CN104568885A - 光纤驱动双扫描荧光探针 - Google Patents
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Abstract
一种光纤驱动双扫描荧光探针，它包括两组压电驱动器，一根光刺激用光纤，一根荧光激发光纤，一根荧光收集光纤和一组微型光学系统，其中微型光学系统包括三片准直透镜，两片反射镜，两片二向色镜和一组物镜。它采用双扫描机制，即使用第一组压电驱动器驱动光刺激用光纤完成定点光刺激，同时采用第二组压电驱动器驱动荧光激发光纤完成二维扫描成像。该光纤驱动双扫描荧光探针具有体积小，重量轻等优点，可以同时完成清醒自由活动实验动物的神经光刺激，功能成像和行为学研究。
Description
技术领域
本发明涉及一种光纤驱动双扫描荧光探针，特别是采用一组压电驱动器驱动第一根光纤完成定点光刺激，同时采用另一组压电驱动器驱动第二根光纤完成二维扫描成像。该光纤驱动双扫描荧光探针可以同时完成清醒自由活动实验动物的神经光刺激，功能成像和行为学研究。
背景技术
将实验动物的行为学与神经功能相结合的研究方法已成为近年神经科学领域的研究热点，应用研究领域涉及神经科学研究的多个方面，包括神经环路基础研究、学习记忆研究、成瘾性研究、运动障碍、睡眠障碍、帕金森症模型、抑郁症和焦虑症动物模型等应用。
为了观测和记录实验动物(如小鼠，大鼠和猕猴)的大脑皮层中各类神经细胞以及神经环路的活动，传统上采用多电极阵列(MEA)技术。然而多电极阵列技术存在电极不易固定，电信号不稳定等缺点。近年来，多光子荧光显微成像技术由于其具有空间分辨率高等优点，已被广泛用于记录活体动物大脑神经系统活动。但目前多光子荧光显微镜多为台式系统，多数系统用于对麻醉，固定的实验动物进行成像；少数系统可以对清醒，部分固定的实验动物进行成像。由于实验动物的神经系统的功能性在麻醉，固定状态下与清醒，自由活动状态下有巨大的差异，而目前的商业化荧光成像系统只能完成功能成像，无法同时进行实验动物的行为学研究。
目前国内外广泛采用光纤束成像和光纤振动扫描这两种技术以实现微型化荧光成像系统用于清醒自由活动实验动物的功能成像和行为学研究。2001年F.Helmchen等人率先提出头戴式微型光纤荧光显微镜，其主要通过压电驱动器驱动单模光纤自由谐振进行扫描。2004年W.Gobel等人设计并实现了基于光纤束和自聚焦透镜(GRINLens)的微型双光子显微镜。2005年B.A.Flusberg等人研制了重3.9克的双光子荧光微型内窥镜(Fluorescence MicroEndoscopy，FME)，并成功将其应用于活体动物脑成像，其基于压电光纤振动扫描技术。2008年C.J.Engelbrecht等人报道了用于活体功能荧光成像的超紧凑光纤双光子显微镜，同样应用了压电光纤振动扫描技术。2008年H.Bao等人研制了手持式快速双光子荧光微型内窥镜，实现了0.23的大视野成像。2014年J.Cha等人研制了基于光纤束的荧光成像装置，并应用于清醒半固定大鼠的脑功能成像。国内方面，2012年殷刚等人报道了基于光纤束的共聚焦显微内窥镜的研究，获得了活体大鼠结肠粘膜细胞的单光子荧光图像，但其并非为双光子荧光设计，也未用于活体动物的脑功能成像。
此外将解笼锁(Uncage)光刺激等技术与功能成像相结合的双扫描技术近期刚刚已被商业化荧光成像系统，如Nikon AlR MP和Olympus FVMPE-RS所采用，但可应用于实验动物行为学研究的微型化双扫描荧光探针仍未见诸报道。
因此本发明提出的用于同时脑功能成像和神经光刺激的光纤驱动双扫描荧光探针可以将实验动物的行为学与神经功能研究相结合，将光刺激解笼锁等技术与功能成像相结合，对于神经科学的研究具有重要的意义。该光纤驱动双扫描荧光探针采用一组压电驱动器驱动一根光纤完成定点光刺激，同时采用另一组压电驱动器驱动第二根光纤完成二维扫描成像，具有体积小，重量轻，扫描速度快等优点。
发明内容
本发明的目的在于提出一种光纤驱动双扫描荧光探针，特别是采用一组压电驱动器驱动第一根光纤完成定点光刺激，同时采用另一组压电驱动器驱动第二根光纤完成二维扫描成像。该光纤驱动双扫描荧光探针可以同时完成清醒自由活动实验动物的神经光刺激，功能成像和行为学研究。
为实现上述目的，本发明采用技术方案是：它包括两组压电驱动器，一根光刺激用光纤，一根荧光激发光纤，一根荧光收集光纤和一组微型光学系统，其中微型光学系统包括三片准直透镜，两片反射镜，两片二向色镜和一组物镜。
第一组压电驱动器的输出端与光刺激用光纤的输出端相连，第二组压电驱动器的输出端与荧光激发光纤的输出端相连；微型光学系统包括三片准直透镜，两片反射镜，两片二向色镜和一组物镜；第一片准直透镜的输出端与第一片反射镜的输入端相连，第一片反射镜的输出端和第二片准直透镜的输出端分别与第一片二向色镜的两个输入端相连，第一片二向色镜的输出端与第二片二向色镜的输入端相连，第二片二向色镜的一个输出端与物镜的输入端相连，第二片二向色镜的另一个输出端与第二片反射镜的输入端相连，第二片反射镜的输出端与第三片准直透镜的输入端相连，第三片准直透镜的输出端与荧光收集光纤的输入端相连；刺激光由光刺激用光纤进行传输，再由第一片准直透镜进行准直，再由第一片反射镜进行反射，再由第一片二向色镜进行反射，再由第二片二向色镜进行透射，最后由物镜进行聚焦；荧光激发光由荧光激发光纤进行传输，再由第二片准直透镜进行准直，再由第一片二向色镜进行透射，再由第二片二向色镜进行透射，最后由物镜进行聚焦；荧光由物镜进行收集，再由第二片二向色镜进行反射，再由第二片反射镜进行反射，再由第三片准直透镜耦合进荧光收集光纤。
所述的第一组压电驱动器由两片压电晶体组成，用于驱动光刺激用光纤进行二维定点光刺激，其中两片压电晶体呈90度夹角安装，采用微加工技术制成，基于压电驱动原理，用于将外部驱动电信号通过逆压电效应转换为机械形变，工作在线性模式；
所述的第二组压电驱动器由两片压电晶体组成，用于驱动荧光激发光纤进行二维荧光激发扫描，其中两片压电晶体呈90度夹角安装，采用微加工技术制成，基于压电驱动原理，用于将外部驱动电信号通过逆压电效应转换为机械形变，两片压电晶体工作在谐振模式进行二维利萨如图形扫描；
所述的光刺激用光纤用于单光子刺激/解笼锁时采用可见光波长的单模光纤，连接外部可见光激光器或发光二极管光源，用于多光子刺激/解笼锁时采用光子晶体光纤(Photonic Crystal Fiber，PCF)，连接外部红外光激光器；
所述的荧光激发光纤用于单光子荧光激发时采用可见光波长的单模光纤，连接外部可见光激光器或发光二极管光源，用于多光子荧光激发时采用光子晶体光纤(Photonic Crystal Fiber，PCF)，连接外部红外光激光器；
所述的荧光收集光纤采用高数值孔径大模场面积(Large Mode Area，LMA)光纤；
所述的第一片准直透镜采用自聚焦透镜，用于将光刺激用光纤发出的光束进行准直；
所述的第二片准直透镜采用自聚焦透镜，用于将荧光激发光纤发出的光束进行准直；
所述的第三片准直透镜采用自聚焦透镜，用于将荧光聚焦并耦合进荧光收集光纤；
所述的第一片反射镜用于将经第一片准直透镜准直的光刺激用光反射90度进入第一片二向色镜；
所述的第二片反射镜用于将第二片二向色镜所反射的荧光反射90度进入第三片准直透镜；
所述的第一片二向色镜用于将光刺激用光反射90度，并将荧光激发光透射；
所述的第二片二向色镜用于将光刺激用光和荧光激发光透射，并将荧光反射90度；
所述的物镜采用多片结构，具有消色差功能，可以为一组双胶合透镜或两组双胶合透镜或一片自聚焦透镜和一片透镜的组合。
本发明的工作原理是这样的：首先，光刺激用光纤的一端与外部光源相连，光刺激用光纤的另一端与第一组压电驱动器相连；第一组压电驱动器在外部驱动电信号的作用下驱动光刺激用光纤作单点或多点矢量扫描，用于对样品进行光刺激或解笼锁等；刺激光由光刺激用光纤进行传输，再由第一片准直透镜进行准直，再由第一片反射镜进行反射，再由第一片二向色镜进行反射，再由第二片二向色镜进行透射，最后由物镜进行聚焦；其次，荧光激发光纤的一端与外部光源相连，荧光激发光纤的另一端与第二组压电驱动器相连；第二组压电驱动器在外部驱动电信号的作用下驱动荧光激发光纤作二维荧光激发扫描，其中两片压电晶体呈90度夹角安装，两片压电晶体工作在谐振模式进行二维利萨如图形扫描，用于对样品进行荧光激发；在实验前需要采用外部二维光电位置传感器(Position Sensitive Detector，PSD)对第二组压电驱动器的二维利萨如图形扫描进行记录，建立外部驱动电信号与光斑扫描轨迹一一对应的查找表，用于成像和校准第二组压电驱动器扫描的非线性，此部分为业界通用方法，此处不再详述；再次，荧光由物镜进行收集，再由第二片二向色镜进行反射，再由第二片反射镜进行反射，再由第三片准直透镜耦合进荧光收集光纤。荧光经荧光收集光纤传输至外部光电传感器，如光电倍增管等，完成荧光探测。
本发明由于采用了上述技术方案，具有如下优点：
1、采用双扫描机制，同时实现光刺激和荧光激发，可以用于高级生物实验；
2、采用压电驱动光纤端部振动扫描，简化了设备结构，提高了可靠性；
3、体积小，重量轻，便于实验动物携带，可用于行为学实验。
附图说明
图1为本发明的结构示意图；
图2为压电驱动器的结构示意图；
图3为第二组压电驱动器的扫描示意图；
图4为第二组压电驱动器的驱动波形示意图；
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明：如图1所示，它包括第一组压电驱动器1.1，第二组压电驱动器1.2，光刺激用光纤2.1，荧光激发光纤2.2，荧光收集光纤2.3和一组微型光学系统，其中微型光学系统包括第一片准直透镜3.1，第二片准直透镜3.2，第三片准直透镜3.3，第一片反射镜4.1，第二片反射镜4.2，第一片二向色镜4.3，第二片二向色镜4.4和一组物镜5。第一组压电驱动器1.1的输出端与光刺激用光纤2.1的输出端相连，第二组压电驱动器的输出端1.2与荧光激发光纤2.2的输出端相连；第一片准直透镜3.1的输出端与第一片反射镜4.1的输入端相连，第一片反射镜4.1的输出端和第二片准直透镜3.2的输出端分别与第一片二向色镜4.3的两个输入端相连，第一片二向色镜4.3的输出端与第二片二向色镜4.4的输入端相连，第二片二向色镜4.4的一个输出端与物镜5的输入端相连，第二片二向色镜4.4的另一个输出端与第二片反射镜4.2的输入端相连，第二片反射镜4.2的输出端与第三片准直透镜3.3的输入端相连，第三片准直透镜3.3的输出端与荧光收集光纤2.3的输入端相连；刺激光由光刺激用光纤2.1进行传输，再由第一片准直透镜3.1进行准直，再由第一片反射镜4.1进行反射，再由第一片二向色镜4.3进行反射，再由第二片二向色镜4.4进行透射，最后由物镜5进行聚焦；荧光激发光由荧光激发光纤2.2进行传输，再由第二片准直透镜3.2进行准直，再由第一片二向色镜4.3进行透射，再由第二片二向色镜4.4进行透射，最后由物镜5进行聚焦；荧光由物镜5进行收集，再由第二片二向色镜4.4进行反射，再由第二片反射镜4.2进行反射，再由第三片准直透镜3.3耦合进荧光收集光纤2.3。
所述的第一组压电驱动器1.1如图2所示由两片压电晶体组成，用于驱动光刺激用光纤进行二维定点光刺激，其中两片压电晶体呈90度夹角安装，采用微加工技术制成，基于压电驱动原理，用于将外部驱动电信号通过逆压电效应转换为机械形变，工作在线性模式；
所述的第二组压电驱动器1.2如图2-4所示由两片压电晶体组成，用于驱动荧光激发光纤进行二维荧光激发扫描，其中两片压电晶体呈90度夹角安装，采用微加工技术制成，基于压电驱动原理，用于将外部驱动电信号通过逆压电效应转换为机械形变，两片压电晶体工作在谐振模式进行二维利萨如图形扫描；
所述的光刺激用光纤2.1用于单光子刺激/解笼锁时采用可见光波长的单模光纤，连接外部可见光激光器或发光二极管光源，用于多光子刺激/解笼锁时采用光子晶体光纤(Photonic Crystal Fiber，PCF)，连接外部红外光激光器；
所述的荧光激发光纤2.2用于单光子荧光激发时采用可见光波长的单模光纤，连接外部可见光激光器或发光二极管光源，用于多光子荧光激发时采用光子晶体光纤(Photonic Crystal Fiber，PCF)，连接外部红外光激光器；
所述的荧光收集光纤2.3采用高数值孔径大模场面积(Large Mode Area，LMA)光纤；
所述的第一片准直透镜3.1采用自聚焦透镜，用于将光刺激用光纤2.1发出的光束进行准直；
所述的第二片准直透镜3.2采用自聚焦透镜，用于将荧光激发光纤2.2发出的光束进行准直；
所述的第三片准直透镜3.3采用自聚焦透镜，用于将荧光聚焦并耦合进荧光收集光纤2.3；
所述的第一片反射镜4.1用于将经第一片准直透镜3.1准直的光刺激用光反射90度进入第一片二向色镜4.3；
所述的第二片反射镜4.2用于将第二片二向色镜4.4所反射的荧光反射90度进入第三片准直透镜3.3；
所述的第一片二向色镜4.3用于将光刺激用光反射90度，并将荧光激发光透射；
所述的第二片二向色镜4.4用于将光刺激用光和荧光激发光透射，并将荧光反射90度；
所述的物镜5采用多片结构，具有消色差功能，可以为一组双胶合透镜或两组双胶合透镜或一片自聚焦透镜和一片透镜的组合。
本发明的工作原理是这样的：首先，光刺激用光纤2.1的一端与外部光源相连，光刺激用光纤2.1的另一端与第一组压电驱动器1.1相连；第一组压电驱动器1.1在外部驱动电信号的作用下驱动光刺激用光纤2.1作单点或多点矢量扫描，用于对样品进行光刺激或解笼锁等；刺激光由光刺激用光纤2.1进行传输，再由第一片准直透镜3.1进行准直，再由第一片反射镜4.1进行反射，再由第一片二向色镜4.3进行反射，再由第二片二向色镜4.4进行透射，最后由物镜5进行聚焦；其次，荧光激发光纤2.2的一端与外部光源相连，荧光激发光纤2.2的另一端与第二组压电驱动器1.2相连；第二组压电驱动器1.2在外部驱动电信号的作用下驱动荧光激发光纤2.2作二维荧光激发扫描，其中两片压电晶体呈90度夹角安装，两片压电晶体工作在谐振模式进行二维利萨如图形扫描，用于对样品进行荧光激发；在实验前需要采用外部二维光电位置传感器(Position SensitiveDetector，PSD)对第二组压电驱动器1.2的二维利萨如图形扫描进行记录，建立外部驱动电信号与光斑扫描轨迹一一对应的查找表，用于成像和校准第二组压电驱动器1.2扫描的非线性，此部分为业界通用方法，此处不再详述；再次，荧光由物镜5进行收集，再由第二片二向色镜4.4进行反射，再由第二片反射镜4.2进行反射，再由第三片准直透镜3.3耦合进荧光收集光纤2.3。荧光经荧光收集光纤2.3传输至外部光电传感器，如光电倍增管等，完成荧光探测。
本发明所述的荧光收集光纤2.3的纤芯(Core)直径为(10-1500)微米。
本发明所述的第一片二向色镜4.3用于单光子刺激，双光子扫描时的反射波长为(300-750)纳米，透射波长为(800-1500)纳米；用于双光子刺激，单光子扫描时的反射波长为(800-1500)纳米，透射波长为(300-750)纳米；用于单光子刺激，单光子扫描或双光子刺激，双光子扫描时采用多波段窄带带通滤光片，反射刺激光，透射荧光激发光。
本发明所述的第二片二向色镜4.3采用多波段窄带带通滤光片，反射荧光，透射刺激光和荧光激发光。
本发明所述的物镜的数值孔径为(0.1-1.4)。
Claims (10)
1.一种光纤驱动双扫描荧光探针，其特征在于：它包括两组压电驱动器，一根光刺激用光纤，一根荧光激发光纤，一根荧光收集光纤和一组微型光学系统，其中微型光学系统包括三片准直透镜，两片反射镜，两片二向色镜和一组物镜；第一组压电驱动器与光刺激用光纤相连，第二组压电驱动器与荧光激发光纤相连；第一片准直透镜与第一片反射镜相连，第一片反射镜和第二片准直透镜分别与第一片二向色镜相连，第一片二向色镜与第二片二向色镜相连，第二片二向色镜与物镜相连，第二片二向色镜与第二片反射镜相连，第二片反射镜与第三片准直透镜相连，第三片准直透镜与荧光收集光纤相连。
2.如权利要求1所述的一种光纤驱动双扫描荧光探针，其特征在于：所述的第一组压电驱动器由两片压电晶体组成，用于驱动光刺激用光纤进行二维定点光刺激，其中两片压电晶体呈90度夹角安装，采用微加工技术制成，基于压电驱动原理，工作在线性模式。
3.如权利要求1所述的一种光纤驱动双扫描荧光探针，其特征在于：所述的第二组压电驱动器由两片压电晶体组成，用于驱动荧光激发光纤进行二维荧光激发扫描，其中两片压电晶体呈90度夹角安装，采用微加工技术制成，基于压电驱动原理，工作在谐振模式进行二维利萨如图形扫描。
4.如权利要求1所述的一种光纤驱动双扫描荧光探针，其特征在于：所述的光刺激用光纤用于单光子刺激/解笼锁时采用可见光波长的单模光纤，连接外部可见光激光器或发光二极管光源，用于多光子刺激/解笼锁时采用光子晶体光纤，连接外部红外光激光器。
5.如权利要求1所述的一种光纤驱动双扫描荧光探针，其特征在于：所述的荧光激发光纤用于单光子荧光激发时采用可见光波长的单模光纤，连接外部可见光激光器或发光二极管光源，用于多光子荧光激发时采用光子晶体光纤，连接外部红外光激光器。
6.如权利要求1所述的一种光纤驱动双扫描荧光探针，其特征在于：所述的荧光收集光纤采用高数值孔径大模场面积光纤，其纤芯直径为10-1500微米。
7.如权利要求1所述的一种光纤驱动双扫描荧光探针，其特征在于：所述的第一片二向色镜用于单光子刺激，双光子扫描时的反射波长为300-750纳米，透射波长为800-1500纳米；用于双光子刺激，单光子扫描时的反射波长为800-1500纳米，透射波长为300-750纳米；用于单光子刺激，单光子扫描或双光子刺激，双光子扫描时采用多波段窄带带通滤光片，反射刺激光，透射荧光激发光。
8.如权利要求1所述的一种光纤驱动双扫描荧光探针，其特征在于：所述的第二片二向色镜采用多波段窄带带通滤光片，反射荧光，透射刺激光和荧光激发光。
9.如权利要求1所述的一种光纤驱动双扫描荧光探针，其特征在于：所述的物镜采用多片结构，具有消色差功能，可以为一组双胶合透镜或两组双胶合透镜或一片自聚焦透镜和一片透镜的组合，数值孔径为0.1-1.4。
10.如权利要求1所述的一种光纤驱动双扫描荧光探针，其特征在于：所述的第一片，第二片和第三片准直透镜采用自聚焦透镜。
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