CN108802988A - 超分辨光学显微成像系统及其调节方法 - Google Patents

Abstract

本发明的超分辨光学显微成像系统及其调节方法，通过对三维纳米平移台的扫描过程，可以获得激光光束的直观光强分布情况，并可实时观测；使用中空光束消除所述第二实心光束的旁瓣，同时增加第一实心光束以增强光斑的中心光强，有效提高了成像系统的分辨率；利用金纳米颗粒首先对多光束的光斑形状进行调节，包括中空光束，第一实心光束及第二实心光束光斑形状和强度分布调节，然后通过调节光束发散度以及光束的入射角度，完成多光束的重合度调节，对进一步优化STED系统以及多光束超分辨系统的实现，以及成像分辨率的提升具有一定的指导及经验性意义。

Description

超分辨光学显微成像系统及其调节方法

技术领域

本发明涉及超分辨成像技术领域，特别是涉及一种多光束超分辨显微成像系统及其调节方法。

背景技术

光学显微技术因其具有实时、动态观察，对样品损伤较小等优点，在生物医学及细胞生物学等方面有着广泛的应用，但由于光学“衍射极限”的存在，导致其成像分辨率限制在了200nm左右，极大地阻碍了其进一步发展，例如细胞内的一些细胞器，核糖体，线粒体等，无法利用光学显微技术观察其中的精细结构。于是Stefan W.Hell和Jan Wichman于1994年，在共聚焦显微技术的基础上，提出了受激辐射倒空技术(Stimulated Emissiondepletion microscopy，STED)，并于1999年由Hell与Thomas Klar首次完成实验上的验证，该技术利用两束激光调制的方法实现了数十纳米的分辨率，成功使系统的成像分辨率突破了光学“衍射极限”的限制。该技术中的两束激光光束，其中一束作为激发光，另外一束则作为损耗光，两束光束经物镜聚焦照射作用在样品表面，聚焦区域在空间上严格重合。而STED系统分辨率的限制主要取决于I_m与I_s的强度比值，其中，I_m表示损耗光束的强度，I_s则表示激发光束强度，为了获得较高的系统成像分辨率，要求I_m＞＞I_s，这使得损耗光束对细胞样品的损害较大，不利于细胞的长时间成像。因此，科研工作者们为了降低高功率损耗光对细胞样品的“光毒性”作用，提出了G-STED技术，高掺稀土纳米粒子，以及采用时序控制多束光束和材料开关性质的RESOLFT显微技术等STED技术的优化改进方案，其中RESOLFT显微技术是基于材料的光开关性质的STED技术优化方案，需要通过三束激光光束的调制来实现超分辨的效果，而这些多光束超分辨显微技术的核心在于多光束的整形以及重合度的调节。

因此，有必要提出一种超分辨光学显微成像系统及其调节方法，可对多光束超分辨显微成像系统的光束光强分布进行良好的整形，包括实心光束和损耗光束的光斑整形；以及对多波长光束的重合度进行良好的整形。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种超分辨光学显微成像系统及其调节方法，用于解决现有技术中多光束超分辨显微成像系统的光束光强分布整形效果不佳，包括实心光束和损耗光束光斑的整形效果不佳；以及对多波长光束的重合度的整形效果不佳等的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种超分辨光学显微成像系统，包括：两激光光源整形模块、一分光模块、两光束扩束模块、一第一实心光束调节模块、一中空光束调制及光束重合调节模块、一扫描成像及探测模块；

所述激光光源整形模块包括依次排列的激光器、光纤及准直透镜，两所述激光器分别发射第一激光束及第二激光束并经相应的所述光纤及所述准直透镜传输和准直；

所述分光模块用于将经准直的所述第二激光束分为两束子第二激光束；

两所述光束扩束模块分别用于扩束和准直两所述子第二激光束，以形成第二实心光束及第三实心光束；

所述第一实心光束调节模块用于将所述第一激光束调节为左旋圆偏振的第一实心光束；

所述中空光束调制及光束重合调节模块包括涡旋相位板及依次排列的偏振分束器、二向色镜、1/4波片及1/2波片，所述涡旋相位板用于将所述第三实心光束调制为中空光束，所述偏振分束器用于重合所述第二实心光束及所述中空光束，所述二向色镜用于重合所述第二实心光束、所述中空光束及所述第一实心光束形成重合光；

所述扫描成像及探测模块包括分束镜、物镜、样品台、金纳米颗粒及成像装置，所述分束镜用于将所述重合光导入所述物镜。

优选地，所述分光模块包括依次排列的1/2波片及偏振分束器，所述1/2波片及所述偏振分束器的光轴在同一直线上。

进一步地，所述光束扩束模块包括依次排列的扩束短焦胶合透镜及准直长焦胶合透镜，所述扩束短焦胶合透镜及所述准直长焦胶合透镜的光轴在同一直线上。

进一步地，所述第一实心光束调节模块包括依次排列的1/2波片及1/4波片，所述1/2波片及所述1/4波片的光轴在同一直线上。

进一步地，所述激光光源整形模块中的所述光纤包括单模光纤。

进一步地，所述成像装置包括依次排列的准直透镜、多模光纤及光子探测器，

进一步地，所述光子探测器包括由电子倍增电荷耦合器及光电二极管组成的群组中的一种。

进一步地，所述超分辨光学显微成像系统还包括多个银镜，用于改变所述超分辨光学显微成像系统的光路。

本发明还提供一种基于上述所述超分辨光学显微成像系统的调节方法，所述调节步骤包括：

1)所述激光光源整形模块中，所述光纤及所述准直透镜分别对所述第一激光束及所述第二激光束进行光斑的整形与准直；

2)所述扫描成像及探测模块中，所述物镜对所述重合光进行聚焦并照射至所述金纳米颗粒上，并经所述金纳米颗粒的散射增强后发射至所述成像装置，完成实时成像过程；

3)根据实时成像效果，调节所述中空光束调制及光束重合调节模块，完成所述重合光的整形调节及所述重合光的重合度调节。

优选地，所述金纳米颗粒的直径介于70nm～90nm之间。

如上所述，本发明的超分辨光学显微成像系统及其调节方法，通过对三维纳米平移台的扫描过程，可以获得激光光束的直观光强分布情况，并可实时观测；使用中空光束消除所述第二实心光束的旁瓣，同时增加第一实心光束以增强光斑的中心光强，有效提高了成像系统的分辨率；利用金纳米颗粒首先对多光束的光斑形状进行调节，包括中空光束，第一实心光束及第二实心光束光斑形状和强度分布调节，然后通过调节光束发散度以及光束的入射角度，完成多光束的重合度调节，对进一步优化STED系统以及多光束超分辨系统的实现，以及成像分辨率的提升具有一定的指导及经验性意义。

附图说明

图1～图2显示为本发明的超分辨光学显微成像系统的结构示意图。

图3显示为本发明的超分辨光学显微成像系统的第一实心光束的光斑效果图。

图4显示为发明的超分辨光学显微成像系统的中空光束的光斑效果图。

图5显示为本发明的超分辨光学显微成像系统的第二实心光束的光斑效果图。

图6显示为本发明的超分辨光学显微成像系统的第一实心光束、第二实心光束及中空光束叠加后的光斑效果图。

图7显示为本发明的超分辨光学显微成像系统的第一实心光束、第二实心光束及中空光束在三维空间的高斯拟合效果图。

元件标号说明

1 激光光源整形模块

11 激光器

12 光纤

13、651 准直透镜

2 分光模块

21、41、55 1/2波片

22、52 偏振分束器

3 光束扩束模块

31 扩束短焦胶合透镜

32 准直长焦胶合透镜

4 第一实心光束调节模块

42、54 1/4波片

5 中空光束调制及光束重合调节模块

51 涡旋相位板

53 二向色镜

6 扫描成像及探测模块

61 分束镜

62 物镜

63 样品台

64 金纳米颗粒

652 多模光纤

653 光子探测器

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

实施例一

请参阅图1～图7。需要说明的是，本实施例中所提供的图示仅以示意方式说明本发明的基本构想，遂图式中仅显示与本发明中有关的组件而非按照实际实施时的组件数目、形状及尺寸绘制，其实际实施时各组件的型态、数量及比例可为一种随意的改变，且其组件布局型态也可能更为复杂。

如图1及图2所示，本发明提供一种超分辨光学显微成像系统，所述超分辨光学显微成像系统包括：两激光光源整形模块1、一分光模块2、两光束扩束模块3、一第一实心光束调节模块4、一中空光束调制及光束重合调节模块5、一扫描成像及探测模块6；

所述激光光源整形模块1包括依次排列的激光器11、光纤12及准直透镜13，两所述激光器11分别发射第一激光束及第二激光束并经相应的所述光纤12及所述准直透镜13传输和准直；

所述分光模块2用于将经准直的所述第二激光束分为两束子第二激光束；

两所述光束扩束模块3分别用于扩束和准直两所述子第二激光束，以形成第二实心光束及第三实心光束；

所述第一实心光束调节模块4用于将所述第一激光束调节为左旋圆偏振的第一实心光束；

所述中空光束调制及光束重合调节模块5包括涡旋相位板51及依次排列的偏振分束器52、二向色镜53、1/4波片54及1/2波片55，所述涡旋相位板51用于将所述第三实心光束调制为中空光束，所述偏振分束器52用于重合所述第二实心光束及所述中空光束，所述二向色镜53用于重合所述第二实心光束、所述中空光束及所述第一实心光束形成重合光；

所述扫描成像及探测模块6包括分束镜61、物镜62、样品台63、金纳米颗粒64及成像装置，所述分束镜61用于将所述重合光导入所述物镜62。

作为示例，所述分光模块2包括依次排列的1/2波片21及偏振分束器22，所述1/2波片21及所述偏振分束器22的光轴在同一直线上。

作为示例，所述光束扩束模块3包括依次排列的扩束短焦胶合透镜31及准直长焦胶合透镜32，所述扩束短焦胶合透镜31及所述准直长焦胶合透镜32的光轴在同一直线上。

作为示例，所述第一实心光束调节模块4包括依次排列的1/2波片41及1/4波片42，所述1/2波片41及所述1/4波片42的光轴在同一直线上。

作为示例，所述激光光源整形模块1中的所述光纤12包括单模光纤。

作为示例，所述成像装置包括依次排列的准直透镜651、多模光纤652及光子探测器653。优选地，所述光子探测器653包括由电子倍增电荷耦合器及光电二极管组成的群组中的一种。

作为示例，所述超分辨光学显微成像系统还包括多个银镜7，用于改变所述超分辨光学显微成像系统的光路。

作为示例，所述物镜62包括100X物镜。

作为示例，所述样品台63包括三维纳米平移台。

以所述第一激光束为405nm的激光，所述第二激光束为488nm的激光为例，所述超分辨光学显微成像系统的成像过程为：

两所述激光器11分别发射405nm的第一激光束及488nm的第二激光束，所述第一激光束耦合进入所述光纤12并经所述准直透镜13准直进入所述第一实心光束调节模块4，所述第一激光束经过所述第一实心光束调节模块4中所述1/2波片41及所述1/4波片42整形调节为左旋圆偏振的第一实心光束，所述第一实心光束经所述二向色镜53的反射进入所述中空光束调制及光束重合调节模块5；所述第二激光束耦合进入所述光纤12并经所述准直透镜13准直进入所述分光模块2，所述第二激光束经过所述分光模块2中的所述1/2波片21及所述偏振分束器22分为强度不同的两束子第二激光束，两束所述子第二激光束分别进入两所述光束扩束模块3，经过所述光束扩束模块3中的所述扩束短焦胶合透镜31及所述准直长焦胶合透镜32的扩束和准直后成为第二实心光束及第三实心光束；所述第三实心光束进入所述涡旋相位板51被调制为中空光束；所述第二实心光束经所述银镜7的反射与所述中空光束共同进入所述偏振分束器52，经过所述偏振分束器52后进入所述二向色镜53，此时，所述第二实心光束、所述中空光束及所述第一实心光束经所述二向色镜53重合形成重合光，所述重合光经所述1/4波片54及所述1/2波片55的整形调节进入所述扫描成像及探测模块6，经所述分束镜61的分束，部分所述重合光进入所述物镜62聚焦在所述样品台63上的样品上；最后所述成像装置收集所述样品反射的荧光或激光信号成像，从而完成整个系统的成像过程。

本实施例的超分辨光学显微成像系统，通过对三维纳米平移台的扫描过程，可以获得激光光束的直观光强分布情况，并可实时观测；使用中空光束消除所述第二实心光束的旁瓣，同时增加第一实心光束以增强光斑的中心光强，有效提高了成像系统的分辨率。

实施例二

本实施例是基于实施例一提出的所述超分辨光学显微成像系统的一种调节方法，所述调节步骤包括：

1)所述激光光源整形模块1中，所述光纤12及所述准直透镜13分别对所述第一激光束及所述第二激光束进行光斑的整形与准直；

2)所述扫描成像及探测模块6中，所述物镜62对所述重合光进行聚焦并照射至所述金纳米颗粒64上，并经所述金纳米颗粒64的散射增强后发射至所述成像装置，完成实时成像过程；

3)根据实时成像效果，调节所述中空光束调制及光束重合调节模块6，完成所述重合光的整形调节及所述重合光的重合度调节。

作为示例，所述金纳米颗粒64的直径介于70nm～90nm之间。

本实施例利用金纳米颗粒对激光具有散射增强作用的基础上进行，系统在实时成像过程中，当实时成像的效果不理想时，需要对所述重合光进行整形调节和对所述重合光的重合度进行调节。其中，所述重合光的整形调节包括对所述中空光束、所述第一实心光束及所述第二实心光束的整形调节，所述整形调节包括对光斑的强度和形状的调节；所述重合光的重合度包括水平方向及垂直方向的重合度调节。

以所述第一实心光束为405nm的激光，所述第二实心光束为488nm的激光及所述中空光束为488nm的激光为例详细描述所述重合光的整形调节及所述重合光的重合度调节。

在扫描的过程中，由于制作的金纳米颗粒的密度问题，在大范围(30μm)扫描时，由于步长较长，通常为0.5μm，而对于488nm的聚焦光斑而言，FWHM(Full Width HalfMaximum)为250nm左右，因此观察到的图像点大概只有一到两个像素格；确定其中光斑密度较为稀疏的位置，移动位移台XY起始位置(软件中已实现初始位置的调节，可直接软件直接控制)，并缩小扫描范围及对应的步长，分别缩小扫描范围，扫描范围为10μm，步长0.2μm；缩小扫描范围，和XY起始位置，扫描范围为5μm，步长0.1μm和扫描范围为3μm，步长0.05μm；最后，获得对应的扫描范围1μm，步长10nm的光斑强度分布图像。

中空光束的整形调节标准主要包括两方面的问题，一是中空光束的形状，包括光斑是否是圆形，中空光束的中心强度是否为零；另一是中空光束的环形光斑的强度分布是否均匀。

基于以上两点标准，描述所述中空光束的整形调节过程。对于系统的分辨率而言，以上的标准中最重要的是中空光束的中心强度是否为零。调节步骤包括：调节所述涡旋相位板51的水平位置，将所述中空光束的黑心调节至所述重合光的光斑中心；调节所述中空光束调制及光束重合调节模块5中的所述1/4波片54及所述1/2波片55，将所述中空光束调节为左旋圆偏振光；最后微调所述中空光束调制及光束重合调节模块5中的所述1/4波片54，将所述中空光束的光斑强度调节均匀，完成所述中空光束的整形调节。

所述第一实心光束整形调节步骤包括：保持所述中空光束调制及光束重合调节模块5中的所述1/4波片54及所述1/2波片55位置不变，调节所述第一实心光束调节模块4中的所述1/4波片42及1/2波片41，将所述第一激光束调节为左旋圆偏振的第一实心光束；微调所述第一实心光束调节模块4中的所述1/2波片41，将所述第一实心光束的光斑调节均匀；调节所述物镜62，使所述第一实心光束沿所述物镜62的光轴进入所述物镜62，以调节所述第一实心光束的光斑形状。

所述第二实心光束整形调节主要是由于衍射的存在，会使得所述第二实心光束的光斑周围有旁瓣，旁瓣的存在会影响最后的分辨率，因此第二实心光束的光斑调节的标准为光斑的形状以及旁瓣的强度。旁瓣的存在是由于衍射造成的，较难消除，一般都是尽量使得旁瓣的强度尽量低，使其对分辨率的影响降低，主要是通过所述中空光束消除所述旁瓣，由于所述中空光束的偏振已经固定，因此所述中空光束调制及光束重合调节模块5中的所述1/4波片54及所述1/2波片55位置不要再变，微调所述分光模块2中的所述1/2波片21，将所述第二实心光束的光斑调节均匀；调节所述物镜62，使所述第二实心光束沿所述物镜62的光轴进入所述物镜62，以调节所述第二实心光束的光斑形状。

综上，便可以得到所述第一实心光束、所述第二实心光束以及中空光束强度分布的扫描图片，得到488nm的所述第二实心光束的实心光斑半高全宽为200nm左右，与衍射极限公式算的结果相近，并且第二实心光束的实心光斑四个方向强度分布最后高斯拟合出的结果也为200nm上下，说明光斑的强度分布均匀，中心光强最大，可以以此作为评价实心光束的调节是否准确的标准。

以上通过调节可得到所述中空光束、所述第一实心光束及所述第二实心光束的二维强度分布，但是对应的扫描深度纵深是不同的，即不同光束在垂直空间上由于色差的存在，聚焦位置存在很大差异，所以需要对所述重合光的重合度进行调节。光斑重合度的调节主要为两方面的调节，一为不同波长的激光，在物镜聚焦时由于色差的原因造成聚焦深度不同，从而在垂直方向存在较大差异，即使是同种波长的激光，如488nm实心激光和488nm空心激光，由于发散度以及激光模式和相位的差异也会造成聚焦深度存在较大差异；二为多光束的重合度在聚焦平面，由于光束的入射角度以及光束重合度的差异，使得水平方向上重合度存在较大差异，所以需要从这两方面进行所述重合光的重合度的调节。

所述重合光的光斑重合度调节步骤包括：定义扫描范围5μm，步长100nm，粗调节所述物镜62的前后位置，以使在聚焦平面上同时观察到所述第一实心光束、所述第二实心光束及所述中空光束。具体地，以调节488nm第二实心光束的实心光斑与488nm中空光束的空心光斑为例，即首先挡住488nm第二实心光束，保证能在水平面内扫描出488nm中空光束的空心光斑的强度分布，此时挡住488nm中空光束的空心光斑，扫描488nm第二实心光束，在不移动垂直轴的情况下，调节488nm第二实心光束的实心光斑的发散度，保证在同一聚焦平面上也可同时扫描获得488nm第二实心光束的实心光斑的强度分布，然后分别调节对应入射光角度，使得在水平面内，多束光束聚焦光斑重合，至此完成多光束重合度的粗调节；定义扫描范围1μm，步长20nm，细调节所述第一激光束及所述第二激光束的入射角度，分别得到多束光束的光斑分布情况，此步的调节难点主要在于在1μm范围内，光斑的位置对于入射角度十分敏感，在调节过程中容易造成光束偏移量太大，难以调节，此时建议将距离物镜62较近处的反射镜7用作光斑位置调节，较远处的反射镜7则用作光斑形状调节，较近处的反射镜7对于位置的调节灵敏度相对较低，易于调节。至此完成所述重合光的重合度调节。

如图3至图6所示，分别为描范围1μm，步长20nm获得的405nm第一实心光束的实心激光聚焦光斑，488nm中空光束的空心激光聚焦光斑，488nm第二实心光束的实心激光聚焦光斑以及上述三束光斑叠加后的效果图，由图6可以看出，该三束光束在水平方向上高度重合。如图7所示，为将上述三束光束光强分布进行高斯拟合，可以看出，该三束光束在空间上，包括水平方向与垂直方向高度重合，基本符合超分辨系统对于光斑重合度的要求。

综上所述，本发明提供一种超分辨光学显微成像系统及其调节方法，通过对三维纳米平移台的扫描过程，可以获得激光光束的直观光强分布情况，并可实时观测；使用中空光束消除所述第二实心光束的旁瓣，同时增加第一实心光束以增强光斑的中心光强，有效提高了成像系统的分辨率；利用金纳米颗粒首先对多光束的光斑形状进行调节，包括中空光束，第一实心光束及第二实心光束光斑形状和强度分布调节，然后通过调节光束发散度以及光束的入射角度，完成多光束的重合度调节，对进一步优化STED系统以及多光束超分辨系统的实现，以及成像分辨率的提升具有一定的指导及经验性意义。所以，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (10)

1.一种超分辨光学显微成像系统，其特征在于，所述超分辨光学显微成像系统至少包括：两激光光源整形模块、一分光模块、两光束扩束模块、一第一实心光束调节模块、一中空光束调制及光束重合调节模块、一扫描成像及探测模块；

所述激光光源整形模块包括依次排列的激光器、光纤及准直透镜，两所述激光器分别发射第一激光束及第二激光束并经相应的所述光纤及所述准直透镜传输和准直；

所述分光模块用于将经准直的所述第二激光束分为两束子第二激光束；

两所述光束扩束模块分别用于扩束和准直两所述子第二激光束，以形成第二实心光束及第三实心光束；

所述第一实心光束调节模块用于将所述第一激光束调节为左旋圆偏振的第一实心光束；

所述中空光束调制及光束重合调节模块包括涡旋相位板及依次排列的偏振分束器、二向色镜、1/4波片及1/2波片，所述涡旋相位板用于将所述第三实心光束调制为中空光束，所述偏振分束器用于重合所述第二实心光束及所述中空光束，所述二向色镜用于重合所述第二实心光束、所述中空光束及所述第一实心光束形成重合光；

所述扫描成像及探测模块包括分束镜、物镜、样品台、金纳米颗粒及成像装置，所述分束镜用于将所述重合光导入所述物镜。

2.根据权利要求1所述的超分辨光学显微成像系统，其特征在于：所述分光模块包括依次排列的1/2波片及偏振分束器，所述1/2波片及所述偏振分束器的光轴在同一直线上。

3.根据权利要求2所述的超分辨光学显微成像系统，其特征在于：所述光束扩束模块包括依次排列的扩束短焦胶合透镜及准直长焦胶合透镜，所述扩束短焦胶合透镜及所述准直长焦胶合透镜的光轴在同一直线上。

4.根据权利要求3所述的超分辨光学显微成像系统，其特征在于：所述第一实心光束调节模块包括依次排列的1/2波片及1/4波片，所述1/2波片及所述1/4波片的光轴在同一直线上。

5.根据权利要求4所述的超分辨光学显微成像系统，其特征在于：所述激光光源整形模块中的所述光纤包括单模光纤。

6.根据权利要求5所述的超分辨光学显微成像系统，其特征在于：所述成像装置包括依次排列的准直透镜、多模光纤及光子探测器。

7.根据权利要求6所述的超分辨光学显微成像系统，其特征在于：所述光子探测器包括由电子倍增电荷耦合器及光电二极管组成的群组中的一种。

8.根据权利要求7所述的超分辨光学显微成像系统，其特征在于：所述超分辨光学显微成像系统还包括多个银镜，用于改变所述超分辨光学显微成像系统的光路。

9.使用如权利要求1-8任一项所述的超分辨光学显微成像系统的调节方法，其特征在于，所述调节步骤包括：

1)所述激光光源整形模块中，所述光纤及所述准直透镜分别对所述第一激光束及所述第二激光束进行光斑的整形与准直；

2)所述扫描成像及探测模块中，所述物镜对所述重合光进行聚焦并照射至所述金纳米颗粒上，并经所述金纳米颗粒的散射增强后发射至所述成像装置，完成实时成像过程；

3)根据实时成像效果，调节所述中空光束调制及光束重合调节模块，完成所述重合光的整形调节及所述重合光的重合度调节。

10.根据权利要求9所述的超分辨光学显微成像系统的调节方法，其特征在于：所述金纳米颗粒的直径介于70nm～90nm之间。