incision in the head, the fruit fly has its antennae removed, its brain exposed, or its antennae removed and its brain exposed. Drosophila, whose heads have been dissected, are perfused with brain perfusate as needed.
  • the fruit fly is in a state where at least part of the digestive organs (eg, esophagus) has been removed and nutrition intake is not possible.
  • the digestive organs eg, esophagus
  • Drosophila is provided with a structure that regulates the movement of the proboscis.
  • a structure that regulates the movement of the proboscis may be, for example, a structure that inhibits folding of the proboscis.
  • the structure may be, for example, an adhesive that is dropped and cured.
  • the position where the structure is provided is, for example, near the lower part of the proboscis on the head of Drosophila, and the direction of extension of the proboscis moves more upward than when no structure is provided.
  • a conditioned stimulus is a stimulus that, when presented in a pair with an unconditioned stimulus to be described later, associates the conditioned stimulus with the behavior induced by the unconditioned stimulus and induces a change in the behavior of Drosophila melanogaster.
  • Drosophila conditioned by pair presentation of conditioned and unconditioned stimuli behaves in the same way as when presented with the unconditioned stimulus (i.e., memory is formed) even when only the conditioned stimulus is presented. be done).
  • "pulling a fruit fly away from an object held by its limbs” is used as a conditioned stimulus.
  • This conditioned stimulus involves the fruit fly holding onto an object with its paws and then moving the fly relative to the object: 1) immobilizing the fly and moving the object; or 3) moving both the fruit fly and the object.
  • Relative movement between the fruit fly and the object is preferably accomplished by: 1) immobilizing the fruit fly and moving the object, i.e. moving the object away from the limb.
  • the direction in which the object is moved may be selected from, for example, upward, downward, horizontal, rotational, and combinations thereof.
  • the object is not particularly limited in terms of shape, material, size, etc., as long as it can be grasped by Drosophila with its legs.
  • the object is wooden and rod-shaped.
  • the diameter of the rod is preferably 2 mm or more, and the length of the rod (the length of the part that the fly grabs) is preferably 3 mm or more.
  • the advantages of using a mechanical stimulus as a conditioned stimulus are: 1) it is superior as a conditioned stimulus; , there is no problem in performing fluorescence observation of the brain accompanied by excitation light irradiation, and the like.
  • An unconditioned stimulus that is presented against a conditioned stimulus is suitable, for example, "feeding fruit flies". Food is preferably provided to the flies as a solution in order to make the stimulus as constant (reproducible) as possible. It is also more preferable to apply the bait solution through a paper with a lower mesh than machine-made paper.
  • machine-made paper the fiber structure is aligned (there are grains) along the paper-making direction, so the stimulation given to the paper depends on where the proboscis of the fruit fly hits the paper, and the evaporation of water from the paper. Speed isn't the same. Note that the paper that has a smaller mesh than the machine-made paper is, for example, batch-type paper-made paper.
  • Batch papermaking paper includes, for example, hand-made paper, and from the viewpoint of less mesh, hand-made paper is more preferable than water-made paper.
  • the bait solution sucrose solution
  • the bait solution was given using hand-made Japanese paper (ganpishi) because the surface has very little unevenness and it is possible to uniformly stimulate the entire snout surface.
  • the reproducibility of the application of the unconditioned stimulus was clearly superior to that of the conventional method (Shiraiwa and Carlson, 2007 using Kimwipe torn fibers).
  • the paper is connected to a supply means (eg, a needle connected to a microinjector) containing a bait solution.
  • a supply means eg, a needle connected to a microinjector
  • concentration can be kept substantially constant, and unconditioned stimulus can be applied with good reproducibility.
  • the method of presenting the conditioned stimulus and the unconditioned stimulus in pairs is not particularly limited, and examples include a method of providing the unconditioned stimulus immediately after the start of applying the conditioned stimulus.
  • the paired presentation of the conditioned stimulus and the unconditioned stimulus is at least one time or more, and is usually performed multiple times until the desired state (memory is formed) is achieved.
  • the number of pair presentations may be, for example, 2 or more, 3 or more, 4 or more, or 5 or more, and may be, for example, 10 or less, 9 or less, or 8 or less.
  • Various conditions such as the duration of the conditioned stimulus, the duration of the unconditioned stimulus, and the intervals between pair presentations when these stimuli are presented multiple times may be appropriately set according to the type of Drosophila.
  • Test method> One aspect of the present invention is the above ⁇ 1.
  • memory was evaluated using Drosophila that showed a response related to unconditioned stimulus (e.g., extending the proboscis) when the conditioned stimulus was applied. It is the method of conducting the relevant tests.
  • Observing the Drosophila brain includes exposing the Drosophila brain, especially exposing and observing the SEZ of the brain.
  • SEZ it is desirable that a structure be provided on the head of the fruit fly with an adhesive or the like dropped on the lower part of the proboscis as described above. This prevents the root structure of the proboscis called the fulcrum from interfering with observation of the SEZ, and enables observation of changes in the SEZ and changes in the movement of the proboscis at the same time.
  • the proboscis of Drosophila When observing the movement of the proboscis of Drosophila, it is preferable to observe under conditions that do not give visual stimulation to Drosophila. Specifically, it is preferable to use light having a wavelength that is invisible to Drosophila as a light source for observation, and it is particularly preferable to use red light having a wavelength in the range of 700 nm or more and 780 nm or less.
  • the light source during observation is more preferably red light within the range of 710 nm or more and 770 nm or less, or 720 nm or more and 760 nm or less, or 730 nm or more and 750 nm or less, or 735 nm or more and 745 nm or less. be.
  • GCaMP a protein whose fluorescence intensity changes depending on the concentration of calcium ions (Ca 2+ indicator protein), is expressed only in specific neurons in the brain using genetic recombination technology.
  • a change in fluorescence intensity occurs due to the influx of calcium ions from the outside.
  • neural activity in animals can be monitored.
  • feeding neurons which are command neurons that trigger feeding behavior such as proboscis extension, we found that rod removal stimulus alone hardly increased GCaMP fluorescence at first (feeding neuron).
  • - Neurons are almost inactive), but after training, an increase in fluorescence is observed (feeding neurons become active).
  • This change in neural activity corresponds well with the change in behavior such as extending the proboscis, which is also an index for evaluating memory.
  • the quantification of the change in fluorescence intensity can be performed using, for example, a two-photon fluorescence microscope.
  • the use of two-photon fluorescence microscopy is preferable in terms of focused observation of feeding neurons.
  • it is preferable to use a method that places less burden on the Drosophila brain. 2 As soon as an observation target region (here, a feeding neuron) is found, a resonant scan mode is applied to observe its neural activity.
  • the wavelength of the far-infrared rays with which the Drosophila brain is irradiated when the resonant scan mode is applied is not particularly limited as long as it generates two-photon excitation, but is preferably 900 nm.
  • the irradiation time of the same far-infrared rays can be a length necessary for observation, and can be, for example, 10 seconds or longer.
  • a device is the device described in ⁇ 1.
  • This device consists of (1) an "object” to be grasped by the limbs of the fruit fly, (2) a “fixing member” for physically fixing the fruit fly in a living state, and (3) the fixing member and the object. and a “driving means” (conditional stimulus applying means) for relatively moving the .
  • a means for imparting an unconditioned stimulus (5) an observation means for observing the Drosophila brain, and (6) a perfusion means for perfusing the Drosophila brain with a cerebral perfusate, etc.
  • a rod is provided as an object to be grasped by Drosophila with its legs, and this rod can be moved up and down by a stepping motor (driving means).
  • the apparatus also includes an observation chamber for physically immobilizing and observing Drosophila in a live state. A decapitated Drosophila with its brain exposed is fixed at its head to an observation chamber.
  • This device further includes a microinjector (unconditional stimulation imparting means) for giving a sucrose solution (bait solution) to fruit flies through Japanese paper; a two-photon fluorescence microscope (observation means) for fluorescence observation inside the brain of fruit flies. and a perfusion device for perfusing the Drosophila brain with a brain perfusate.
  • a microinjector unconditional stimulation imparting means
  • a sucrose solution bait solution
  • observation means for fluorescence observation inside the brain of fruit flies.
  • a perfusion device for perfusing the Drosophila brain with a brain perfusate.
  • this device is equipped with a camera that records the behavior of Drosophila; a stereomicroscope for observation during operation; and a light source (red light with a wavelength of 740 nm) for the camera and stereomicroscope;
  • the operation of the stepping motor is controlled by a control circuit (not shown).
  • a control circuit (not shown).
  • the conditioned stimulus is presented to the fruit fly under programmed conditions during training of the fruit fly.
  • this control presents the Drosophila with a stimulus similar to the conditioned stimulus under programmed conditions.
  • a brain perfusate for Drosophila is an aqueous solution containing 1) at least one selected from trehalose and glucose, and 2) salts, and 3) an osmotic pressure of 225 mOsm or more and 261 mOsm or less. is within the range of Moreover, this cerebral perfusate is not limited to Drosophila, and can also be used as a cerebral perfusate for insects.
  • Trehalose is a component of insect blood sugar, and is a sugar with a structure in which two glucoses are linked. Glucose can be used as a substitute for trehalose.
  • the lower limits of the concentrations of trehalose and glucose (the total concentration when both are used) in the brain perfusate are, for example, 1 mM or higher, 3 mM or higher, 4 mM or higher, or 5 mM or higher.
  • the upper limits of the concentrations of trehalose and glucose (the total concentration when both are used) are, for example, 75 mM or less, 70 mM or less, 65 mM or less, or 60 mM or less.
  • Salts may be appropriately selected from salts constituting common physiological saline. Salts are, for example, at least one selected from the group consisting of NaCl, KCl, MgCl 2 and CaCl 2 , and it is preferable to use a plurality of salts.
  • the lower limit of salt concentration in the brain perfusate is, for example, 50 mM or higher, 60 mM or higher, 70 mM or higher, or 75 mM or higher.
  • the upper limit of the salt concentration is, for example, 160 mM or less, 150 mM or less, 140 mM or less, or 130 mM or less.
  • the lower limit of the concentration is, for example, 40 mM or more, 50 mM or more, 60 mM or more, or 70 mM or more
  • the upper limit of the concentration is, for example, 150 mM or less, 140 mM or less, 130 mM or less, or 120 mM. It is below.
  • the lower limit of each concentration is, for example, 0.5 mM or more, 0.6 mM or more, or 1 mM or more
  • the upper limit of the concentration is, for example, 10 mM or less. , 7 mM or less, or 5 mM or less.
  • the lower limit of the osmotic pressure of the brain perfusate may be preferably 230 mOsm or higher, 235 mOsm or higher, or 240 mOsm or higher, and the upper limit may be preferably 255 mOsm or lower, or 250 mOsm or lower.
  • the osmotic pressure of the cerebral perfusate may be adjusted using an osmotic pressure regulator such as sucrose, which is not metabolized in body fluids.
  • the pH of the brain perfusate is, for example, 6.5 or higher, preferably 7.0 or higher.
  • the pH of the brain perfusate is, for example, 8.0 or less, preferably 7.5 or less.
  • the brain perfusate is preferably a pH buffer.
  • Drosophila melanogaster can be observed with the brain exposed for at least 2 hours or more, 3 hours or more, 4 hours or more, or 5 hours or more. , over 10 hours, or over 24 hours.
  • the inventors used a technique called optogenetics, which manipulates the activity of nerve cells by illuminating them with light, and discovered that memories are formed by changes in molecules and cells that occur in feeding neurons. clarified.
  • optogenetics manipulates the activity of nerve cells by illuminating them with light
  • memories are formed by changes in molecules and cells that occur in feeding neurons. clarified.
  • This technological advance has made it possible to examine the functions of molecules that play a role in the process of memory formation. It has also enabled the search for drugs that act on the process of memory formation. More specifically, the following applications are conceivable.
  • the present invention not only assesses behavioral changes resulting from memory as in the conventional method, but also detects synaptic changes occurring on feeding neurons at the cellular level. can be found in Using Drosophila genetics, to investigate the function of each molecule in the pre- and post-synaptic cells involved in memory formation (post-synaptic cells are feeding neurons) can be done. This method makes it possible to search for groups of molecules that play a role in memory processes. 2) It is also possible to screen drugs that affect the memory mechanism by randomly administering the drug, but in addition, in 1), the molecular groups that function for memory formation are identified, and those molecular groups are used for drug discovery. It will also be possible to design drugs as targets.
  • the drug can be given directly to the site of memory formation by refluxing. Furthermore, it is also possible to locally administer drugs only to the feeding neurons by using a small pipette if desired.
  • the advantage of this is that the drug's effect on nerve cells, which is not directly related to memory formation, changes the animal's behavior as a side effect, and the possibility of picking up false positives that seem to have an effect on memory at first glance ( For example, in the conventional technology that only observes the behavior of flies, even if the general activity of flies increases regardless of memory, even if the amount of walking increases, the score of memory seems to improve at first glance. ) can be lowered. Therefore, by administering drugs and assessing changes in cells responsible for memory, it is possible to truly know the effects of drugs on the process of memory formation.
  • the present invention can also be expressed as including, for example, the following aspects. 1) A method of imparting a conditioned stimulus to Drosophila, wherein the conditioned stimulus is imparted by pulling a limb away from an object grasped by the Drosophila with the limb. 2) The method according to 1), wherein feeding to Drosophila is provided as an unconditioned stimulus presented during conditioning together with the conditioned stimulus. 3) The method according to 2), wherein the bait solution is applied to the fruit flies through a paper that is less dense than machine-made paper. 4) The method according to 3), wherein the feeding and absorption of the bait solution onto the paper are repeated before the bait solution is given to the fruit flies.
  • a brain perfusate for insects which is an aqueous solution containing at least one selected from trehalose and glucose, and a salt, and has an osmotic pressure in the range of 225 mOsm or more and 261 mOsm or less.
  • the brain perfusate according to 11 which is for Drosophila.
  • the brain perfusate according to 11) or 12 which is a pH buffer solution having a pH in the range of 6.5 to 8.0.
  • Example 1 An example of the method for simultaneously observing the brain and behavior of Drosophila according to the present invention will be described below, but the present invention is not limited by the following description.
  • Table 1 shows a list of important materials. ⁇ Details of experimental model and conditions> Drosophila melanogaster was kept at 25° C. with a 12 hour light/dark cycle according to standard protocols. Females were used in all experiments.
  • GMR81E10-GAL4 was isolated by Janelia Farm (reference document 3) and used for gene expression in feeding neurons. Individuals expressing GMR81E10-GAL4 and UAS-mCD8-gfp (ref. 4) as heterozygotes were used to visualize feeding neuron anatomy.
  • a drop of light-curing adhesive is applied to the bottom of the proboscis to prevent the base of the proboscis (a structure called the fulcrum) from obscuring the SEZ for imaging and optical manipulation as shown in Figures 3 and 4. bottom.
  • the proboscis often moved upward rather than forward during extension.
  • SY2020 composition: NaCl 85 mM, KCl 1 mM, MgCl 2 2.5 mM, CaCl 2 3 mM, NaHCO 3 10 mM, HEPES-NaOH 5 mM, trehalose 5 mM, sucrose 35 mM, pH 7.2.
  • SY2020 composition: NaCl 85 mM, KCl 1 mM, MgCl 2 2.5 mM, CaCl 2 3 mM, NaHCO 3 10 mM, HEPES-NaOH 5 mM, trehalose 5 mM, sucrose 35 mM, pH 7.2.
  • the individual flies were placed in the recording chamber as shown in A of Figure 3. Flies were illuminated with 740 nm red light (fiber coupled LED M740F2, Thorlabs) through an optical fiber (central diameter 200 mm, NA 2.2, Thorlabs) and allowed to receive sucrose while avoiding visual stimulation. Individual behavior was recorded from its lateral side using a Video-Zoom microscope XV-440 equipped with a CMOS camera (DMK23U445, Imaging Source). IC capture 2.4 software (Imaging Source) was used to acquire images. For rod removal, we used a stepping motor (TAMM40-10C and GSC-01, SigmaKoki) driven by LabView 2017. The stepping motor is equipped with a small manipulator (YOU-2, Narishige).
  • Rods (2 mm diameter, 10 mm length) were connected to longer rods and fixed at appropriate angles to the manipulator for flexibility of manipulation. A stick was placed near the individual with a manipulator so that the individual fly could grasp it with its paws. The action of the stepper motor released the rod from the animal's limb and returned it to its original position so that it could be grasped again.
  • Stimulation with sucrose was performed by contact with a piece of paper containing a sucrose solution.
  • a rectangular (400 ⁇ m wide, several mm long) piece of Japanese paper (Haibara) was made to be held in the needle using a machined and bent pin.
  • the injection needle was connected to a silicon tube and a microinjector (IM-11-2, Narishige) for supplying the sucrose solution (A in FIG. 3).
  • IM-11-2, Narishige for supplying the sucrose solution (A in FIG. 3).
  • a joystick manipulator MN-151, Narishige
  • flies cannot swallow sucrose as a reward, and the reward is limited to sensory perception of sweetness by sensory hairs on the surface of the snout.
  • the microscope stage and condenser were replaced with a recording chamber mounted on a movable viewing platform with manipulator M-152 (Narishige) and height adjustment platform (P-1A, Narishige).
  • Saline was perfused by pump (TP10-SA, As-One) or gravity for oxygenation. The perfusion was continued for 2 hours or more until the condition of the fly individual stabilized after dissection (until spontaneous extension of the proboscis subsided and the response to the sucrose solution became stronger).
  • Two-photon imaging and conditioning experiments except for optical activation were performed at 25°C.
  • GCaMP fluorescence in the main dendritic trunk of feeding neurons was quantified.
  • the main dendritic trunk of the feeding neuron was identified in galvanoscan mode and quantified with a ROI (Region of Interest) of 15 pixels (4.97 mm) x 30 pixels (9.93 mm).
  • ROI Region of Interest
  • a 142 pixel (47.07 mm) x 512 pixel (169.71 mm) area containing a 15 pixel x 30 pixel ROI was scanned for 200 cycles at 50 ms per scan for a total of 10 seconds.
  • scanning was performed with 900 nm far-infrared rays (5% power) for 10 seconds from 1 second before the start of the conditioned stimulus.
  • the average fluorescence intensity within the ROI was quantified using FV31S-SW software (Olympus) attached to the FVMPE-RS two-photon microscope.
  • the proboscis of fly individuals was stimulated with 1 mM, 10 mM and 100 mM sucrose solutions, and fluorescence of GCaMP was observed. Feeding neuron activity and proboscis extension to the conditioned stimulus observed in individuals 20 minutes after conditioning were just as strong as with 10 mM sucrose. From the above results, it can be seen that the reactivity of feeding neurons to CS was strengthened by conditioning, and feeding behavior (proboscis extension) could be induced by changes in the reactivity.
  • Example 2 physiological saline SY2020 (composition: 85 mM NaCl, 1 mM KCl, 2.5 mM MgCl 2 , 3 mM CaCl 2 , 10 mM NaHCO 3 , 5 mM HEPES-NaOH, 5 mM trehalose, 35 mM sucrose, pH 7.0) was used to observe the brains of Drosophila melanogaster individuals. Using 2), it was possible to maintain the survival of flies for 24 hours or more in the experimental operation, but there are other physiological saline solutions that have been confirmed to be able to maintain the survival of flies for a long time. The list is shown in Table 2 below.
  • the present invention can be used to search for molecules involved in memory and to search for drugs that act on them.

Abstract

ショウジョウバエにおいて、観察のために脳を露出させた状態でも実行可能な学習方法を提供する。本発明に係る方法は、ショウジョウバエに対して条件刺激を付与する方法であって、ショウジョウバエに肢でつかませておいた物体から当該肢を引き離すことを、条件刺激として付与する方法である。

Description

条件付けに用いる刺激の付与方法、試験の方法、方法を実施する装置、及び、脳灌流液
　本発明は、ショウジョウバエに対する、条件付けに用いる刺激の付与方法、試験の方法、方法を実施する装置、及び、脳灌流液に関する。
　ショウジョウバエは、モデル生物として１００年以上実験材料として用いられており、多くの発見がヒトを含むホニュウ類の生命現象の理解に貢献してきた。例えば、ヒトの時差ボケの原因となる体内時計の分子メカニズムは、キイロショウジョウバエを用いた研究によって明らかになり、２０１７年にノーベル生理学・医学賞の受賞対象となった。
　マウスなどの他のモデル生物にはないショウジョウバエの利点は、飼育のコストが低く大規模なスクリーニングに適している点や、繁殖が早いために複数世代かかるような遺伝子操作を短期間に行える点にある。また、記憶の分野においては、ｃＡＭＰ－ＰＫＡシグナルと呼ばれる分子機構がホニュウ類とキイロショウジョウバエとで共通して重要な役割を担っていることが報告されている。このように、生存に関わる重要な分子メカニズムは進化的によく保存されており、ショウジョウバエをモデルとした研究が、ヒトの記憶の分子メカニズムの解明に資することが期待されている。
　ヒト以外の動物の場合、筆記や言語によるコミュニケーションが取れないため、記憶はその動物の「行動の変化」として測定される。動物の行動が変化する理由は、脳を構成する１つ１つの神経細胞（ニューロン）同士の接続の変化によると信じられている。つまり、記憶は、脳の細胞が変化することによって、脳の機能が変化し、動物の行動が変わるという現象と考えられている。そのため、記憶の研究は、動物の行動の変化を観察するアプローチと、脳神経細胞の変化を観察するアプローチとが存在する。
　キイロショウジョウバエにおいては、「Ｔ－ｍａｚｅ」と呼ばれる方法が記憶を測定する方法として最も一般的に用いられている（特許文献１）。この方法においては、２種類の匂い物質（仮に「匂い１」及び「匂い２」とする）を用意し、１００匹のハエに「匂い１」を嗅がせながら、電気ショックまたはエサを与える。その後、Ｔ字型の迷路にそれらのハエを入れ、分かれ道のうち片側からは「匂い１」が、もう片側からは「匂い２」が漂ってくるようにし、どちらへ行くかをハエに選択させる。ハエは電気ショックと対にされた場合には「匂い１」を避け「匂い２」のほうへ進みがちになる。一方、エサと対にした場合には、「匂い１」の方へ進みがちになる。全く記憶が形成されていない場合には、それぞれの匂いを選ぶ個体数はほぼ５０対５０になるが、記憶が形成されるとこの数値に差異が生じる。Ｔ－ｍａｚｅは、これを記憶の点数として評価する手法である。
　また、ショウジョウバエにおいて脳を観察するためには、解剖によって頭部に穴をつくり、脳を露出させる必要がある。脳を露出された状態でショウジョウバエを生存させるためには、体液（細胞外液）の組成を模した水溶液を灌流するのが常套手段である。例えば、非特許文献１～３には、以下の脳灌流液が記載されている。
　（非特許文献１）名称An adult hemolymph like (AHL) saline
組成(mM) : NaCl, 108; KCl, 5; MgCl2, 4; CaCl2, 2; NaHCO3, 4; NaH2PO4, 1; HEPES-NaOH,5; Trehalose, 10; Sucrose, 5 (pH 7.5, 265 mOsm).
　（非特許文献２）組成(mM) : NaCl, 103; KCl, 5; MgCl2, 4; CaCl2, 1.5; NaHCO3, 26; NaH2PO4, 1; TES, 5;Trehalose, 8; Glucose, 10 (pH 7.3, 270-275 mOsm).
　（非特許文献３）名称Na-Mg external solution
組成(mM) : NaCl, 140; KCl, 2; MgCl2, 4.5; CaCl2, 1.5; HEPES-NaOH, 5 (pH 7.1, 284
 mOsm).
日本国特表２００２－５３７８５９号公報
Jing W. Wang, Allan M. Wong, Jorge Flores, Leslie B. Vosshall and Richard Axel. (2003). Two-Photon Calcium Imaging Reveals an Odor-Evoked Map of Activity in the Fly brain. Cell 112,271-282. Rachel Wilson, Glenn C. Turner and Gilles Laurent. (2004). Transformation of olfactory representations in the Drosophila antennal lobe. Science 303, 366-370. Thomas F. Flood, Shinya Iguchi, Michael Gorczyca, Benjamin White, Kei Ito and Motojiro Yoshihara. (2013). A single pair of interneurons commands the Drosophila feeding motor program.Nature 499, 83-87.
　古くからある多くの記憶の実験系は、行動の変化を観察して点数化するのみであり、神経細胞の変化はモニターできない。例えば、特許文献１の方法では、記憶の点数化が１００匹のキイロショウジョウバエの行動の総計で為されるのに対して、脳の観察は１匹ずつしか行うことはできないため、脳の変化と行動の変化との対応付けが困難である。さらに、キイロショウジョウバエが２種類の匂いのうちどちらかを選択し、そちらへ歩いて向かうことで記憶の点数化が為されるため、顕微鏡下に頭部を固定する必要がある脳の観察を同時に行うことは出来ない。
　また、脳の観察に関しても、脳を露出させたショウジョウバエを、充分な時間、行動可能な状態で維持することが困難である。例えば、非特許文献１～３に記載の方法では、観察のために脳を露出させると、３０分ほどで行動しなくなる。記憶形成に伴う脳の変化を追跡するためには、脳を露出させてから行動テストを行い、その後にショウジョウバエを訓練し、一定の間隔で行動テストを繰り返して記憶の保持を観察する必要がある。３０分という限られた時間の中では、記憶の保持を観察することができない。
　本発明の一態様は、ショウジョウバエにおいて、観察のために脳を露出させた状態でも実行可能な学習方法を提供することを一つの目的とする。本発明の他の態様では、脳を露出させた状態でショウジョウバエを長時間生かし続けることが可能な脳灌流液を提供することを目的とする。
　上記の課題を解決するために、本発明には、例えば、以下の態様が含まれる。
１）ショウジョウバエに対して条件刺激を付与する方法であって、ショウジョウバエに肢でつかませておいた物体から当該肢を引き離すことを、条件刺激として付与する方法。
２）トレハロース及びグルコースから選択される少なくとも一つと、塩類と、を含んでなる水溶液であり、浸透圧が２２５ｍＯｓｍ以上２６１ｍＯｓｍ以下の範囲内である、昆虫用の脳灌流液。
３）紙を介して、餌の溶液をショウジョウバエに対して与える方法であって、上記餌の溶液をショウジョウバエに対して与える前に、上記紙に対して、餌の溶液の送液と吸液とを繰り返す工程を含む、方法。
　本発明の一態様によれば、ショウジョウバエにおいて、観察のために脳を露出させた状態でも実行可能な学習方法を提供することが出来る。本発明の他の態様によれば、脳を露出させた状態でショウジョウバエを長時間生かし続けることが可能な脳灌流液を提供することが出来る。
新規パブロフ条件付け実験系を示す図である。（Ａ）頭部を露出したハエ個体１体をパブロフ反射条件付けに使い新しく設計された行動実験の模式図。左：頭部を生理食塩水灌流と顕微鏡観察のため露出し、記録チャンバの中に置かれたハエの成虫個体を示す。右：条件づけ及び試験の流れを示す。口吻の伸展のような摂食行動を引き起こさせるため１Ｍのスクロース溶液が紙片に浸して与えられた。（Ｂ）条件付けの時間スケジュール。条件付けにおいては、rod removal刺激ののち、１Ｍスクロース溶液による刺激を行うという操作を、３０秒おきに５回行った。（Ｃ）図１のＤ－Ｆ及び以降の図でどのように口吻の伸展を計測したかを示すために、同一ハエ個体のＣＳに対する反応の連続的な変化を示したもの（上から２つめの条件付け中の１Ｍスクロース溶液に対する反応は除く）。口吻の伸展のデータはすべて１Ｍスクロース溶液を与えた際（上から２つめ）の長さに対する割合（％）で示されている。口吻を伸ばした状態の頭部と、胸部の上端と動く前足が示されている。頭部はチャンバに取り付けられており、その上面は露出し生理食塩水の中で切開されている。（Ｄ）条件付けされた行動（口吻伸展を指標とした）の時間経過（図１のＣで示した最大伸展に対する割合で示す)。図１のＢに示される手順でＣＳとＵＳを対にして呈示したグループ（Pairedグループ）と、ＵＳの１０分前にＣＳを与えることでＣＳとＵＳの呈示のタイミングをずらしたグループ（Unpairedグループ）について、Mann-Whitney U検定を用いて、各観察時点で比較解析を行った。２グループ間で条件付け１０分後（＊＊ｐ＜０．０１）及び２０分後（＊ｐ＜０．０５）において統計的有意差がみられた。各時点においてPairedグループは７個体、Unpairedグループは５個体が実験に使われた。エラーバーは標準誤差を示す。（Ｅ）強化したCS（連続的なrod removalの代わりに、０．３秒の小休止を４回挟んだ７．６秒のrod removal）を用いた条件付け（図１のＢと同じ手順によって為され、その後１０分おきに試験のためにCSを与えた）を行った場合に、６０分後に観察される条件反射。口吻伸展の長さを計測し、図１のＣと同様に最大伸展に対する割合で示している。Pairedグループ（ｎ＝８）、Unpaired（ｎ＝９）、ＣＳのみ与えたグループ（ｎ＝８）及びＵＳのみ与えたグループ（ｎ＝８）についてKruskal-Wallis検定を行い、４グループ間で統計的な有意差がみられた（＊＊＊ｐ＜０．００１）。Dunn's post hoc検定によってPairedグループとUnpairedグループ間（＊ｐ＜０．０５）、PairedグループとCSのみのグループ間（＊＊＊ｐ＜０．００１）及びPairedグループとＵＳのみのグループ間（＊＊ｐ＜０．０１）で統計的な有意差がみられた。エラーバーは標準誤差を示す。（Ｆ）条件付けの前後におけるスクロース溶液に対する反応の比較。１ｍＭ、１０ｍＭ、１００ｍＭスクロース溶液による口吻への刺激に対する反応を、口吻伸展の長さによって条件付け前後に同一個体で連続的に測定した。条件付け後には口吻の先端はＭｉｌｌｉ－Ｑ水によって洗い、口吻表面に残ったスクロースを洗い落とした。いずれの濃度においても、条件付け前後でt検定において有意差は見られなかった（ｐ＞０．０５）。６個体が分析に使われた。エラーバーは標準誤差を示す。 dnc1変異体及びrut2変異体における、条件反射の成立効率の低下を示す図である。（Ａ）口吻の伸展の長さを指標にした条件反射の時間経過。野生型、dnc1変異体、rut2変異体は各観察時点においてKruskal-Wallis検定によって比較され、これらの３群間で１０分後（＊＊ｐ＜０．０１）、３０分後（＊＊＊ｐ＜０．００１）、４０分後（＊ｐ＜０．０５）、５０分後（＊＊＊ｐ＜０．００１）、６０分後（＊＊ｐ＜０．０１）に統計的な有意差がみられた。Dunn's post hoc検定により、野生型とdnc1変異体間で１０分後（＊＊ｐ＜０．０１）、３０分後（＊＊ｐ＜０．０１）、４０分後（＊ｐ＜０．０５）、５０分後（＊＊ｐ＜０．０１）、６０分後（＊ｐ＜０．０５）、野生型とrut2変異体間で３０分後（＊＊ｐ＜０．０１）、４０分後（＊ｐ＜０．０５）、５０分後（＊＊ｐ＜０．０１）、６０分後（＊＊ｐ＜０．０１）において統計的な有意差がみられた。（＊印は両変異体の６０分後の結果を示すグラフにのみ表示）。各時点での分析には各遺伝子型から５個体が実験に供された。エラーバーは標準誤差を示す。（Ｂ－Ｃ）条件付け中の野生型、dnc1変異体、rut2変異体のＣＳ及びＵＳに対する反応。図１のＥも参照。（Ｂ）各rod removalにおけるカメラ側に映った中肢のバタつき回数を計測し、５回のＣＳ－ＵＳ対刺激中におけるその平均頻度（回／秒）を各遺伝子型のＣＳに対する反応として示した。（Ｃ）ＵＳに対する反応として、スクロース溶液による口吻の伸展（最大伸展に対する％）を計測。野生型、dnc1変異体、rut2変異体を一元配置分散分析にかけた結果、（Ｂ）及び（Ｃ）どちらにおいても３群間に有意差は見られなかった（ｐ＞０．０５）。分析には各遺伝子型について５個体が使用された。これらはKolmogorov-Smirnovの正規性検定を通過した。エラーバーは標準誤差を示す。 ＧＣａＭＰを用いたカルシウムイメージング法によって測定した、パブロフ条件付け前後のフィーディング・ニューロンの活動を示す図である。（Ａ上段）摂食行動とハエの脳におけるＧＣａＭＰ蛍光を同時観察するための実験装置の模式図。（Ａ下段左）チャンバ内の解剖後の脳を上から見た図。Subesophageal zone（ＳＥＺ）を点線で縁取りしている。（Ａ下段右）ＳＥＺ内のフィーディング・ニューロンの位置を示す。画像はＧＭＲ８１Ｅ１０－ＧＡＬ４＞ＧＦＰ発現個体の、二光子顕微鏡による８光学切片（１切片２．２５μｍ)のＺスタック画像である。白色正方形の枠は（Ｂ）のＧＣａＭＰ蛍光を示した図に該当する領域を示す。各フィーディング・ニューロンの分枝については、さらに下段において左右それぞれ赤及び黒で示す。ネイビーブルーの長方形の枠（４．９７μｍ×９．９３μｍ）は、（Ｂ）で示されるＧＣａＭＰの蛍光強度を計測した領域を示す。（Ｂ）ＧＭＲ８１Ｅ１０－ＧＡＬ４＞ＧＣａＭＰ６ｍ発現個体の、条件付け前（上段）及び条件付け１０分後（下段）のＧＣａＭＰによる蛍光と摂食行動。左の正方形枠内にＧＣａＭＰの蛍光、そして右側枠内に摂食行動の様子を示す。下に示された蛍光強度の変化を示すトレースの線でつないで示した各時点での記録である。フィーディング・ニューロンのmain dendritic trunkと口吻の先端を白の矢尻で示す。ＧＣａＭＰ蛍光を観察するための励起光照射によりハエが明るく光っているため、頭部の外形を図示した。下の蛍光強度の変化を示すトレースは、（Ａ）のネイビーブルー枠内の１０秒間の記録であり、元の蛍光強度に対する比（ΔＦ／Ｆ０）として示されている。ＣＳとして７．６秒間のrod removalを行ったタイミングを、トレースの下に黒の横棒で示す。緑の横棒は口吻の伸展がみられたタイミングを示している。（Ｃ）パブロフ条件付けによるフィーディング・ニューロンの活動と摂食行動の時間経過に伴う変化を示す。（上段）７．６秒のrod removal中のΔＦ／Ｆ０の平均値を、実験個体ごとに各時点で求めるという作業を７個体について行い、それら７個体の平均値として示す。ＣＳとＵＳを対呈示する３０秒前、１０分後及び２０分後におけるrod removal中のΔＦ／Ｆ０の平均値を、Friedman検定を用いて比較したところ、３群間において有意差がみられた（＊＊ｐ＜０．０１）。Dunn's post hoc検定により、刺激前と刺激１０分後の間（＊＊ｐ＜０．０１）及び刺激前と刺激２０分後の間（＊ｐ＜０．０５）に有意差がみられた。エラーバーは標準誤差を示す。（下段）rod removal中に観察された口吻伸展のうち最大のものを定量した（スクロース刺激によって完全に伸展された際の大きさに対する比として示す）。条件付け前及び条件付け１０分後、２０分後の口吻伸展をFriedman検定を用いて比較したところ、３群間において有意差がみられた（＊＊ｐ＜０．０１）。Dunn's post hoc検定により、条件付け前と条件付け１０分後の間及び条件付け前と条件付け２０分後の間に有意差がみられた（ともに＊ｐ＜０．０５）。エラーバーは標準誤差を示す。（Ｄ）１０ｍＭスクロース溶液による刺激後のフィーディング・ニューロンの活動を、ＧＣａＭＰの蛍光として計測した結果を示す。データの示し方や縮尺は（Ｂ）と同様。緑のバーは口吻の伸展がみられたタイミングを示す。（Ｅ）（左）１ｍＭ（ｎ＝１６）、１０ｍＭ（ｎ＝１０）、１００ｍＭ（ｎ＝８）スクロース溶液による刺激時のフィーディング・ニューロンの活動をＧＣａＭＰの蛍光として計測した。最も蛍光強度（ΔＦ／Ｆ０, ％）が増したピークの値を濃度ごとにプロットした。縦軸と横軸の値はそれぞれ対数で示されている。エラーバーは標準誤差を示す。（右）同様に、パブロフ条件付け前後の各時点における蛍光強度の最大値（ΔＦ／Ｆ０, ％）を示す。７．６秒のrod removal期における最大値を、各時点の７個体の平均値として示している。条件付け前（線でつながれずに示されているもの）及び条件付け１０分後、２０分後のΔＦ／Ｆ０のピーク値についてFriedman検定を行い、これら３群間において有意差がみられた（＊ｐ＜０．０５）。条件付け前と条件付け１０分後の間及び条件付け前と条件付け２０分後の間（ともに＊ｐ＜０．０５）に有意差がみられた。エラーバーは標準誤差を示す。 ハロロドプシンを用いたフィーディング・ニューロンの不活性化による条件反射への影響を示す図である。（Ａ）フィーディング・ニューロンの活動を抑制する実験のタイムテーブルを示す。両側のフィーディング・ニューロンの背側樹状突起に５８８ｎｍのレーザーを照射した。条件付けのためにＣＳとＵＳを与えているときに同時に５８８ｎｍのレーザー光を照射し、フィーディング・ニューロンの活動を抑制した場合（Simultaneous illumination）の影響について、対象群としてＣＳとＵＳを与える１０秒前にレーザーを照射する場合（Shifted illumination）と比較することで解析した。（Ｂ）ＧＭＲ８１Ｅ１０－ＧＡＬ４を用いて、フィーディング・ニューロンにハロロドプシンを発現させた。フィーディング・ニューロンの不活性化により、ＵＳに対する反応が抑制された。条件付けのために行った５回のスクロース溶液による刺激（ＵＳ）によって起こる口吻伸展の大きさの平均をSimultaneous illuminationを受けたグループと、Shifted illuminationを受けたグループとの間でt検定による比較を行ったところ、有意差がみられた（＊ｐ＜０．０５）。各グループにそれぞれにつき５個体を用いて実験を行ったが、Kolmogorov-Smirnovの正規性検定を通過することが確認された。（Ｃ）条件反射（口吻伸展）の時間経過による変化を示す。Simultaneous illuminationグループとShifted illuminationグループについて、各時点についてKolmogorov-Smirnovの正規性検定を通過することが確認された場合はt検定を行い、次のように２グループ間に有意差がみられた。１０分後、２０分後、４０分後において＊ｐ＜０．０５であり、３０分後、５０分後において＊＊ｐ＜０．０１であった。６０分後については、同時照射グループが正規性検定を通過せず、またMann-Whitney U検定を行ったが、統計的に有意な差はみられなかった（ｐ＝０．０６３５）。各時点において５個体を実験に供した。エラーバーは標準誤差を示す。（Ｄ）パブロフ条件付けにおいて、ＣＳ（rod removal）とＵＳ（スクロース）が連合される様子を模式的に示した図。条件付け後、摂食行動の運動プログラムがＣＳのみで引き起こされるように、フィーディング・ニューロンによる情報処理過程が変化している。 パブロフ条件付けの新しい実験系を示す図であり、図１と関連する。条件付けの手順を示す動画のスナップ画像。（Ａ）ハエ個体が木製のロッド（直径２ｍｍ）をつかんでいる。（Ｂ－Ｃ）LabViewによる制御でステッピングモータを動かし、ハエがつかんでいる棒を下方へ引き離した（矢印）。（Ｄ－Ｅ）棒をハエから引き離した直後に、スクロース溶液を染み込ませた紙片をハエの口吻（矢尻）に接触させた。インジェクターにつないだ注射針からスクロース溶液を紙片へと供給した。紙片中のスクロース溶液の濃度を目的の一定の値にするために、刺激直前に紙片へとスクロース溶液を供給し、紙片上で液滴をつくらせ、そしてまた注射針内に戻すという操作を行った。（Ｆ）ハエ個体がスクロース溶液反応し、摂食行動として口吻を伸展した（矢尻）。（Ｇ）ＵＳ（１Ｍスクロース溶液）に対する反応と、条件付け後に引き起こされるようになったＣＳ（rod removal）に対する反応の比較。上段は、野生型個体が口吻（矢尻）にスクロース溶液の染み込んだ紙片を接触させた際に観察される自然状態での摂食行動のタイムラプス写真を示している。下段は、図１のＢに示す方法により獲得される条件反射のタイムラプス写真を示す。上段に示されるような口吻を１００％伸展させた時とほとんど同様に、rod removal後すぐに口吻の伸展が引き起こされた。写真は１／１５秒おきに撮影されている。 ＵＳとして水を用いた条件付けの試み、ＧＭＲ８１Ｅ１０－ＧＡＬ４の発現パターン、スクロース溶液による刺激に対するフィーディング・ニューロンの反応のカルシウムイメージングの様子を示す図であり、図３と関連する。（Ａ）条件付け中のＵＳに対する反応を１Ｍスクロース溶液の場合と、水の場合とでMann-Whitney U 検定を用いて比較したところ、両者のあいだで有意差がみられた（＊＊＊Ｐ＜０．００１）。各グループについて８個体が実験に供された。口吻の伸展を最大値に対する％で示す。（Ｂ）条件付け後のＣＳに対する反応を、ＵＳに１Ｍスクロースを用いた場合と、水を用いた場合とで、Mann-Whitney U 検定を用いて比較したところ、両者の間で有意差がみられた（＊＊＊Ｐ＜０．００１）。各グループについて８個体が実験に供された。条件付け１０分後のＣＳに対する口吻の伸展を最大値に対する％で示す。（Ｃ－Ｄ）フィーディング・ニューロンを標識するＧＭＲ８１Ｅ１０－ＧＡＬ４ラインの発現パターン。ＵＡＳ－ｍＣＤ８－ｇｆｐを発現させ可視化している。（Ｃ）記録チャンバにセットされた状態で二光子顕微鏡を用いて観察されたフィーディング・ニューロンを含むＧＦＰ蛍光画像。ＳＥＺをスキャンした８枚の光学切片（１切片の厚みは２．２５μｍ）のＺスタックとして示されている。矢尻がフィーディング・ニューロンの細胞体を、矢印はフィーディング・ニューロンの樹状突起を示す。（Ｄ）同じ個体のＳＥＺ後部の１５光学切片（厚さ２．２５μｍ）のＺスタック画像であり、口吻から脳へと投射する神経線維束（矢印）の一部としてＳＥＺの腹側後部領域へ到達する（矢尻）神経細胞を示している。破線は、左右のフィーディング・ニューロンが共に投射する枝の背腹軸上の位置を示す。スケールバーは２０μｍを示す。（Ｅ）１００ｍＭスクロース溶液刺激の前後におけるＧＣａＭＰライブイメージングの一例。図３のＥにおいて定量に使った長方形のＲＯＩ（４．９７μｍ×９．９３μｍ）を赤色で示す。スケールバーは２０μｍを示す。 条件付けによる可塑的変化が、条件付け中のフィーディング・ニューロン不活性化によって抑制されることを示す図であり、図４と関連する。（Ａ－Ｃ）フィーディング・ニューロンを通る情報の流れを模式図で示す。ＵＳとＣＳの情報が統合される。（Ａ）フィーディング・ニューロンの反応性の変化は、フィーディング・ニューロンそのものではなく、その上流のニューロンに起こる変化に起因するという可能性もある。例えば、ＵＳとして用いたスクロース刺激を受容し摂食行動につながるシグナルを下流に送っている甘味感受性ニューロンである。（Ｂ）ＣＳの情報が、摂食神経回路内でフィーディング・ニューロンそのものか、その下流の運動ニューロンへと入ってきている場合には、フィーディング・ニューロンの不活性化によって条件反射が成立しなくなるはずである。（Ｃ）フィーディング・ニューロンが活動することが、条件反射の成立に必要である。フィーディング・ニューロンの上で可塑的な変化が起こり、機能的なつながりがつくられるということと符合する結果である。（Ｄ）図４に示されるハロロドプシンを用いた実験において、条件付け時のＣＳに対する反応を定量した。各個体５回のrod removalについて、カメラ側の中肢のバタつき回数を計測し、その頻度（回数／秒）の平均値を求め、Simultaneous illuminationグループとShifted illuminationグループごとに、ＣＳに対する反応として示した。両者の間でt検定による有意差は見られなかった（Ｐ＞０．０５）。正規性の検定には、Kolmogorov-Smirnovの検定を用いた。エラーバーは標準誤差を示す。
　〔実施形態１〕
　以下、本発明の一実施形態について、詳細に説明する。
　＜１．条件付けに用いる刺激を付与する方法＞
　本発明の一態様は、ショウジョウバエに肢でつかませておいた物体から当該肢を引き離すことを、条件刺激として付与する方法である。
　　（ショウジョウバエ）
　ショウジョウバエは、ショウジョウバエ科に属する昆虫を指し、より好ましくはショウジョウバエ属に属する昆虫を指す。その種類は特に限定されないが、キイロショウジョウバエが好ましい。
　一態様において、ショウジョウバエは、頭部が切開されている。また、頭部が切開されていることにより、ショウジョウバエは、触角が取り除かれているか、脳が露出しているか、触角が取り除かれると共に脳が露出している。頭部が切開されているショウジョウバエは、必要に応じて脳灌流液を用いた脳の灌流が行われている。
　また、別の一態様において、ショウジョウバエは、消化器官（例えば、食道）の少なくとも一部が取り除かれていて、栄養の摂取が出来ない状態のものである。
　さらに別の一態様において、ショウジョウバエには、口吻の動きを規制する構造物が設けられている。口吻の動きを規制する構造物とは、例えば口吻の折り畳みを阻害する構造物であり得る。構造物は、例えば接着剤を滴下して硬化させたものなどであってもよい。構造物を設ける位置は、例えば、ショウジョウバエの頭部における口吻の下部付近であり、構造物を設けない場合と比較して、口吻の伸展の方向がより上向きに動くようになる。また、構造物を設けない場合と比較して、口吻の折り畳みが阻害されることによって、口吻の根元（フルクラムと呼ばれる構造）が脳のSubesophageal zone（ＳＥＺ）を覆い隠すことが防止される。この結果、実施例にも示すように、ＳＥＺの観察と、口吻の観察とを一度に行うことができる。
　　（条件刺激の付与）
　条件刺激とは、後述する無条件刺激と対にして呈示することによって、条件刺激が無条件刺激によって引き起こされる行動に連合され、ショウジョウバエの行動に変化を引き起こすようになる刺激である。具体的には、条件刺激と無条件刺激との対呈示によって条件付けされたショウジョウバエは、条件刺激を呈示されるだけで、無条件刺激を呈示されたときと同様の行動をとる（つまり記憶が形成される）ようになる。
　本実施の形態では、「ショウジョウバエに肢でつかませておいた物体から肢を引き離すこと」を、条件刺激として用いる。この条件刺激は、ショウジョウバエに肢で物体につかませておいてから、ショウジョウバエと物体との相対的な移動、すなわち、１）ショウジョウバエを固定し、物体を動かすこと、２）物体を固定し、ショウジョウバエを動かすこと、又は、３）ショウジョウバエと物体とを何れも動かすこと、によって実現できる。ショウジョウバエと物体との相対的な移動は、１）ショウジョウバエを固定し、物体を動かすこと、すなわち物体を肢から引き離す方向に動かすこと、が好ましい。物体を動かす方向は、例えば、上方向、下方向、水平方向、回転方向、及び、これらの組合せの方向等から選択される。
　物体は、ショウジョウバエが肢でつかむことが出来るものであれば、その形状、材質、及びサイズ等は特に限定されない。好ましい一例では、物体は木製であり、棒状である。棒の直径は好ましくは２ｍｍ以上であり、棒の長さ（ハエがつかむ部分の長さ）は好ましくは３ｍｍ以上である。
　条件刺激として機械的な刺激を用いる利点は、１）まず条件刺激として優れていること、２）頭部が切開され触角が取り除かれたショウジョウバエにも適用できること、及び、３）視覚刺激ではないので、励起光の照射を伴う脳の蛍光観察等を行う上でも支障のないこと、等が挙げられる。
　　（無条件刺激の付与）
　条件刺激と対呈示される無条件刺激は、例えば、「ショウジョウバエに対して餌を与えること」、が好適である。刺激を可能な限り一定にする（再現性あるものにする）ため、餌は溶液として、ショウジョウバエに与えることが好ましい。また、機械抄紙の紙よりも目の少ない紙を介して、餌の溶液を与えることがより好ましい。機械抄紙の紙は、抄紙時の流れ方向に沿って繊維構造が揃う（目がある）ため、ショウジョウバエの口吻が紙のどこに当たるかで付与される刺激が異なってくるし、紙からの水分の蒸発スピードも一様ではない。なお、機械抄紙の紙よりも目の少ない紙とは、例えば、バッチ式抄紙の紙である。バッチ式抄紙の紙とは、例えば、手漉きの紙が挙げられ、目の少なさの観点で、流し漉きよりもため漉きの手漉きの紙が好ましい。なお、実施例では、表面の凹凸が極めて少なく吻表面全体を一様に刺激することが可能との理由で、手漉きの和紙（雁皮紙）を用いて餌の溶液（スクロース溶液）を与えたが、従来の方法（キムワイプをちぎった繊維を用いるShiraiwa and Carlson,　2007）よりも、無条件刺激の付与の再現性が明らかに優れていた。
　一態様において、紙は、餌の溶液を貯蔵した供給手段（例えば、マイクロインジェクタに接続した注射針）に連結されている。ショウジョウバエに無条件刺激を付与する直前まで、供給手段から紙に対して、餌の溶液の送液と吸液とを繰り返すことによって、紙から水分が蒸発した場合でも、紙に含まれる餌の溶液の濃度を略一定に保つことができ、再現性よく無条件刺激の付与を行うことができる。
　条件刺激と無条件刺激とを対呈示する方式は特に限定されず、条件刺激の付与の開始後速やかに無条件刺激を付与する方式等が挙げられる。
　条件刺激と無条件刺激との対呈示は、少なくとも１回以上であり、通常は、所望する状態になる（記憶が形成される）まで複数回行われる。対呈示の回数は、例えば、２回以上、３回以上、４回以上、又は、５回以上であってよく、例えば、１０回以下、９回以下、又は、８回以下であってよい。
　条件刺激の時間、無条件刺激の時間、これら刺激の対呈示を複数回行う場合の対呈示同士の間隔等の諸条件も、ショウジョウバエの種類等に応じて適宜設定すればよい。
　キイロショウジョウバエの場合は、rod removal（棒を離す）刺激（条件刺激）を与えながら、スクロース水溶液を与える（無条件刺激）と、パブロフの犬がベルの音を聞くだけで唾液の分泌という摂食行動をとるようになったように、ハエはrod removal刺激のみで、吻を伸展させるという摂食行動を示すようになった（実施例参照）。吻の伸展は、キイロショウジョウバエの頭部を固定した状態でも観察し定量可能な行動である。吻を最大に伸ばしたときの長さに対してどのくらい伸ばしたか、その割合（％）を記憶の点数として評価する。最初は、rod removal刺激のみでは、ほとんど吻を伸ばすことはなく、記憶の点数としてはほぼ０％であるが、rod removal刺激とスクロース水溶液による刺激とを対にして呈示する操作を３０秒間隔で５回くり返す（訓練）と、ほぼ全ての個体でこの点数が増大する。また、記憶形成に異常があると報告されている、キイロショウジョウバエの突然変異体「dnc1」「rut2」では、訓練後の点数の上昇が小さく、この点数化法が記憶の評価方法として理にかなっていることの裏付けも得られた。
　＜２．試験の方法＞
　本発明の一態様は、上記＜１．条件付けに用いる刺激を付与する方法＞の欄に記載の方法によって、条件刺激が付与されると無条件刺激に関する応答（例えば、口吻を伸ばすこと）を示すようになったショウジョウバエを用いて、記憶に関係する試験を行う方法である。
　この試験では、上記条件刺激と同種の刺激をショウジョウバエに付与して、ショウジョウバエの応答（無条件刺激に関する応答の程度）を観察することや、ショウジョウバエの脳を観察すること、等が行われる。
　ショウジョウバエの脳を観察することには、ショウジョウバエの脳を露出し、特に脳のＳＥＺを露出して観察することが含まれる。ＳＥＺの観察においては、上記のとおり口吻の下部に滴下された接着剤等によって、ショウジョウバエの頭部に構造物が設けられていることが望ましい。これにより、フルクラムと呼ばれる口吻の根元構造がＳＥＺの観察の妨げとなることを防ぎ、ＳＥＺの変化と口吻の動きの変化とを一度に観察することができる。
　ショウジョウバエの口吻の動きの観察においては、ショウジョウバエに視覚的刺激を与えない条件下で観察を行うことが好ましい。具体的には観察時の光源としてショウジョウバエが視認できない波長の光を用いることが好ましく、特に波長７００ｎｍ以上７８０ｎｍ以下の範囲内の赤色光を用いることがより好ましい。観察時の光源は、さらに好ましくは７１０ｎｍ以上７７０ｎｍ以下の範囲内、又は、７２０ｎｍ以上７６０ｎｍ以下の範囲内、又は、７３０ｎｍ以上７５０ｎｍ以下の範囲内、又は、７３５ｎｍ以上７４５ｎｍ以下の範囲内の赤色光である。
　記憶現象においては、脳の神経細胞の変化によって動物の行動が変化するが、本発明の一実施形態では、上記のとおりこれらを同時に観察することができる（実施例も参照）。カルシウムイオンの濃度によって蛍光強度が変わるタンパク質（Ｃａ2+インジケータタンパク質）ＧＣａＭＰを、遺伝子組換え技術を用いて脳の特定の神経細胞にのみ発現させておくと、神経細胞が活動する際には細胞外からカルシウムイオンが流入するため、蛍光強度の変化が生じる。この蛍光強度の変化を定量することによって、動物の神経活動をモニターすることができる。この手法を用いて、吻を伸ばすなどの摂食行動を引き起こすコマンドニューロンであるフィーディング・ニューロンの活動をモニターすると、最初はrod removal刺激のみでは、ＧＣａＭＰの蛍光増大はほとんど見られない（フィーディング・ニューロンはほとんど活動しない）が、訓練後には蛍光増大が観察される（フィーディング・ニューロンが活動する）ようになる。この神経活動の変化は、上述の吻を伸ばすようになるという行動の変化とよく対応しており、これも記憶を評価するための指標となる。なお、上記蛍光強度の変化の定量は、例えば二光子蛍光顕微鏡を使用することで行われ得る。二光子蛍光顕微鏡を使用することは、フィーディング・ニューロンに焦点をしぼった観察を行う点で好ましい。また、ショウジョウバエの脳への負担が少ない方法であることが好ましく、例えば、１）ガルバノスキャンモードを適用して、観察の対象領域（ここではフィーディング・ニューロン）を、遠赤外光を照射して探索し、２）観察の対象領域（ここではフィーディング・ニューロン）を発見次第、レゾナントスキャンモードを適用してその神経活動を観察する、方法などが採用され得る。レゾナントスキャンモード適用時にショウジョウバエの脳に照射される遠赤外線の波長は、二光子励起を発生させるものであれば特に限定されないが、９００ｎｍであることが好ましい。同遠赤外線の照射時間は、観察に必要な長さであり得、例えば１０秒以上であり得る。
　＜３．装置＞
　本発明の一態様に係る装置は、上記＜１．条件付けに用いる刺激を付与する方法＞欄に記載の方法や、上記＜２．試験の方法＞欄に記載の方法を実施するのに適した装置である。この装置は、（１）ショウジョウバエが肢でつかむ対象となる「物体」と、（２）ショウジョウバエを生きた状態で物理的に固定するための「固定部材」と、（３）固定部材と上記物体とを相対的に移動させる「駆動手段」（条件刺激の付与手段）と、を備えている。さらに、（４）無条件刺激の付与手段、（５）ショウジョウバエの脳を観察する観察手段、及び、（６）ショウジョウバエの脳に対して脳灌流液を用いた灌流を行う灌流手段、等を備えてもよい。
　装置の一具体例について、図３に基づき説明する。この装置では、ショウジョウバエが肢でつかむ対象となる物体として棒（rod)を備え、この棒はステッピングモータ（駆動手段）によって上下方向に動かすことが出来る。また、装置は、ショウジョウバエを生きた状態で物理的に固定し、観察するための観察チャンバを備える。頭部が切開され脳が露出したショウジョウバエは、その頭部において、観察チャンバに固定されている。
　この装置はさらに、スクロース溶液（餌の溶液）を、和紙を介してショウジョウバエに与えるためのマイクロインジェクタ（無条件刺激の付与手段）；ショウジョウバエの脳内を蛍光観察する二光子蛍光顕微鏡（観察手段）；及び、ショウジョウバエの脳に対して脳灌流液を用いた灌流を行う灌流装置；を備えている。
　さらに、この装置は、ショウジョウバエの行動を記録するカメラ；操作時の観察用の実体顕微鏡；及び、カメラ及び実体顕微鏡用の光源（波長７４０ｎｍの赤色光）；等を備えている。
　ステッピングモータの動作は、図示しない制御回路によって制御されている。この制御によって、ショウジョウバエの訓練時には、条件刺激をプログラムされた条件にて、ショウジョウバエに呈示する。訓練を受けたショウジョウバエを実験に用いる際には、この制御によって、条件刺激と同様の刺激をプログラムされた条件にて、ショウジョウバエに呈示する。
　＜４．脳灌流液＞
　本発明の一態様に係るショウジョウバエ用の脳灌流液は、１）トレハロース及びグルコースから選択される少なくとも一つと、２）塩類と、を含んでいる水溶液であり、３）浸透圧が２２５ｍＯｓｍ以上２６１ｍＯｓｍ以下の範囲内である。また、この脳灌流液は、ショウジョウバエ用に限定されず、昆虫用の脳潅流液として用いることも出来る。
　トレハロースは、昆虫の血糖の成分であり、グルコースが２つ結合した構造の糖である。グルコースはトレハロースの代替として利用が可能である。脳灌流液における、トレハロース及びグルコースの濃度（両方を用いる場合は合計の濃度）の下限は、例えば、１ｍＭ以上、３ｍＭ以上、４ｍＭ以上、又は、５ｍＭ以上である。トレハロース及びグルコースの濃度（両方を用いる場合は合計の濃度）の上限は、例えば、７５ｍＭ以下、７０ｍＭ以下、６５ｍＭ以下、又は、６０ｍＭ以下である。
　塩類は、一般的な生理的食塩水を構成する塩類から適宜選択すればよい。塩類は、例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、及び、ＣａＣｌ２からなる群より選択される少なくとも一種であり、複数種を用いることが好ましい。脳灌流液における、塩類の濃度の下限は、例えば、５０ｍＭ以上、６０ｍＭ以上、７０ｍＭ以上、又は、７５ｍＭ以上である。塩類の濃度の上限は、例えば、１６０ｍＭ以下、１５０ｍＭ以下、１４０ｍＭ以下、又は、１３０ｍＭ以下である。塩類としてＮａＣｌを用いる場合、その濃度の下限は、例えば、４０ｍＭ以上、５０ｍＭ以上、６０ｍＭ以上、又は、７０ｍＭ以上であり、濃度の上限は、例えば、１５０ｍＭ以下、１４０ｍＭ以下、１３０ｍＭ以下、又は、１２０ｍＭ以下である。塩類としてＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、及び、ＣａＣｌ２を用いる場合、それぞれの濃度の下限は、例えば、０．５ｍＭ以上、０．６ｍＭ以上、又は、１ｍＭ以上であり、濃度の上限は、例えば、１０ｍＭ以下、７ｍＭ以下、又は、５ｍＭ以下である。
　脳灌流液の浸透圧の下限は、２３０ｍＯｓｍ以上、２３５ｍＯｓｍ以上、又は、２４０ｍＯｓｍ以上が好ましい場合があり、上限は、２５５ｍＯｓｍ以下、又は、２５０ｍＯｓｍ以下が好ましい場合がある。なお、脳灌流液の浸透圧の調整は、スクロース等の体液中においては代謝されない浸透圧調節剤を用いて行えばよい。
　脳灌流液のｐＨは、例えば、６．５以上であり、７．０以上であることが好ましい。脳灌流液のｐＨは、例えば、８．０以下であり、７．５以下であることが好ましい。ｐＨの変動を防止するため、脳灌流液はｐＨ緩衝液であることが好ましい。
　従来のキイロショウジョウバエ用の脳灌流液では、脳を露出させた状態でのキイロショウジョウバエの観察は、３０分程度が限度であった。本発明の一態様に係るショウジョウバエ用の脳灌流液では、驚くべきことに、脳を露出させた状態でのキイロショウジョウバエの観察が、少なくとも２時間以上、３時間以上、４時間以上、５時間以上、１０時間以上、又は、２４時間以上にわたり可能となった。
　脳灌流液は、本来は、生物の体液組成を模した組成物を用いるのが常套手段である。しかし、ショウジョウバエの場合は体が小さい（キイロショウジョウバエは体長が２～３ｍｍ）ため、細胞を壊さずに体液を回収することが困難である。また、細胞内と細胞外では液体成分の組成が異なり、すりつぶしてしまうと両者が混ざり、正確な体液組成の測定は不可能となる。そのため従来は、他の体の大きな昆虫の体液組成を参考にするなどして、場当たり的に組成を決めて実験を行っており、ここに改善の余地が存在した。
　＜５．応用など＞
　１つ１つの神経細胞の変化と、記憶形成による行動の変化の因果関係を追及することが、記憶研究の最も大きなテーマの１つである。記憶研究においても、ある薬を投与したら行動の点数がアップしたりダウンしたりするというだけではなく、その原因となる細胞の変化がどうなっているのか（神経活動に影響しているのか、あるいは神経細胞の形態に影響しているのかなど）をモニターする意義がある。
　本発明の一態様では、キイロショウジョウバエの脳を露出させた状態で記憶形成をリアルタイムで観察することが可能となった。そこで発明者たちは、オプトジェネティクスと呼ばれる、神経細胞へ光を照射してその活動を操作する技術を用いて、フィーディング・ニューロンで起こる分子や細胞の変化によって、記憶が形成されることを明らかにした。これによって、キイロショウジョウバエの脳を構成する約２０～２５万の神経細胞の中から、フィーディング・ニューロンに焦点をしぼった解析を行うことができ、記憶形成の過程でどのような細胞変化がみられるか、すなわち記憶の脳内変化を、初めて観察することが可能になった。この技術的進歩により、記憶形成の過程で働く分子群の機能をしらべることが可能になった。ひいては、記憶形成の過程に作用する薬剤の探索も可能にした。より具体的には、以下に示す応用が考えられる。
　１）ショウジョウバエ遺伝学を使った記憶に関与する分子の探索
本発明は、従来法のように記憶の結果生ずる行動変化を査定するだけでなく、フィーディング・ニューロン上に生じるシナプスの変化を細胞レベルで調べることができる。ショウジョウバエ遺伝学を駆使すると、記憶の形成に関与する、シナプスの前後の細胞（シナプスの後の細胞は（入力をうけるのは）フィーディング・ニューロンである。）での各分子の機能を調べることができる。この方法によって、記憶過程で働いている分子群を検索することが可能になる。
　２）薬剤投与
無作為に記憶機構に影響を与える薬剤をスクリーニングすることも可能であるが、さらに、１）で記憶形成のために機能する分子群を同定し、それらの分子群を創薬のターゲットとして、薬剤をデザインすることも可能になる。本発明の一態様では、薬剤を還流することによって、記憶形成の現場に直接与えることができる。さらに、必要に応じては小ピペットを用いることによって、薬剤を局所的にフィーディング・ニューロンのみに投与することも可能である。その利点は、記憶形成とは直接関係のない神経細胞への薬剤の作用によって、副作用として動物の行動が変化し、一見すると記憶に効果があるように見えるというような偽陽性をひろう可能性（例えば、ハエの行動観察のみを行う従来技術では、記憶とは無関係に、ハエの一般的な活動が亢進した結果、歩行量が上昇した場合でも、一見すると記憶の点数が良くなったように見えることもある）を低くすることができる。そのため、薬剤投与したうえで記憶を担う細胞変化を査定することによって、真に記憶形成過程への薬剤の影響について知ることができる。
　〔まとめ〕
　本発明は、例えば、以下の態様が含まれるとも表現され得る。
１）ショウジョウバエに対して条件刺激を付与する方法であって、ショウジョウバエに肢でつかませておいた物体から当該肢を引き離すことを、条件刺激として付与する方法。
２）ショウジョウバエに対して餌を与えることを、上記条件刺激と共に条件付けの際に呈示する無条件刺激として付与する、１）に記載の方法。
３）機械抄紙の紙よりも目の少ない紙を介して、上記餌の溶液をショウジョウバエに対して与える、２）に記載の方法。
４）上記餌の溶液をショウジョウバエに対して与える前に、上記紙に対して、餌の溶液の送液と吸液とを繰り返す、３）に記載の方法。
５）ショウジョウバエは、消化器官の少なくとも一部が取り除かれている、２）～４）の何れかに記載の方法。
６）上記のショウジョウバエは、口吻の折り畳みを阻害する構造物が設けられている、１）～５）の何れかに記載の方法。
７）１）～６）の何れかに記載の方法によって、上記条件刺激が付与されると無条件刺激に関する応答を示すようになったショウジョウバエを用いて、記憶に関係する試験を行う、試験の方法。
８）観察光源として波長７００ｎｍ以上７８０ｎｍ以下の範囲内の赤色光を用いる、７）に記載の方法。
９）ショウジョウバエは脳を露出されたものであり、当該脳における観察の対象領域をガルバノスキャンモードで遠赤外光を照射して探索する、７）又は８）に記載の方法。
１０）１）～９）の何れかに記載の方法を実施する装置であって、ショウジョウバエが肢でつかむ対象となる物体と、ショウジョウバエを生きた状態で物理的に固定するための固定部材と、固定部材と上記物体とを相対的に移動させる駆動手段と、を備える装置。
１１）トレハロース及びグルコースから選択される少なくとも一つと、塩類と、を含んでなる水溶液であり、浸透圧が２２５ｍＯｓｍ以上２６１ｍＯｓｍ以下の範囲内である、昆虫用の脳灌流液。
１２）ショウジョウバエ用である、１１）に記載の脳灌流液。
１３）ｐＨが６．５以上８．０以下の範囲内にあるｐＨ緩衝液である、１１）又は１２）に記載の脳灌流液。
１４）紙を介して、餌の溶液をショウジョウバエに対して与える方法であって、上記餌の溶液をショウジョウバエに対して与える前に、上記紙に対して、餌の溶液の送液と吸液とを繰り返す工程を含む、方法。
　本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
　〔実施例１〕
　以下、本発明のショウジョウバエの脳と行動を同時的に観察する方法に係る一実施例について説明するが、本発明は以下の記載によっては限定されない。表１に重要材料一覧を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 　＜実験モデルと条件の詳細＞
　標準プロトコルに従い、キイロショウジョウバエは、明暗１２時間サイクル、２５℃下におかれた。すべての実験において雌個体が使われた。
　＜ハエ個体の系統＞
　野生型としてCanton-Sが使われた。dnc1突然変異体（参考文献１）、及びrut2突然変異体（参考文献２）は、パブロフ条件付けアッセイにおいて記憶形成に異常を示すことが確認されている。
　ＧＭＲ８１Ｅ１０－ＧＡＬ４はJanelia Farm（参考文献３）によって単離され、フィーディング・ニューロンにおける遺伝子の発現に使われた。ＧＭＲ８１Ｅ１０－ＧＡＬ４とＵＡＳ－ｍＣＤ８－ｇｆｐ（参考文献４）をヘテロ接合体として発現する個体を、フィーディング・ニューロンの解剖学的構造を可視化するために使用した。
　＝方法詳細＝
　＜準備・設計と生理食塩水＞
　今回の実験においては、ＦＬＩＥＳ（Fly brain Live Imaging and Electrophysiology
 Stage）（参考文献５）と呼ばれる記録チャンバを改良して、ハエの行動観察と脳のイメージングを行った。頭部の切開には、ピンセットを加工して作成した１０ミクロンのものも切断できる超微細はさみを用いた。長方形の端部を持つピンセット（約１００μｍ幅）を、内部器官と外骨格を取り除くために使った。ハエの空腹が満たされること、そして給餌による報酬効果を避けるために、食道は取り除いた。成虫の頭部の気嚢は、解剖中、可能な限りそのまま維持した。図３及び４に示すようなイメージング及び光学的操作のために、口吻の根元（フルクラムと呼ばれる構造）がＳＥＺを覆い隠すのを防ぐため、口吻の下部に、光硬化型の接着剤を一滴滴下した。その結果、しばしば口吻が伸展時に前方よりも上向きに動くようになった。実験はＳＹ２０２０と呼称される新しい生理食塩水（組成：ＮａＣｌ８５ｍＭ、ＫＣｌ１ｍＭ、ＭｇＣｌ２２．５ｍＭ、ＣａＣｌ２３ｍＭ、ＮａＨＣＯ３１０ｍＭ、ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ５ｍＭ、トレハロース５ｍＭ、スクロース３５ｍＭ、ｐＨ７．２）を用いて行われた。ＳＹ２０２０は既存の体液組成に似た溶液を改良して作られ（参考文献６～１０）、２４時間以上の実験操作にあたりプレップを良好に維持するのに最適であった。
　＜条件付け＞
　０．６５±０．０５ｍｇの木片を３－５日齢の成虫雌個体の胸部背側に糊付けし、その状態でハエ個体が動けるようにしておき、そのハエを麻酔を行うことなく記録チャンバに取りつけられるようにした。野生型個体については、条件付け中にスクロース刺激に対して強く反応するように、実験前に４ｍｌのＭｉｌｌｉ－Ｑ水を浸したペーパータオルを入れたプラスチックバイアル内で２７－２８時間かけて飢餓状態にさせた。一方、ＧＣａＭＰ６ｍを発現する個体（参考文献１１）は４７時間、ハロロドプシンを発現させた個体（参考文献１２）は４０－４４時間を飢餓状態にするために必要とした。解剖後の個体の頭部気嚢が勢い良く拍動し、気管を通して酸素の供給が良好に行われている場合に限り条件付けアッセイを行った。
　飢餓状態にしたのち、図３のＡに示す通りハエ個体を記録チャンバにセットした。ハエ個体には７４０ｎｍ赤色光（fiber coupled LED M740F2,Thorlabs）を光学ファイバー（中心直径２００ｍｍ,NA 2.2,Thorlabs）から照射し、視覚的刺激を避けながらスクロースを与えられるようにした。個体の行動は、ＣＭＯＳカメラ（DMK23U445,Imaging Source）を取り付けたVideo-Zoom顕微鏡XV-440を用いて、その側方から記録した。映像の取得にはIC capture 2.4 software （Imaging Source）を使用した。rod removalについてはLabView 2017で駆動するステッピングモータ（TAMM40-10C and GSC-01,SigmaKoki）を使用して行った。ステッピングモータには小型マニピュレータ（YOU-2,Narishige）を搭載した。ロッド（直径２ｍｍ、長さ１０ｍｍ）は、操作の融通のため、より長い棒に接続し、マニピュレータに適切な角度で固定した。棒をマニピュレータとともに個体の近くに配置し、ハエ個体がその肢でつかめるようにした。ステッピングモータの動作により、個体の肢からロッドを離し、またロッドを再びつかむことができるように、もとの位置にロッドを戻した。
　スクロースによる刺激は、スクロース溶液を含む紙片の接触により行った。長方形（幅４００μｍ、長さ数ｍｍ)の和紙（雁皮紙（Haibara））の紙片を、加工して曲げたピンを用いて、注射針の中に保持されるようにした。注射針はスクロース溶液を供給するための、シリコンチューブ及びマイクロインジェクタ（IM-11-2, Narishige）に接続した（図３のＡ）。アームスタンド（Nikon）に搭載した実体顕微鏡ＳＭＺ－８００、またはアームスタンドＦ１０（Wraymer）に搭載した実体顕微鏡ＬＷ－８２０（Wraymer）を通して実験ハエ個体を見ながら、ジョイスティックマニピュレータ（MN-151, Narishige）を用いてこの注射針を操作した。この方法においては、ハエ個体は報酬としてスクロースを飲み込むことはできず、報酬としては吻表面の感覚毛による甘味感覚受容に限られる。顕微鏡のステージとコンデンサーは、マニピュレータＭ－１５２（Narishige）及び高さ調整台（P-1A, Narishige）とともに可動観察台に取り付けられた記録チャンバへ交換した。生理食塩水は酸素供給のために、ポンプ（TP10-SA, As-One）または重力によって灌流させた。灌流は、解剖後ハエ個体の状態が安定するまで（自発的な口吻の伸展が落ち着きスクロース溶液への反応が強くなるまで）２時間以上続けた。２光子イメージングと光学的活性化を除いた条件付け実験は２５℃で行った。
　＜カルシウムイメージングとレーザー不活性化＞
　カルシウムイメージング実験にあたり, 可視化のためにＦＶＭＰＥ－ＲＳ２光子顕微鏡（Olympus）が、励起のためにInSight DS Dual-OL（Spectra-Physics）が使用された。ＧＭＲ８１Ｅ１０－ＧＡＬ４の発現がおおむねＳＥＺ内の１対のフィーディング・ニューロンに制限されている一方（参考文献１３）、ＧＭＲ８１Ｅ１０－ＧＡＬ４の発現は、口吻から脳のＳＥＺ腹側後部へと投射する感覚神経線維束においても確認される。感覚神経線維束が投射する部位は、フィーディング・ニューロンの可視化と操作を行った領域の外にある。第３染色体上にＵＡＳ－ＧＣａＭＰ６ｍとＧＭＲ８１Ｅ１０－ＧＡＬ４をもつヘテロ接合体において、フィーディング・ニューロンのmain dendritic trunkのＧＣａＭＰ蛍光を定量した。条件付け前に、フィーディング・ニューロンのmain dendritic trunkをガルバノスキャンモードで特定し、定量には１５ピクセル（４．９７ｍｍ）×３０ピクセル（９．９３ｍｍ）のＲＯＩ（Region of interest）を設定した。同ＲＯＩ設定で、高速スキャニングを行うためにレゾナントスキャニングモードに切り替えた。レゾナントスキャニングモードにおいては、１５ピクセル×３０ピクセルのＲＯＩを含む１４２ピクセル（４７．０７ｍｍ）×５１２ピクセル（１６９.７１ｍｍ）の範囲を、１スキャン当たり５０ミリ秒で２００サイクル、合計１０秒間スキャンした。７．６秒持続する強い条件刺激の際には、条件刺激開始１秒前から１０秒間、９００ｎｍ遠赤外線（５％power）でスキャンした。ＲＯＩ内における蛍光強度の平均値は、ＦＶＭＰＥ－ＲＳ２光子顕微鏡に付属するFV31S-SW software（Olympus）によって定量した。
　第２染色体に２０ＸＵＡＳ－ｅＮｐＨＲ３．０－ＥＹＦＰ（参考文献１４）というハロロドプシンを発現させるトランスジーンを、第３染色体にＧＭＲ８１Ｅ１０－ＧＡＬ４を持つホモ接合体を、レーザーを用いたフィーディング・ニューロンの活動抑制実験に使用した。レーザー光の照射はフィーディング・ニューロンの樹状突起がmain dendritic trunkの中心から背側にかけて広がる領域に限定して行った（参考文献１５）。条件付け前に、ハロロドプシンと連結されたＹＦＰの蛍光によってフィーディング・ニューロンを特定するため、ハエ個体の脳ＳＥＺはガルバノスキャンモード（９２５ｎｍ）によってスキャンされた。不活性化のため、脳の両側のフィーディング・ニューロンの背側樹状突起に５８８ｎｍレーザーを照射した。レーザーシステムの維持のため、カルシウムイメージングとレーザーによる不活性化実験は、２１℃にて行われた。
　＜画像加工＞
　すべての画像は比較のために全く同じ方法でAdobe PHOTOSHOP（登録商標） 2020 21.2. 2. 又は Final cut Pro X10.5.1を用いて加工した。
　＜定量と統計分析＞
　統計分析はGraphPad Prism 8.4.3（GraphPad Software）を用いた標準的な方法（参考文献１６）に従って行われた。行動解析のデータと、Ｃａ2+イメージングのデータのうちKolmogorov-Smirnovの正規性検定を通過したものは,スチューデントのt検定のようなパラメトリック検定を行った。Kolmogorov-Smirnovの正規性検定を通過しなかったものについては、Mann-Whitney U 検定又はKruskal-Wallis 検定のようなノンパラメトリック検定を行った。F検定は図３において条件付け後の変化を解析するために行った。
　＝結果＝
　＜新規パブロフ条件付け実験系＞
　記憶形成に有効な条件刺激（Conditioned stimulus;ＣＳ）として、多くの昆虫が触覚刺激によるインプットには強い反応を見せることから、“rod removal”を採用した。多くの昆虫はrod removalによって、おそらく引き離されたロッドを再度掴もうとして、振り回すように大きく肢を動かした。ハエも、ロッドが取り除かれると他の昆虫と同様に肢を動かした。５秒間のrod removalを条件刺激として開始した直後に、無条件刺激（Unconditioned stimulus;ＵＳ）として１Ｍスクロースをハエの口吻に与えると、ハエ個体は、ＣＳによって肢を動かすと同時に、ＵＳによって口吻をさかんに伸展した（図１Ａ）。条件付け前のハエはrod removalのみではほとんど口吻を伸展しないのに対し、３０秒ごとにスクロースによるＵＳと、rod removalによるＣＳを対にして呈示することを５回くりかえすと、条件反射としてrod removalに対して口吻を伸展するようになった（図１のＡ－Ｄ）。条件付け後、ＣＳによって引き起こされた口吻伸展は、スクロースによるＵＳによって引き起こされた口吻伸展と区別がつかないほどによく一致していた（図５のＧ）。一方、ＣＳとＵＳのタイミングをずらした対照実験プロトコルでは、ＣＳによる口吻の伸展はほとんど見られなかった（図１のＤ）。
　この条件反射はＣＳとＵＳの対呈示ののち２０分間は観察されたが、時間がたつに従い反応が鈍くなった。より長時間強い条件反射を維持するため、従前のような継続的なrod removalの代わりに、CSを更新するための０．３秒の小休止を４回挟んだ７.６秒のrod removalを与えた。このより強いプロトコルによって条件反射はより長く継続され、ＣＳに誘発された口吻の伸展も条件付け１時間後において統計的に有意であり（図１のＥ）、いくつかのケースでは３時間以上条件反射が観察された。このより強い方法においても、ＣＳ－ＵＳを対にして与えたグループの条件反射は対照グループ（ＣＳ－ＵＳ非対付与、ＣＳのみ付与、ＵＳのみ付与）と統計的に有意な差があった。
　「ＣＳ－ＵＳ非対付与」「ＵＳのみ付与」の結果については、どちらもＣＳとＵＳを対呈示した場合と同じＵＳによって同じだけ感作の機会があったが、ＣＳとＵＳを対呈示した場合に観られたような条件反射は形成されなかった。また、スクロースに対する感度は、条件付けの前後で比較しても統計的に有意な差はみられなかった（図１のＦ）。つまり、スクロース刺激に比べて、ＣＳ刺激による入力が特異的に強められていたことから、この実験において、条件反射はフィーディング・ニューロンの非特異的な感作によって引き起こされたとは言えない。これらの結果から、この条件付けプロトコルを用いれば、ライブイメージング（図３）及び光遺伝学的な神経活動の操作（図４）のために脳を露出した動物個体において、連合学習が可能であることが示された。
　＜記憶変異体における条件反射形成の異常＞
　この条件付けパラダイムと他の学習アッセイとを比較するため、ｃＡＭＰシグナルに異常があり、嗅覚valenceアッセイにおいて記憶形成効率の著しい低下が報告されているキイロショウジョウバエの突然変異体dunce（dnc）とrutabaga（rut）を用いて実験した。dnc個体とrut個体両方とも同条件付けののち条件反射の成立効率が低下していた（図２のＡ）。一方で、条件付け中のＣＳに誘発される反応とＵＳに誘発される反応は野生型と同レベルであった（図２のＢ・Ｃ）。
＜条件付けによるフィーディング・ニューロンのＣＳに対する応答性の獲得＞
　条件付け実験の間を通してフィーディング・ニューロンの活動を観察するため、カルシウムインジケータたんぱく質ＧＣａＭＰ６ｍの蛍光強度を測定した。フィーディング・ニューロンにおいて、カルシウムインジケータをＧＭＲ８１Ｅ１０－ＧＡＬ４driverによって発現させた。ＧＣａＭＰ６ｍは口吻にスクロース溶液を与えることで強い反応を示す（図６のＥ）。条件付け前は、ＣＳによるフィーディング・ニューロンの活動は検出されなかった。条件付け後は、ＧＣａＭＰ６ｍの蛍光増大として、フィーディング・ニューロンのＣＳに対する（甘味刺激なし）活動が検出された。条件反射の強さを評価するために、筆者らは次にフィーディング・ニューロンの条件刺激に対する反応と、スクロースを与えた際の反応とを比較した。ハエ個体の口吻を１ｍＭ、１０ｍＭ、１００ｍＭのスクロース溶液で刺激し、ＧＣａＭＰの蛍光を観測した。条件付け２０分後の個体で観察される条件刺激に対するフィーディング・ニューロンの活動及び口吻伸展は、ちょうど１０ｍＭスクロースによるものと同程度の強さであった。以上の結果から、条件付けによってフィーディング・ニューロンのＣＳに対する反応性が強化され、その反応性の変化によって摂食行動（口吻伸展）を起こすことができるようになったことがわかる。
　＜条件付け中にフィーディング・ニューロンの活動を不活性化すると、可塑性的な変化が抑制される＞
　条件付けの間フィーディング・ニューロンを不活性化し、条件付け後１０分ごとにＣＳ単独刺激に対する摂食行動を定量した。条件付け中にフィーディング・ニューロンでハロロドプシンをはたらかせると、ＵＳに対する反応は抑制された一方で（図４のＢ）、ＣＳによる反応は変化がなかった（図７のＤ）。すべてのＣＳ－ＵＳ対呈示においてハロロドプシンを介した不活性化を行うと、ＣＳによって口吻伸展が起こるようになるという可塑的な行動変化はほとんど起こらなくなった一方で、不活性化のタイミングをずらした場合にはこれが起きた（図４のＡ・Ｃ）。以上の結果から、フィーディング・ニューロンが条件付け中に活動することが、条件反射の成立には必要であることが示唆された。このことから、フィーディング・ニューロン上のシナプスの変化によって、行動の変化がもたらされていると考えられる。
　＜実施例の参考文献＞
1. Dudai, Y., Jan, Y.N., Byers, D., Quinn, W.G., and Benzer, S. (1976). dunce, a
 mutant of Drosophila deficient in learning. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73, 1684-1688.
2. Bellen, H.J., Gregory, B.K., Olsson, C.L., and Kiger, J.A., Jr. (1987). Two Drosophila learning mutants, dunce and rutabaga, provide evidence of a maternal role for cAMP on embryogenesis. Dev. Biol. 121, 432-444.
3. Jenett, A., Rubin, G.M., Ngo, T.T., Shepherd, D., Murphy, C., Dionne, H., Pfeiffer, B.D., Cavallaro, A., Hall, D., Jeter, J., et al. (2012). A GAL4-driver line resource for Drosophila neurobiology. Cell Rep. 2, 991-1001.
4. Lee, T., and Luo, L. (1999). Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron 22,
5. Yoshihara, M. (2012). Simultaneous recording of calcium signals from identified neurons and feeding behavior of Drosophila melanogaster.
6. Singleton, K., and Woodruff, R.I. (1994). The osmolarity of adult Drosophila hemolymph and its effect on oocyte-nurse cell electrical polarity. Dev. Biol. 161, 154-167.
7. Pierce, V.A., Mueller, L.D., and Gibbs, A.G. (1999). Osmoregulation in Drosophila melanogaster selected for urea tolerance. J. Exp. Biol. 202, 2349-2358.
8. Stewart, B.A., Atwood, H.L., Renger, J.J., Wang, J., and Wu, C.F. (1994) Improved stability of Drosophila larval neuromuscular preparations in haemolymph-like physiological solutions. J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sens. Neural Behav. Physiol. 175, 179-191.
9. Macleod, G.T., Hegstro¨ m-Wojtowicz, M., Charlton, M.P., and Atwood, H.L. (2002). Fast calcium signals in Drosophila motor neuron terminals. J. Neurophysiol. 88, 2659-2663.
10. Feng, Y., Ueda, A., and Wu, C.F. (2004). A modified minimal hemolymphlike solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J. Neurogenet. 18, 37-402.
11. Chen, T.W., Wardill, T.J., Sun, Y., Pulver, S.R., Renninger, S.L., Baohan, A., Schreiter, E.R., Kerr, R.A., Orger, M.B., Jayaraman, V., et al. (2013). Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature 499, 295-300.
12. Petersen, L.K., and Stowers, R.S. (2011). A Gateway MultiSite recombination cloning toolkit. PLoS ONE 6, e24531. 
13. Pool, A.H., Kvello, P., Mann, K., Cheung, S.K., Gordon, M.D., Wang, L., and Scott, K. (2014). Four GABAergic interneurons impose feeding restraint in Drosophila. Neuron 83, 164-177.
14. Gradinaru, V., Zhang, F., Ramakrishnan, C., Mattis, J., Prakash, R., Diester, I., Goshen, I., Thompson, K.R., and Deisseroth, K. (2010). Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics. Cell 141, 154-165.
15. Flood, T.F., Iguchi, S., Gorczyca, M., White, B., Ito, K., and Yoshihara, M.
 (2013). A single pair of interneurons commands the Drosophila feeding motor program. Nature 499, 83-87.
16. Zar, J.H. (1999). Biostatistical Analysis, Fourth Edition (Prentice Hall).　〔実施例２〕
　以下、本発明の脳灌流液に係る一実施例について説明するが、本発明は以下の記載によっては限定されない。
　＜脳灌流液の好適条件の探索＞
　実施例１において、キイロショウジョウバエ個体の脳の観察に生理食塩水ＳＹ２０２０（組成：ＮａＣｌ８５ｍＭ、ＫＣｌ１ｍＭ、ＭｇＣｌ２２．５ｍＭ、ＣａＣｌ２３ｍＭ、ＮａＨＣＯ３１０ｍＭ、ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ５ｍＭ、トレハロース５ｍＭ、スクロース３５ｍＭ、ｐＨ７．２）を用い、実験操作において２４時間以上ハエの生存状態を維持することが可能となっていたが、その他にもハエの生存状態を長時間維持できることを確認できた生理食塩水が存在する。以下表２にその一覧を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　本発明は、記憶に関与する分子の探索及びそれらに作用する薬剤の探索に利用することができる。

Claims (14)

  1. 　ショウジョウバエに対して条件刺激を付与する方法であって、
    　ショウジョウバエに肢でつかませておいた物体から当該肢を引き離すことを、条件刺激として付与する方法。
  2. 　ショウジョウバエに対して餌を与えることを、上記条件刺激と共に条件付けの際に呈示する無条件刺激として付与する、請求項１に記載の方法。
  3. 　機械抄紙の紙よりも目の少ない紙を介して、上記餌の溶液をショウジョウバエに対して与える、請求項２に記載の方法。
  4. 　上記餌の溶液をショウジョウバエに対して与える前に、上記紙に対して、餌の溶液の送液と吸液とを繰り返す、請求項３に記載の方法。
  5. 　ショウジョウバエは、消化器官の少なくとも一部が取り除かれている、請求項２に記載の方法。
  6. 　上記のショウジョウバエは、口吻の折り畳みを阻害する構造物が設けられている、請求項２に記載の方法。
  7. 　請求項１に記載の方法によって、上記条件刺激が付与されると無条件刺激に関する応答を示すようになったショウジョウバエを用いて、記憶に関係する試験を行う、試験の方法。
  8. 　観察光源として波長７００ｎｍ以上７８０ｎｍ以下の範囲内の赤色光を用いる、請求項７に記載の方法。
  9. 　上記ショウジョウバエは脳を露出されたものであり、当該脳における観察の対象領域をガルバノスキャンモードで遠赤外光を照射して探索する、請求項７に記載の方法。
  10. 　請求項１～９の何れか一項に記載の方法を実施する装置であって、
    　ショウジョウバエが肢でつかむ対象となる物体と、
    　ショウジョウバエを生きた状態で物理的に固定するための固定部材と、
    　固定部材と上記物体とを相対的に移動させる駆動手段と、
    を備える装置。
  11. 　トレハロース及びグルコースから選択される少なくとも一つと、
    　塩類と、を含んでなる水溶液であり、
    　浸透圧が２２５ｍＯｓｍ以上２６１ｍＯｓｍ以下の範囲内である、昆虫用の脳灌流液。
  12. 　ショウジョウバエ用である、請求項１１に記載の脳灌流液。
  13. 　ｐＨが６．５以上８．０以下の範囲内にあるｐＨ緩衝液である、請求項１１に記載の脳灌流液。
  14. 　紙を介して、餌の溶液をショウジョウバエに対して与える方法であって、
    　上記餌の溶液をショウジョウバエに対して与える前に、上記紙に対して、餌の溶液の送液と吸液とを繰り返す工程を含む、方法。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080187492A1 (en) * 2004-04-16 2008-08-07 Mcbride Sean M J Drosophila Models For Diseases Affecting Learning and Memory
JP2012503798A (ja) * 2008-09-25 2012-02-09 ザ トラスティーズ オブ コロンビア ユニヴァーシティ イン ザ シティ オブ ニューヨーク 構造物の光刺激およびイメージングを提供するためのデバイス、装置、および方法
US20150226755A1 (en) * 2014-02-13 2015-08-13 New York University Green-to-red photo-convertible fluorescent calcium indicator
US20200400567A1 (en) * 2017-09-27 2020-12-24 Peking University Fusion polypeptide

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080187492A1 (en) * 2004-04-16 2008-08-07 Mcbride Sean M J Drosophila Models For Diseases Affecting Learning and Memory
JP2012503798A (ja) * 2008-09-25 2012-02-09 ザ トラスティーズ オブ コロンビア ユニヴァーシティ イン ザ シティ オブ ニューヨーク 構造物の光刺激およびイメージングを提供するためのデバイス、装置、および方法
US20150226755A1 (en) * 2014-02-13 2015-08-13 New York University Green-to-red photo-convertible fluorescent calcium indicator
US20200400567A1 (en) * 2017-09-27 2020-12-24 Peking University Fusion polypeptide

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MOTOJIRO YOSHIHARA: "Discovery of the identity of the Pavlovian conditioned reflex ~ Conditioned reflex occurs by manipulating the command neuron ~", NICT - PRESS RELEASE, NATIONAL INSTITUTE OF INFORMATION AND COMMUNICATIONS TECHNOLOGY, JP, JP, XP009546209, Retrieved from the Internet <URL:https://www.nict.go.jp/press/2021/08/05-1.html> [retrieved on 20221221] *
SAKURAI AKIRA: "Molecular cytological studies to link synaptic plasticity to memory", PERFORMANCE REPORT ON ACADEMIC RESEARCH GRANT OF HYOGO SCIENCE AND TECHNOLOGY ASSOCIATION (2015), 30 June 2016 (2016-06-30), XP093064897, Retrieved from the Internet <URL:https://hyogosta.jp/wp-content/uploads/2016/05/js27-k6.pdf> [retrieved on 20230718] *
SAKURAI, A ET AL.: "Alteration in information flow through a pair of feeding command neurons underlies a form of Pavlovian conditioning in the Drosophila brain", CURRENT BIOLOGY, vol. 31, no. 18, 4 August 2021 (2021-08-04), pages 4163 - 4171, XP086798654, DOI: 10.1016/j.cub.2021.07.021 *
YOSHIHARA MOTOJIRO: "Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of <em>Drosophila melanogaster</em>", JOURNAL OF VISUALIZED EXPERIMENTS, no. 62, XP093064898, DOI: 10.3791/3625 *
YOSHIHARA, MOTOJIRO; SAKURAI, AKIRA: "Intelligence in Nature, Generating Intelligence in the Brain", NICT TECHNICAL REPORT, NATIONAL INSTITUTE OF INFORMATION AND COMMUNICATIONS TECHNOLOGY, JP, vol. 66, no. 1, 30 September 2020 (2020-09-30), JP, pages 43 - 50, XP009546121, ISSN: 2187-767X *

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