CN107049247B - 微型双光子显微成像装置、活体样本行为成像系统 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种微型双光子显微成像装置和方法、活体样本行为成像系统，所述微型双光子显微成像装置包括：飞秒脉冲激光器，其用于产生波长为920纳米的激光；飞秒脉冲激光调制器，其用于接收所述飞秒脉冲激光器输出的激光，并预啁啾补偿激光的脉冲展宽至预设值，并输出；微型探头，所述微型探头包括：扫描成像部分，用于接收所述飞秒脉冲激光调制器输出的激光，该激光对活体样本内部的组织进行扫描，以激发所述活体样本产生荧光信号；和荧光输出光纤，其用于接收所述扫描成像部分输出的所述荧光信号，并进行输出。所述微型双光子显微成像装置能够在自然生理环境中对自由活动的动物的树突和树突棘活动进行稳定的观测。

Description

微型双光子显微成像装置、活体样本行为成像系统

技术领域

本发明涉及光学成像技术领域，特别是涉及一种微型双光子显微成像装置、活体样本行为成像系统。

背景技术

神经科学的最终目标之一是在自由活动的动物上了解亚细胞、细胞、环路和更高层次的神经元信息处理的基本原理。结合荧光指示剂，光学显微镜已经成为这一任务中的基本研究工具，因为它允许在多个时间和空间尺度上直接观测神经元活动。单个突触是信息传递，处理和存储的基本单位，对于理解脑功能和疾病机理至关重要。突触后结构--树突棘是亚微米结构，深埋在脑内，并以毫秒级的速度活动。由于其固有的光学切片和深层组织穿透能力，多光子显微镜一直是过去二十年内体内无创光学脑成像的首选技术。使用台式双光子显微镜(英文全称为“Two-Photon Microscopy”，下文均简称为“TPM”)，已能够在活体内观察到树突棘的形态变化，比如学习和记忆的神经元的活动。观察在清醒状态下活体样本头部复杂的树突棘活动可以通过配备有快速图像采集(采集频率大于15Hz)、高激发和光电探测效率的最先进的台式多光子显微镜实现。然而，活体样本的头部一直被固定，整个实验期间都处在物理约束和情绪压力下，而且没有先验证据表明神经元对外界的响应在虚拟现实和自由探索下是等价的。更重要的是，许多社会行为，比如亲子护理、交配和战斗，都不能用头部固定的实验来研究。

为了应对这些挑战，一个理想的解决方案是开发能够长时间观察活体样本在自由活动过程中的树突棘的结构和功能动态的微型化显微镜。Denk和他的同事在2001年建立了基于光纤尖端扫描的第一个微型双光子显微镜(英文全称为“micro Two-PhotonMicroscopy”，下文均简称为“mTPM”)，然后接下来的十年里，其他许多课题组采取不同方法继续尝试。然而，这些mTPM没有一个被用于后续的生物应用，主要是由于两个主要的限制：第一，没人能够成像应用最广泛的荧光探针，如GCaMPs，原因是缺乏适当的光纤用来传输920纳米飞秒激光脉冲，以保证脉冲到样品没有失真。第二，mTPMs在体内实验中经常表现出低于它们的理论分辨率，原因可能是采样率低，微型渐变折射率(英文全称为“Graded-Index Lenses”，下文均简称为“GRIN”)透镜的像差，微型光学器件的缺陷和运动引起的成像噪声等等。目前，树突棘分辨率的神经元结构的活动不能被mTPMs很好的解决，尽管其理论横向分辨率为大约1μm。

另一方面，微型单光子宽场显微镜，例如由Ghosh及其同事开发的显微镜，已经实现了快速采集和大视场(英文全称为“Field of Vision”，下文均简称为“FOV”)以及解决了运动引起的噪声问题(在神经元分辨率)。然而，当前的无创微型宽场显微镜仅能获得细胞分辨率，并且图像对比度受到累积的焦外背景信号的影响。到目前为止，可以提供很好的成像能力和实验方案，而且足够强大到可以满足神经科学家的日常实验的新型的mTPM仍有待完成。

因此，希望有一种技术方案来克服或至少减轻现有技术的上述缺陷中的至少一个。

发明内容

本发明的目的在于提供一种微型双光子显微成像装置来克服或至少减轻现有技术的上述缺陷中的至少一个。

为实现上述目的，本发明提供一种微型双光子显微成像装置，所述装置包括：飞秒脉冲激光器，其用于产生波长为920纳米的激光；飞秒脉冲激光调制器，其用于接收所述飞3秒脉冲激光器输出的激光，并预啁啾补偿激光的脉冲展宽至其预设值，并输出；以及微型探头，所述微型探头包括：扫描成像部分，用于接收所述飞秒脉冲激光调制器输出的激光，该激光对活体样本内部的组织进行扫描，以激发所述活体样本产生荧光信号；和荧光输出光纤，其用于接收所述扫描成像部分输出的所述荧光信号，并进行输出。

本发明还提供一种微型双光子显微成像方法，该方法包括：步骤1，选取待成像区域：固定活体样本，并利用台式双光子显微镜在所述活体样本上选取待成像区域；步骤2，采集荧光信号：将连接有激光输入光纤的微型探头安装在所述活体样本上，释放活体样本，以检测步骤1中选取的待成像区域输出的荧光信号，完成所述活体样本内部的组织平面的成像。

本发明还提供一种活体样本行为成像系统，所述系统包括：微型双光子显微成像装置，其为如上所述的微型双光子显微成像装置；箱体，其为活体活体样本的自由移动提供限定空间；数据收集组件，其安装在所述箱体上，且输入端通过荧光输出光纤连接所述微型探头的输出端，用于收集所述微型探头输出的所述荧光信号；和线路安装组件，所述激光输入光纤和荧光输出光纤通过所述线路安装组件以能够相对于所述箱体随意转动的方式安装在所述箱体上。

本发明提供的微型双光子显微成像装置(下文简称为“FIRM-TPM”)测试和应用的速度快、分辨率高，能够用于解决自由活动动物中单个树突棘的成像问题的整套实验方法。在涉及到不规则的、频繁的身体和头部运动的行为范例中(例如，尾悬挂，跳台，和社交行为)，本发明的微型显微镜都可以对GCaMP6f标记的的皮层神经元的体细胞，树突和树突棘进行观测。综合起来，FIRM-TPM代表了下一代微型显微镜，它满足在自由活动动物中进行高分辨率脑成像的需求。

附图说明

图1是本发明所提供的FIRM-TPM一优选实施方式的结构示意图。

图2是图1中的微型探头安装在小老鼠上的状态示意图。

图3是图1中的微型探头的光路原理示意图。

图4是本发明所提供的飞秒脉冲激光调制器一优选实施方式的结构示意图。

图5a是本发明利用图1的微型双光子显微成像装置的活体样本行为成像系统的结构示意图。

图5b是图5a中的数据收集组件和线路安装组件的分解示意图。

图6是台式TPM、微型宽场荧光显微镜和FIRM-TPM各项性能的集成平台在台式双光子模式下的光路示意图，该图示意出了台式TPM的结构示意图。

图7是图6的集成平台在宽场成像模式下的光路示意图。

图8是图6的集成平台在FIRM-TPM成像模式下的光路示意图，该图示意出了在图6的台式TPM中的物镜与物面(活体样本或活体样本)之间的光路上设置有图1的FIRM-TPM。

图9a-9f是比较GCaMP-6f在800nm、920nm和1030nm激发下的双光子激发效率。

图10a是定制设计的HC-920光纤的传输损耗和色散参数，其中，上方左侧的插图显示了HC-920的截面照片，上方右侧的插图显示了由HC-920射出并由具有3mm的焦距的双合透镜准直之后的920nm激光的图像。

图10b是在不同激光功率下1米HC-920出口处920-nm飞秒激光脉冲宽度的自相关分布。

图10c中，左侧图：MEMS扫描器的x(浅灰色)和y(黑色)轴的频率响应。右侧板：机械倾斜角作为MEMS扫描器的x(黑色)和y(浅灰色)轴的DC驱动电压的函数。

图11a-11d是图4的飞秒脉冲激光调制器中色散补偿说明。

图12a-12e是比较在头部固定和自由移动条件下在黑暗环境下活体样本V-1皮质中的树突活性。

图13a-13c是利用图5中的活体样本行为成像系统在不同的行为范例中活体样本的成像视觉皮层活动。

图14a-14d是FIRM-TPM与台式TPM、微型宽视场显微镜的性能比较。

具体实施方式

在附图中，使用相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面结合附图对本发明的实施例进行详细说明。

在本发明的描述中，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明保护范围的限制。

如图1所示，本实施例所提供的一种微型双光子显微成像装置(英文全称为“Fasthigh resolution miniature two photon microscope”；下文均简称为“FIRM-TPM”)包括飞秒脉冲激光器、飞秒脉冲激光调制器1和微型探头2，其中：

所述飞秒脉冲激光器用于产生波长为920纳米的激光。所述飞秒脉冲激光器在图中并未示意出来，其可以使用相干公司变色龙固体激光器作为光源，中心波长为920nm，输出功率100±1mW。相比于现有的波长为1030nm和800nm的激光，波长为920纳米的激光能够有效地激发常用的生物指示剂(例如Thy1-GFP和GCaMP-6f，其中的GCaMP是最普遍使用的钙离子指示剂)产生荧光。下面是比较GCaMP-6f分别在800nm、920nm和1030nm激光激发下的双光子激发效率，利用可调谐的钛宝石飞秒激光器(Coherent，USA，Vision-S，680-1080nm，85-110fs)中选择不同波长进行激发。

如图9a-9f所示，图9a是在不同激发波长下在V-1皮质中表达GCaMP-6f的AAV转染活体样本中成像相同组的神经元胞体cell1、cell2和cell3，图中从左至右依序分别是使用800nm、920nm和1030nm激光获得的荧光图像。图9b是10个胶质细胞的Ca²⁺信号的神经元胞体的频率。图9c中的c是10个胶质细胞的Ca²⁺信号的神经元胞体的幅度，图9c中的d是10个胶质细胞的Ca²⁺信号的神经元胞体的平均时程。图9d如在图9a中，在不同的焦平面成像神经元树突dendrite1、dendrite2和dendrite3，图中从左至右依序分别是使用800nm、920nm和1030nm激光获得的荧光图像。图9e是来自图9d中所示的十个树突Ca²⁺信号的频率。图9f中的g是来自图9d中所示的十个树突Ca²⁺信号的幅度，图9f中的h是来自图9d中所示的十个树突Ca²⁺信号的平均时程。从这些实验数据可以看出：以800nm为中心的飞秒激光脉冲完全不能激发来自神经元胞体或树突的GCaMP6信号，1030nm激发与920nm激发相比，仅能记录到树突钙离子活性的1/10，同时所记录的荧光信号的振幅显著降低。实验数据进一步证明使用波长为920nm的激光可以更加有效地激发GCaMP-6f产生荧光。

再次参阅图1，飞秒脉冲激光调制器1用于接收所述飞秒脉冲激光器输出的激光，并预啁啾补偿激光的脉冲展宽至其预设值，并输出。85fs、920nm为中心的激光脉冲，在经由飞秒脉冲激光调制器1预啁啾补偿之后，调制成大约为100fs的激光脉冲，传输功率可以从5mW到200mW(该数据是通过实验在激光输入光纤11的出口处测量获得)。

微型探头2包括扫描成像部分和荧光输出光纤21，其中：所述扫描成像部分用于接收飞秒脉冲激光调制器1输出的激光，该激光对活体样本内部的组织进行扫描，以激发所述活体样本产生荧光信号。荧光输出光纤21用于接收所述扫描成像部分输出的所述荧光信号，并进行输出。

如图1和图2所示，荧光输出光纤21选择的是一种新型的柔性光纤束(SFB)，本实施方式中的荧光输出光纤21由700-900根玻璃光纤熔接而成，同时，保持各玻璃光纤松散并在两者之间分开，这样便于由自由活动的活体样本携带并减少运动伪影的轻质显微镜探头，进而最小化动物运动引起的扭矩和张力，而不降低光子收集效率。所有的玻璃光纤熔接的两个端部呈1.5mm直径的圆柱体，以方便安装在微型探头2上。下表1是本实施例中的荧光输出光纤21的性能参数，其与多模光纤相比具有更高的收集效率，并且比之前使用的塑料光纤和传统的融合型光纤束更灵活，能够进行多波长发射检测。荧光输出光纤21将来自微型探头2中的物镜的荧光信号传递到远端的GaAsP PMT(10770P-40，Hamamatsu，日本)中，其总收集效率在532nm处为大约80％。

表1

光纤数量	800
		单个光纤直径(μm)	30
数值孔径(NA)	0.65
		收集角度(度)	80
传输效率(％/m)	90
		占空比(％)	90
整体传输效率(％)	80

如图2所示，微型探头2中集成在固定支架28上。通过固定支架28，微型探头2以可拆卸的方式(螺钉连接)安装在活体样本(如图2中示出的小老鼠等活体样本)的头上。微型探头2和固定支架28的总重量大约位2.15g，体积不超过1cm³，系统足够小而紧凑和足够轻以便活体样本携带。固定支架28采用铝材料制成，比如铝框架。固定支架28的形状可以设计成一个头盔形状，这样易于安装和拆卸，主要是可以稳固地将微型探头2安装在自由活动的活体样本的头部，因此有利于在同一个动物中进行数小时成像，并保持微型双光子显微成像装置的视场(下文简称为“FOV”)在存在强烈的身体和头部运动的情况下不产生漂移。除此之外，利用本发明进行成像之前，会预先训练活体样本适应安装在其头骨上的微型探头2，并滴加1.5％低熔点琼脂糖使其充满在微型探头2的物镜和活体样本的脑组织之间，这些操作都显著降低了微型探头2与大脑之间的相对运动，这些措施改善了实验短期和长期的稳定性，允许在动物进行包含大量身体和头部自由活动的行为检测中进行高分辨率成像。

在一个实施例中，如图4所示，飞秒脉冲激光调制器1具有负色散光路和正色散光路，其中：所述负色散光路包括激光输入光纤11，激光输入光纤11用于将脉冲展宽预啁啾补偿好的激光传输给所述扫描成像部分。所述正色散光路位于所述飞秒脉冲激光器和所述负色散光路之间，用于补偿由所述激光输入光纤11在传输激光过程中引起的负色散。

由于材料色散和非线性效应，单模光纤会将飞秒激光脉冲展宽。而本实施例中使用的激光输入光纤11为空心光子晶体光纤(下文简称为“HC-PCF”)，即图中或文中出现的HC-920，其中大多数激光传播是通过HC-920中间的充气芯，这有效地最小化了由于非线性效应产生的脉冲展宽。本实施例的激光输入光纤11用于传输数百毫瓦的920纳米飞秒激光脉冲，其非线性脉冲展宽可忽略不计(图10a和表2)。

表2

本实施例的激光输入光纤11为920纳米飞秒激光脉冲提供了无畸变传输，这种改进让有效激发常用的生物指示剂成为可能，例如Thy1-GFP和GCaMP-6f。

在一个实施例中，所述正色散光路包括色散补偿元件12和声光调制器13，其中：声光调制器13用于接收经由色散补偿元件12补偿后的激光，并调节激光强度，然后输出给所述扫描成像部分。声光调制器13可以采用现有产品实现。

色散补偿元件12临近所述飞秒脉冲激光器设置，用于补偿由激光输入光纤11在传输激光过程中引起的负色散。

激光输入光纤11中的负色散相对较低，色散补偿元件12只要使用具有特定长度的正色散的商业玻璃材料通过预啁啾方法就可以精确地补偿。在预啁啾补偿之后，85fs、920nm为中心的激光脉冲经过1m长的激光输入光纤11传输后变成大约为100fs的脉冲，传输功率可以从5mW到200mW(该数据是通过实验在激光输入光纤11的出口处测量获得)(图10b)。

优选地，色散补偿元件12采用的是H-ZF62玻璃管，其在920nm波长的激光中具有458ps/nm/km的正色散。其中：图11a是使用H-ZF62玻璃管补偿HC-920色散示意图；图11b是玻璃H-ZF62的色散参数；图11c是从没有色散补偿的1米的HC-920输出的920nm飞秒激光的脉冲宽度；图11d是在具有和没有色散补偿的1米的HC-920之前和之后的920nm飞秒激光器的脉冲宽度。

下面是对飞秒脉冲激光调制器1实现对85fs、920nm为中心的激光脉冲预啁啾补偿之后，变成大约为100fs的激光脉冲，传输功率可以从5mW到200mW的详细说明。

在超快激光脉冲的传输期间，两个因素有导致脉冲展宽：材料的色散以及高激光峰值功率的非线性效应。在激光输入光纤11中，大多数激光传播通过空气芯，因此非线性效应最小。在微型探头2的光路中，诸如透镜和反射镜的光学部件的中心处的光密度相对较低，因为光束尺寸较大(直径为不超过2mm)，因此几乎不引起非线性。由于显微镜的前部件和样本中的微型部件的长度相对较短，因此也可忽略。因此，主要的扩展效应起源于由台式光学器件和激光输入光纤引起的材料色散。通过简化，在本实施方式的系统中仅考虑二阶色散。因此，整个系统的脉冲展宽为：

B_system＝|∑_n{L_n∫_λ,ΔλD_n(λ)dλ}|  (1.1)

其中：n表示系统中的光学器件的数量；D_n(λ)由第n个分量(光学器件)引起的色散参数；L_n表示第n分量(光学器件)的光路长度；λ和Δλ是激光的中心波长和光谱宽度；||表示来自透镜的正色散(负D(λ))和来自激光输入光纤异常色散(正D(λ))总和的绝对值。因此，当Δλ<<λ，在本发明的系统中(λ＝920nm，Δλ不超过15nm)，方程简化为：

B_system＝|∑_n{L_n·D_n(λ)·Δλ}|  (1.2)

最终脉冲宽度表示为：

P_output＝P_input+|B_system|  (1.3)

其中P_input和P_output表示激光器的输入和输出脉冲宽度。

在本实施例提供的系统中使用的HC-920的长度为1m(L_hc-920)，由制造商测量并在图10a中示出。因此，HC-920的扩展是：

L_hc-920·D_hc-920(920nm)·Δλ～1(m)·75(ps/nm/km)·15(nm)＝1.125(ps)

容易确定诸如偏振分束器、透镜和声光调制器的长度，并且通过它们使用的镜片折射率信息来计算，其表示为：

和

其中，GVD表示介质中群速度色散，c是光速，n是介质的折射率。

加在一起，这些分量引起约-200fs的展宽，因此从85fs变换限制脉冲的HC-920输出的计算脉冲宽度约为：

(0.085+1.125-0.2)(ps)＝1.01(ps)

其与实验测量的脉冲宽度(不超过1ps)(图11c)匹配，并且对于有效的双光子激发太弱。通过将H-ZF62玻璃管(本实施例中的色散补偿元件12均采用H-ZF62玻璃管)插入具有正色散的光路中，本实施例预补偿了由HC-920引起的负色散。本实施例选择H-ZF62玻璃管，因为它具有大的正色散(在波长为920nm中的色散大约为58ps/nm/km)，由Scott公司提供的折射率信息和等式(1.4)计算，如图11b所示)。所需的H-ZF62玻璃管的长度计算如下：

(1.125-0.2)(ps)/458(ps/nm/km)/15(nm)＝13.5(cm)

考虑到由显微镜前端和样品引起的小的正色散，本实施例使用一个12厘米长、12.7毫米直径的H-ZF62玻璃管，小于计算值。在H-ZF62玻璃管(图11b和图6)的这种“预线性调频”之后，来自HC-920的激光脉冲宽度在测试照明功率的整个范围内被压缩到大约为100fs(图11d和图10b)。本实施例的FIRM-TPM通过使用自行设计的HC-PCF来传输具有可忽略的非线性脉冲展宽的920纳米飞秒激光脉冲(名为HC-920)，能够实验对常用的生物指示剂进行成像，并取得了和台式TPM相当的性能。

在一个实施例中，所述正色散光路还包括激光方位调整组件，所述激光方位调整组件设置在色散补偿元件12与声光调制器13之间，所述激光方位调整组件包括第一半波片14、第一反射镜15和第二反射镜16，其中：

第一半波片14用于接收经由色散补偿元件12补偿后的激光，并调整激光偏振方向，以使得声光调制器13的调制效率最高。第一反射镜15用于接收经由第一半波片14的激光，并反射激光，以调整激光射入声光调制器13的位置。第二反射镜16用于接收经由第一反射镜15的激光，并反射激光，以调整激光射入声光调制器13的角度，并传输给声光调制器13。

在一个实施例中，所述正色散光路还包括分光组件，所述分光组件临近激光输入光纤11设置，用于接收经由声光调制器13调节好强度的激光以及将该激光分成至少两束，并传输给激光输入光纤11。

在一个实施例中，激光输入光纤11的数量至少为两根，包括第一激光输入光纤和第二激光输入光纤。

所述分光组件包括偏振分束器17、第二半波片18、第三反射镜19、第一准直透镜110、第三半波片111、第四反射镜112、第二准直透镜113和第四半波片114，其中：

偏振分束器17用于接收经由声光调制器13调节好强度的激光以及将该激光分成至少两束，分别传输给所述第一激光输入光纤和第二激光输入光纤。第二半波片18布置在偏振分束器17和声光调制器13之间，用于改变偏振分束器17的分光比。第三反射镜19布置在偏振分束器17和第二半波片18之间，用于反射激光，以调整激光的位置并投射到所述偏振分束器17的入射面上。第一准直透镜110布置在偏振分束器17的第一出射面与第一激光输入光纤11之间，用于接收偏振分束器17输出的激光以及将激光耦合进第一激光输入光纤11。第三半波片111布置在偏振分束器17的第一出射面与第一准直透镜110之间，用于接收偏振分束器17输出的激光，并调整激光偏振方向，使得激光耦合进第一激光输入光纤11的效率最高。第四反射镜112布置在偏振分束器17的第二出射面与所述第二激光输入光纤之间，用于接收偏振分束器17输出的激光，用于反射激光，以调整激光的位置并投射到所述第二激光输入光纤中。第二准直透镜113布置在第四反射镜112与第二激光输入光纤之间，用于接收偏振分束器17输出的激光以及将激光耦合进所述第二激光输入光纤。第四半波片114布置在第四反射镜112与第二准直透镜113之间，用于接收第四反射镜112反射的激光，并调整激光偏振方向，使得激光耦合进所述第二激光输入光纤的效率最高。

如图1和图3所示，在一个实施例中，所述扫描成像部分包括微机电扫描仪22、物镜23、扫描透镜24、准直器25、双色镜26和采集透镜27，其中：

微机电扫描仪22(MEMS)用于通过转动改变激光入射角角度的方式将激光对所述活体样本内部的组织平面进行二维扫描。优选地，微机电扫描仪22的直径为0.8mm，封装尺寸为9×9mm²，第一谐振频率为不超过6kHz，其最大光学扫描角度为±10度,支持帧大小为256×256和最大视场为130×130μm²的40Hz成像,以实现视频速率图像采集。与其它扫描方式相比，例如使用压电致动器的螺旋或Lissajous图案的光纤扫描相比，本实施例提供的微机电扫描仪22扫描对于其在整个视场上的高速，均匀激发和大扫描角、大视野都是有利的。微机电扫描仪22扫描过程中的x和y控制信号由FPGA(现场可编程门阵列)卡(PXI-7853R)生成，该卡也用于驱动声光调制器以调整激光强度和触发其它器件(例如，红外摄像机采集)。来自光电检测器(H10770P-40，Hamamatsu Japan)的信号通过高速前置放大器(DHPCA-100，FEMTO Gmbh，Berlin，Germany)放大，然后连接到120MS/s数字转换器适配器模块(NI5734，National Instruments Inc.，Austin，TX，USA)和FlexRIO FPGA(PXIe-7961R，NationalInstruments Inc.，Austin，TX，USA)，用于高速数据采集。整个系统由基于LabVIEW平台的定制开发软件控制。

物镜23用于将来自微机电扫描仪22的激光会聚到所述活体样本内部，以激发所述活体样本产生所述荧光信号以及用于输出所述荧光信号。优选地，物镜23的数值孔径(下文均简称为“NA”)为0.8，NA较高，光学层切较薄，这有利于实现亚微米成像分辨率，进而能够在自由活动的样本中分辨出树突和树突棘的结构和功能变化。

本实施例中，物镜23使用的是GRINTECH GmbH(Jena，Germany)的高分辨率水浸小型物镜(GT-MO-080-018-AC900-450)，这是用4.76×的放大率，0.80的物方NA和0.173的像方NA进行有限校正。物镜23的长度为6mm长，直径是1.4mm，并且具有200μm的工作距离。物镜23具体包括薄菲涅耳透镜231、平凸透镜232、中继透镜233和聚焦透镜234，其中，薄菲涅耳透镜231和平凸透镜232都是微型渐变折射率(GRIN)透镜。与现有技术中使用的物镜相比，本实施例入射到物镜23中的衍射分量(菲涅尔透镜)有效地校正了双光子成像期间激发和发射波长之间的大色差，这会使得更好的光束聚焦质量，且改善信号收集效率，从而有利于实现亚微米成像分辨率，进而为能够在自由活动的样本中分辨出树突和树突棘的结构和功能变化提供有利条件。

扫描透镜24布置在微机电扫描仪22和物镜23之间的光路上，用于将微机电扫描仪22二维扫描所产生的角度变化的激光转化成位置变化的激光。扫描透镜24使用非球面透镜(#355160B，Lightpath Technologies，Orlando，FL，USA；直径：3mm；等效焦距：2.7mm)作为扫描透镜，以减少球面像差。

准直器25布置在激光输入光纤11与微机电扫描仪22之间，用于准直来自激光输入光纤11输出的激光以及减少不同频率激光之间的色差，以与扫描透镜24共同匹配物镜23的图像NA。本实施例的准直器25使用的是消色差准直透镜(#65-286，Edmund Optics Inc.，Barrington，NJ，USA；直径：2mm，等效焦距：3mm，专用近红外光)，能够准直输出激光器并减少飞秒激光器的不同频率分量之间的色差，这样有利于提高传输效率(从激光源到样本高达50％)，光束聚焦和激发效率。

双色镜26设在扫描透镜24和物镜23之间，用于将激光和荧光信号分开以及输出所述荧光信号。双色镜26采用的是中国福建Sunlight有限公司生产制造的产品，尺寸3×3×0.2mm³，反射带是750-1100nm，透射带是400-650nm，以将来自扫描透镜24的激光束反射到物镜23。采集透镜27用于有效收集荧光信号。

本发明使用光学设计软件(ZEMAX)来模拟和优化所有光学元件和它们之间的距离，并使用商业CAD软件(Solidworks)进行几何设计。

本发明提供的微型探头2的分辨率的具体计算过程如下：

首先，有效激发NA(NA_ex)由激发的整个光路确定。准直器25之后的激光束的直径D₁为：

D₁＝2·NA_hc-920·EFL_c  (2.1)

其中，NA_hc-920是HC-920的NA(大约为0.15)和EFL_c准直器25的等效焦距(3mm)。

因为激光束的直径D₁(0.9mm)大于微机电扫描仪22的尺寸(对于x方向为0.8mm，对于y方向为大约为0.6mm)，考虑到微机电扫描仪22的倾斜度受到其尺寸的限制并由下式给出：

NA_ex＝(1/2·D_m/EFL_s)·NA_o/NA_i  (2.2)

其中，EFL_s是扫描透镜24的等效焦距(2.7mm)。NA_o,NA_i分别表示物镜的NA和图像NA，分别为0.8和0.173。

然后，由微机电扫描仪22的x方向决定的最大激发NA为：

NA_ex＝(1/2·0.8/2.7)·0.8/0.173～0.685

使用参考文献2中的方程计算双光子激发(I_PSF ²)的点扩散函数的衍射极限横向(ω_xy)和轴向(ω_z)1/e半径，本实施例有：

其中，浸没介质(生理盐水)的折射率不超过1.34，激光的波长为920nm。aNA_ex为0.685，ω_xy＝0.304μm和ω_z＝1.840μm。

分辨率通常定义为PSF²的半高宽(FWHM)，本实施例有：

利用嵌入琼脂糖中的100nm荧光珠的图像测量得到：本发明提供的微型双光子显微成像装置的横向分辨率为0.64±0.02μm，轴向分辨率为3.35±0.36μm。

在上述实施例中,测试本发明的分辨率时制作实验样本的方法为：首先将2μL的TetraSpeck 100-nm荧光珠(T7270，Life Technologies，Oregon USA)稀释到100μL生理盐水中，然后与900μL 1.5％低熔点琼脂糖混合。再将含有微球荧光珠(4μM)的琼脂糖小滴加到盖玻片上，10分钟后备用。等效横向像素尺寸为61nm，轴向扫描间隔为80nm，两者均大于奈奎斯特采样定理要求的5倍以上，进而足以测量显微镜的真实光学分辨率。

表3是本发明提供的FIRM-TPM与现有技术中mTPM的分辨率的对比表，第2列是本发明提供的FIRM-TPM的分辨率及其参数说明，第3-6列是现有技术中mTPM的分辨率及其参数说明。需要说明的是：表3中的*:数据来自文献。从现有的实验数据证明：现有技术中mTPM尽管在动物的体外得到了较高的空间分辨率，但是，大多数mTPM在动物的体内表现不佳，并未能得到高信噪比(SNR)的荧光图像。从表3中的对比分析可以得出：本发明提供的FIRM-TPM的分辨率大约为现有技术中的mTPM的最高分辨率的两倍，这种高分辨率为解决自由活动动物中单个树突棘的成像问题提供了有利条件。

表3

为了在同一基准上测试和比较现有技术中的台式TPM和微型宽场显微镜与FIRM-TPM之间的性能差异，本实施例建立了一个集成平台，允许在同一样品上进行台式TPM模式(图6)、宽场成像模式(图7)和FIRM-TPM成像模式(图8)之间的切换。如图6-8所示，该集成平台配备有微型和常规物镜、多个照明源(用于TPM的激光器和用于宽场的高功率汞灯)和检测装置(用于TPM的GaAsP和用于宽场的sCMOS相机)。不同的成像模式具有相同的焦平面和同心视场、总帧采集时间和成像NA，而平均照明功率和检测器灵敏度也进行了仔细选择和匹配，下面结合图6至图8说明上述集成平台的组成。

上述集成平台分别在台式TPM模式、宽场成像模式和FIRM-TPM成像模式下对同一标本的同一焦平面进行成像。激光(Chameleon Vision-S，Coherent，USA；中心波长：920nm)，通过H-ZF62玻璃管，随后用声光调制器(MT110-B50A1.5-IR-Hk，AA Sa，OrsayCede，France)。然后将中心波长为920nm的激光分成两束，一束耦合到在FIRM-TPM中使用的一根HC-920中，另一束耦合到在台式TPM中使用的另一根HC-920中。

如图6所示，在台式TPM模式中，来自HC-920的准直激光器由一对检流计计扫描镜A1(6215H，Cambridge Technology，MA，USA)扫描，然后通过扫描透镜A2(LMS05-BB，Thorlabs Inc，New Jersey)、管透镜A3(Olympus Japan)和第一二向色镜A4(DM1，DMLP650R，Thorlabs Inc，New Jersey，USA)，然后最终传送到物镜A5的后焦平面(BFP)(CFIApo 40XW NIR，Nikon，Japan；40×NA 0.8，工作距离：3.5mm)。来自物镜A5的荧光发射信号由第一二向色镜A4反射，通过收集透镜A6(LA1213-A，Thorlabs Inc，New Jersey，USA)、第二分色镜A7(DM2，#87-284，Edmund Optics Inc.，Barrington，USA，反射带：375-393,466-490和546-565nm；透射带：420-460,510-531,590-624和677-725nm)，通过聚光透镜A8(ACL25416U-A，Thorlabs Inc，New Jersey，USA)，最后用光电倍增管A9(GaAsP PMT 7422P-40，Hamamatsu，Japan)检测。为了实现与FIRM-TPM(0.685)相同的激发NA，将物镜A5的后焦平面(BFP)处的激发激光束的光束尺寸设置为：

(2×0.685×200)(mm)/40＝6.85(mm)

其中，200mm是用于该物镜A5的匹配管透镜A3的EFL，40是物镜A5的放大率。

如图7和图8所示，在宽场成像模式和FIRM-TPM成像模式中，将本发明提供的微型探头2连接到定制的微小三轴手动显微操作器(Sigma Koki，Tokyo，JAPAN)上，微型探头2中物镜像平面是空气物镜(Plan Apo NIR 5X，Mitutoyo，Japan；5×，NA为0.14，工作距离为37.5mm)的焦平面。使用具有高精度的双向重复性(±2.5μm)的4端口物镜转盘(OT1，Thorlabs Inc，New Jersey，USA)在微型探头2和40×尼康物镜之间切换。通过调整尼康物镜和微型探头2之前的镜头镜筒的螺纹，本发明可以设置微型探头2和尼康物镜具有相同的焦平面。

如图7所示，在微型宽视场荧光结构中，使用具有蓝光滤光器(MF475-35，ThorlabsInc，New Jersey，USA；中心波长为475nm，带宽为40nm)的荧光照明器(X-Cite 120Q，Excelitas Technologies，MA，USA)：35nm)作为光源B1。将台式TPM构造中的第一二向色镜A4改变为分色镜B2(DM3，#87-284，Edmund Optics Inc.，Barrington，NJ，USA；反射带：375-393,466-490和546-565nm；透射带包括：420-460,510-531,590-624和677-725nm),以将照明光反射到微型探头2,并将来自微型探头2的荧光发射信号传输到科学CMOS照相机B3(8050M-GE，Thorlabs Inc，New Jersey，USA)。在台式TPM和FIRM-TPM配置中的成像在目标之后使用类似的平均功率，通常为10-25mW。由于单光子和双光子激发的吸收截面的差异，单光子成像中使用的平均功率通常比双光子成像中的平均功率低得多。因此，本发明在宽场荧光显微镜配置中使用100-500μW照明(在微型物镜之后)，类似于之前报告中使用的170-600μW照度。

图14a的左侧图像是Thy1-GFP转基因活体样本脑的神经元树突和树突棘的3D形态成像，在1s的总曝光(FIRM-TPM和微型宽视场显微镜的8Hz的8帧的平均值，以及台式TPM的2Hz的2帧的平均值)下获得大致相同焦平面处的图像，图14a的右侧曲线是左侧图像中所示的裁剪区域中两对相邻树突棘的横截面轮廓。图14b是在表达GCaMP6f的活体样本的PFC中富含神经元胞体的平面(-130μm)的图像，上部图片：相同ROI的30秒平均图像。微型宽场图像显示为归一化的ΔF/F(参见在线方法)；下部波浪线：三个选择的神经元中Ca²⁺的时程变化(持续时间：100秒)(在上图中用数字标记)。图14c的左侧图像是来自于(图14b)中相同活体样本的树突和棘突(焦平面-120μm)的Ca²⁺信号，由于缺乏可辨别的树突信号，未示出用微型宽视场显微镜记录的图像，图14c的右侧上部图像用台式TPM捕获的一个带树突轴(D1)和树突棘(S1，S2，S3)的成像和Ca²⁺信号(持续时间：100s)，图12c的右侧下部图像是用FIRM捕获的一个带树突轴(D1)和树突棘(S1，S2，S3)(左)的成像和Ca²⁺信号(持续时间：100s)。图12d是在不同配置中成像的Ca2+信号的平均频率和幅度，来自相同组的神经元胞体(n＝4)，统计：树突(n＝8)和树突棘(n＝6)的数据。

对于形态学成像，本发明在Thy1-GFP转基因活体样本的固定脑中的V1区域(130×130μm²，从表面到60μm以下)进行成像，获取3D的图像数据(图14a)。FIRM-TPM和台式TPM在树突成像中表现出相同的对比度和分辨率(图14a)。然而，在微型宽场成像模式下，基本上不能分辨结构细节，主要是因为来自焦外组织的强背景信号。在功能成像的比较中，本发明利用腺相关病毒感染的方式在活体样本前额皮层神经元中表示Ca²⁺指标剂GCaMP 6f，并在头部固定的清醒活体样本上进行钙成像(图14b-图14d)。选择两个焦平面以显现来自胞体(表面以下130μm)或树突和树突棘(表面以下120μm)的活动。在图像归一化和对比增强(ΔF/F)之后，微型宽场成像以相似的频率分辨体细胞Ca²⁺信号，而它们的幅度(ΔF/F为5-10％)比用台式TPM或FIRM-TPM(ΔF/F大约为150％)测量的幅度低约一个数量级(图14d)。值得注意的是，大多数源自树突结构的Ca²⁺信号在这种成像配置中未被检测到(图14b和图14d)。总之，这些基准的测试证明本发明的FIRM-TPM达到与台式TPM相同的性能，同时在分辨清醒动物中树突和树突棘的结构和功能活性方面优于微型宽场显微镜。

在FIRM-TPM中使用的快速微机电扫描仪22比在高速台式TPM中使用的共振扫描器具有更加线性的电压-倾斜响应和可控性。因此其赋予其成像更大的灵活性，使得在单个系统种可以实现快速栅格式扫描成像、任意指定的区域(ROI)的随机扫描成像和超快线扫描成像。特别是128Hz的随机扫描成像有助于分辨Ca²⁺信号时间上的超微结构，并且可以赋予mTPM在自由活动的动物中进行精确光遗传学操作的能力。10kHz线扫描成像能力对于利用基因编码的电压指示剂来快速观测动作电位至关重要。

树突棘活动是神经元信息处理的基本事件，利用台式TPMs在头固定的动物上的研究表明单个神经细胞的不同树突棘可以被不同朝向的视觉刺激或不同强度频率的声音刺激所激活。虽然通过微型宽场显微镜获得的数百个神经元的整体活动可以帮助探测在不同行为条件下的神经元网络编码特性，本发明的FIRM-TPM提供了一个可供选择的更加强大的工具，在头固定动物上不能实现的行为范式中对更加基本的神经编码单位的时空特性进行观测。

总之，新开发的FIRM-TPM已经实现了高时空分辨率，良好的机械稳定性，以及对应用范围最广的指示剂的有效激发。通过使用新一代的mTPM，本发明实现了在自由活动的动物中单突触水平的长时间成像这一科学家梦寐以求的目标。可以预见未来会有更多的改进和扩展。使用正确设计的微型高NA物镜，可以进一步扩展FOV和穿透深度。深脑成像可以通过直接将微型物镜插入脑中，或通过在大脑中嵌入GRIN透镜来实现，类似于以前报告的方法。对于较大的动物，例如大鼠或狨猴，可以在头骨上安装多个FIRM-TPM，以探索大脑中远程结构和功能连接的相关问题。本发明预计，FIRM-TPM将被证明是神经科学家以及生物医学科学家在动物体内探索健康和疾病机制的重要工具。

如图5a所示，本发明还提供一种活体样本行为成像系统，所述活体样本行为成像系统包括箱体3、飞秒脉冲激光器、飞秒脉冲激光调制器1、微型探头2、数据收集组件7和线路安装组件，其中：

飞秒脉冲激光器用于产生波长为920纳米的激光。飞秒脉冲激光调制器1用于接收所述飞秒脉冲激光器输出的激光，并预啁啾补偿激光的脉冲展宽至预设值，该预设值优选不超过100fs，并输出。微型探头2用于安装在活体样本身上，且输入端通过所述飞秒脉冲激光调制器中的激光输入光纤连接所述飞秒脉冲激光器的输出端，用于接收所述飞秒脉冲激光调制器输出的激光，该激光对活体样本内部的组织进行扫描，以激发所述活体样本产生荧光信号；以及用于接收所述扫描成像部分输出的所述荧光信号，并进行输出。飞秒脉冲激光器、飞秒脉冲激光调制器1和微型探头2在上文均已经详细介绍，此处不再赘述。

箱体3为活体样本的自由移动提供限定空间，该限定空间相比于活体样本的体型要大很多，可以为活体样本的自由活动提供足够大的空间。数据收集组件7安装在箱体3上，数据收集组件7的输入端通过荧光输出光纤21连接微型探头2的输出端，用于收集微型探头2输出的所述荧光信号。激光输入光纤11和荧光输出光纤21通过所述线路安装组件以能够相对于3箱体随意转动的方式安装在箱体3上。通过线路安装组件，可以防止荧光输出光纤21、激光输入光纤11和其它供电线8彼此之间相互缠绕，为活体样本的自由活动提供有利条件。

在一个实施例中，数据收集组件7提供探测光路，该探测光路上包括同轴布置的光电倍增管71、聚光器72、发射滤光片73、短通滤光片74和收集透镜75，其中：光电倍增管71用于将光信号转化为电信号后输出。聚光器72用于汇聚由荧光输出光纤21传输的荧光信号。发射滤光片73用于滤掉波长为920纳米的激光。短通滤光片74用于过滤掉除信号光以外的杂散光。荧光输出光纤21与收集透镜75共轴，且荧光输出光纤21位于收集透镜75的焦平面上，收集透镜75用于将所述荧光信号更充分的收集到光电倍增管71中。

优选地，所述线路安装组件包括电动旋转头6和支架10，其中：电动旋转头6贯穿设置在箱体3的顶部，并且，一端连接外部电源，另一端连接供电线8，使所述外部电源与供电线8能够电连接。支架10罩设在位于箱体3顶部的电动旋转头6外，激光输入光纤11和荧光输出光纤21穿过电动旋转头6的外壳，荧光输出光纤21与数据收集组件7中的收集透镜75光信号连接。荧光输出光纤21通过轴承9连接到数据收集组件7，这样，电动旋转头6和轴承9允许荧光输出光纤21和供电线8进行独立地旋转，同时保持探测光路不变，这种设计防止了活体样本自由探索其环境时造成的连接线的缠绕，极大地提高了微型探头2的稳定性，即使活体样本进行强烈的身体活动也不会有影响，以使动物在自由探索期间线的扭曲和缠绕最小化。

在一个实施例中，所述自由移动活体样本行为成像装置还包括供电线8，为微机电扫描仪22供电。供电线8通过所述线路安装组件以能够相对于所述箱体随意转动的方式安装在所述箱体上，从而保证供电线8能够正常供电，也能够避免供电线8与激光输入光纤11和荧光输出光纤21彼此相互缠绕，以使动物在自由探索期间线的扭曲和缠绕最小化。

在一个实施例中，所述自由移动活体样本行为成像装置还包括多个相机4，相机4都安装在箱体3的内壁上，比如图2中示出的安装在箱体3的侧面以及顶面，分别以不同的角度拍摄和记录活体样本的自由移动过程的行为。

在一个实施例中，所述自由移动活体样本行为成像装置还包括照明灯5，照明灯5安装在箱体3的内壁上，用于照明箱体3的内腔。

如图12a-12e所示，图12a是V-1皮质L2/3神经元的50张平均FIRM-TPM(本发明的微型双光子显微成像装置)图像，图像中圈出了1、2、3个树突。图12b是活体样本在竞技场内的二维轨迹(持续时间：100秒)，从其中顶部的相机捕获的视频记录计算轨迹，并且移动速度用颜色编码。图12c和图12d分别是在头部固定(12c)和自由移动条件(12d)下从三个树突(在图12a中圈出)的Ca²⁺信号的时程(持续时间：100s)，活体样本速度的时间相关变化也显示在底部。图12e是在头部固定和自由移动条件下所有树突状Ca²⁺瞬变的平均频率；数据表示为平均值±s.e.m.，n＝15个树突。***p<0.001，配对t检验。由以上实验数据，可以发现当活体样本在黑暗中自由地探索时(轨迹显示在图12a-12e中)，其视觉皮层的神经元树突活性相对于活体样本头部固定的情况有显著的增加(图12a-12e)。

如图13a-13c所示，图13a是在三种不同的行为范例内的视觉皮层中成像神经元活动：悬尾试验、跳台、社交行为。最左侧第一列图像：通过在行为装置侧面上的侧面的两个相机拍摄的活体样本参与不同行为的快照；中间第二列图像：GCaMP6f标记的神经元胞体，树突和树突棘的FIRM-TPM成像；右侧第三列图像：相应的钙活动分布图(持续时间：100s)。最右侧第四列图像：FIRM-TPM图像中指示的三个ROI的Ca²⁺信号(持续时间：50秒)。图13b是FIRM-TPM成像的短期和长期稳定性，图13b左侧曲线是基于每个行为范例中的帧与帧之间的互相关分析的横向晃动分布，曲线中，FM：自由移动；TS：试验；SD：跳台；SI：社交行为；平均帧与帧之间的横向晃动为：在FM中，0.11±0.06μm(75％在0.14μm内)；在TS中为0.10±0.07μm(75％在0.13μm内)；在SD中为0.19±0.09μm(75％在0.24μm内)；在SI中，0.06±0.03μm(75％在0.07μm内)；图13c右侧曲线是在4小时的实验期间的视场的整体漂移。图13c是悬尾试验中树突和树突棘的全局和局部钙活动，上部：具有多个树突棘分枝的树突的10s平均图像，插图显示在3对树突棘其根部树突轴的Ca²⁺信号，全局钙活动被定义为同时激活树突棘和其根部树突轴。

这个结果与多位点电学探针记录到的运动可以增强动物视觉皮层神经元活动一致。接下来，为了证明FIRM-TPM的鲁棒性，本发明在活体样本的初级视觉皮层中的130×130μm²的FOV上进行40Hz的成像来观察其神经元的活动，该活体样本在三种行为范例中依次测试，包括悬尾实验、跳台和社交行为。这些范例都不能在头部固定的实验策略中实现，整个测试过程持续约4小时。值得注意的是，即使当活体样本在悬尾试验中强烈挣扎，从高台跳下或与其同胞交流时，来自不同胞体、树突和树突棘的活性仍然可以被稳定的观测。不同的行为范式似乎与同一V1皮层的不同区域的神经活动相关联(图13a)。

为了量化本发明提供的微型双光子显微镜的短期和长期稳定性，本发明通过逐帧互相关和视场的一段时间到另一段时间的漂移来分析横向位移(图13b)。本发明发现，在2000连续帧内，帧与帧之间的平均位移在跳台行为范例中(0.19±0.09μm；75％在0.24μm以下)是最大的，但仍然小于像素大小的一半。在整个4h测试中，FIRM-TPM的FOV的整体漂移<10μm，大多数漂移发生在悬尾实验中剧烈运动的第一个小时。值得注意的是，较高的图像采集速度降低了帧内的错位，这种水平的运动伪影并不妨碍本发明对树突棘结构和功能的成像。为了演示本发明提供的微型双光子显微镜对单突触活动的成像能力，通过跟踪树突棘及其父树突轴上的Ca²⁺活动，本发明进一步分析了整体和局部活动之间的关系。总而言之，本发明提供的微型双光子显微镜能够在自然生理环境中对自由活动的动物的树突和树突棘活动进行稳定的观测。

本发明还提供一种微型双光子显微成像方法，所述微型双光子显微成像方法包括：

步骤1，选取待成像区域：固定活体样本，并利用台式TPM在所述活体样本上选取待成像区域。在步骤1中，需要采用如图6示出的成像平台，并在台式TPM模式下，也就是说利用台式TMP在活体样本上选取待成像区域，具体操作是：利用身体固定器固定活体样本，以通过台式TPM来确认活体样本头部的病毒感染的区域。

步骤2，采集荧光信号：将连接有激光输入光纤的微型探头安装在所述活体样本上，释放活体样本，以检测步骤1中选取的待成像区域输出的荧光信号，完成所述活体样本内部的组织平面的成像。步骤2具体操作如下：

首先，将本发明提供的微型探头2粘合到活体样本头部颅骨的支架上，该支架在开颅手术准备期间已经固定在活体样本头部的颅骨上，再用牙科水泥将微型探头2加固到活体样本头部颅骨的支架上。

然后，将1.5％低熔点琼脂糖覆盖到暴露的脑组织区域。该方法显著的抑制了探头和大脑之间的相对运动。为了实现随机存取中对大量神经元的染色，标记神经元的过程为：本发明用人工脑脊液(Sigma-Aldrich，中国上海；mM，125NaCl，4.5KCl，26NaHCO₃，1.25NaH₂PO₄，2CaCl₂，1MgCl₂，20葡萄糖，当用95％O₂和5％CO₂充盈时pH为7.4)覆盖暴露脑区。将50微克Cal-520AM(AAT Bioquest.CA，USA)溶解于4μlDMSO(含20％Pluronic F-127)中，并用人工稀释液(mM，150NaCl，2.5KCl，10Hepes,pH 7.432)稀释至500μM。使用2-3MΩ电阻的硼硅酸盐移液管，通过施加压力脉冲(1分钟，400毫巴)将Ca²⁺染料注射到初级视觉皮层的层2/3中。1小时后，将SR-101滴加到皮质表面以鉴定星形胶质细胞。将活体样本头部固定，并使用FIRM-TPM以随机存取模式进行成像。

最后，将活体样本从固定器上释放，并放入上述实施例的小动物成像系统的箱体3中，利用微型探头2对活体样本进行悬尾实验测试或滑落实验测试(圆柱形平，5cm²，5cm高)和社交行为(30×30cm²方形活动场地)。

步骤3，处理所述荧光信号，获取活体样本自由活动的三维图像。

在上述步骤之前,还包括如下步骤4,制作活体样本，具体包括：

步骤41，选取活体样本:在实验中使用C57BL/6野生型和Thy-1-GFP转基因活体样本(出生后8-16周)。所有程序均符合北京大学动物使用与护理委员会和实验动物护理评估和认证协会的标准，包括动物育种和实验操作。将Thy-1-GFP转基因活体样本麻醉并用0.9％盐水灌注，然后用4％多聚甲醛灌注，并取出脑。在4℃的4％多聚甲醛的PBS中固定过夜。

步骤42，用于活体脑皮质成像的切骨术：在这些实验中使用C57BL/6野生型活体样本。简言之，通过吸入纯O₂中的1-1.5％异氟烷将活体样本麻醉，并置于立体定位框架(68025，RWD，中国深圳)上。同时，使用加温板(37.5-38℃)保持活体样本的正常温度。在局部施用xylocaine并去除皮肤和肌肉之后，在目标皮层的中部用高速颅钻(尖端直径0.5mm)钻开小方形头窗(0.5×0.5mm²)。GCaMP-6f用重组AAV在钙调素依赖性激酶II(CaMK II)启动子(血清型2/9；>2×10¹³个基因组拷贝/ml，由宾夕法尼亚大学基因治疗程序载体核心产生)下表达。使用注射器(Nanoliter 2010，World Precision Instruments，Sarasota，USA)和玻璃微电极，在20分钟内将总量为0.5-0.8μl的AAV缓慢注射到活体样本的靶向皮质的2/3层(深度为130-400μm)。在表达3周后，用异氟烷麻醉活体样本，用氰基丙烯酸胶将自制的支架连接到颅骨上并用牙齿水泥加固。用颅钻在目标皮质上钻出小的方形头窗(2.5×2.5mm²)。小心地去除硬脑膜，将小型玻璃盖玻片(3.5×2.5mm²)放在开颅上。恢复一周后，然后每天训练活体样本适应头部固定30分钟，持续3天。在清醒的活体样本适应之后，操作步骤1和步骤2。

最后需要指出的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制。本领域的普通技术人员应当理解：可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (5)

1.一种微型双光子显微成像装置，其特征在于，包括：飞秒脉冲激光器，其用于产生波长为920纳米的激光；飞秒脉冲激光调制器，其用于接收所述飞3秒脉冲激光器输出的激光，并预啁啾补偿激光的脉冲展宽至其预设值，并输出；以及微型探头，所述微型探头包括：扫描成像部分，用于接收所述飞秒脉冲激光调制器输出的激光，该激光对活体样本内部的组织进行扫描，以激发所述活体样本产生荧光信号；和荧光输出光纤，其用于接收所述扫描成像部分输出的所述荧光信号，并进行输出，

所述飞秒脉冲激光调制器具有负色散光路和正色散光路，其中：所述负色散光路包括激光输入光纤，所述激光输入光纤用于将脉冲展宽预啁啾补偿好的激光传输给所述扫描成像部分；所述正色散光路位于所述飞秒脉冲激光器和所述负色散光路之间，用于补偿由所述激光输入光纤在传输激光过程中引起的负色散，

所述正色散光路包括：色散补偿元件,其临近所述飞秒脉冲激光器设置，用于补偿由所述激光输入光纤在传输激光过程中引起的负色散；和声光调制器，其用于接收经由所述色散补偿元件补偿后的激光，并调节激光强度，然后输出给所述扫描成像部分，

所述正色散光路还包括：分光组件，其临近所述激光输入光纤设置，用于接收经由所述声光调制器调节好强度的激光以及将该激光分成至少两束，并传输给所述激光输入光纤。

所述激光输入光纤的数量至少为两根，包括第一激光输入光纤和第二激光输入光纤；所述分光组件包括：偏振分束器，用于接收经由所述声光调制器调节好强度的激光以及将该激光分成至少两束，分别传输给所述第一激光输入光纤和第二激光输入光纤；第二半波片，其布置在所述偏振分束器和声光调制器之间，用于改变所述偏振分束器的分光比；第三反射镜，其布置在所述偏振分束器和第二半波片之间，用于反射激光，以调整激光的位置并投射到所述偏振分束器的入射面上；第一准直透镜，其布置在所述偏振分束器的第一出射面与所述第一激光输入光纤之间，用于接收所述偏振分束器输出的激光以及将激光耦合进所述第一激光输入光纤；第三半波片，其布置在所述偏振分束器的第一出射面与所述第一准直透镜之间，用于接收所述偏振分束器输出的激光，并调整激光偏振方向，使得激光耦合进所述第一激光输入光纤的效率最高；第四反射镜，其布置在所述偏振分束器的第二出射面与所述第二激光输入光纤之间，用于接收所述偏振分束器输出的激光，用于反射激光，以调整激光的位置并投射到所述第二激光输入光纤中；第二准直透镜，其布置在所述第四反射镜与所述第二激光输入光纤之间，用于接收所述偏振分束器输出的激光以及将激光耦合进所述第二激光输入光纤；第四半波片，其布置在所述第四反射镜与所述第二准直透镜之间，用于接收所述第四反射镜反射的激光，并调整激光偏振方向，使得激光耦合进所述第二激光输入光纤的效率最高。

2.如权利要求1所述的微型双光子显微成像装置，其特征在于，所述正色散光路还包括：激光方位调整组件，其设置在所述色散补偿元件与所述声光调制器之间，所述激光方位调整组件包括：第一半波片，用于接收经由所述色散补偿元件补偿后的激光，并调整激光偏振方向，以使得所述声光调制器的调制效率最高；第一反射镜，用于接收经由所述第一半波片的激光，并反射激光，以调整激光射入所述声光调制器的位置；和第二反射镜，用于接收经由所述第一反射镜的激光，并反射激光，以调整激光射入所述声光调制器的角度，并传输给所述声光调制器。

3.如权利要求1或2所述的微型双光子显微成像装置，其特征在于，所述扫描成像部分包括：微机电扫描仪，其用于通过转动改变激光入射角角度的方式将激光对所述活体样本内部的组织平面进行二维扫描；物镜，其用于将来自所述微机电扫描仪的激光会聚到所述活体样本内部，以激发所述活体样本产生所述荧光信号以及用于输出所述荧光信号；扫描透镜，其布置在所述微机电扫描仪和物镜之间的光路上，用于将所述微机电扫描仪二维扫描所产生的角度变化的激光转化成位置变化的激光；准直器，其布置在所述激光输入光纤与所述微机电扫描仪之间，用于准直来自所述激光输入光纤输出的激光以及减少不同频率激光之间的色差，以与所述扫描透镜共同匹配所述物镜的图像数值孔径；和双色镜，其设在所述扫描透镜和物镜之间，用于将激光和荧光信号分开以及输出所述荧光信号。

4.如权利要求3所述的微型双光子显微成像装置，其特征在于，所述荧光输出光纤由700-900根玻璃光纤熔接而成，且熔接的两个端部呈1.5mm直径的圆柱体；所述激光输入光纤为空心光子晶体光纤，其脉冲展宽表示为：

L_hc-920·D_hc-920(920nm)·Δλ

其中：L_hc-920是所述激光输入光纤的光路长度；D_hc-920(920nm)是由所述激光输入光纤传输波长为920nm的激光引起的色散参数，为75ps/nm/km；Δλ是激光的光谱宽度，不超过15nm。

5.一种活体样本行为成像系统，其特征在于，包括：微型双光子显微成像装置，其为如权利要求1至4中任一项所述的微型双光子显微成像装置；箱体，其为活体样本的自由移动提供限定空间；数据收集组件，其安装在所述箱体上，且输入端通过荧光输出光纤连接所述微型探头的输出端，用于收集所述微型探头输出的所述荧光信号；和线路安装组件，所述激光输入光纤和荧光输出光纤通过所述线路安装组件以能够相对于所述箱体随意转动的方式安装在所述箱体上。

Images