CN109724954B - 荧光收集装置、微型双光子显微镜及双光子成像方法 - Google Patents

Abstract

本发明实施例提供一种荧光收集装置、微型双光子显微镜及双光子成像方法，其中，上述荧光收集装置包括第一光路和第二光路，第一光路依次包括第一透镜、第一滤光片、二向色镜、红外滤光片和耦合透镜；第二光路依次包括耦合透镜、红外滤光片、二向色镜、第二滤光片和第二透镜。本发明实施例提供的荧光收集装置、微型双光子显微镜及双光子成像方法集成两路光路，通过选择滤光片和二向色镜、复用红外滤光片和耦合透镜，实现了不增加微型双光子显微探头重量和体积，但能够实现在自由活动的动物脑部同时进行光遗传操控和荧光信号收集，并实现不同形式的光遗传学刺激，进而实现不同光遗传学刺激下荧光信号的同步收集，操作简单、使用方便。

Description

荧光收集装置、微型双光子显微镜及双光子成像方法

技术领域

本发明实施例涉及双光子显微镜技术领域，尤其涉及一种集成光遗传操控的荧光收集装置、微型双光子显微镜以及基于微型双光子显微镜的神经元双光子成像方法。

背景技术

神经元是神经系统的结构和功能单位，有接受、整合和传递信息的功能。神经元按其功能可分为传入神经元(感觉神经元)、中间神经元(联络神经元)和传出神经元(运动神经元)三种。如果按照对后继神经元的影响来分类，则可分为兴奋性神经元和抑制性神经元。神经元作为神经系统的重要组成部分，一直是医学和生物学领域重要的研究课题。而对神经元活性的研究一般采用单光纤对动物脑部神经元进行观察或通过对神经元进行荧光成像的方法来获取神经元的活性信息，例如利用传统的台式双光子显微镜或微型单光子显微镜对动物脑部神经元进行观察成像。

利用单光纤对动物脑部神经元进行观察是直接通过导入激光光纤到动物脑部的特定脑区，开启激光光源对特定的光遗传蛋白进行照射(操控)来观察脑部神经元，优点是结构简单，但是这种方法不能精确的完成对单个神经元的光遗传学操控，且不能对相应的神经元进行成像；传统的台式双光子显微镜对动物脑部神经元进行观察成像时，由于传统的台式双光子显微镜体积很大，光遗传学光路集成在主镜体中，实验动物必须稳固的固定在显微物镜下或者在麻醉情况下放置显微物镜下，进行成像和光遗传学操控，如若使用传统的台式双光子显微镜来研究光遗传学操控下的小鼠自由运动，目前只能在小鼠下方安装跑步机，前方放置显示屏，通过虚拟现实的方式，模拟小鼠的运动。但是这种虚拟现实的方法招到很多科学家的质疑，认为这种方式和动物真正的运动和行为是很不一样的，并不能得到准确的神经元的活性信息。微型单光子显微镜可以戴在小鼠头上，在小鼠自由运动的状况下，对小鼠脑部神经区域的神经元进行观察成像，但由于微型单光子显微镜的对比度很差，无法清晰的看到神经树突、轴突甚至神经元胞体，且由于其佩戴在小鼠头上，受其体积限制，微型单光子显微镜中仅集成了用于荧光信号收集的荧光收集装置，无法同步完成光遗传操控和荧光信号收集。

因此，需要一种能够集成在微型显微镜上不增加显微镜体积的情况下，在自由运动小鼠上，同步完成光遗传操控和荧光信号收集的装置，且具有足够高的分辨率和成像对比度。

发明内容

针对背景技术中现有技术存在的缺陷，本发明实施例提供了一种集成光遗传操控的荧光收集装置、微型双光子显微镜以及基于微型双光子显微镜的神经元双光子成像方法。

第一方面，本发明实施例提供的一种集成光遗传操控的荧光收集装置，该荧光收集装置包括：

光遗传光源控制器、光遗传操控光源、第一光纤、第一光纤通用接口、第二光纤通用接口、光电倍增管以及在所述第一光纤通用接口和所述第二光纤通用接口之间的第一光路、在所述第二光纤通用接口和所述光电倍增管之间的第二光路，其中：

所述第一光路依次包括位于所述第一光纤通用接口和所述第二光纤通用接口之间的第一透镜、第一滤光片、二向色镜、红外滤光片以及耦合透镜；其中，所述第一光路，用于传导所述第一光纤传输的第一激光信号从所述第一光纤通用接口至所述第二光纤通用接口，所述第一激光信号为所述光遗传光源控制器控制所述光遗传操控光源发出的激光信号；

所述第二光路依次包括位于所述第二光纤通用接口和所述光电倍增管之间的所述耦合透镜、所述红外滤光片、二向色镜、第二滤光片以及第二透镜；其中所述第二光路，用于传导所述荧光收集装置收集到的双光子荧光信号从所述第二光纤通用接口至所述光电倍增管。

第二方面，本发明实施例提供的一种微型双光子显微镜，该微型双光子显微镜包括：

微型双光子显微镜探头、扫描控制器、飞秒脉冲激光器、光纤耦合模块以及本发明实施例第一方面提供的集成光遗传操控的荧光收集装置，所述荧光收集装置和所述光纤耦合模块均与所述微型双光子显微镜探头光纤通信连接，所述荧光收集装置和所述微型双光子显微镜探头均与所述扫描控制器电连接，其中：

所述飞秒脉冲激光器，用于输出第二激光信号至所述光纤耦合模块，其中，所述第二激光信号用于激发待测生命体脑部神经区域的荧光探针产生双光子荧光信号；

所述光纤耦合模块，用于耦合所述飞秒脉冲激光器输出的所述第二激光信号，并将所述第二激光信号传输至所述微型双光子显微镜探头；

所述微型双光子显微镜探头，用于接收所述荧光收集装置发送的所述第一激光信号，并输出所述第一激光信号至待测生命体脑部神经区域的光遗传蛋白，以及获取所述荧光探针激发后产生的所述双光子荧光信号，并输出所述双光子荧光信号至所述荧光收集装置，其中所述光遗传蛋白和所述荧光探针位于所述神经区域的同一位置；

所述荧光收集装置，用于输出所述第一激光信号至所述微型双光子显微镜探头，以及接收所述微型双光子显微镜探头传输的所述双光子荧光信号；

所述扫描控制器，用于控制所述微型双光子显微镜探头对所述第二激光信号进行扫描并激发所述荧光探针产生所述双光子荧光信号，以及获取所述荧光收集装置中所述光电倍增管转换所述双光子荧光信号得到的电信号，其中所述电信号用于生成反映神经元活性的钙离子图像。

第三方面，本发明实施例提供的一种基于本发明实施例第二方面提供的微型双光子显微镜的神经元双光子成像方法，该方法包括：

在待测生命体脑部神经区域的同一位置分别植入光遗传蛋白和荧光探针后，通过频率调制后的所述第一激光信号间歇式照射激活所述光遗传蛋白，引发所述位置的神经元的膜电位发生改变以及通过飞秒脉冲激光器发射的第二激光信号激发所述位置的所述神经元上的所述荧光探针，获取所述荧光探针被激发后产生的双光子荧光信号，其中所述生命体处于自由运动状态且所述生命体的脑部戴有所述微型双光子显微镜；

基于所述双光子荧光信号，获取反映所述神经元的膜电位变化的钙离子图像。

本发明实施例提供的集成光遗传操控的荧光收集装置、微型双光子显微镜及基于微型双光子显微镜的神经元双光子成像方法将两路光路进行集成化，通过对合适的滤光片和二向色镜选择，复用红外滤光片和耦合透镜，实现了不增加微型双光子显微探头的重量和体积，但能够同时进行光遗传操控和用于双光子神经元成像的荧光信号收集。最后通过给光遗传光源控制器输入不同的频率的信号，改变光遗传操控光源输出的激光序列，从而实现不同形式的光遗传学刺激，进而实现不同光遗传学刺激下荧光信号的同步收集，操作简单、使用方便。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例提供的集成光遗传操控的荧光收集装置结构示意图；

图2为本发明实施例提供的微型双光子显微镜结构示意图；

图3为本发明实施例提供的微型双光子显微镜工作原理示意图；

图4为本发明实施例提供的微型双光子显微镜系统示意图；

图5为本发明实施例提供的基于微型双光子显微镜的神经元双光子成像方法流程示意图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在研究生命体脑部神经区域的神经元的活性状态时，一般采用单光纤对动物脑部神经元进行观察或通过对神经元进行荧光成像的方法来获取神经元的活性信息，例如利用传统的台式双光子显微镜或微型单光子显微镜对动物脑部神经元进行观察成像。

但是单光纤对动物脑部神经元进行观察只能直接获得观察结果，并不能精确的对单个神经元进行光遗传学操控，更不能对神经元进行成像；传统的台式双光子显微镜虽然可以神经元进行成像，但是由于传统的台式双光子显微镜体积很大，光遗传学光路集成在主镜体中，实验动物必须固定在显微物镜下或者在麻醉情况下放置显微物镜下，无法完成对自由运动的动物的脑部神经元进行观察成像和光遗传学操控，虽然可以把小鼠安装在跑步机上模拟自由运动，但是这种方法招到很多科学家的质疑，认为这种方式和动物真正的运动和行为是很不一样的，并不能得到准确的神经元的活性信息。微型单光子显微镜可以戴在小鼠头上，在小鼠自由运动的状况下，对小鼠脑部神经区域的神经元进行观察成像，但由于微型单光子显微镜的对比度很差，无法清晰的看到神经树突、轴突甚至神经元胞体，且由于体积限制，微型单光子显微镜中仅集成了用于荧光信号收集的荧光收集装置，无法同步完成光遗传操控和荧光信号收集。

为了准确获取小鼠自由运动下，脑部神经区域神经元的成像信息，基于不增加微型显微镜体积的情况下，同步完成光遗传操控和荧光信号收集，本发明实施例提供了一种集成光遗传操控的荧光收集装置，图1为本发明实施例提供的集成光遗传操控的荧光收集装置结构示意图，如图1所示，该荧光收集装置包括：

光遗传光源控制器191、光遗传操控光源192、第一光纤、第一光纤通用接口193、第二光纤通用接口194、光电倍增管18以及在第一光纤通用接口193和第二光纤通用接口194之间的第一光路、在第二光纤通用接口194和光电倍增管18之间的第二光路，其中：

第一光路依次包括位于第一光纤通用接口193和第二光纤通用接口194之间的第一透镜、第一滤光片12、二向色镜15、红外滤光片13以及耦合透镜14；其中，第一光路，用于传导第一光纤传输的第一激光信号从第一光纤通用接口193至第二光纤通用接口194，第一激光信号为光遗传光源控制器191控制光遗传操控光源192发出的激光信号；

第二光路依次包括位于第二光纤通用接口194和光电倍增管18之间的耦合透镜14、红外滤光片13、二向色镜15、第二滤光片16以及第二透镜17；其中第二光路，用于传导荧光收集装置收集到的双光子荧光信号从第二光纤通用接口194至光电倍增管18。

具体地，本发明实施例提供的集成光遗传操控的荧光收集装置主要包括光遗传光源控制器191、光遗传操控光源192、第一光纤、第一光纤通用接口193、第二光纤通用接口194、光电倍增管18以及在第一光纤通用接口193和第二光纤通用接口194之间的第一光路、在第二光纤通用接口194和光电倍增管18之间的第二光路，其中光遗传光源控制器191控制光遗传操控光源192输出第一激光信号，经第一光纤接入光纤通用接口，第一激光信号在光纤出口经过25mm焦距的第一透镜，变成准直光，准直光经过与光遗传操控光源192相同波长的窄带滤光片即第一滤光片12后至二向色镜15上，二向色镜15将入射的第一激光信号进行反射，再通过红外滤波片和25mm焦距的耦合透镜14后，进入柔软的收集光纤束，柔软光纤束连接至所需要的设备中。荧光收集装置收集到的双光子荧光信号经耦合透镜14汇聚、红外滤光片13滤光、二向色镜15透射后经第二滤光片16滤光、第二透镜17汇聚，至光电倍增管18，即从光纤通用接口输出至耦合透镜14变成准直光，通过红外滤光片13滤除多余的红外激光，再通过二向色镜15至第二滤光片16上，最后透过25mm聚焦的第二透镜17收集至光电倍增管18(PMT)上，经光电倍增管18将双光子荧光信号转换为电信号，用于生成反映神经元活性状态的钙离子图像。

本发明实施例提供的集成光遗传操控的荧光收集装置将两路光路进行集成化，通过对合适的滤光片和二向色镜选择，复用红外滤光片和耦合透镜，实现了不增加微型双光子显微探头的重量和体积，但能够同时进行光遗传操控和用于双光子神经元成像的荧光信号收集。最后通过给光遗传光源控制器输入不同的频率的信号，改变光遗传操控光源输出的激光序列，从而实现不同形式的光遗传学刺激，进而实现不同光遗传学刺激下荧光信号的同步收集。

在上述各实施例的基础上，本发明实施例提供的集成光遗传操控的荧光收集装置中的光遗传操控光源具体为多种发出单一波长激光信号的激光光源或用于调制不同频率激光信号的调谐激光器。即本发明实施例提供的集成光遗传操控的荧光收集装置中的光遗传操控光源可以为多种发出单一波长激光信号的激光光源，也可以为调制不同频率激光信号的调谐激光器，其中，根据实验需要，基于第一光纤通用接口，可以更换输出单一波长激光信号的光遗传操控光源或通过调谐激光器输出需要特定频率的激光信号。

在上述各实施例的基础上，本发明实施例提供的集成光遗传操控的荧光收集装置中的第一滤光片和第二滤光片均为窄带滤光片。即第一滤光片和第二滤光片根据滤光需要选择为相应的窄带滤光片，第一滤光片可以选择为590±30nm或635±30nm的滤光片，第二滤光片可以选择为525nm±30nm的带通滤光片。

在上述各实施例的基础上，本发明实施例提供的集成光遗传操控的荧光收集装置中的二向色镜具体为反射第一激光信号，并透射双光子荧光信号的二向色镜。即本发明实施例提供的集成光遗传操控的荧光收集装置中的二向色镜用于反射第一激光信号，并透射双光子荧光信号，可根据光遗传操控激光波长和荧光波长，选择长通短反或者是短通长反，例如，当第一激光信号的波长为635nm、双光子荧光为525nm附件的绿色荧光时，二向色镜可选为对635nm反射，对525nm透射的二向色镜。这样就可以保证光遗传操控的激光信号通过二向色镜反射至柔软收集光纤，同样，收集的双光子荧光也可以透过二向色镜传输至光电倍增管。

在上述各实施例的基础上，本发明实施例提供的集成光遗传操控的荧光收集装置中的红外滤光片具体为滤除双光子荧光信号中的干扰激光信号，透射第一激光信号的红外滤光片。即本发明实施例提供的集成光遗传操控的荧光收集装置中的第一激光信号经红外滤光片透射后，通过耦合透镜进行汇聚；荧光收集装置收集的双光子荧光信号经红外滤光片后滤除掉其中的干扰激光信号，一般该干扰激光信号的波长大于第一激光信号。因此，该红外滤光片可以选择透射波长大于第一激光信号小于干扰激光信号的红外滤光片。

本发明实施例还提供了一种微型双光子显微镜，图2为本发明实施例提供的微型双光子显微镜结构示意图，如图2所示，该微型双光子显微镜包括：

微型双光子显微镜探头23、扫描控制器25、飞秒脉冲激光器21、光纤耦合模块22以及上述各实施例提供的集成光遗传操控的荧光收集装置24，荧光收集装置24和光纤耦合模块22均与微型双光子显微镜探头23光纤通信连接，荧光收集装置24和微型双光子显微镜探头23均与扫描控制器25电连接，其中：

飞秒脉冲激光器21，用于输出第二激光信号至光纤耦合模块22，其中，第二激光信号用于激发待测生命体脑部神经区域的荧光探针产生双光子荧光信号；

光纤耦合模块22，用于耦合飞秒脉冲激光器21输出的第二激光信号，并将第二激光信号传输至微型双光子显微镜探头23；

微型双光子显微镜探头23，用于接收荧光收集装置24发送的第一激光信号，并输出第一激光信号至待测生命体脑部神经区域的光遗传蛋白，以及获取荧光探针激发后产生的双光子荧光信号，并输出双光子荧光信号至荧光收集装置24，其中光遗传蛋白和荧光探针位于神经区域的同一位置；

荧光收集装置24，用于输出第一激光信号至微型双光子显微镜探头23，以及接收微型双光子显微镜探头23传输的双光子荧光信号；

扫描控制器25，用于控制微型双光子显微镜探头23对第二激光信号进行扫描并激发荧光探针产生双光子荧光信号，以及获取荧光收集装置24中光电倍增管转换双光子荧光信号得到的电信号，其中电信号用于生成反映神经元活性的钙离子图像。

具体地，本发明实施例提供的微型双光子显微镜包括微型双光子显微镜探头23、扫描控制器25、飞秒脉冲激光器21、光纤耦合模块22以及集成光遗传操控的荧光收集装置24，其中，扫描控制器25可通过电缆与微型双光子显微镜探头23电连接，荧光收集装置24中的光遗传光源控制器调控光遗传操控光源输出特定频率的第一激光信号，用于激活待测生命体脑部神经区域的光遗传蛋白，该光遗传蛋白引发神经元的膜电位发生改变，引诱神经元进入兴奋或抑制状态；飞秒脉冲激光器21输出用于激发神经元上的荧光探针的第二激光信号，扫描控制器25控制微型双光子显微镜探头23对第二激光信号进行扫描并激发荧光探针产生双光子荧光信号，该双光子荧光信号被荧光收集装置24收集后，经光电倍增管转换为电信号，用于生成反映神经元活性状态的钙离子图像，其中，光遗传蛋白和荧光探针位于神经区域的同一位置，如此，在同一区域、同时刺激与记录生命体脑部神经元的动态变化，既能得到高分辨率、高信噪比的稳定图像，同时能对特定神经元进行光遗传学操控，进而，实现在对神经元进行光遗传学操控，调控其兴奋或抑制状态下，准确获取反映其活性状态的钙离子图像，其中，微型双光子显微镜的成像分辨率为650nm，成像速度26Hz(256*256像素)。

其中，关于光敏感蛋白和滤光片的具体选择为：目前神经元钙成像中使用最多的是Gcamp6绿色荧光蛋白，使用920nm的飞秒脉冲激光激发后产生525nm附近的绿色荧光，因此在使用此类绿色荧光蛋白成像时，第二滤光片应该选用525nm±30nm的带通滤光片。此时，光遗传蛋白应该选择远离525nm的，比如选择对590nm、635nm敏感的光遗传蛋白，这样在光遗传光源控制器中对光遗传操控光源的选择，也应该选择对应光遗传蛋白所需要的波长(590nm或635nm)的光源。第一滤光片应该选择和频率调制后的激光波长一致的窄带滤光片，保证输出激光确定在此波段内，无其余杂光。

本发明实施例提供的微型双光子显微镜采用集成光遗传操控的荧光收集装置，在不增加微型双光子显微探头的重量和体积的情况下，实现在同一区域、同时刺激与记录生命体脑部神经元的动态变化，既能得到高分辨率、高信噪比的稳定图像，同时能对特定神经元进行光遗传学操控，进而，实现在对神经元进行光遗传学操控，调控其兴奋或抑制状态下，同步准确获取反映其活性状态的钙离子图像，且具有足够高的分辨率和成像对比度，能在自由运动的小鼠头上清晰的看到神经树突、轴突和神经元胞体，且同步完成光遗传操控和荧光信号收集。

在上述各实施例的基础上，本发明实施例提供的微型双光子显微镜，还包括复用光纤，其中：

复用光纤，用于在微型双光子显微镜探头和荧光收集装置之间传输第一激光信号和双光子荧光信号。即本发明实施例提供的微型双光子显微镜还包括微型双光子显微镜探头和荧光收集装置之间的复用光纤，通过该复用光纤实现微型双光子显微镜探头和荧光收集装置之间第一激光信号和双光子荧光信号的双向传输，传导第一激光信号对光遗传蛋白进行激活，进而在使用一根光纤的情况下，实现微型双光子显微镜探头和荧光收集装置之间的信号传输，节省了微型双光子显微镜制作成本、体积和重量。

在上述各实施例的基础上，本发明实施例提供的微型双光子显微镜，还包括控制器通用控制接口，控制器通用控制接口设置在光遗传光源控制器上，其中：

扫描控制器通过控制器通用控制接口控制光遗传光源控制器输出频率调制后的第一激光信号。即本发明实施例提供的微型双光子显微镜还包括控制器通用控制接口，扫描控制器通过控制器通用控制接口控制光遗传光源控制器输出频率调制后的第一激光信号。

在上述各实施例的基础上，本发明实施例提供的微型双光子显微镜中的飞秒脉冲激光器具体为920nm飞秒脉冲激光器或1030nm飞秒脉冲激光器。即本发明实施例提供的微型双光子显微镜中的飞秒脉冲激光器可以根据不同的荧光探针选择不同的飞秒脉冲激光器，其中包括920nm飞秒脉冲激光器和1030nm飞秒脉冲激光器，一般利用920nm的飞秒脉冲激光器激发钙成像指示剂Gcamp6，获得双光子荧光信号，红色荧光蛋白mCherry和绿色荧光蛋白GFP也可以用920nm的飞秒激光激发，红色荧光蛋白RFP和红色荧光蛋白tdTomato使用1030nm的飞秒脉冲激光器激发。

在上述各实施例的基础上，本发明实施例提供的微型双光子显微镜中的扫描控制器，用于控制微型双光子显微镜探头对第二激光信号进行扫描具体为：

扫描控制器控制微型双光子显微镜探头中的微机电扫描振镜对第二激光信号进行扫描。即本发明实施例提供的微型双光子显微镜中的扫描控制器在控制微型双光子显微镜探头对第二激光信号进行扫描，来激发荧光探针时，是控制微型双光子显微镜探头中的微机电扫描振镜对第二激光信号进行扫描，从而实现的荧光探针激发，产生双光子荧光信号。

其中，图3为本发明实施例提供的微型双光子显微镜工作原理示意图，如图3所示，微型双光子显微镜工作原理为：

步骤30、扫描控制器调控荧光收集装置输出频率调制后的第一激光信号；

步骤31、荧光收集装置输出上述第一激光信号至微型双光子显微镜探头，用于激活光遗传蛋白；

步骤32、飞秒脉冲激光器输出第二激光信号至光纤耦合模块；

步骤33、光纤耦合模块接收到的第二激光信号经光纤耦合模块耦合后，传输至微型双光子显微镜探头，用于激发荧光探针；

步骤34、扫描控制器控制微型双光子显微镜探头中的微机电扫描振镜对光纤耦合后的第二激光信号进行扫描并激发荧光探针产生双光子荧光信号；

步骤35、微型双光子显微镜探头传输获取的双光子荧光信号至荧光收集装置；

步骤36、扫描控制器获取荧光收集装置中光电倍增管转换双光子荧光信号得到的电信号；

步骤37、扫描控制器传输获得的电信号至计算机，生成用于反映神经元活性信息的钙离子图像。

其中，图4为本发明实施例提供的荧光收集装置与微型双光子显微镜探头连接示意图，如图4所示，微型双光子显微镜探头47与荧光收集装置通过复用光纤48相连接，其中，荧光收集装置集成有光遗传光源控制器41、光遗传操控光源42、第一透镜43、耦合透镜44、滤光片组45和光电倍增管46，其中滤光片组45包括第一滤光、第二滤光片以及二向色镜，其中在第二滤光片上方设置有第二透镜。

为了实现准确获取生命体神经元活性状态，基于光遗传学和双光子成像，本发明实施例提供了一种基于上述实施例中微型双光子显微镜的神经元双光子成像方法，图5为本发明实施例提供的基于微型双光子显微镜的神经元双光子成像方法流程示意图，如图5所示，该方法包括：

步骤50、在待测生命体脑部神经区域的同一位置分别植入光遗传蛋白和荧光探针后，通过频率调制后的所述第一激光信号间歇式照射激活所述光遗传蛋白，引发所述位置的神经元的膜电位发生改变以及通过飞秒脉冲激光器发射的第二激光信号激发所述位置的所述神经元上的所述荧光探针，获取所述荧光探针被激发后产生的双光子荧光信号，其中所述生命体处于自由运动状态且所述生命体的脑部戴有所述微型双光子显微镜；

步骤51、基于双光子荧光信号，获取反映神经元的膜电位变化的钙离子图像。

具体地，本发明实施例提供的基于双光子显微镜的神经元双光子成像方法采用在自由运动状态下的待测生命体脑部神经区域的同一位置分别植入光遗传蛋白和荧光探针后，通过频率调制后的第一激光信号间歇式照射激活光遗传蛋白，引发位置的神经元的膜电位发生改变以及通过飞秒脉冲激光器发射的第二激光信号激发位置的神经元上的荧光探针，获取荧光探针被激发后产生的双光子荧光信号，其中待测生命体的脑部戴有所述微型双光子显微镜。其中，光遗传蛋白用于引发位置的神经元的膜电位发生改变，进而，引诱光遗传蛋白所在位置处的神经元进入兴奋或抑制状态，荧光探针用于被瞬时高功率的脉冲飞秒激光激发后产生双光子荧光信号，其中，光遗传蛋白和荧光探针被植入在脑部神经区域的同一位置，即同一神经元上，而处于同一位置的荧光探针被飞秒脉冲激光器发射的激光信号激发产生双光子荧光信号，该双光子荧光信号通过钙离子成像的方式能够反映上述光遗传蛋白位置处的神经元膜电位变化中体现出来的活性信息，其中，微型双光子显微镜的成像分辨率为650nm，成像速度26Hz(256*256像素)。

本发明实施例提供的基于双光子显微镜的神经元双光子成像方法采用在待测生命体脑部神经区域的同一位置分别植入光遗传蛋白和荧光探针后，通过频率调制后的第一激光信号间歇式照射激活光遗传蛋白，引发位置的神经元的膜电位发生改变以及通过飞秒脉冲激光器发射的第二激光信号激发位置的神经元上的荧光探针，获取荧光探针被激发后产生的双光子荧光信号，用于获取能够反映神经元膜电位变化以及活性信息的钙离子图像，如此实现了在自由运动小鼠大脑上实现光遗传学和高时空分辨的荧光成像。在不增加微型双光子显微镜主体本身重量和复杂性的同时，首次在自由运动待测生命体上实现了光遗传学与微型双光子荧光成像在同一区域、同时刺激与记录小鼠大脑神经元的动态变化，既能得到高分辨率、高信噪比的稳定图像，同时能对特定神经元进行光遗传学操控，为神经科学家提供了又一利器，从而准确、及时获取要观察的神经元的活性信息，方法简单、操作方便。

在上述各实施例的基础上，本发明实施例提供的基于双光子显微镜的神经元双光子成像方法中的通过频率调制后的第一激光信号间歇式照射激活光遗传蛋白，引发位置的神经元的膜电位发生改变具体为：

通过调制后的不同频率的第一激光信号激活与第一激光信号相对应的光遗传蛋白，引发神经元的膜电位发生相应改变，其中，光遗传蛋白为多种不同类型的光遗传蛋白。即在待测生命体脑部神经区域植入多种光遗传蛋白，并通过调制后的不同频率的第一激光信号激活与第一激光信号相对应的光遗传蛋白，引发神经元的膜电位发生相应的不同变化。其中，一种光遗传蛋白在特定频率激光信号的刺激下激活后，会改变细胞膜电位即膜电压的变化，如膜的去极化与超极化。当膜电压去极化超过一定阈值时就会诱发神经元产生可传导的电信号，即神经元的激活；相反，当膜电压超极化到一定水平时，就会抑制神经元动作电位的产生，即神经元的抑制。因此当在测生命体脑部神经区域植入多种光遗传蛋白后，可以通过不同频率、不同颜色的激光信号来激活不同类型的光遗传蛋白，从而实现神经元膜电位发生相应改变，引诱调控神经元进入兴奋或抑制状态，进而，更加方便的获取该神经元兴奋或抑制等不同状态下的反映膜电位变化的钙离子图像，来获得该神经元更加准确的活性信息。

在上述各实施例的基础上，本发明实施例提供的基于双光子显微镜的神经元双光子成像方法中的通过频率调制后的第一激光信号间歇式照射激活光遗传蛋白，引发位置的神经元的膜电位发生改变以及通过飞秒脉冲激光器发射的第二激光信号激发位置的神经元上的荧光探针包括：

通过频率调制后的第一激光信号间歇式照射激活光遗传蛋白，引发位置的神经元的膜电位发生改变后，通过飞秒脉冲激光器发射的第二激光信号激发位置的神经元上的荧光探针，或，

通过频率调制后的第一激光信号间歇式照射激活光遗传蛋白，引发位置的神经元的膜电位发生改变的同时，通过飞秒脉冲激光器发射的第二激光信号激发位置的神经元上的荧光探针。即本发明实施例提供的基于双光子显微镜的神经元双光子成像方法中的步骤通过频率调制后的激光信号间歇式照射激活光遗传蛋白，获取由光遗传蛋白引发的位置的神经元的兴奋或抑制状态和步骤通过飞秒脉冲激光器发射的激光信号激发位置的神经元上的荧光探针，获取荧光探针被激发后产生的双光子荧光信号在整个方法中可以同时进行，也可以通过频率调制后的激光信号间歇式照射激活光遗传蛋白，获取由光遗传蛋白引发的位置的神经元的兴奋或抑制状态在先，当通过飞秒脉冲激光器发射的激光信号激发位置的神经元上的荧光探针，获取荧光探针被激发后产生的双光子荧光信号在后，如此，便可以实现获取神经元在被操控处于兴奋或抑制状态下的活性信息。

在上述各实施例的基础上，本发明实施例提供的基于双光子显微镜的神经元双光子成像方法，还包括：

基于钙离子图像，获取神经元的活性信息。即本发明实施例提供的基于双光子显微镜的神经元双光子成像方法获得的钙离子图像能够反映该神经元在兴奋或抑制状态下的活性状态，从而获得相应的活性信息。

在上述各实施例的基础上，本发明实施例提供的基于双光子显微镜的神经元双光子成像方法，还包括：

通过对激光信号进行方波调制，获得具有方波频率的第一激光信号。即本发明实施例提供的基于双光子显微镜的神经元双光子成像方法中的用于照射光遗传蛋白的第一激光信号，是通过方波调制的方式进行激光调制获得的特定频率的激光信号，其中，黄色或绿色激光均可，激光颜色不加限制，即通过控制光遗传激光器的控制器驱动光遗传激光信号，输入一个特定频率的方波，输出的光遗传激光信号即被调制成这个频率。

在上述各实施例的基础上，本发明实施例提供的基于双光子显微镜的神经元双光子成像方法中的引发位置的神经元的膜电位发生改变具体为：

引发位置相关区域的多个神经元的膜电位发生改变，其中区域为基于微型双光子显微镜视野下的以光遗传蛋白为中心的450*450μm或200*200μm的面积区域。即本发明实施例提供的基于双光子显微镜的神经元双光子成像方法中的通过光遗传蛋白引发膜电位发生改变，引诱进入兴奋或抑制状态的神经元并不是单一的，而是以光遗传蛋白的位置为中心的一个区域，该区域的大小，以微型双光子显微镜视野为准，当微型双光子显微镜视野为200*200μm的面积区域时，光遗传蛋白便引发200*200μm面积内的神经元的膜电位发生改变，引诱200*200μm面积内的神经元进入兴奋或抑制状态，当微型双光子显微镜视野为450*450μm的面积区域时，光遗传蛋白便引发450*450μm面积内的神经元的膜电位发生改变，引诱450*450μm面积内的神经元进入兴奋或抑制状态，从而获取该区域范围内的神经元的活性信息。

在上述各实施例的基础上，本发明实施例提供的基于双光子显微镜的神经元双光子成像方法中的在基于双光子荧光信号，获取反映神经元的膜电位变化的钙离子图像前，还包括：

通过滤光片滤除荧光探针被激发后产生的双光子荧光信号中的二次谐波信号。即本发明实施例提供的基于双光子显微镜的神经元双光子成像方法获得的荧光探针被激发后产生的双光子荧光信号会有微弱的二次谐波信号，因此在通过双光子荧光信号，获取神经元的钙离子图像前，利用相应的滤光片将上述二次谐波信号滤出，来获得更加清楚准确的钙离子图像。

在上述各实施例的基础上，本发明实施例提供的基于双光子显微镜的神经元双光子成像方法中的荧光探针为钙成像指示剂Gcamp6、红色荧光蛋白mCherry、红色荧光蛋白RFP、红色荧光蛋白tdTomato和绿色荧光蛋白GFP中的至少一种。即本发明实施例提供的基于双光子显微镜的神经元双光子成像方法中用到的荧光探针可以为多种，选用其中一种或多种均可，其中该荧光探针可以为钙成像指示剂Gcamp6、红色荧光蛋白mCherry、红色荧光蛋白RFP、红色荧光蛋白tdTomato和绿色荧光蛋白GFP，其中，钙成像指示剂Gcamp6最为常用，利用920nm的飞秒脉冲激光器激发该钙成像指示剂Gcamp6即可，获得双光子荧光信号，红色荧光蛋白mCherry和绿色荧光蛋白GFP也可以用920nm的飞秒激光激发，红色荧光蛋白RFP和红色荧光蛋白tdTomato使用1030nm的飞秒脉冲激光器激发。

在上述各实施例的基础上，本发明实施例提供的基于双光子显微镜的神经元双光子成像方法，还包括：

在待测生命体脑部神经区域的同一位置植入与标定的神经元相对应的光遗传蛋白和荧光探针，以获取标定的神经元对应的钙离子图像。即本发明实施例提供的基于双光子显微镜的神经元双光子成像方法在待测生命体脑部神经区域植入的光遗传蛋白和荧光探针可以事先选择特定的光遗传蛋白和荧光探针，而这些光遗传蛋白和荧光探针可以用于获取标定的需要研究的神经元的活性信息。即植入能够获取标定的需要研究的神经元的活性信息的光遗传蛋白和荧光探针，从而使得实验更加方便、有效。

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

以上所描述的装置实施例仅仅是示意性的，其中作为分离部件说明的单元可以是或者也可以不是物理上分开的，作为单元显示的部件可以是或者也可以不是物理单元，即可以位于一个地方，或者也可以分布到多个网络单元上。可以根据实际的需要选择其中的部分或者全部模块来实现本实施例方案的目的。本领域普通技术人员在不付出创造性的劳动的情况下，即可以理解并实施。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种集成光遗传操控的荧光收集装置，其特征在于，包括：

光遗传光源控制器、光遗传操控光源、第一光纤、第一光纤通用接口、第二光纤通用接口、光电倍增管以及在所述第一光纤通用接口和所述第二光纤通用接口之间的第一光路、在所述第二光纤通用接口和所述光电倍增管之间的第二光路，其中：

所述第一光路依次包括位于所述第一光纤通用接口和所述第二光纤通用接口之间的第一透镜、第一滤光片、二向色镜、红外滤光片以及耦合透镜；其中，所述第一光路，用于传导所述第一光纤传输的第一激光信号从所述第一光纤通用接口至所述第二光纤通用接口，所述第一激光信号为所述光遗传光源控制器控制所述光遗传操控光源发出的激光信号；

所述第二光路依次包括位于所述第二光纤通用接口和所述光电倍增管之间的所述耦合透镜、所述红外滤光片、二向色镜、第二滤光片以及第二透镜；其中所述第二光路，用于传导所述荧光收集装置收集到的双光子荧光信号从所述第二光纤通用接口至所述光电倍增管。

2.根据权利要求1所述的集成光遗传操控的荧光收集装置，其特征在于，所述光遗传操控光源具体为多种发出单一波长激光信号的激光光源或用于调制不同频率激光信号的调谐激光器。

3.一种微型双光子显微镜，其特征在于，包括：

微型双光子显微镜探头、扫描控制器、飞秒脉冲激光器、光纤耦合模块以及权利要求1或2所述的集成光遗传操控的荧光收集装置，所述荧光收集装置和所述光纤耦合模块均与所述微型双光子显微镜探头光纤通信连接，所述荧光收集装置和所述微型双光子显微镜探头均与所述扫描控制器电连接，其中：

所述飞秒脉冲激光器，用于输出第二激光信号至所述光纤耦合模块，其中，所述第二激光信号用于激发待测生命体脑部神经区域的荧光探针产生双光子荧光信号；

所述光纤耦合模块，用于耦合所述飞秒脉冲激光器输出的所述第二激光信号，并将所述第二激光信号传输至所述微型双光子显微镜探头；

所述微型双光子显微镜探头，用于接收所述荧光收集装置发送的所述第一激光信号，并输出所述第一激光信号至待测生命体脑部神经区域的光遗传蛋白，以及获取荧光探针激发后产生的所述双光子荧光信号，并输出所述双光子荧光信号至所述荧光收集装置，其中所述光遗传蛋白和所述荧光探针位于所述神经区域的同一位置；

所述荧光收集装置，用于输出所述第一激光信号至所述微型双光子显微镜探头，以及接收所述微型双光子显微镜探头传输的所述双光子荧光信号；

所述扫描控制器，用于控制所述微型双光子显微镜探头对所述第二激光信号进行扫描并激发所述荧光探针产生所述双光子荧光信号，以及获取所述荧光收集装置中所述光电倍增管转换所述双光子荧光信号得到的电信号，其中所述电信号用于生成反映神经元活性的钙离子图像。

4.根据权利要求3所述的微型双光子显微镜，其特征在于，还包括复用光纤，其中：

所述复用光纤，用于在所述微型双光子显微镜探头和所述荧光收集装置之间传输所述第一激光信号和所述双光子荧光信号。

5.根据权利要求3所述的微型双光子显微镜，其特征在于，还包括控制器通用控制接口，所述控制器通用控制接口设置在所述光遗传光源控制器上，其中：

所述扫描控制器通过所述控制器通用控制接口控制所述光遗传光源控制器输出频率调制后的所述第一激光信号。

6.一种基于权利要求3-5任一项所述的微型双光子显微镜的神经元双光子成像方法，其特征在于，包括：

在待测生命体脑部神经区域的同一位置分别植入光遗传蛋白和荧光探针后，通过频率调制后的所述第一激光信号间歇式照射激活所述光遗传蛋白，引发所述位置的神经元的膜电位发生改变以及通过飞秒脉冲激光器发射的第二激光信号激发所述位置的所述神经元上的所述荧光探针，获取所述荧光探针被激发后产生的双光子荧光信号，其中所述生命体处于自由运动状态且所述生命体的脑部戴有所述微型双光子显微镜；

基于所述双光子荧光信号，获取反映所述神经元的膜电位变化的钙离子图像。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述通过频率调制后的所述第一激光信号间歇式照射激活所述光遗传蛋白，引发所述位置的神经元的膜电位发生改变具体为：

通过调制后的不同频率的所述第一激光信号激活与所述第一激光信号相对应的所述光遗传蛋白，引发所述神经元的膜电位发生相应改变，其中，所述光遗传蛋白为多种不同类型的光遗传蛋白。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述通过频率调制后的第一激光信号间歇式照射激活所述光遗传蛋白，引发所述位置的神经元的膜电位发生改变以及通过飞秒脉冲激光器发射的第二激光信号激发所述位置的所述神经元上的所述荧光探针包括：

通过频率调制后的第一激光信号间歇式照射激活所述光遗传蛋白，引发所述位置的神经元的膜电位发生改变后，通过飞秒脉冲激光器发射的第二激光信号激发所述位置的所述神经元上的所述荧光探针，或，

通过频率调制后的第一激光信号间歇式照射激活所述光遗传蛋白，引发所述位置的神经元的膜电位发生改变的同时，通过飞秒脉冲激光器发射的第二激光信号激发所述位置的所述神经元上的所述荧光探针。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述引发所述位置的神经元的膜电位发生改变具体为：

引发所述位置相关区域的多个神经元的膜电位发生改变，其中所述区域为基于微型双光子显微镜视野下的以所述光遗传蛋白为中心的450*450μm或200*200μm的面积区域。

10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，还包括：

在待测生命体脑部神经区域的同一所述位置植入与标定的神经元相对应的光遗传蛋白和荧光探针，以获取标定的所述神经元对应的钙离子图像。

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