CN110068560A - 一种受激辐射损耗超分辨成像系统及方法 - Google Patents

Abstract

本发明实施例公开了一种受激辐射损耗超分辨成像系统及方法，通过分光单元将激光器产生的入射光分离为波长不同的激发光和擦除光；然后由第一光路调整单元调整激发光和擦除光的方向，将激发光与擦除光进行重叠；再由扫描单元将重叠后的激发光和擦除光同步扫描至待成像样品；最后成像单元对待成像样品受激发所产生的荧光信号进行STED超分辨成像。通过本发明的实施，由分光单元通过分光的方式从单一光源中分离出STED超分辨成像所需的两种类型的激光，可以有效降低系统硬件冗杂度，扩展了系统的应用范围，并节省了成像成本。

Description

一种受激辐射损耗超分辨成像系统及方法

技术领域

本发明涉及光学成像显微领域，尤其涉及一种受激辐射损耗超分辨成像系统及方法。

背景技术

受激辐射损耗(Stimulated Emission Depletion,STED)显微技术是一种超分辨成像技术，可以突破衍射极限对光学显微镜的分辨率的限制，实现超分辨显微成像。

具体地说，STED技术是针对扫描成像系统的一种空域处理的技术，其原理为利用两束激光来进行显微成像，其中一束为激发光，用于激发荧光材料；而另一束是光斑形状为圆环状，与激发光共轴且波长与荧光分子发射波长匹配的擦除光(也称为STED光)，用来使两束光重叠区域产生受激辐射作用，而在中心区域的荧光分子则不受擦除光的影响，只会发生自发辐射。由于自发辐射的波长和受激辐射的波长不同，因此可以通过滤光片滤掉受激辐射的光，达到减小成像光斑的目标，从而提升系统的分辨率。

由于该显微技术需要依赖于两种类型的光来实现，目前通常是通过设置两个单独的激光器，来分别产生激发光与擦除光，因此目前的STED超分辨显微系统的硬件冗杂度相对较高，应用范围较为局限，成像成本较高。

发明内容

本发明实施例的主要目的在于提供一种受激辐射损耗超分辨成像系统及方法，至少能够解决相关技术中在进行STED超分辨成像时，通过设置两个单独的激光器来分别产生激发光与擦除光，所导致的系统硬件冗杂度较高、应用范围较为局限以及成像成本较高的问题。

为实现上述目的，本发明实施例第一方面提供了一种受激辐射损耗超分辨成像系统，包括：激光器、分光单元、第一光路调整单元、扫描单元以及成像单元；

所述激光器用于产生入射光；

所述分光单元用于将所述入射光分离为波长不同的激发光和擦除光；

所述第一光路调整单元用于调整所述激发光和擦除光的方向，将所述激发光与擦除光进行重叠；

所述扫描单元用于将重叠后的所述激发光和擦除光同步扫描至待成像样品；

所述成像单元用于对所述待成像样品受激发所产生的荧光信号进行STED超分辨成像。

为实现上述目的，本发明实施例第二方面提供了一种受激辐射损耗超分辨成像方法，应用于上述受激辐射损耗超分辨成像系统，该受激辐射损耗超分辨成像方法包括：

所述分光单元将所述激光器产生的入射光分离为波长不同的激发光和擦除光；

所述第一光路调整单元调整所述激发光和擦除光的方向，将所述激发光与擦除光进行重叠；

所述扫描单元将重叠后的所述激发光和擦除光同步扫描至待成像样品；

所述成像单元对所述待成像样品受激发所产生的荧光信号进行STED超分辨成像。

根据本发明实施例所提供的受激辐射损耗超分辨成像系统及方法，通过分光单元将激光器产生的入射光分离为波长不同的激发光和擦除光；然后由第一光路调整单元调整激发光和擦除光的方向，将激发光与擦除光进行重叠；再由扫描单元将重叠后的激发光和擦除光同步扫描至待成像样品；最后成像单元对待成像样品受激发所产生的荧光信号进行STED超分辨成像。通过本发明的实施，由分光单元通过分光的方式从单一光源中分离出STED超分辨成像所需的两种类型的激光，可以有效降低系统硬件冗杂度，扩展了系统的应用范围，并节省了成像成本。

本发明其他特征和相应的效果在说明书的后面部分进行阐述说明，且应当理解，至少部分效果从本发明说明书中的记载变得显而易见。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或相关技术中的技术方案，下面将对实施例或相关技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明第一实施例提供的一种受激辐射损耗超分辨成像系统的结构框图；

图2为本发明第一实施例提供的STED超分辨成像的原理图；

图3为本发明第二实施例提供的双色受激辐射损耗超分辨成像系统的结构示意图；

图4a至4d分别为本发明第二实施例提供的DM1、DM2、DMD1以及DMD2的透过率曲线图；

图5为本发明第二实施例提供的激发光与擦除光的重合效果图；

图6为本发明第三实施例提供的受激辐射损耗超分辨成像的流程示意图。

具体实施方式

为使得本发明的发明目的、特征、优点能够更加的明显和易懂，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而非全部实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

第一实施例：

为了解决相关技术中在进行STED超分辨成像时，通过设置两个单独的激光器来分别产生激发光与擦除光，所导致的系统硬件冗杂度较高、应用范围较为局限以及成像成本较高的技术问题，本实施例提出了一种受激辐射损耗超分辨成像系统，具体请参见图1，本实施例提出的受激辐射损耗STED超分辨成像系统包括：激光器101、分光单元102、第一光路调整单元103、扫描单元104以及成像单元105；

激光器101用于产生入射光；

分光单元102用于将入射光分离为波长不同的激发光和擦除光；

第一光路调整单元103用于调整激发光和擦除光的方向，将激发光与擦除光进行重叠；

扫描单元104用于将重叠后的激发光和擦除光同步扫描至待成像样品；

成像单元105用于对待成像样品受激发所产生的荧光信号进行STED超分辨成像。

具体的，在本实施例中，STED超分辨成像所需的激发光和擦除光源自于同一光源，通过采用分光单元以分光的形式来实现从单一光源中得到两种类型的光，在实际应用中，激光器可以采用白光激光器，该激光器所产生的入射光至少支持被分为两种不同波长的光，更进一步地，该白光激光器可以为超连续谱飞秒脉冲白光激光器。并且，本实施例中通过将所分出的两束光进行重叠，然后照射至样品上，以使样品受激辐射，而使得样品上的荧光材料被激发产生荧光信号，然后该荧光信号被传输至成像单元进行STED超分辨成像以进行观察处理。如图2所示为本实施例提供的STED超分辨成像的原理图。

在本实施例的一种实施方式中，受激辐射损耗超分辨成像系统还包括：第二光路调整单元；第二光路调整单元包括低通滤波片和偏光镜。

具体的，低通滤波片用于从激光器产生的入射光中筛选出目标波长的光，偏光镜用于将得到低通滤波片出射的目标波长的光整形为线偏振光；对应的，分光单元则具体用于将整形后的线偏振光分离为波长不同的激发光和擦除光。此外，还应当说明的是，本实施例中可以将激光器产生的入射光通过单模光纤传输至低通滤波片，通过单模光纤对飞秒激光器中出射的激光进行模式调控。

在本实施例的一种实施方式中，分光单元102包括：第一分束子单元、第二分束子单元以及带通滤波子单元；第一分束子单元用于将入射光分离为波长不同的单路激发光和擦除光；带通滤波子单元用于将单路激发光分离为多路激发光；第二分束子单元用于将单路擦除光分离为对应于多路激发光的多路擦除光。

具体的，由于单一波长的激发光只能对一部分的荧光材料具有激发效应，从而单一波长的激光只能实现单色STED超分辨成像，本实施例中可以通过带通滤波子单元将单路激发光分离为多路，并由第二分束子单元将单路擦除光分离为与激发光分别对应的多路擦除光。并且对应的，第一光路调整单元具体用于调整多路激发光和多路擦除光的方向，将各路激发光分别与对应的擦除光进行重叠，并将所形成的多路重叠光调整为共轴，扫描单元具体用于将多路重叠光均同步扫描至待成像样品，成像单元具体用于对待成像样品受激发所产生的所有荧光信号进行多色STED超分辨成像。应当理解的是，在需要实现双色STED超分辨成像时，带通滤波子单元采用两个带通滤波器实现，也即分别通过一个带通滤波器滤过一路激发光，而第二分束子单元则单个分束器实现。此外，还应当说明的是，本实施例中多路激发光的传输光路上还可以设置有角反射器，用于改变激发光的光路，可在时间上控制激发光和擦除光之间的脉冲间隔。

进一步地，在本实施例的一种实施方式中，分光单元102还包括：螺旋相位板；螺旋相位板用于将多路擦除光的波前由高斯型分布转换为环形分布。

具体的，本实施例中通过螺旋相位板来将擦除光转换为涡旋光束，也即该光束的波前沿传播方向上的轴螺旋前进，这种旋转导致光束在光轴处相互抵消，投影到一个平面上形成中心具有暗孔的光环。

进一步地，在本实施例的一种实施方式中，在第二分束子单元所分离的擦除光以及带通滤波子单元所分离的激发光均为两路时，第一光路调整单元103包括：第一二向色镜、第二二向色镜、第三二向色镜以及第四二向色镜；第一二向色镜用于反射第一路激发光，并透射对应于第一路激发光的第一路擦除光，将第一路激发光与第一路擦除光进行重叠；第二二向色镜用于反射第二路激发光，并透射对应于第二路激发光的第二路擦除光，将第二路激发光与第二路擦除光进行重叠；第三二向色镜用于反射重叠后的第二路激发光与第二路擦除光；第四二向色镜用于反射重叠后的第一路激发光与第一路擦除光。

具体的，本实施例中在进行双色STED超分辨成像时，所分离出的激发光和擦除光分别为两路，在一种优选的实施方式中，第一路激发光、第二路激发光、第一路擦除光以及第二路擦除光的波长可以分别为：488nm、635nm、592nm以及775nm。本实施例中所分离出的激发光和擦除光需要进行光路调整，也即分别通过第一二向色镜和第二二向色镜分别形成一路重叠后的光，然后再通过第三二向色镜和第四二向色镜将所形成的两路重叠光调整为共轴。应当说明的是，在本实施例一种优选的实施方式中，可以将第三二向色镜以及第四二向色镜设置于扫描单元与成像单元之间的光路上，从而第三二向色镜以及第四二向色镜还用于在荧光信号传输至成像单元的过程中，透射荧光信号。

在本实施例的一种实施方式中，扫描单元104包括：在光路的传播方向上一次设置的扫描振镜、四分之一玻片以及高数值孔径物镜。

具体的，扫描振镜用于对重叠后的激发光和擦除光进行同步扫描；四分之一玻片用于将扫描振镜出射的光由线偏振转化为圆偏振；高数值孔径物镜用于将四分之一玻片出射的光聚焦至待成像样品。

在本实施例的一种实施方式中，成像单元105包括：窄带带通滤波片、光电倍增管以及显示与处理子单元。

具体的，窄带带通滤波片用于对待成像样品受激发所产生的荧光信号中，目标波段之外的杂散光进行过滤；光电倍增管用于放大窄带带通滤波片出射的荧光信号；显示与处理子单元用于将光电倍增管出射的荧光信号进行STED超分辨成像处理。还应当说明的是，在将窄带带通滤波片出射的荧光信号传输至光电倍增管时，可以采用多模光纤进行传输，光纤纤芯可作为小孔，接收透镜聚焦的荧光信号，并排除杂散光的影响。

本实施例提供的受激辐射损耗超分辨成像系统，通过分光单元将激光器产生的入射光分离为波长不同的激发光和擦除光；然后由第一光路调整单元调整激发光和擦除光的方向，将激发光与擦除光进行重叠；再由扫描单元将重叠后的激发光和擦除光同步扫描至待成像样品；最后成像单元对待成像样品受激发所产生的荧光信号进行STED超分辨成像。通过本发明的实施，由分光单元通过分光的方式从单一光源中分离出STED超分辨成像所需的两种类型的激光，可以有效降低系统硬件冗杂度，扩展了系统的应用范围，并节省了成像成本。

第二实施例：

为了更加直观的理解本发明实施例中的受激辐射损耗超分辨成像系统，本发明实施例二以一个具体的示例对受激辐射损耗超分辨成像系统进行详细说明。如图3所示为本实施例提供的双色受激辐射损耗超分辨成像系统的结构示意图，包括：

超连续谱飞秒脉冲白光激光器(Laser)，用于产生可分为四种波长的白光光源；

单模光纤(SMF)，用于对飞秒激光器中出射的激光进行模式调控；

低通滤波片(F1)，用于筛选出所需要范围内的光波长；

反射镜(M)，用于反射入射光，改变光束传输方向；

偏光镜(H)，用于保证所在光路的激光为线偏振光；

分束器(PBS1，PBS2)，可对光束进行分光，并可调节分光比例；

螺旋相位板(VPP)，用于将两路擦除光的波前由高斯型转换成环形分布；

二向色镜(DM1)，用于反射第一路激发光(488nm)，透射第一路擦除光(592nm)和第二路激发光(635nm)，同时还可以微调第一路激发光的传输方向，使激发光和损耗光能够很好的重叠；

二向色镜(DM2)，用于反射第二路激发光(635nm)，透射第二路擦除光(775nm)，同时还可以微调第二路激发光的传输方向，使激发光和损耗光能够很好的重叠；

二向色镜(DMD1)，用于反射第二路激发光与擦除光(635nm和775nm)，同时透射样品(sample)被激发后所产生的荧光信号的光；

二向色镜(DMD2)，用于反射第一路激发光与擦除光(488nm和592nm)，透射第二路激发光与擦除光(635nm和775nm)，同时透射样品被激发后所产生的荧光信号的光；

角反射器(RR)，用于改变激发光的光路，可在时间上控制激发光和擦除光之间的脉冲间隔；

透镜(L1，L2，L3)，用于对入射激光进行聚焦或发散，组合使用可以扩大或缩小光斑直径；

振镜扫描系统(Scanner)，用于对重合后的激发光和擦除光进行扫描，实现对样品的面阵成像；

四分之一玻片(QWP)，用于将擦除激光由线偏振转化为圆偏振；

带通滤波片(F2，F3，F4，F5)，用于筛选出单一波长的激发光及其对应的擦除光；

窄带带通滤波片(F6)，用于透过所要收集波段的荧光信号，并过滤此波段以外的杂散光；

多模光纤(MMF)，用于将收集到的荧光信号传输给光电倍增管PMT；光纤纤芯可作为小孔，接收透镜L3聚焦的荧光信号，并排除杂散光的影响；

光电倍增管(PMT)，用于接收样品的荧光信号并放大该信号；

高数值孔径物镜(OL)，放大倍率为100倍，数值孔径为1.4，用于聚焦重叠的激发光和损耗光，同时收集样品反射回来的荧光信号。

如图4a至4d分别为本实施例提供的DM1、DM2、DMD1以及DMD2的透过率曲线图。如表1所示为本实施例提供的各滤波片与二向色镜的型号表。

表1

白光激光器发出宽带激光，经低通滤波片F1后仅允许800nm以下波光的激光通过，然后经偏光镜H使激光为线偏振光，随后经过分束器PBS1，分成的两路光可分别作为激发光和擦除光。激发光经过转轮，转轮上安置了F2和F3，分别可通过488nm与635nm波长的激发光，旋转转轮即可选择使用特定的激发波长；488nm激发光与635nm激发光经过相同的路径进入角反射器(RR)，角反射器可以对激发光的光程进行调节，且对两个波长的激发光都具有调节作用，前提是角反射器的位置必须与光路保持严格垂直，否则进行光程调节时会对光路的传播产生偏差。经过延时后激发光到达第一个二向色镜DM1的位置，系统中的二向色镜与入射光线成45°夹角时为最佳位置。

擦除光经过L1和L2两个透镜(L2焦距为L1的两倍)将光斑放大两倍，然后经过螺旋相位板VPP形成环形光，随后再由分束器PBS2分成两束光，其中一束光经过带通滤波片F4，成为592nm的窄带激光，作为第一路擦除光到达第一个二向色镜DM1处；另一束经过带通滤波片F5成为775nm的窄带激光，作为第二路擦除光到达第二个二向色镜DM2处。

在转轮滤波片选择为F2时，则激发光光路仅存在488nm波长的激发光，此时在DM1处488nm激发光发生反射，第一路592nm擦除光在此处发生透射，488nm激发光与592nm擦除光在DM1处产生重合，DM1可调节488nm激发光与592nm擦除光的重合度，形成如图5所示的效果，如图5所示为本实施例提供的激发光与擦除光的重合效果图。488nm激发光与592nm擦除光重合之后经过DMD2均发生反射，重合光经过反射镜M进入扫描振镜Scanner进行同步扫描，再经过四分之一玻片QWP，将擦除光由线偏振转变为圆偏振，最后经过高数值孔径物镜(OL)后对样品(sample)进行扫描形成面阵成像。样品发出荧光后，荧光沿着入射光路返回到达DMD2处发生透射，在DMD1处同样发生透射，再经过透镜L3聚焦和窄带带通滤波片F6透过所要收集波段的荧光信号，并过滤此波段以外的杂散光进入多模光纤(MMF)到达光电倍增管PMT。最后PMT进行信号放大并将信号数据传到显示与处理子单元(如电脑)成像以进行观察和处理。

在转轮滤波片选择为F3时，则激发光光路仅存在635nm波长的激发光，此时在DM1处635nm激发光发生透射，在DM2处发生反射，第二路775nm擦除光在此处发生透射，635nm激发光与775nm擦除光在DM2处产生重合，DM2可调节635nm激发光与775nm擦除光的重合度。635nm激发光与775nm擦除光重合之后经过DMD1发生反射，在DMD2处均发生透射。与第一路光相同，重合光随后进入扫描振镜进行同步扫描，再经过四分之一玻片，将擦除光由线偏振转变为圆偏振，最后经过物镜后对样品进行扫描形成面阵成像。样品发出荧光后，荧光沿着入射光路返回到达DMD2处发生透射，在DMD1处同样发生透射，再经过L3聚焦和F6透过所要收集波段的荧光信号，并过滤此波段以外的杂散光进入多模光纤(MMF)到达PMT。最后PMT进行信号放大并将信号数据传到显示与处理子单元(如电脑)成像以进行观察和处理。

通过本发明实施例提供的受激辐射损耗超分辨成像系统，该系统设计可以达到利用单一白光光源实现双色STED成像，在节省材料成本的情况下，也拓展了STED系统的应用范围。

第三实施例：

为了解决相关技术中在进行STED超分辨成像时，通过设置两个单独的激光器来分别产生激发光与擦除光，所导致的系统硬件冗杂度较高、应用范围较为局限以及成像成本较高的技术问题，本实施例还提供了一种受激辐射损耗超分辨成像方法，应用于前述实施例中所述的包括激光器、分光单元、第一光路调整单元、扫描单元以及成像单元的受激辐射损耗超分辨成像系统，如图6所示，本实施例提出的受激辐射损耗超分辨成像方法包括以下的步骤：

步骤601、分光单元将激光器产生的入射光分离为波长不同的激发光和擦除光；

步骤602、第一光路调整单元调整激发光和擦除光的方向，将激发光与擦除光进行重叠；

步骤603、扫描单元将重叠后的激发光和擦除光同步扫描至待成像样品；

步骤604、成像单元对待成像样品受激发所产生的荧光信号进行STED超分辨成像。

其中，在本实施例中，STED超分辨成像所需的激发光和擦除光源自于同一光源，通过分光的形式来实现从单一光源中得到两种类型的光。通过将所分出的两束光进行重叠，然后照射至样品上，以使样品受激辐射，而使得样品上的荧光材料被激发产生荧光信号，然后该荧光信号被传输至成像单元进行STED超分辨成像以进行观察处理。

在本实施例的一些实施方式中，受激辐射损耗超分辨成像系统还包括：第二光路调整单元；第二光路调整单元包括低通滤波片和偏光镜；在分光单元将激光器产生的入射光分离为波长不同的激发光和擦除光之前，还包括：低通滤波片从激光器产生的入射光中筛选出目标波长的光；偏光镜将得到低通滤波片出射的目标波长的光整形为线偏振光。对应的，分光单元将激光器产生的入射光分离为波长不同的激发光和擦除光包括：分光单元将将整形后的线偏振光分离为波长不同的激发光和擦除光。

在本实施例的一些实施方式中，分光单元包括：第一分束子单元、第二分束子单元以及带通滤波子单元；分光单元将激光器产生的入射光分离为波长不同的激发光和擦除光包括：第一分束子单元将激光器产生的入射光分离为波长不同的单路激发光和擦除光；带通滤波子单元将单路激发光分离为多路激发光，以及第二分束子单元将单路擦除光分离为分别对应于多路激发光的多路擦除光。对应的，第一光路调整单元调整激发光和擦除光的方向，将激发光与擦除光进行重叠包括：第一光路调整单元调整多路激发光和多路擦除光的方向，将各路激发光分别与对应的擦除光进行重叠，并将所形成的多路重叠光调整为共轴；扫描单元将多路重叠光同步扫描至待成像样品包括：扫描单元将多路重叠光均同步扫描至待成像样品；成像单元对待成像样品受激发所产生的荧光信号进行STED超分辨成像包括：成像单元对待成像样品受激发所产生的所有荧光信号进行多色STED超分辨成像。

进一步地，在本实施例的一些实施方式中，分光单元还包括：螺旋相位板；在第二分束子单元将单路擦除光分离为多路擦除光之前，还包括：螺旋相位板将多路擦除光的波前由高斯型分布转换为环形分布。对应的，第二分束子单元将单路擦除光分离为多路擦除光包括：第二分束子单元将经过螺旋相位板出射的单路擦除光分离为多路擦除光。

在本实施例的一些实施方式中，在第二分束子单元所分离的擦除光以及带通滤波子单元所分离的激发光均为两路时，第一光路调整单元包括：第一二向色镜、第二二向色镜、第三二向色镜以及第四二向色镜；第一光路调整单元调整多路激发光和多路擦除光的方向，将各路激发光分别与对应的擦除光进行重叠，并将所形成的多路重叠光调整为共轴包括：第一二向色镜反射第一路激发光，并透射对应于第一路激发光的第一路擦除光，将第一路激发光与第一路擦除光进行重叠；第二二向色镜反射第二路激发光，并透射对应于第二路激发光的第二路擦除光，将第二路激发光与第二路擦除光进行重叠；第三二向色镜反射重叠后的第二路激发光与第二路擦除光，第四二向色镜反射重叠后的第一路激发光与第一路擦除光，将两路重叠光调整为共轴。

进一步地，在本实施例的一些实施方式中，第一路激发光、第二路激发光、第一路擦除光以及第二路擦除光的波长分别为：488nm、635nm、592nm以及775nm。

在本实施例的一些实施方式中，扫描单元包括：扫描振镜、四分之一玻片以及高数值孔径物镜；扫描单元将重叠后的激发光和擦除光同步扫描至待成像样品包括：扫描振镜对重叠后的激发光和擦除光进行同步扫描；四分之一玻片将扫描振镜出射的光由线偏振转化为圆偏振；高数值孔径物镜将四分之一玻片出射的光聚焦至待成像样品。

在本实施例的一些实施方式中，成像单元包括：窄带带通滤波片、光电倍增管以及显示与处理子单元；成像单元对待成像样品受激发所产生的荧光信号进行STED超分辨成像包括：窄带带通滤波片对待成像样品受激发所产生的荧光信号中，目标波段之外的杂散光进行过滤；光电倍增管放大窄带带通滤波片出射的荧光信号；显示与处理子单元将光电倍增管出射的荧光信号进行STED超分辨成像处理。

应当说明的是，本实施例中的受激辐射损耗超分辨成像方法均可基于前述实施例提供的受激辐射损耗超分辨成像装置实现，所属领域的普通技术人员可以清楚的了解到，为描述的方便和简洁，本实施例中所描述的受激辐射损耗超分辨成像方法的部分执行流程，可以参考前述装置实施例中的对应工作过程，在此不再赘述。

采用本实施例提供的受激辐射损耗超分辨成像方法，通过分光单元将激光器产生的入射光分离为波长不同的激发光和擦除光；然后由第一光路调整单元调整激发光和擦除光的方向，将激发光与擦除光进行重叠；再由扫描单元将重叠后的激发光和擦除光同步扫描至待成像样品；最后成像单元对待成像样品受激发所产生的荧光信号进行STED超分辨成像。通过本发明的实施，由分光单元通过分光的方式从单一光源中分离出STED超分辨成像所需的两种类型的激光，可以有效降低系统硬件冗杂度，扩展了系统的应用范围，并节省了成像成本。

以上内容是结合具体的实施方式对本发明实施例所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种受激辐射损耗超分辨成像系统，其特征在于，包括：激光器、分光单元、第一光路调整单元、扫描单元以及成像单元；

所述激光器用于产生入射光；

所述分光单元用于将所述入射光分离为波长不同的激发光和擦除光；

所述第一光路调整单元用于调整所述激发光和擦除光的方向，将所述激发光与擦除光进行重叠；

所述扫描单元用于将重叠后的所述激发光和擦除光同步扫描至待成像样品；

所述成像单元用于对所述待成像样品受激发所产生的荧光信号进行STED超分辨成像。

2.如权利要求1所述的受激辐射损耗超分辨成像系统，其特征在于，所述分光单元包括：第一分束子单元、第二分束子单元以及带通滤波子单元；

所述第一分束子单元用于将所述入射光分离为波长不同的单路激发光和擦除光；所述带通滤波子单元用于将所述单路激发光分离为多路激发光；所述第二分束子单元用于将所述单路擦除光分离为对应于所述多路激发光的多路擦除光；

所述第一光路调整单元具体用于调整所述多路激发光和多路擦除光的方向，将各路激发光分别与对应的擦除光进行重叠，并将所形成的多路重叠光调整为共轴；

所述扫描单元具体用于将所述多路重叠光均同步扫描至待成像样品；

所述成像单元具体用于对所述待成像样品受激发所产生的所有荧光信号进行多色STED超分辨成像。

3.如权利要求2所述的受激辐射损耗超分辨成像系统，其特征在于，所述分光单元还包括：螺旋相位板；

所述螺旋相位板用于将所述多路擦除光的波前由高斯型分布转换为环形分布。

4.如权利要求2所述的受激辐射损耗超分辨成像系统，其特征在于，在所述第二分束子单元所分离的擦除光以及所述带通滤波子单元所分离的激发光均为两路时，所述第一光路调整单元包括：第一二向色镜、第二二向色镜、第三二向色镜以及第四二向色镜；

所述第一二向色镜用于反射第一路激发光，并透射对应于所述第一路激发光的第一路擦除光，将所述第一路激发光与第一路擦除光进行重叠；

所述第二二向色镜用于反射第二路激发光，并透射对应于所述第二路激发光的第二路擦除光，将所述第二路激发光与第二路擦除光进行重叠；

所述第三二向色镜用于反射重叠后的所述第二路激发光与第二路擦除光；

所述第四二向色镜用于反射重叠后的所述第一路激发光与第一路擦除光。

5.如权利要求4所述的受激辐射损耗超分辨成像系统，其特征在于，所述第一路激发光、所述第二路激发光、所述第一路擦除光以及所述第二路擦除光的波长分别为：488nm、635nm、592nm以及775nm。

6.如权利要求1所述的受激辐射损耗超分辨成像系统，其特征在于，所述扫描单元包括：扫描振镜、四分之一玻片以及高数值孔径物镜；

所述扫描振镜用于对重叠后的所述激发光和擦除光进行同步扫描；

所述四分之一玻片用于将所述扫描振镜出射的光由线偏振转化为圆偏振；

所述高数值孔径物镜用于将所述四分之一玻片出射的光聚焦至所述待成像样品。

7.如权利要求1所述的受激辐射损耗超分辨成像系统，其特征在于，所述成像单元包括：窄带带通滤波片、光电倍增管以及显示与处理子单元；

所述窄带带通滤波片用于对所述待成像样品受激发所产生的荧光信号中，目标波段之外的杂散光进行过滤；

所述光电倍增管用于放大所述窄带带通滤波片出射的荧光信号；

所述显示与处理子单元用于将所述光电倍增管出射的荧光信号进行STED超分辨成像处理。

8.如权利要求1所述的受激辐射损耗超分辨成像系统，其特征在于，还包括：第二光路调整单元；所述第二光路调整单元包括低通滤波片和偏光镜；

所述低通滤波片用于从所述激光器产生的入射光中筛选出目标波长的光；

所述偏光镜用于将得到低通滤波片出射的目标波长的光整形为线偏振光；

所述分光单元具体用于将所述整形后的线偏振光分离为波长不同的激发光和擦除光。

9.一种受激辐射损耗超分辨成像方法，其特征在于，应用于如权利要求1至8中任意一项所述的受激辐射损耗超分辨成像系统，包括：

所述分光单元将所述激光器产生的入射光分离为波长不同的激发光和擦除光；

所述第一光路调整单元调整所述激发光和擦除光的方向，将所述激发光与擦除光进行重叠；

所述扫描单元将重叠后的所述激发光和擦除光同步扫描至待成像样品；

所述成像单元对所述待成像样品受激发所产生的荧光信号进行STED超分辨成像。

10.如权利要求9所述的受激辐射损耗超分辨成像方法，其特征在于，所述分光单元包括：第一分束子单元、第二分束子单元以及带通滤波子单元；

所述分光单元将所述激光器产生的入射光分离为波长不同的激发光和擦除光包括：

所述第一分束子单元将所述激光器产生的入射光分离为波长不同的单路激发光和擦除光；

所述带通滤波子单元将所述单路激发光分离为多路激发光，以及所述第二分束子单元将所述单路擦除光分离为对应于所述多路激发光的多路擦除光；

所述第一光路调整单元调整所述激发光和擦除光的方向，将所述激发光与擦除光进行重叠包括：

所述第一光路调整单元调整所述多路激发光和多路擦除光的方向，将各路激发光分别与对应的擦除光进行重叠，并将所形成的多路重叠光调整为共轴；

所述扫描单元将重叠后的所述激发光和擦除光同步扫描至待成像样品包括：

所述扫描单元将所述多路重叠光均同步扫描至待成像样品；

所述成像单元对所述待成像样品受激发所产生的荧光信号进行STED超分辨成像包括：

所述成像单元对所述待成像样品受激发所产生的所有荧光信号进行多色STED超分辨成像。