CN111678895B - 一种近红外双光子、三光子多色光光学成像系统和方法 - Google Patents

一种近红外双光子、三光子多色光光学成像系统和方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种近红外双光子、三光子多色光光学成像系统和方法，所述系统包括激光光源模块、激光扫描和样品照射模块、并行荧光信号探测模块、数据分析模块。所述方法包括采用第一、第三成像波长窗口的双波长激光器作为光源；采用扫描振镜、透镜、物镜对样品上进行二维或三维的高分辨率、大深度扫描；待测样品通过双波长激发分别产生双光子和三光子荧光；通过二色镜、滤波片的相互配合，使用光电倍增管分别采集两种荧光波长信息，并通过数据分析实现近红外双光子、三光子多色光的光学成像。本发明为多模态光学成像领域，应用于生物体内近红外双光子、三光子多色光光学成像研究。

Description

一种近红外双光子、三光子多色光光学成像系统和方法
技术领域
本发明涉及多模态光学成像领域，具体涉及一种近红外双光子、三光子多色光光学成像系统和方法。
背景技术
双光子成像技术具有高分辨率、高成像深度等特点，可提高成像的信噪比和分辨率。目前，受荧光蛋白和神经科学发展的推动，第一波长窗口的双光子非线性成像技术已被广泛应用于各种生物光学成像研究中，2018年Fellin课题组利用光刺激技术结合920nm双光子系统，对小鼠视神经中的光敏蛋白进行刺激成像，研究了神经元特定集合中的活动模式如何决定大脑功能和动物行为。(A.Forli,D.Vecchia,N.Binini,F.Succol,S.Bovetti,C.Moretti,F.Nespoli,M.Mahn,C.A.Baker,M.M.Bolton,O.Yizhar and T.Fellin,CellReports 22(11),3087-3098(2018).)2019年Inoue课题组利用920nm双光子显微镜研究了小鼠的星型胶质细胞对血脑屏障的作用。(H.Kubotera,H.Ikeshima-Kataoka,Y.Hatashita,A.L.Allegra Mascaro,F.S.Pavone and T.Inoue,Scientific Reports 9(1),1263(2019).)。第三波长窗口的飞秒激光理论上可以通过三光子吸收激发荧光标记物，并实现深层组织的高分辨率光学成像。特别是在大脑成像方面，第三波长窗口能提供最佳的成像深度和对比度。Horton等人于2013年所报道的基于SSFS技术的1675nm光源的三光子显微镜，对小鼠脑部组织实现深度达1.4mm的成像。(N.G.Horton,K.Wang,D.Kobat,C.G.Clark,F.W.Wise,C.B.Schaffer and C.Xu,Nature Photonics 7(3),205-209(2013).)Rowlands等人于2017年基于时间聚焦激光脉冲，使用光学参量放大(OPA)技术得到1300nm的激光对特定区域的同时照明，实现三光子宽场成像。(C.J.Rowlands,D.Park,O.T.Bruns,K.D.Piatkevich,D.Fukumura,R.K.Jain,M.G.Bawendi,E.S.Boyden andP.T.C.So,Light:Science&Applications 6(5),e16255-e16255(2017).)
尽管双光子成像技术和三光子成像技术都获得了一定程度的发展，但光学成像系统的成像深度和分辨率均还有待提高，并且单一衬度的光学成像技术存在一定的缺陷和信号盲区，特别是在复杂生物组织中，不同组织成分的生物形态和特性往往要通过不同的衬度来显现。实现近红外双光子、三光子多色光的非线性光学成像能更加全面掌握生物组织及其网络间的内在联系和协同作用，有助于更加精确地分析生物医学问题，尤其推动前沿大脑神经网络的探索。因此，结合双光子和三光子激发的多波长、多模态的非线性光学显微技术将为生物医学诊断提供更加全面的技术支持。然而，受限于生物显微成像系统无法兼容多个波长窗口，特别是第一、第三波长窗口，此类技术还没有得到深入研究。
本发明所提出的一种近红外双光子、三光子多色光光学成像系统和方法就将为上述问题提出解决方案。这是一套兼容两种波长窗口的高分辨率、大成像深度的非线性光学显微系统，以实现近红外双光子、三光子多色光光学研究。可实现深层、实时光学诊断，特别是在具有复杂结构的脑部神经元领域具有广泛应用，并可推动生物医学以及其他领域的研究的发展。
发明内容
本发明针对近红外双光子、三光子多色光生物成像等领域对生物显微成像系统的要求，提出了一种近红外双光子、三光子多色光光学成像系统和方法。本发明为多模态光学成像领域，为一套兼容两种波长窗口的高分辨率、大成像深度的非线性光学显微系统，应用于生物体内近红外双光子、三光子多色光光学成像研究。
本发明至少通过如下技术方案之一实现。
一种近红外双光子、三光子多色光学成像系统，包括激光光源模块、激光扫描和样品照射模块、并行荧光信号探测模块、数据分析模块；
所述激光扫描和样品照射模块依序包含扫描振镜、第一透镜、第二透镜、第一二色镜、物镜和样品；所述激光光源模块向扫描振镜发射激发光；
所述并行荧光信号探测模块包括第二二色镜、第三透镜、第一光电倍增管滤波片、第四透镜和第二光电倍增管；
所述并行荧光信号探测模块包括双光子荧光信号探测光路和三光子荧光信号探测光路；
所述双光子荧光信号探测光路的路径依序经过第二二色镜、样品、物镜、所述第一二色镜、第三透镜、第一光电倍增管；
所述三光子荧光信号探测光路的路径依序经过样品、第二二色镜、滤波片、第四透镜、第二光电倍增管；所述样品位于所述第二二色镜的上表面；
所述第一光电倍增管第二光电倍增管均和数据分析模块连接。
进一步地，所述激光光源模块为双波长脉冲激光器。
进一步地，所述双波长脉冲激光器发出两种不同生物成像波长窗口的激发光，分别为第一波长窗口和第三波长窗口。
进一步地，所述第一波长窗口大小为650～950nm；第三波长窗口大小为1600～1870nm。
进一步地，所述数据分析模块将电信号进行电流电压转换，最终实现并行多通道数据实时采集和分析，数据分析模块包括数据采集卡，并通过优化算法程序的方法对数据进行分析，以得到具有高对比度的多衬度生物图像。
进一步地，所述第一透镜和所述第二透镜对光束进行准直以防止扩束。
进一步地，所述第一光电倍增管和所述第二光电倍增管将光信号转换为电信号，所述第一光电倍增管和所述第二光电倍增管用雪崩二极管、电子倍增CCD相机或者科研级CMOS相机来代替。
所述的一种近红外双光子、三光子多色光光学成像系统的方法，包括以下步骤：
S1、所述双波长脉冲激光器向扫描振镜输出第一波长窗口和第三波长窗口的激光作为成像系统的激发光；
S2、通过扫描振镜确定扫描位置，再利用第一透镜和第二透镜对光束进行调整以防止扩束，之后通过所述物镜将光束聚焦到样品上；两个波长窗口的激光同时对样品进行荧光激发，其中第一波长窗口的激光照射样品实现双光子荧光激发，第三波长窗口的激光照射样品实现三光子荧光激发；
S3、双光子荧光通过第二二色镜反射，反射光依次经过样品、物镜和第一二色镜，再由第一二色镜反射到第三透镜中，第三透镜使光束汇聚进第一光电倍增管中将荧光信号转换为电信号；
S4、三光子荧光先通过第二二色镜透射后，再经滤波片滤除剩余的第一波长窗口和第三波长窗口的激发光，最后通过第四透镜使光束汇聚进第二光电倍增管中将荧光信号转换为电信号；
S5、最终通过数据分析模块对第一光电倍增管和第二光电倍增管得到的两个电信号同时进行电流电压转换，对数据进行分析得到生物图像。
进一步地，所述双光子荧光和三光子荧光经过所述数据分析模块得到样品不同的特定深度和组织的成像信息，数据分析模块对两种荧光的信息并行处理，得到近红外双光子、三光子多色光的样品成像图。
进一步地，所述第一二色镜对所述第一波长窗口激发光和所述第三波长窗口激发光透射，对所述双光子荧光反射；
所述第二二色镜对所述双光子荧光反射，对所述第一波长窗口激发光、所述第三波长窗口激发光和所述三光子荧光透射；
所述滤波片对所述三光子荧光透射，对所述第一波长窗口激发光、所述第三波长窗口激发光滤除。
与现有的技术相比，本发明的有益效果如下：本发明所提出的一种近红外双光子、三光子多色光光学成像系统和方法是一套兼容两种波长窗口的高分辨率、大成像深度的非线性光学显微系统，以实现近红外双光子、三光子多色光光学研究，为生物医学诊断提供更加全面的技术支持。可实现深层、实时光学诊断，能更加全面掌握生物组织及其网络间的内在联系和协同作用，有助于更加精确地分析生物医学问题，特别是在具有复杂结构的脑部神经元领域具有广泛应用，并可推动生物医学以及其他领域的研究的发展。
附图说明
图1为本实施例的一种近红外双光子、三光子多色光光学成像系统的结构示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
如图1所示，本实施例的一种近红外双光子、三光子多色光光学成像系统，包括激光光源模块、激光扫描和样品照射模块、并行荧光信号探测模块、数据分析模块。
所述激光光源模块为双波长脉冲激光器1；
所述激光扫描和样品照射模块依序包含扫描振镜2、第一透镜3、第二透镜4、第一二色镜5、物镜6、样品7；所述激光光源模块向扫描振镜2发射激发光；
所述并行荧光信号探测模块包括第二二色镜8、第三透镜9、第一光电倍增管10滤波片11、第四透镜12和第二光电倍增管13；
所述并行荧光信号探测模块包括双光子荧光信号探测光路和三光子荧光信号探测光路；
所述双光子荧光信号探测光路的路径依序经过所述第二二色镜8、样品7、物镜6、所述第一二色镜5、第三透镜9、第一光电倍增管10；
所述三光子荧光信号探测光路按照光线传播方向依次为：样品7、第二二色镜8、滤波片11、第四透镜12、第二光电倍增管13。
所述第一光电倍增管10第二光电倍增管13均和数据分析模块14连接。
所述激光光源模块可同时输出两种不同生物成像波长窗口的激发光，分别为第一波长窗口和第三波长窗口。本实施例中第一波长窗口和第三波长窗口的激发光为波长分别为和920nm和1840nm的飞秒激光，输出激光峰值功率达500kW，满足成像系统中双光子和三光子荧光激发的功率需求。
所述扫描振镜2采用振镜扫描的方式对样品7进行周期性扫动，以达到30帧/秒的视频帧率扫描，减少对生物样本的激光损伤，并调整扫描角度，扩大扫描范围，配合系统中各种透镜的焦距组合，实现直径达200μm的成像视场。
所述物镜6为高透过率(60％—80％)的成像物镜，用于将光束汇聚到样品成像点，配合调整扫描振镜2的输出激发光的光束光斑半径，实现横向小于500nm、纵向小于5μm的成像分辨率，并结合处于最佳生物成像窗口的激发光波长，实现大于1.0mm的成像深度。
所述第一光电倍增管(10)和所述第二光电倍增管(13)将光信号转换为电信号；由于多光子成像时荧光效果非常微弱，第一光电倍增管10和第二光电倍增管13为高量子效率(20％—30％)和高增益(104—107)的光电倍增管。所述第一光电倍增管(10)和所述第二光电倍增管(13)可使用雪崩二极管、电子倍增CCD相机或者科研级CMOS相机等高量子效率、低噪声的探测器来代替。
所述数据分析模块14将电信号进行电流电压转换，最终实现并行多通道数据实时采集和分析；
数据分析模块14使用多通道、高采样率的数据采集卡，并通过计算机设备进行数据处理和分析，以得到具有高对比度的多衬度生物图像。所述第一二色镜5的功能为对所述第一波长窗口激发光和所述第三波长窗口激发光进行透射，对双光子荧光进行反射，具体的，对波长为920nm和1840nm的光透射，对波长为460nm的光反射。
第二二色镜8的功能为对双光子荧光反射，对所述第一波长窗口激发光、所述第三波长窗口激发光和三光子荧光进行透射，具体的，对波长为610nm、920nm和1840nm的光透射，对波长为460nm的光反射。
滤波片11功能为对三光子荧光透射，对所述第一波长窗口激发光、所述第三波长窗口激发光滤除，具体的，对波长为610nm的光透射，对波长为920nm和1840nm的光滤除。
所述近红外双光子、三光子多色光光学成像系统的工作方式为：所述双波长锁模全光纤飞秒脉冲激光器1向扫描振镜2输出第一波长窗口和第三波长窗口作为成像系统的激发光，第一波长窗口和第三波长窗口的波长分别为920nm和1840nm；通过扫描振镜2确定扫描位置，再利用第一透镜3和第二透镜4对光束进行调整以防止扩束，之后通过所述物镜6将光束聚焦到样品7上；两个波长窗口的激光同时对样品7进行荧光激发，其中波长为920nm的激光照射样品7得到波长约为460nm的双光子荧光，所述双光子荧光约为绿光；双光子荧光再通过所述第二二色镜8反射回原光路中，经过物镜6后由第一二色镜5反射到第三透镜9中，第三透镜9使光束汇聚进第一光电倍增管10中将荧光信号转换为电信号；波长为1840nm的激光照射样品得到波长约为610nm的三光子荧光，所述三光子荧光约为红光；三光子荧光通过第二二色镜8透射，再经滤波片11滤除剩余的第一波长窗口和第三波长窗口的激发光，然后通过第四透镜12使光束汇聚进第二光电倍增管13中将荧光信号转换为电信号；最终通过数据分析模块14对第一光电倍增管10和第二光电倍增管13得到的两个电信号同时进行电流电压转换，对数据进行分析，以得到具有高分辨率、大成像深度、高对比度的多模态、多衬度生物图像。
所述双光子荧光信号经过所述数据分析模块14得到样品特定深度和组织的成像信息，所述三光子荧光信号经过所述数据分析模块14得到样品另一特定深度和组织的成像信息，通过对两种信息的并行处理，得到近红外双光子、三光子多色光的样品成像图。
上述实施例为本发明的实施方式之一，但本发明的实施方式并不受所述实施例与测试例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种近红外双光子、三光子多色光光学成像系统，其特征在于：包括激光光源模块、激光扫描和样品照射模块、并行荧光信号探测模块、数据分析模块(14)；
所述激光扫描和样品照射模块依序包含扫描振镜(2)、第一透镜(3)、第二透镜(4)、第一二色镜(5)、物镜(6)和样品(7)；所述激光光源模块向扫描振镜(2)发射激发光；
所述并行荧光信号探测模块包括第二二色镜(8)、第三透镜(9)、第一光电倍增管(10)、滤波片(11)、第四透镜(12)和第二光电倍增管(13)；
所述并行荧光信号探测模块包括双光子荧光信号探测光路和三光子荧光信号探测光路；
所述双光子荧光信号探测光路的路径依序经过第二二色镜(8)、样品(7)、物镜(6)、所述第一二色镜(5)、第三透镜(9)、第一光电倍增管(10)；
所述三光子荧光信号探测光路的路径依序经过样品(7)、第二二色镜(8)、滤波片(11)、第四透镜(12)、第二光电倍增管(13)；所述样品(7)位于所述第二二色镜(8)的上表面；
所述第一光电倍增管(10)第二光电倍增管(13)均和数据分析模块(14)连接；双波长脉冲激光器发出两种不同生物成像波长窗口的激发光，分别为第一波长窗口和第三波长窗口的激发光，两个波长窗口的激光同时对样品进行荧光激发，第一波长窗口的激光照射样品实现双光子荧光激发，第三波长窗口的激光照射样品实现三光子荧光激发；第一二色镜对所述第一波长窗口激发光和所述第三波长窗口激发光透射，对所述双光子荧光反射、所述第二二色镜对所述双光子荧光反射，对所述第一波长窗口激发光、所述第三波长窗口激发光和所述三光子荧光透射、所述滤波片对所述三光子荧光透射，对所述第一波长窗口激发光、所述第三波长窗口激发光滤除。
2.根据权利要求1所述的一种近红外双光子、三光子多色光光学成像系统，其特征在于：所述激光光源模块为双波长脉冲激光器(1)。
3.根据权利要求1所述的一种近红外双光子、三光子多色光光学成像系统，其特征在于：所述第一波长窗口大小为650～950nm；第三波长窗口大小为1600～1870nm。
4.根据权利要求1所述的一种近红外双光子、三光子多色光光学成像系统，其特征在于：所述数据分析模块将电信号进行电流电压转换，最终实现并行多通道数据实时采集和分析，数据分析模块包括数据采集卡，并通过优化算法程序的方法对数据进行分析，以得到具有高对比度的多衬度生物图像。
5.根据权利要求1所述的一种近红外双光子、三光子多色光光学成像系统，其特征在于：所述第一透镜(3)和所述第二透镜(4)对光束进行准直以防止扩束。
6.根据权利要求1所述的一种近红外双光子、三光子多色光光学成像系统，其特征在于：所述第一光电倍增管(10)和所述第二光电倍增管(13)将光信号转换为电信号，所述第一光电倍增管(10)和所述第二光电倍增管(13)用雪崩二极管、电子倍增CCD相机或者科研级CMOS相机来代替。
7.用于权利要求1所述的一种近红外双光子、三光子多色光光学成像系统的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、所述双波长脉冲激光器(1)向扫描振镜(2)输出第一波长窗口和第三波长窗口的激光作为成像系统的激发光；
S2、通过扫描振镜(2)确定扫描位置，再利用第一透镜(3)和第二透镜(4)对光束进行调整以防止扩束，之后通过所述物镜(6)将光束聚焦到样品(7)上；两个波长窗口的激光同时对样品(7)进行荧光激发，其中第一波长窗口的激光照射样品(7)实现双光子荧光激发，第三波长窗口的激光照射样品(7)实现三光子荧光激发；
S3、双光子荧光通过第二二色镜(8)反射，反射光依次经过样品(7)、物镜(6)和第一二色镜(5)，再由第一二色镜(5)反射到第三透镜(9)中，第三透镜(9)使光束汇聚进第一光电倍增管(10)中将荧光信号转换为电信号；
S4、三光子荧光先通过第二二色镜(8)透射后，再经滤波片(11)滤除剩余的第一波长窗口和第三波长窗口的激发光，最后通过第四透镜(12)使光束汇聚进第二光电倍增管(13)中将荧光信号转换为电信号；
S5、最终通过数据分析模块(14)对第一光电倍增管(10)和第二光电倍增管(13)得到的两个电信号同时进行电流电压转换，对数据进行分析得到生物图像。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述双光子荧光和三光子荧光经过所述数据分析模块(14)得到样品不同的特定深度和组织的成像信息，数据分析模块(14)对两种荧光的信息并行处理，得到近红外双光子、三光子多色光的样品成像图。
9.根据权利要求7所述的的方法，其特征在于：
所述第一二色镜(5)对所述第一波长窗口激发光和所述第三波长窗口激发光透射，对所述双光子荧光反射；
所述第二二色镜(8)对所述双光子荧光反射，对所述第一波长窗口激发光、所述第三波长窗口激发光和所述三光子荧光透射；
所述滤波片(11)对所述三光子荧光透射，对所述第一波长窗口激发光、所述第三波长窗口激发光滤除。
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