CN107045187A - 多光子超分辨显微成像装置及方法 - Google Patents

多光子超分辨显微成像装置及方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种多光子超分辨显微成像装置及方法。多光子超分辨显微成像装置包括：激光光源、分光装置、并光装置、物镜和光子探测器；所述激光光源发出的激光到所述分光装置，所述分光装置将入射的激光并分为激发光和退激发光，所述激发光经过的光路为第一光路，所述退激发光经过的光路为第二光路，所述第二光路中设有空间调制装置，所述空间调制装置用于对所述退激发光进行空间调制，使得所述退激发光的光斑成为中心零点的光斑；所述并光装置用于将所述激发光和所述退激发光重叠为同轴光线，重叠后的激光用于经物镜聚焦后照射荧光样品。本发明提供的多光子超分辨显微成像装置，结构简单、成本低。

Description

多光子超分辨显微成像装置及方法
技术领域
本发明涉及显微成像，特别涉及一种多光子超分辨显微成像装置及方法。
背景技术
激光共聚焦显微镜是80年代随着光学、视频、计算机等技术的飞速发展而诞生的新一代显微镜。目前，已成为形态学、分子细胞生物学、神经科学、药理学、遗传学等领域中强有力的研究工具。多光子共聚焦显微镜是近年来发展的一种成像技术，主要包括双光子显微镜和三光子显微镜，其原理是使用高光子密度激发发光材料，使其同时吸收两个光子或三个光子跃迁到激发态。相对于传统的共聚焦显微镜，多光子共焦显微镜具有以下优势：(1)可以采用在生物组织中穿透能力比较强的红外激光作为激发光源，可以解决生物组织中深层物质的成像问题；(2)由于多光子荧光波长远离激发光波长，因此多光子共焦显微镜可以实现暗场成像；(3)多光子荧光可以避免普通荧光成像中的荧光漂白问题和对生物细胞的光致毒问题；(4)多光子跃迁具有很强的选择激发性，有利于对生物组织中一些特殊物质进行成像研究。
由于多光子显微镜通常使用红外光源作为激发光源，根据Ernst Abbe成像理论，远场光学显微镜的横向分辨率极限约为λ/2NA，其中λ是光波波长， NA为透镜数值孔径且小于1，因此在可见光波段内，多光子荧光显微镜的横向分辨极限为300纳米。但是，细胞的细微结构、调节细胞增殖﹑分化﹑凋亡以及信号传递等体系的特征尺度都在纳米量级，所以多光子显微镜分辨率的提高就成为一个亟需解决的难题。
美国专利公开的专利号为US5731588的受激辐射损耗显微镜(STED)是第一个突破衍射限制的超分辨显微镜，这项技术在2006年度被《Science》杂志评选为科学界十大突破之一，2008年被《Nature method》杂志评为年度技术，最终于2014年获得诺贝尔化学奖。STED显微术的基本原理是使用两束组合激光，一束激光被聚焦成正常的衍射极限焦斑，使焦斑内的荧光分子处于激发态，另一束波长较长的经过相位调制的中心为零点激光，称为退激发光，使激发态的电子以受激发射损耗的方式回到基态，并发出一个与退激发光波长相同的光子。
经过二十年的不断改进和创新，STED超分辨显微术已取得了长足进步，日趋成熟和多样化。已经有专利公开了双光子STED显微术(CN 101821607A)。目前实现双光子STED成像的组装方式为采用两个激光飞秒激光器，一个作为激发光源，一个作为退激发光源。由于需要同步来自两个激光器脉冲的，因此装置非常复杂。更重要的是采用两个飞秒光源会使装置的成本变得昂贵，难以推广应用。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明提供一种结构简单、成本低的多光子超分辨显微成像装置及方法。
第一方面，本发明提供的多光子超分辨显微成像装置，包括：激光光源、分光装置、并光装置、物镜和光子探测器；所述激光光源发出的激光到所述分光装置，所述分光装置将入射的激光并分为激发光和退激发光，所述激发光经过的光路为第一光路，所述退激发光经过的光路为第二光路，所述第二光路中设有空间调制装置，所述空间调制装置用于对所述退激发光进行空间调制，使得所述退激发光的光斑成为中心零点的光斑；所述并光装置用于将所述激发光和所述退激发光重叠为同轴光线，重叠后的激光用于经物镜聚焦后照射荧光样品，光子探测器用于采集探测荧光样品发出的荧光，进行成像。
本发明提供的多光子超分辨显微成像装置，仅使用一个激光光源，通过偏分光装置将激光分成两束，一束作为退激发光，另一束作为激发光，退激发光经相位调制变成中心零点的光斑，然后将激发光和退激发光通过并光装置合并为同轴光线，并由物镜聚焦到待测样品上，激发待测样品的荧光。产生的荧光进入单光子探测器进行采集，进行成像。由于本发明中使用的激发光和退激发光来自同一台激光器，因此他们的脉冲重复频率从本质上是同步的，无需使用额外的电子元器件,结构简单、成本低。
根据本发明提供的一实施方式，所述第二光路中还设有脉冲拉宽装置和脉冲时间调制装置。
根据本发明提供的一实施方式，所述脉冲拉宽装置包括多个脉冲拉宽器。
根据本发明提供的一实施方式，所述第二光路中还设有第一能量开关，用于控制所述退激发光的激光能量。
根据本发明提供的一实施方式，所述激发光和所述退激发光重叠后的激光还经过第二能量开关，所述第二能量开关用于控制重叠后激光的激光能量。
根据本发明提供的一实施方式，所述光子探测器的入射端还设置有滤镜，所述滤镜用于选择所需测量的光谱范围。
根据本发明提供的一实施方式，所述第一光路中设有第一扩束器，所述第二光路中设有第二扩束器，且所述第二激光先经过所述第二扩束器扩束后，进入所述空间调制装置。
根据本发明提供的一实施方式，所述第一扩束器和所述第二扩束器均为凸透镜。
根据本发明提供的一实施方式，还包括半波片，所述激光光源发出的激光经所述半波片入射到所述分光装置。
第二方面，本发明提供的多光子超分辨显微成像方法，包括如下步骤：
步骤S1，将初始激光分为激发光和退激发光；
步骤S2，对所述退激发光进行空间调制，使得所述退激发光的光斑成为中心零点的光斑；
步骤S3，将所述激发光和所述退激发光重叠为同轴光线，并聚焦于待测荧光物上；
步骤S4，采集荧光样品发出的荧光，获得图像。
本发明提供的多光子超分辨显微成像方法，将初始激光分成两束，一束作为退激发光，另一束作为激发光，退激发光经相位调制变成中心零点的光斑，然后将激发光和退激发光合并为同轴光线，并聚焦到待测样品上，激发待测样品的荧光，荧光样品发出的荧光，进行成像。由于本发明中使用的激发光和退激发光来自同一台激光器，因此他们的脉冲重复频率从本质上是同步的，无需使用额外的电子元器件,结构简单、成本低。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。在所有附图中，类似的元件或部分一般由类似的附图标记标识。附图中，各元件或部分并不一定按照实际的比例绘制。
图1为一实施例提供的多光子超分辨显微成像装置的结构示意图；
图2为一实施例提供的对退激发光进行时间调制的示意图；
图3为一实施例提供的对退激发光空间调制所使用的相位板图；
图4为一实施例提供的多光子超分辨显微成像方法的原理图。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。
图1到图3为一实施例提供的多光子超分辨显微成像装置，附图标记如下：
1-激光光源，2-半波片，3-分光装置，4-第一扩束器，5-并光装置，6- 玻璃棒，7-脉冲时间调制装置，8-单模保偏光纤，9-第二能量开关，10-第二扩束器，11-空间调制装置，12-第二能量开关，13-双色分光镜，14-偏振调控装置，15-扫描控制装置，16-物镜，17-载物台，18-滤镜，19-光子探测器， 20-计算机。
本实施例的本发明提供的多光子超分辨显微成像装置，包括：激光光源1、分光装置3、并光装置5、物镜16和光子探测器19；所述激光光源1发出的激光到所述分光装置3，所述分光装置3将入射的激光并分为激发光和退激发光，所述激发光经过的光路为第一光路，所述退激发光经过的光路为第二光路，所述第二光路中设有空间调制装置11，所述空间调制装置11用于对所述退激发光进行空间调制，使得所述退激发光的光斑成为中心零点的光斑；所述并光装置5用于将所述激发光和所述退激发光重叠为同轴光线，重叠后的激光用于经物镜16聚焦后照射荧光样品，光子探测器19用于采集探测荧光样品发出的荧光，上传到计算机20数模转换后，进行成像。
其中，所述激光光源1为飞秒脉冲激光器，所述空间调制装置11为涡旋相位板。所述分光装置3和所述并光装置5均为分光棱镜。
本发明提供的多光子超分辨显微成像装置，仅使用一个激光光源1，通过偏分光装置3将激光分成两束，一束作为退激发光，另一束作为激发光，退激发光经相位调制变成中心零点的光斑，然后将激发光和退激发光通过并光装置 5合并为同轴光线，并由物镜16聚焦到待测样品上，激发待测样品的荧光。产生的荧光进入单光子探测器19进行采集，进行成像。由于本发明中使用的激发光和退激发光来自同一台激光器，因此他们的脉冲重复频率从本质上是同步的，无需使用额外的电子元器件,结构简单、成本低。
根据本发明提供的一实施方式，所述第二光路中还设有脉冲拉宽装置和脉冲时间调制装置7。本实施例采用飞秒激光作为初始光源，为了达到更好的退激发效果，需要把脉冲宽度拉宽到200到300皮秒。本实施例中，脉冲拉宽装置使用30厘米长的高折射率玻璃棒6和100米长的保偏单模光纤，高折射率玻璃棒6G将脉冲宽度先拉宽到皮秒级，之后将退激发光导入100米长的单模保偏光纤8进一步拉宽到300皮秒左右。
进一步地，所述第二光路中还设有第一能量开关，用于控制所述退激发光的激光能量。所述激发光和所述退激发光重叠后的激光还经过第二能量开关，所述第二能量开关用于控制重叠后激光的激光能量。通过第一能量开关和第二能量开关调节激发光和退激发光的能量，从而匹配样品的荧光分子。
所述光子探测器19的入射端还设置有滤镜18，用于选择所需测量的光谱范围，防止其他光谱影响成像效果。
根据本发明提供的一实施方式，所述第一光路中设有第一扩束器4，所述第二光路中设有第二扩束器10，且所述第二激光先经过所述第二扩束器10扩束后，进入所述空间调制装置11。所述第一扩束器4和所述第二扩束器10均为凸透镜。
具体的，本实施例的多光子超分辨显微成像装置还包括半波片2，所述激光光源1发出的激光经所述半波片2入射到所述分光装置3。物镜16的入射端还设有用于控制扫描范围的扫描控制装置15，扫描控制装置15为三维纳米移动平台，当然也可以为声光振镜。
在扫描控制装置15的入射端还进一步设有偏振调控装置14，用于调节激光的偏振性，使其满足激光空间调制装置11的需求，先透过偏振调控装置14，然后进入扫描控制装置15。
其中，本装置还设有二色分光镜，光子探测器19、滤镜18、双色分光镜 13、偏振调控装置14、扫描控制装置15、物镜16和载物台17依次设置在同一直线上。所述激发光和退激发光重叠后，经双色分光镜13反射进入偏振调控装置14，并依次穿过扫描控制装置15和物镜16，聚焦在待测样品上。样品发出的荧光，依次穿过物镜16、扫描控制装置15、偏振调控装置14、双色分光镜13和滤镜18进入光子探测器19，通过计算机20进行成像。
参照图4，另一实施例中，本发明提供的多光子超分辨显微成像方法，包括如下步骤：
步骤S1，将初始激光分为激发光和退激发光；
步骤S2，对所述退激发光进行空间调制，使得所述退激发光的光斑成为中心零点的光斑；
步骤S3，将所述激发光和所述退激发光重叠为同轴光线，并聚焦于待测荧光物上；
步骤S4，采集荧光样品发出的荧光，获得图像。
本发明提供的多光子超分辨显微成像方法，将初始激光分成两束，一束作为退激发光，另一束作为激发光，退激发光经相位调制变成中心零点的光斑，然后将激发光和退激发光合并为同轴光线，并聚焦到待测样品上，激发待测样品的荧光，荧光样品发出的荧光，进行成像。由于本发明中使用的激发光和退激发光来自同一台激光器，因此他们的脉冲重复频率从本质上是同步的，无需使用额外的电子元器件,结构简单、成本低。
进一步地，步骤S2之前，还对所述退激发光进行扩束，步骤S3之前，对所述激发光进行扩束。为了使激发光和退激发光到达待测样品的时间一致，还对退激发光进行时间调制。
在本申请的描述中，需要理解的是，术语“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
此外，术语“第一”、“第二”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个以上，除非另有明确具体的限定。
本发明的说明书中，说明了大量具体细节。然而，能够理解，本发明的实施例可以在没有这些具体细节的情况下实践。在一些实例中，并未详细示出公知的方法、结构和技术，以便不模糊对本说明书的理解。
在本说明书的描述中，具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。

Claims (10)

1.一种多光子超分辨显微成像装置，其特征在于，包括：激光光源、分光装置、并光装置、物镜和光子探测器；所述激光光源发出的激光到所述分光装置，所述分光装置将入射的激光并分为激发光和退激发光，所述激发光经过的光路为第一光路，所述退激发光经过的光路为第二光路，所述第二光路中设有空间调制装置，所述空间调制装置用于对所述退激发光进行空间调制，使得所述退激发光的光斑成为中心零点的光斑；所述并光装置用于将所述激发光和所述退激发光重叠为同轴光线，重叠后的激光用于经物镜聚焦后照射荧光样品，光子探测器用于采集探测荧光样品发出的荧光，进行成像。
2.根据权利要求1所述的多光子超分辨显微成像装置，其特征在于，所述第二光路中还设有脉冲拉宽装置和脉冲时间调制装置。
3.根据权利要求2所述的多光子超分辨显微成像装置，其特征在于，所述脉冲拉宽装置包括多个脉冲拉宽器。
4.根据权利要求1所述的多光子超分辨显微成像装置，其特征在于，所述第二光路中还设有第一能量开关，用于控制所述退激发光的激光能量。
5.根据权利要求1所述的多光子超分辨显微成像装置，其特征在于，所述激发光和所述退激发光重叠后的激光还经过第二能量开关，所述第二能量开关用于控制重叠后激光的激光能量。
6.根据权利要求1所述的多光子超分辨显微成像装置，其特征在于，所述光子探测器的入射端还设置有滤镜，所述滤镜用于选择所需测量的光谱范围。
7.根据权利要求1所述的多光子超分辨显微成像装置，其特征在于，所述第一光路中设有第一扩束器，所述第二光路中设有第二扩束器，且所述第二激光先经过所述第二扩束器扩束后，进入所述空间调制装置。
8.根据权利要求7所述的多光子超分辨显微成像装置，其特征在于，所述第一扩束器和所述第二扩束器均为凸透镜。
9.根据权利要求1所述的多光子超分辨显微成像装置，其特征在于，还包括半波片，所述激光光源发出的激光经所述半波片入射到所述分光装置。
10.一种多光子超分辨显微成像方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤S1，将初始激光分为激发光和退激发光；
步骤S2，对所述退激发光进行空间调制，使得所述退激发光的光斑成为中心零点的光斑；
步骤S3，将所述激发光和所述退激发光重叠为同轴光线，并聚焦于待测荧光样品上；
步骤S4，采集荧光样品发出的荧光，获得图像。
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