CN113075177B - 一种氮化镓位错双光子超分辨显微三维成像装置及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种氮化镓位错双光子超分辨显微三维成像装置及方法。本发明利用光学手段对氮化镓位错进行三维成像，是一种非接触式成像，不会对样品造成破坏，不涉及昂贵的扫描电镜等设备，也不需要对样品进行预处理，单次成像区域面积大，同时该设备成像分辨率较高，成像速度快；激发光源为光纤激光器，其成本较低，结构简单，稳定性强，易于维护，对氮化镓晶体激发效率高，荧光信号易于探测，检测模块可以灵活配置；结合氮化镓位错的荧光特性，提出利用涡旋光束作为激发光，能够获得超过衍射极限的横向空间分辨能力。

Description

一种氮化镓位错双光子超分辨显微三维成像装置及方法

技术领域

本发明涉及光学成像技术，具体涉及一种基于涡旋光束的氮化镓位错超分辨双光子荧光显微三维成像装置及其成像方法。

背景技术

氮化镓是一种三五族半导体材料，具有禁带宽度宽，电子迁移率高，熔点高，击穿电压高，热导率高等特点，由于其优秀的电学以及光学性质，在近些年获得了越来越多的关注。基于氮化镓的半导体器件也得到了广泛的应用，如基于氮化镓的发光二极管，半导体激光器，高功率及高频晶体管等。

由于缺少本征衬底，氮化镓材料在生产制造时，一般利用外来材料(如蓝宝石等)作为衬底，进行外延生长。然而，由于异质衬底和外延层之间的晶格失配和热膨胀系数的差异，会使得在生长出的氮化镓材料中产生密度为10⁶～10¹⁰cm^-2的位错，同时，这些位错会随着外延方向生长，形成类似于线条一样的缺陷，被称为穿线位错。位错的存在，会对基于氮化镓材料的器件性能造成严重的不良影响。

为了降低氮化镓的位错密度，人们进行了大量的研究。氮化镓的位错密度与衬底材料，生长厚度以及生长工艺等条件密切相关，如何对不同条件下生长的材料位错进行观察，并对位错密度进行评估，是降低氮化镓位错密度中非常重要的一环。同时，位错在外延生长过程中，会随着材料的外延方向生长，这就需要检测设备具有三维成像的能力。另外，由于氮化镓位错的尺寸很小，在原子量级，也需要检测设备具有高的空间分辨能力。

在传统的位错检测方法中，最常用的有透射电子显微镜测量法，蚀坑法(the etchpit method)，阴极发光测量法等。透射电子显微镜具有很高的空间分辨率，但是只能对样品进行二维成像，在测量前还需要对样品进行复杂的预处理，其单次测量尺寸也被限制在几个平方微米的范围。同时，透射电子显微镜的价格昂贵，不适合于大批量的商用检测。蚀坑法同样需要对样品进行预处理，且只能对材料表面进行处理，难以追踪穿线位错的生长情况。以上两种方法对样品会造成不可逆的损坏，测量完成后样品无法被再次使用。阴极发光法虽然对样品本身不会造成破坏，但是其探测范围也被限制在样品表面，无法观察位错的三维分布。因此，上述几种方法由于自身的局限性限制了其在氮化镓位错检测中的进一步应用。

氮化镓材料在一定光照条件下会产生荧光，但是其位错为非辐射复合中心，当有光照射时不会发射荧光，曾经有人提出过用荧光成像的方法来观察氮化镓位错。然而，普通的单光子荧光成像也只能对样品表面进行二维成像，成像深度只有1微米左右，其成像分辨率较差，结果不够理想。另外，由于氮化镓禁带宽度为3.4eV(365nm)，需要用紫外波段的激光进行激发，相应的激光源比较缺乏，同时紫外波段的光学元器件价格昂贵，所以这一方法并没有得到大量应用。

发明内容

基于上述提到的氮化镓位错显微成像的发展现状与局限，本发明提出了一种基于涡旋光束的氮化镓位错超分辨双光子荧光显微三维成像装置及其成像方法；本发明利用成本低、装置简单、分辨率较高、成像速度较快、稳定性强且具有三维成像能力的技术对氮化镓位错进行直接观察，对于基于氮化镓材料的器件的应用具有非常重要的意义。

本发明的一个目的在于提出一种基于涡旋光束的氮化镓位错超分辨双光子荧光显微三维成像装置。

本发明的基于涡旋光束的氮化镓位错超分辨双光子荧光显微三维成像装置包括：光纤飞秒激光器、光纤飞秒激光放大系统、倍频晶体、光束整形系统、双色镜、二维扫描振镜、无限远矫正光学系统、物镜、信号探测系统、一维压电平移台、数据采集卡和计算机；其中，待检测位错的氮化镓晶体作为样品放置在一维压电平移台上；二维扫描振镜、一维压电平移台和信号探测系统连接至数据采集卡，数据采集卡与计算机连接；光纤飞秒激光器作为种子源产生近红外波段的高斯型飞秒激光脉冲，通过光纤飞秒激光放大系统进行功率放大，再经过倍频晶体获得可见光波段的高斯型飞秒激光脉冲；高斯型飞秒激光脉冲经过光束整形系统进行空间整形，形成涡旋光束；经整形后的涡旋光束经过双色镜至二维扫描振镜，经过二维扫描振镜反射，实现光束的二维空间偏折，经过无限远矫正光学系统后作为激发光，经物镜聚焦在样品上，对样品产生双光子激发；样品上没有位错的位置由于双光子激发产生双光子荧光信号，而位错的位置被激发光照射后不产生荧光；双光子荧光信号经物镜收集后，与激发光反向依次经无限远矫正光学系统和二维扫描振镜至双色镜，利用双色镜与激发光分开，至信号探测系统，信号探测系统收集双光子荧光信号，传输至数据采集卡，转换成数字信号传输至计算机；进一步，计算机发出的指令通过数据采集卡对一维压电平移台和二维扫描振镜进行控制，通过一维压电平移台控制样品进行位移，与二维扫描振镜配合，从而对样品进行三维扫描，实现三维空间中双光子荧光信号的收集；计算机将采集到的双光子荧光信号，与三维扫描的空间位置进行一一对应，得到双光子荧光信号对应的空间位置，在三维空间中重构双光子荧光信号的三维分布，从而得到涡旋双光子荧光图样；涡旋双光子荧光图样中，荧光强度最弱的点反映了位错的位置，通过对双光子荧光信号的三维重构，最终实现了位错在样品内三维空间分布的成像；由于激发光为环状的涡旋光，在激发光对位错扫描的过程中，当位错完全位于激发光的环的中心时，激发光完全照射到没有位错的地方，从而会对样品产生双光子激发并采集到双光子荧光信号，而当位错与激发光的环重叠时，由于位错不发光，此时采集到的双光子荧光信号强度会变弱，因此在涡旋双光子荧光图样上扫描后的二维图案也是环状，但双光子荧光图样中环的中心是亮斑而环是暗的，亮斑的大小与涡旋光环中心不发光部分的半高宽相关，同时亮斑的位置代表位错，即位错的位置对应涡旋双光子荧光图样上的一个亮斑；与传统的高斯光作为激发光不同，利用高斯光对样品扫描后，在双光子荧光图样上，位错的位置是一个实心的暗斑，暗斑的大小与高斯光强度的半高宽相关；在涡旋光中，环中心不发光部分的半高宽比高斯光的半高宽小，因此在涡旋双光子荧光图样中，利用涡旋光扫描得到的亮斑的半高宽小于利用高斯光扫描得到的暗斑的半高宽，更小的半高宽代表更高的分辨率，因此采用涡旋光作为激发光提高了氮化镓位错检测的横向空间分辨率。

光纤飞秒激光器作为种子源，输出飞秒激光脉冲经过光纤飞秒激光放大系统进行功率放大，然后利用倍频晶体进行倍频，倍频后的脉冲半高全宽控制在100飞秒左右；通过计算基频光与倍频光的群速度，确定两个脉冲的走离长度，使倍频晶体的厚度小于走离长度，减小倍频过程中由于群速度失配引起的走离效应，保证最大的倍频转换效率。增益光纤是光纤飞秒激光器及光纤飞秒激光放大系统中用来做增益介质的光纤，在光纤飞秒激光器中的主要作用是产生飞秒激光，在光纤飞秒激光放大系统中的作用是对激光功率实现放大，增益光纤的种类决定了光纤飞秒激光器及光纤飞秒激光放大级产生的激光的波长，通过选择合适种类的增益光纤，光纤飞秒激光器及光纤飞秒激光放大系统中输出的激光经倍频后，产生的可见光波段激光的波长与氮化镓晶体的双光子吸收峰的波长匹配。

光束整形系统采用四分之一波片和涡旋半波片组合，或者采用四分之一波片和涡旋相位板组合，或者采用计算全息图和空间光调制器组合。光束整形系统对高斯光束的相位波前引入螺旋形分布，使其携带轨道角动量，形成涡旋光束，从而光束的光斑具有环状的强度分布特征，即环的中心光强为零，而环的光强不为零。涡旋光束的环中心孔的大小与涡旋光携带的拓扑荷相关，经过光束整形系统产生的涡旋光束携带的拓扑荷为正1或负1，从而产生的涡旋光束的环中心孔径最小。光束整形系统采用四分之一波片和涡旋相位板组合，则通过选择合适的相位板相位分布，使得涡旋光束携带的拓扑荷为正1或负1；采用四分之一波片和涡旋半波片组合，则选择合适的涡旋半波片的偏振分布，使得涡旋光束携带的拓扑荷为正1或负1；采用计算全息图和空间光调制器组合，则通过控制空间光调制器加载的相位图来实现涡旋光束携带的拓扑荷为正1或负1。

无限远矫正光学系统采用扫描透镜和套筒透镜，组成4f系统，将二维扫描振镜的两个反射镜中点共轭到物镜的后焦面处，以此来保证在扫描过程中物镜入瞳处光斑的横向空间位移降低到最小，最大限度减小扫描过程中渐晕的出现。扫描透镜需要具有平场矫正能力，以此来降低扫描过程中由于场曲造成的图形失真。由于本发明中，激发物镜与信号收集物镜为同一个物镜，而氮化镓的双光子荧光信号位于紫外波段，所以要求物镜对可见光及紫外波段激光同时具有较高的透过率。因为本系统的激发效率较高，产生氮化镓的双光子荧光信号较强，所以不需要直接在物镜入瞳后方对双光子信号进行直接收集。

信号探测系统采用滤光片和光电倍增管，利用滤光片滤除双光子荧光信号以外的杂光，剩余的双光子荧光信号由光电倍增管接收；由于本系统的激发效率较高，或者采用滤光片和雪崩光电二极管，雪崩光电二极管收集信号，能够进一步降低系统的成本，减少后期维护，同时也能使整个系统结构更为简化。

计算机通过数据采集卡将数字信号转换为模拟信号，输入到二维扫描振镜的控制器及一维压电平移台的控制器中，对二维扫描振镜及一维压电平移台进行控制，实现激发光聚焦光斑在样品内的三维点扫描。同时，在数据采集过程中，利用数据采集卡将信号探测系统采集的双光子荧光信号、二维扫描振镜及一维压电平移台的空间扫描坐标信息进行同步，最终实现对氮化镓位错分布的三维空间成像。

本发明的另一个目的在于提出一种基于涡旋光束的氮化镓位错超分辨双光子荧光显微三维成像方法。

本发明的基于涡旋光束的氮化镓位错超分辨双光子荧光显微三维成像方法，包括以下步骤：

1)光纤飞秒激光器作为种子源产生近红外波段的高斯型飞秒激光脉冲，通过光纤飞秒激光放大系统进行功率放大，再经过倍频晶体获得可见光波段的高斯型飞秒激光脉冲；

2)高斯型飞秒激光脉冲经过光束整形系统进行空间整形，形成涡旋光束；

3)经整形后的涡旋光束经过双色镜至二维扫描振镜，经过二维扫描振镜反射，实现光束的二维空间偏折，经过无限远矫正光学系统后作为激发光，经物镜聚焦在样品上，对样品产生双光子激发；

4)样品上没有位错的位置由于双光子激发产生双光子荧光信号，而位错的位置被激发光照射后不产生荧光；

5)双光子荧光信号经物镜收集，双光子荧光信号与激发光反向依次经无限远矫正光学系统和二维扫描振镜至双色镜，利用双色镜与激发光分开，至信号探测系统，信号探测系统收集双光子荧光信号，传输至数据采集卡，转换成数字信号传输至计算机；

6)计算机发出的指令通过数据采集卡对一维压电平移台与二维扫描振镜进行控制，通过一维压电平移台控制样品进行位移，与二维扫描振镜配合，从而对样品进行三维扫描，实现三维空间中双光子荧光信号的收集；

7)计算机将采集到的双光子荧光信号，与三维扫描的空间位置进行一一对应，得到双光子荧光信号对应的空间位置，在三维空间中重构双光子荧光信号的三维分布，从而得到涡旋双光子荧光图样；

8)涡旋双光子荧光图样中，荧光强度最弱的点反映了位错的位置，最终实现了位错在样品内三维空间分布的成像；由于激发光为环状的涡旋光，在激发光对位错扫描的过程中，当位错完全位于激发光的环的中心时，激发光完全照射到没有位错的地方，从而会对样品产生双光子激发并采集到双光子荧光信号，而当位错与激发光的环重叠时，由于位错不发光，此时采集到的双光子荧光信号强度会变弱，因此在涡旋双光子荧光图样上扫描后的二维图案也是环状，但双光子荧光图样中环的中心是亮斑而环是暗的，亮斑的大小与涡旋光环中心不发光部分的半高宽相关，同时亮斑的位置代表位错，即位错的位置对应涡旋双光子荧光图样上的一个亮斑；

9)与传统的高斯光作为激发光不同，利用高斯光对样品扫描后，在双光子荧光图样上，位错的位置是一个实心的暗斑，暗斑的大小与高斯光强度的半高宽相关，在涡旋光中，环中心不发光部分的半高宽比高斯光的半高宽小，因此在涡旋双光子荧光图样中，利用涡旋光扫描得到的亮斑的半高宽小于利用高斯光扫描得到的暗斑的半高宽，更小的半高宽代表更高的分辨率，因此采用涡旋光作为激发光提高了氮化镓位错检测的横向空间分辨率。

在步骤1)中，通过选择合适种类的在光纤飞秒激光器及光纤飞秒激光放大系统中的增益光纤，使得光纤飞秒激光器及光纤飞秒激光放大系统中输出的激光经倍频后，产生的可见光波段激光的波长与氮化镓晶体的双光子吸收峰的波长匹配。

在步骤1)中，通过计算基频光与倍频光的群速度，确定基频光与倍频光的走离长度，使倍频晶体的厚度小于走离长度，减小倍频过程中由于群速度失配引起的走离效应，保证最大的倍频转换效率。

在步骤1)中，经倍频系统后可见光飞秒激光脉冲的平均功率在百毫瓦量级，以便在后续实现足够强度的双光子荧光信号激发，保证信号探测系统采集到的双光子荧光信号具有足够高的信噪比。

在步骤2)中，光束整形系统对高斯光束的相位波前引入螺旋形分布，使其携带轨道角动量，形成涡旋光束，从而光束的光斑具有环状的强度分布特征，即环的中心光强为零，而环的光强不为零。涡旋光环中心孔的大小与涡旋光携带的拓扑荷相关，这里产生的涡旋光束携带的拓扑荷为正1或负1，从而产生的涡旋光环中心孔径最小。

在步骤3)中，物镜聚焦后涡旋光束环的大小需要大于位错的大小，由于氮化镓的位错是原子尺度的错位，其尺寸在几个纳米量级，而一般实验中聚焦后涡旋光束环的半高宽在波长量级，即百纳米量级，可以满足对位错的扫描要求。

本发明的优点：

1.本发明利用光学手段对氮化镓位错进行三维成像，是一种非接触式成像，不会对样品造成破坏，不涉及昂贵的扫描电镜等设备，也不需要对样品进行预处理，单次成像区域面积大，同时该设备成像分辨率较高，成像速度快；

2.本发明使用的激发光源为光纤激光器，其成本较低，结构简单，稳定性强，易于维护，对氮化镓晶体激发效率高，荧光信号易于探测，检测模块可以灵活配置；

3.本发明结合氮化镓位错的荧光特性，提出利用涡旋光束作为激发光，能够获得超过衍射极限的横向空间分辨能力。

附图说明

图1为本发明的基于涡旋光束的氮化镓位错超分辨双光子荧光显微三维成像装置的一个实施例的光路图；

图2为根据本发明的基于涡旋光束的氮化镓位错超分辨双光子荧光显微三维成像方法的一个实施例得到的高斯光直接经物镜聚焦后焦平面的光斑强度分布模拟结果，其中(a)为聚焦光斑图，(b)为沿着(a)中画线方向的聚焦光斑强度的剖面图；

图3为根据本发明的基于涡旋光束的氮化镓位错超分辨双光子荧光显微三维成像方法的一个实施例得到的涡旋光束经物镜聚焦后焦平面光斑强度分布模拟结果图，其中，(a)为聚焦光斑图，(b)为沿着a)中画线方向的聚焦光斑强度的剖面图；

图4为根据本发明的基于涡旋光束的氮化镓位错超分辨双光子荧光显微三维成像方法的一个实施例得到的利用高斯光对氮化镓位错成像的模拟结果图，其中，(a)为位错的二维强度分布图，(b)为沿着(a)中画线方向的剖面图；

图5为根据本发明的基于涡旋光束的氮化镓位错超分辨双光子荧光显微三维成像方法的一个实施例得到的利用涡旋光束对氮化镓位错成像的模拟结果图，其中，(a)为位错的二维强度分布，(b)为沿着(a)中画线方向的剖面图。

具体实施方式

下面结合附图，通过具体实施例，进一步阐述本发明。

如图1所示，本实施例的基于涡旋光束的氮化镓位错超分辨双光子荧光显微三维成像装置包括：光纤飞秒激光器1、光纤飞秒激光放大系统2、倍频晶体3、光束整形系统4、平面反射镜5、双色镜6、二维扫描振镜7、无限远矫正光学系统8、物镜9、一维压电平移台10、信号探测系统11、数据采集卡12和计算机13；其中，待检测位错的氮化镓晶体作为样品放置在一维压电平移台10上；二维扫描振镜7、一维压电平移台10和信号探测系统11连接至数据采集卡12，数据采集卡12与计算机13连接；光纤飞秒激光器1作为种子源产生近红外波段的高斯型飞秒激光脉冲，通过光纤飞秒激光放大系统2进行功率放大，再经过倍频晶体3获得可见光波段的飞秒激光脉冲，在光纤飞秒激光器1及光纤飞秒激光放大系统2中，选择合适的增益光纤作为增益介质，使得经倍频晶体3产生的可见光波段激光的波长与氮化镓晶体的双光子吸收峰的波长匹配，从而保证产生的双光子荧光信号的效率；高斯型飞秒激光脉冲经过四分之一波片4-1和一个涡旋相位板4-2进行空间整形，涡旋相位版对高斯光束的波前引入0-2π的螺旋相位分布，选择合适的相位板相位分布，使涡旋光束携带的拓扑荷为正1或负1，形成一阶涡旋光束，从而产生的涡旋光环中心孔径最小；经整形后的涡旋光束经过平面反射镜5反射后经过双色镜6透射至二维扫描振镜7，经过二维扫描振镜7反射，实现光束的二维空间偏折，经过无限远矫正光学系统8后作为激发光，经物镜9聚焦在样品上，对样品产生双光子激发；样品上没有位错的位置由于双光子激发产生双光子荧光信号，而位错的位置被激发光照射后不产生荧光；双光子荧光信号经物镜9收集后，与激发光反向依次经无限远矫正光学系统8和二维扫描振镜7至双色镜6，利用双色镜6与激发光分开，反射至信号探测系统11，信号探测系统11收集双光子荧光信号，传输至数据采集卡12，转换成数字信号传输至计算机13；进一步，计算机13发出的指令通过数据采集卡12对一维压电平移台10和二维扫描振镜7进行控制，通过一维压电平移台10控制样品进行位移，与二维扫描振镜7配合，从而对样品进行三维扫描，实现三维空间中双光子荧光信号的收集；计算机13将采集到的双光子荧光信号，与三维扫描的空间位置进行一一对应，得到双光子荧光信号对应的空间位置，在三维空间中重构双光子荧光信号的三维分布，从而得到涡旋双光子荧光图样；涡旋双光子荧光图样中，荧光强度最弱的点反映了位错的位置，通过对双光子荧光信号的三维重构，最终实现了位错在样品内三维空间分布的成像；由于激发光为环状的涡旋光，在激发光对位错扫描的过程中，当位错完全位于激发光的环的中心时，激发光完全照射到没有位错的地方，从而会对样品产生双光子激发并采集到双光子荧光信号，而当位错与激发光的环重叠时，由于位错不发光，此时采集到的双光子荧光信号强度会变弱，因此在涡旋双光子荧光图样上扫描后的二维图案也是环状，但双光子荧光图样中环的中心是亮斑而环是暗的，亮斑的大小与涡旋光环中心不发光部分的半高宽相关，同时亮斑的位置代表位错，即位错的位置对应涡旋双光子荧光图样上的一个亮斑；与传统的高斯光作为激发光不同，利用高斯光对样品扫描后，在双光子荧光图样上，位错的位置是一个实心的暗斑，暗斑的大小与高斯光强度的半高宽相关；在涡旋光中，环中心不发光部分的半高宽比高斯光的半高宽小，因此在涡旋双光子荧光图样中，利用涡旋光扫描得到的亮斑的半高宽小于利用高斯光扫描得到的暗斑的半高宽，更小的半高宽代表更高的分辨率，因此采用涡旋光作为激发光提高了氮化镓位错检测的横向空间分辨率。

在本实施例中，光纤飞秒激光器1采用掺镱光纤作为增益光纤，其输出中心波长为1030nm，脉冲重复频率为50MHz；种子源通过一级掺镱光纤进行放大后，利用三硼酸锂(LBO)晶体作为倍频晶体进行倍频，倍频后的绿光中心波长为515nm，平均功率大于100mW，脉冲半高全宽为150fs；光束整形系统4采用四分之一波片4-1和涡旋相位板4-2；二维扫描振镜中反射镜的大小只需大于入射光斑直径(～3mm)；无限远矫正光学系统8由一个扫描透镜8-1和一个套筒透镜8-2组成，二者构成4f系统。通过无限远矫正光学系统8将二维扫描振镜的两个反射镜中点共轭到物镜9的后焦面处，以此来保证在扫描过程中物镜9入瞳处光斑的横向空间偏移降低到最小，最大限度减小扫描过程中渐晕的出现。这里选取的扫描透镜焦距为70mm，套筒透镜焦距为200mm，物镜9的数值孔径为0.95，放大倍率为40倍。由于无限远矫正光学系统8对入射的激发光光斑直径会实现约2.86倍的放大，所以需要对进入二维扫描振镜前的光束直径进行调整，使其能够正好填满物镜9的入瞳，从而获得最高的衍射极限分辨能力。本实施例中使用的二维扫描振镜最大偏折角度为±12.5度，最小偏折角度为0.008度，同时考虑所选取的扫描透镜，套筒透镜与物镜9参数，可以计算得到，当二维扫描振镜的扫描角度为±1度时，在物镜9焦平面上扫描面积为110μm×110μm，最小扫描步长小于44nm，远小于涡旋中心孔的半高宽大小，此时，在X和Y方向的像素数均大于2500，可以实现非常精细的扫描。当扫描分辨率为512pixels×512pixels时，单层扫描时间为3秒左右。Z向扫描使用的压电平移台行程为200μm，分辨率为5nm，在实际使用中，综合考虑氮化镓与空气折射率引起的球差，激发光与双光子荧光的穿透深度等参数，本实施例的Z向成像深度可以达到几百微米。

由于晶体吸收以及散射等因素的影响，激发光穿透晶体深度的能力有限，随着进入晶体深度的增加，激发光的功率会逐渐变弱，同时，氮化镓晶体对激发出的双光子荧光的重吸收也会增加，所以在不同的激发深度，调整进入物镜的激发光功率在几毫瓦到十几毫瓦的范围内变化。

另外，由于本发明中氮化镓产生的双光子荧光信号较强，易于探测，所以不需要直接在物镜入瞳后方进行收集。信号采集系统被放置于二维扫描振镜前方，这样做的好处是，在扫描过程中，双光子荧光信号的空间位置不发生改变，利用接收面积更小的雪崩光电二极管也可以进行双光子荧光信号的探测，相比于光电倍增管，雪崩光电二极管使用更为简便，成本更低，维护也更为简便。氮化镓的双光子荧光光谱中心波长在365nm左右，激发光与双光子荧光利用450nm长通双色镜分开，然后利用滤波中心波长为370nm，滤波带宽为30nm的滤光片11-1排除环境中的杂散光，保证只有双光子荧光信号可以进入光电倍增管11-2中。

图2和图3中给出了高斯光束与涡旋光束聚焦光斑的模拟结果，当激发光波长为515nm，物镜数值孔径为0.95时，聚焦后高斯光束强度的半高全宽为306nm，涡旋光束中心环的半高全宽为218nm，涡旋光束经聚焦后其环中心强度的半高全宽小于高斯光束聚焦后强度的半高全宽。图4和图5也给出了利用上述器件参数后得到的位错双光子荧光显微成像的模拟结果，模拟中设定位错的直径为10nm。从模拟结果中可以看到，利用高斯光束扫描后，位错的双光子成像结果是一个不发光的暗斑，而利用涡旋光束扫描时，位错的双光子成像结果是一个以位错点为中心的暗环，环的中心为一个亮斑。通过图4和图5的结果，能够很明显地看出二者的图像完全不同。对两种光斑扫描后的位错成像图案进行分析可以看出，利用高斯光束扫描后，单个位错的半高全宽为306nm，利用涡旋光束扫描后，单个位错的半高全宽为218nm，其成像分辨率提高了30％，证明利用涡旋光束，能够获得更高的横向空间分辨率。

最后需要注意的是，公布实施例的目的在于帮助进一步理解本发明，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附的权利要求的精神和范围内，各种替换和修改都是可能的。因此，本发明不应局限于实施例所公开的内容，本发明要求保护的范围以权利要求书界定的范围为准。

Claims (10)

1.一种基于涡旋光束的氮化镓位错超分辨双光子荧光显微三维成像装置，其特征在于，所述双光子荧光显微三维成像装置包括：光纤飞秒激光器、光纤飞秒激光放大系统、倍频晶体、光束整形系统、双色镜、二维扫描振镜、无限远矫正光学系统、物镜、信号探测系统、一维压电平移台、数据采集卡和计算机；其中，待检测位错的氮化镓晶体作为样品放置在一维压电平移台上；二维扫描振镜、一维压电平移台和信号探测系统连接至数据采集卡，数据采集卡与计算机连接；光纤飞秒激光器作为种子源产生近红外波段的高斯型飞秒激光脉冲，通过光纤飞秒激光放大系统进行功率放大，再经过倍频晶体获得可见光波段的高斯型飞秒激光脉冲；高斯型飞秒激光脉冲经过光束整形系统进行空间整形，形成涡旋光束；经整形后的涡旋光束经过双色镜至二维扫描振镜，经过二维扫描振镜反射，实现光束的二维空间偏折，经过无限远矫正光学系统后作为激发光，经物镜聚焦在样品上，对样品产生双光子激发；样品上没有位错的位置由于双光子激发产生双光子荧光信号，而位错的位置被激发光照射后不产生荧光；双光子荧光信号经物镜收集后，与激发光反向依次经无限远矫正光学系统和二维扫描振镜至双色镜，利用双色镜与激发光分开，至信号探测系统，信号探测系统收集双光子荧光信号，传输至数据采集卡，转换成数字信号传输至计算机；进一步，计算机发出的指令通过数据采集卡对一维压电平移台和二维扫描振镜进行控制，通过一维压电平移台控制样品进行位移，与二维扫描振镜配合，从而对样品进行三维扫描，实现三维空间中双光子荧光信号的收集；计算机将采集到的双光子荧光信号，与三维扫描的空间位置进行一一对应，得到双光子荧光信号对应的空间位置，在三维空间中重构双光子荧光信号的三维分布，从而得到涡旋双光子荧光图样；涡旋双光子荧光图样中，荧光强度最弱的点反映了位错的位置，通过对双光子荧光信号的三维重构，最终实现了位错在样品内三维空间分布的成像；由于激发光为环状的涡旋光束，在激发光对位错扫描的过程中，当位错完全位于激发光的环的中心时，激发光完全照射到没有位错的地方，从而会对样品产生双光子激发并采集到双光子荧光信号，而当位错与激发光的环重叠时，由于位错不发光，此时采集到的双光子荧光信号强度会变弱，因此在涡旋双光子荧光图样上扫描后的二维图案也是环状，但双光子荧光图样中环的中心是亮斑而环是暗的，亮斑的大小与涡旋光束环中心不发光部分的半高宽相关，同时亮斑的位置代表位错，即位错的位置对应涡旋双光子荧光图样上的一个亮斑；与传统的高斯光作为激发光不同，利用高斯光对样品扫描后，在双光子荧光图样上，位错的位置是一个实心的暗斑，暗斑的大小与高斯光强度的半高宽相关；在涡旋光束中，环中心不发光部分的半高宽比高斯光的半高宽小，因此在涡旋双光子荧光图样中，利用涡旋光束扫描得到的亮斑的半高宽小于利用高斯光扫描得到的暗斑的半高宽，更小的半高宽代表更高的分辨率，因此采用涡旋光束作为激发光提高了氮化镓位错检测的横向空间分辨率。

2.如权利要求1所述的双光子荧光显微三维成像装置，其特征在于，通过计算基频光与倍频光的群速度，确定基频光与倍频光的走离长度，使倍频晶体的厚度小于走离长度，减小倍频过程中由于群速度失配引起的走离效应，保证最大的倍频转换效率。

3.如权利要求1所述的双光子荧光显微三维成像装置，其特征在于，所述光束整形系统采用四分之一波片和涡旋半波片组合，或者采用四分之一波片和涡旋相位板组合，或者采用计算全息图和空间光调制器组合。

4.如权利要求1所述的双光子荧光显微三维成像装置，其特征在于，所述光束整形系统对高斯光束的相位波前引入螺旋形分布，使其携带轨道角动量，形成涡旋光束，从而光束的光斑具有环状的强度分布特征，即环的中心光强为零，而环的光强不为零；涡旋光束的环中心孔的大小与涡旋光束携带的拓扑荷相关，经过光束整形系统产生的涡旋光束携带的拓扑荷为正1或负1，从而产生的涡旋光束的环中心孔径最小。

5.如权利要求1所述的双光子荧光显微三维成像装置，其特征在于，所述无限远矫正光学系统采用扫描透镜和套筒透镜，组成4f系统，将二维扫描振镜的两个反射镜中点共轭到物镜的后焦面处，以此来保证在扫描过程中物镜后瞳处光斑的横向空间位移降低到最小，最大限度减小扫描过程中渐晕的出现。

6.如权利要求1所述的双光子荧光显微三维成像装置，其特征在于，所述信号探测系统采用滤光片和光电倍增管，或者采用滤光片和雪崩光电二极管。

7.如权利要求1所述的双光子荧光显微三维成像装置，其特征在于，通过选择合适种类的增益光纤，使得光纤飞秒激光器及光纤飞秒激光放大系统中输出的激光经倍频后，产生的可见光波段激光的波长与氮化镓晶体的双光子吸收峰的波长匹配。

8.一种如权利要求1所述的基于涡旋光束的氮化镓位错超分辨双光子荧光显微三维成像装置的成像方法，其特征在于，所述成像方法包括以下步骤：

1)光纤飞秒激光器作为种子源产生近红外波段的高斯型飞秒激光脉冲，通过光纤飞秒激光放大系统进行功率放大，再经过倍频晶体获得可见光波段的高斯型飞秒激光脉冲；

2)高斯型飞秒激光脉冲经过光束整形系统进行空间整形，形成涡旋光束；

3)经整形后的涡旋光束经过双色镜至二维扫描振镜，经过二维扫描振镜反射，实现光束的二维空间偏折，经过无限远矫正光学系统后作为激发光，经物镜聚焦在样品上，

对样品产生双光子激发；

4)样品上没有位错的位置由于双光子激发产生双光子荧光信号，而位错的位置被激发光照射后不产生荧光；

5)双光子荧光信号经物镜收集，双光子荧光信号与激发光反向依次经无限远矫正光学系统和二维扫描振镜至双色镜，利用双色镜与激发光分开，至信号探测系统，信号探测系统收集双光子荧光信号，传输至数据采集卡，转换成数字信号传输至计算机；

6)计算机发出的指令通过数据采集卡对一维压电平移台与二维扫描振镜进行控制，通过一维压电平移台控制样品进行位移，与二维扫描振镜配合，从而对样品进行三维扫描，实现三维空间中双光子荧光信号的收集；

7)计算机将采集到的双光子荧光信号，与三维扫描的空间位置进行一一对应，得到双光子荧光信号对应的空间位置，在三维空间中重构双光子荧光信号的三维分布，从而得到涡旋双光子荧光图样；

8)涡旋双光子荧光图样中，荧光强度最弱的点反映了位错的位置，最终实现了位错在样品内三维空间分布的成像；由于激发光为环状的涡旋光束，在激发光对位错扫描的过程中，当位错完全位于激发光的环的中心时，激发光完全照射到没有位错的地方，从而会对样品产生双光子激发并采集到双光子荧光信号，而当位错与激发光的环重叠时，由于位错不发光，此时采集到的双光子荧光信号强度会变弱，因此在涡旋双光子荧光图样上扫描后的二维图案也是环状，但双光子荧光图样中环的中心是亮斑而环是暗的，亮斑的大小与涡旋光束环中心不发光部分的半高宽相关，同时亮斑的位置代表位错，即位错的位置对应涡旋双光子荧光图样上的一个亮斑；

9)与传统的高斯光作为激发光不同，利用高斯光对样品扫描后，在双光子荧光图样上，位错的位置是一个实心的暗斑，暗斑的大小与高斯光强度的半高宽相关，在涡旋光束中，环中心不发光部分的半高宽比高斯光的半高宽小，因此在涡旋双光子荧光图样中，利用涡旋光束扫描得到的亮斑的半高宽小于利用高斯光扫描得到的暗斑的半高宽，更小的半高宽代表更高的分辨率，因此采用涡旋光束作为激发光提高了氮化镓位错检测的横向空间分辨率。

9.如权利要求8所述的成像方法，其特征在于，在步骤1)中，通过选择合适种类的增益光纤，光纤飞秒激光器及光纤飞秒激光放大系统中输出的激光经倍频后，产生的可见光波段激光的波长与氮化镓晶体的双光子吸收峰的波长匹配。

10.如权利要求8所述的成像方法，其特征在于，在步骤1)中，通过计算基频光与倍频光的群速度，确定两个脉冲的走离长度，使倍频晶体的厚度小于走离长度，减小倍频过程中由于群速度失配引起的走离效应，保证最大的倍频转换效率。

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