CN105241857A - 一种超分辨成像系统 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种超分辨成像系统，包括第一激光器、第二激光器、第一半波片、第一脉冲分束器、光谱仪、第一透镜组、玻璃棒、保偏光纤、空间光调制器、第一物镜、反射镜组、第二透镜组、反射镜、单模光纤、第二半波片、后向反射镜、反射镜、第一双色镜、第二双色镜、扫描系统、四分之一玻片、空间物镜、第二脉冲分束器和光电倍增管，利用相干自适应光学技术进行像差校正来提高STED超分辨显微成像系统的空间分辨率，解决了由于生物样品表面的不平整和样品内折射率分布不均匀引入的像差；提高了空间分辨率。

Description

一种超分辨成像系统

技术领域

本发明属于光学显微成像领域，更具体地，涉及一种提高受激发射耗损(StimulatedEmissionDepletion，STED)超分辨显微成像空间分辨率的方法及系统。

背景技术

在常规的光学显微成像系统中，由于光学元器件的衍射效应，平行入射的照明光经过显微物镜聚焦之后在样品上所形成的光斑并不是一个理想的点，而是一个具有一定尺寸的衍射光斑，根据德国物理学家恩斯特—阿贝提出的阿贝定律，可见光能聚焦的最小光斑的直径是光波波长的三分之一，约200nm左右。1994年由德国科学家S.W.Hell首次提出STED超分辨显微成像技术，它超越了衍射极限，并于2006年实现了30nm的空间分辨率，这一杰出的工作使他在2014年获得诺贝尔化学奖。

STED超分辨的基本思想是：利用受激辐射效应来减小有效荧光发光面积，一个典型的STED显微系统中需要两束光，一束为激发光，另一束为耗尽光。当激发光照射荧光样品，会使其衍射斑范围内的荧光分子被激发，其中的电子将会跃迁到激发态，然后再将圆环形的耗尽光叠加在激发光上，耗尽光使得处于重叠部分激发态的电子以受激辐射的方式回到基态，其它位于激光光斑中心的激发态电子由于没有受到耗尽光的影响，继续以自发辐射的形式向外发生荧光回到基态。由于在受激辐射和自发辐射过程中发出荧光的方向和波长不同，因此经过过滤后被探测器所接受到的光子均是由位于激发光光斑中心位置的荧光样品通过自发荧光的方式产生的。这样有效荧光的发光面积得以减小，从而提高了系统的空间分辨率。

目前，STED超分辨显微成像系统在生物医学的应用中，由于样品表面的不平整性和样品内部折射率分布的不均匀性所带来的像差使系统的分辨率和成像深度大大降低，限制了其广泛应用。

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于利用相干自适应光学技术(CoherentOpticalAdaptiveTechnique，COAT)进行像差校正来提高STED超分辨显微成像系统的空间分辨率，旨在解决由于生物样品表面的不平整和样品内折射率分布不均匀引入的像差。

本发明提供了一种超分辨成像系统，包括：第一激光器Laser1、第二激光器Laser2、第一半波片、第一脉冲分束器PS1、光谱仪SPEC、第一透镜组(L1，L2)、玻璃棒GR、保偏光纤Fiber1、空间光调制器SLM、第一物镜L3、反射镜组、第二透镜组(L4，L5)、反射镜M4、单模光纤Fiber2、第二半波片、后向反射镜RR、反射镜M5、第一双色镜DM1、第二双色镜DM2、扫描系统Scanner、四分之一玻片、空间物镜L6、第二脉冲分束器PS2和光电倍增管PMT，第一激光器Laser1用于产生飞秒激光；第二激光器Laser2用于产生皮秒激光；第一半波片设置在第一激光器Laser1的出射光路上，用于使得所述飞秒激光为线偏振光并调整线偏振光的方向；第一脉冲分束器PS1用于将经过第一半波片调整后的飞秒激光分成两路，一部分光透射进入光谱仪，另一部分光反射作为耗尽光；光谱仪SPEC设置在第一脉冲分束器的第一路出射光路上，用于实时监测所述耗尽光的波长；第一透镜组(L1，L2)设置在第一脉冲分束器的第二路出射光路上，用于对耗尽光进行调整；玻璃棒GR用于对经过调整后的耗尽光进行展宽，使得耗尽光的脉冲宽度为1皮秒；保偏光纤Fiber1用于对脉冲宽度为1皮秒的耗尽光进一步展宽，使得所述耗尽光的脉冲宽度为200皮秒；空间光调制器SLM用于产生圆环形光斑并作为像差校正系统；第一物镜L3对脉冲宽度为200皮秒的耗尽光进行调整，使得其光斑的直径等于空间光调制器(SLM)中液晶面板的宽度；反射镜组设置在第一物镜L3的出射光与所述空间光调制器的入射光之间，用于对第一物镜L3的出射光进行调整使其以3°～9°的入射角进入所述空间光调制器SLM，第二透镜组(L4，L5)用于将空间光调制器SLM的出射光进行透射；反射镜M4设置在第二透镜组的透射光路上，其入射光为所述第二透镜组的出射光；单模光纤Fiber2设置在第二激光器Laser2的出射光路上，用于对皮秒激光进行模式调整；第二半波片设置在第一激光器Laser1的出射光路上，用于使得所述皮秒激光为线偏振光并调整线偏振光的方向；后向反射镜RR用于对经过第二半波片调整后的皮秒激光进行反射，控制激发光和耗尽光脉冲之间的延迟时间；反射镜M5的入射光为后向反射镜RR的反射光，第一双色镜DM1的第一入射光为经过M4反射的耗尽光，其第二入射光为经过M5反射的激发光，用于对耗尽光进行反射，对激发光进行透射，并调整耗尽光和激发光的方向使其重叠；第二双色镜DM2设置在第一双色镜的出射光路上，用于对激发光和所述耗尽光进行透射，并对荧光进行反射；扫描系统Scanner设置在所述第二双色镜的出射光路上，用于对重叠的激发光和耗尽光进行同步扫描，实现面阵扫描；四分之一玻片用于对经过扫描后的激光进行调整，使其为圆偏振光；空间物镜L6用于对圆偏振光进行聚焦并收集样品反馈的荧光信号；第二脉冲分束器PS2用于将经过第二双色镜DM2反射后的荧光分成两部分，一部分光反射进入自适应光学AO像差校正系统，用于对系统像差进行实时校正；另一部分光被透射；光电倍增管PMT用于对被第二脉冲分束器透射后的荧光进行放大并进行超分辨成像。相干自适应光学像差校正COAT系统由空间光调制器SLM和自适应光学系统AO共同组成，用于对系统的像差进行实时校正，提高STED系统的空间分辨率和成像深度。

更进一步优选地，空间光调制器SLM的入射角为6°。

更进一步优选地，还包括设置在所述第一激光器Laser1与所述第一半波片之间且用于保护激光器的光隔离器FI。

更进一步优选地，同步触发第一激光器和第二激光器，并保持两束激光脉冲峰值之间的间隔为160ps-200ps。

更进一步优选地，间隔为180ps。

更进一步优选地，在所述空间光调制器(SLM)上同时加载用于产生环形光的螺旋灰阶相位图和用于相干自适应光学像差校正的灰阶相位图。其中，螺旋灰阶相位图用于产生圆环形耗尽光光斑，与激发光叠加后形成超越衍射极限的光斑，然后通过扫描形成超分辨图像，而相干自适应光学像差校正系统用于校正样品表面不平整性和样品内部折射率分布的不均匀性产生的像差，使得我们的超分辨成像系统的分辨率更高，成像深度更深。

更进一步优选地，第一脉冲分束器PS1将激光按照9:1分成两路，小部分光透射进入光谱仪，大部分光反射作为耗尽光。第二脉冲分束器PS2将荧光按照9:1分成两部分，一部分光反射进入自适应光学AO像差校正系统，用于对系统像差进行实时校正；另一部分光被透射。

本发明通过调控两束相干光中某一束光的相位，来实现对两束光的相干加强和相干减弱的操控，实现了显微系统的像差校正，从而提了高STED超分辨显微成像系统的空间分辨率，可以解决现有超分辨成像系统在深层生物细胞成像时由于生物样品表面的不平整和样品内折射率分布不均匀引入的像差导致图像质量较差的问题。

附图说明

图1是本发明实施提供的超分辨成像系统的光路结构图；

图2是耗尽光与激发光重叠后超越衍射极限的示意图；

图3是激发光脉冲与耗尽光两脉冲峰值之间的时间间隔；

图4是利用系统得到170nm荧光珠的Confocal图像和STED超分辨图像；

图5是利用单独的COAT像差校正系统实现散射样品中光斑的像差校正。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明提供的一种提高STED超分辨成像空间分辨率的方法及系统是属于受激发射损耗(STED)超分辨显微成像系统和提高系统空间分辨率的新方法，可以解决现有超分辨成像系统在深层生物细胞成像时由于像差导致图像质量较差的问题。

本发明实施例是这样实现的，一种超分辨成像系统，包括：

飞秒激光器(Laser1)，用于产生耗尽光；

皮秒激光器(Laser2)，用于产生激发光；

光隔离器(FI)，用于保护激光器；

玻璃棒(GR)，用于展宽飞秒脉冲的耗尽光，使其脉冲宽度达到约1皮秒；

100米保偏光纤(Fiber1)，用于进一步展宽耗尽光，使其脉冲宽度达到200皮秒左右；

光谱仪(SPEC)，用于实时监测耗尽光的波长等相关参数；

空间光调制器(SLM)，在本系统中，空间光调制器有两种用途，一是充当螺旋相位片的功能，用于产生圆环形光斑，另一作用是用于像差校正系统；

单模光纤(Fiber2)，用于对皮秒激光器中出射的激光进行模式调整；

后向反射镜(RR)，用于控制激发光和耗尽光脉冲之间的延迟时间；

扫描系统(Scanner)，用于对重叠的激发光和耗尽光进行同步扫描，实现面阵扫描；

高数值空间物镜(L6)，用于聚焦重叠的激发光和耗尽光，同时收集荧光信号；具体可以采用数值孔径为1.4的莱卡物镜。

光电倍增管(PMT)，用于放大荧光信号；

本文中所有的半波片，均是用于保证所在光路的激光为线偏振，同时调整线偏振的方向；

四分之一玻片，使得进入物镜前的激光为圆偏振光；

第一脉冲分束器(PS1)，用于将飞秒激光分成两部分(9:1)，小部分光透射进入光谱仪，大部分光反射作为耗尽光；

第二脉冲分束器(PS2)，用于将收集后的荧光信号分成两部分(9:1)，小部分光反射进入自适应光学(AO)像差校正系统，用于对系统像差进行实时校正，大部分透射进入PMT，用于超分辨成像；

第一双色镜(DM1)，用于反射耗尽光(780nm)，透射激发光(635nm)，同时还可以微调耗尽光的方向，使耗尽光和激发光能够很好的重叠；

第二双色镜(DM2)，用于透射激发光和耗尽光，反射荧光；

相干自适应光学像差校正(COAT)系统，由空间光调制器(SLM)和自适应光学系统(AO)共同组成，用于对系统的像差进行实时校正，提高本发明STED系统的空间分辨率和成像深度；

工作时，先点亮激发光光源，后点亮耗尽光光源，我们的做法是利用飞秒激光器的控制系统来同步触发飞秒激光器和皮秒激光器，且最好保持两束激光脉冲峰值之间的间隔为160ps-200ps，优选为180ps，这样才能保证耗尽光更干净的将激发光产生的激发态电子以受激辐射的形式返回到基态。同时在空间光调制器上我们将要同时加载用于产生环形光的螺旋灰阶相位图和用于相干自适应光学像差校正的灰阶相位图，在实验时可以让这两种灰阶相位图同时工作，互不干扰。螺旋灰阶相位图用于产生圆环形耗尽光光斑，与激发光叠加后形成超越衍射极限的光斑，然后通过扫描形成超分辨图像，而相干自适应光学像差校正系统用于校正样品表面不平整性和样品内部折射率分布的不均匀性产生的像差，使得我们的超分辨成像系统的分辨率更高，成像深度更深。

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清晰明白，以下结合附图及实施例，对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不限定于本发明。

以下结合实施例对本发明的实现进行详细描述。

如图1所示，为本发明实施例提供的基于COAT像差校正技术的STED超分辨显微成像的光路系统图。从图中我们可以看到，本系统有两束激光，分别为耗尽光(Laser1波长为780nm)和激发光(Laser2波长为635nm)，耗尽光首先通过光隔离器(FI)，光隔离器FI在这里的主要作用是防止光路中产生的反射光对激光器产生不良影响，光隔离器FI后面的半波片是用来调整耗尽光的偏振特性，确保进入光路系统的耗尽光为线偏振光，PS1为脉冲分束器，将激光分成(9:1)两束光，绝大部分的光反射进入后续光路，而少部分的光则透射进入光谱仪(SPEC)，光谱仪SPEC主要是对激光器输出的激光参数进行实时监测，反射的光则经过透镜组(L1，L2)调整后，以适当大小的光斑进入玻璃棒(GR)，玻璃棒在这里的主要作用是对飞秒的耗尽脉冲光进行展宽，展宽后的脉冲宽度约为1皮秒，然后将展宽的耗尽脉冲光耦合到100米长的保偏光纤中(Fibre1)，主要作用是利用光纤对脉冲耗尽光进一步展宽，最终获得脉冲宽度200皮秒的耗尽光，经过保偏光纤Fibre1调整后的耗尽脉冲光，再经过合适的物镜(L3)进行光斑调整，使光斑的大小直径与空间光调整(SLM)的宽度的大小保持一致，然后经过一系列的反射镜(M1、M2、M3)调整后，以3°～9°(优选为6°)的入射角进入空间光调制器SLM，空间光调制器SLM在这里的作用主要有两个，一个是产生螺旋相位灰阶图，使经过反射的耗尽光为中空圆环形光斑，另一个作用是与后面的自适应光学系统(AO)形成COAT像差校正系统，对耗尽光进行像差校正，以提高STED成像的空间分辨率和成像深度，经过SLM反射后的耗尽光再经过透镜组(L4和L5)进行光斑调整后，以适当的光斑大小进入扫描系统Scanner，然后进入四分之一玻片，将线偏振光转变成圆偏振光，最终经过物镜调整进入样品。

其中，光斑的大小要根据所选用的振镜来决定，所谓适当的光斑大小，是指光斑刚好对准振镜两个反射镜面的中心，且光斑的边缘到镜面的边缘有四分之一镜面宽度(因为振镜的X,Y的振动面为矩形的反射镜，因此这里主要讨论的是矩形的宽)，即光斑大小要占据镜面的中心二分之一的位置。

激发光由皮秒激光器Laser2经过耦合接入单模光纤Fiber2，对激发光的模式进行调整后，通过半波片，对激发光的线偏振状态进行调整，然后经过反射镜(RR和M5)和双色镜(DM1和DM2)的调整，在扫描系统Scanner处与耗尽光重叠，反射镜M5和双色镜DM1，可以对激发光和耗尽光进行小角度微调，以确保两束光高度重合，如图2所示。在STED超分辨系统中要想实现超分辨成像，必须要保持激发光和耗尽光的脉冲峰值之间有约180皮秒的时间间隔，如图3所示，在实验的过程中，为了保持稳定的同步性，和产生这样的脉冲时间间隔，我们实行由激光器Laser1的控制系统通过外接线来同时触发激光器Laser2，180皮秒的时间间隔则通过改变外接触发线缆的长度和调整激发光路中后向反射镜RR的位置来实现(外接触发线缆的长度与时间间隔成线性关系，长度越长，时间间隔也越长；比如，光速为3*10⁸m/s，换算后可知每移动一米可以改变的时间延迟为3.333纳秒)。重叠后的激发光和耗尽光经过物镜聚焦后，激发荧光样品，样品产生的荧光信号，再通过物镜收集，沿原光路返回，在双色镜DM2处被反射，经过分束片(9:1)后分成两束光，大部分光透射后通过耦合进入多模光纤(由于单模光纤的光纤口很小，因此可以起到小孔的作用)，然后再由多模光纤引入光电倍增管PMT，进行信号放大，最后在电脑上成像，小部分光则经过反射后进入AO系统，与前面的SLM共同形成相干自适应光学像差校正系统，该系统能够实时对生物样品引入的像差进行校正，从而提高STED超分辨系统的空间分辨率和成像深度。

在实验中我们将直径为170nm的荧光珠作为实验样品，我们在耗尽光的光路上(M4与DM1之间)设置一块电控挡板，当挡板闭合时，挡板会挡住耗尽光，只有激发光进入物镜，此时可视为Confocal成像，当挡板打开时，耗尽光会与激发光在样品上重叠，形成STED超分辨成像，如图4所示，为我们用本STED超分辨成像系统(没有开启COAT像差校正)采集的170nm的荧光珠图像，对比图中荧光珠的Confocal图像和STED图像，我们可以明显的看到，经过耗尽光作用后，激发光的点扩展函数，确实有明显的减小。虽然STED超分辨成像系统，早在2006年就已经实现了30nm的空间分辨率，但是在生物样品中，由于样品表面的不平整性和样品内部折射率分辨的不均匀性，会给STED超分辨系统引入较大的像差，降低系统的空间分辨率和成像深度，为了克服这一问题，我们提出了在STED超分辨成像系统中引入COAT像差校正系统，如图5所示，为我们利用单独的COAT像差校正系统实现散射样品中光斑的像差校正，因此在本系统中我们将COAT引入后，应当可以克服系统中引入的像差，实现STED超分辨空间分辨率和成像深度的提高。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种超分辨成像系统，其特征在于，包括：

第一激光器Laser1，用于产生飞秒激光；

第二激光器Laser2，用于产生皮秒激光；

第一半波片，设置在所述第一激光器Laser1的出射光路上，用于使得所述飞秒激光为线偏振光并调整线偏振光的方向；

第一脉冲分束器，用于将经过所述第一半波片调整后的飞秒激光分成两路，一部分光透射进入光谱仪，另一部分光反射作为耗尽光；

光谱仪，设置在所述第一脉冲分束器的第一路出射光路上，用于实时监测所述耗尽光的波长；

第一透镜组，设置在所述第一脉冲分束器的第二路出射光路上，用于对耗尽光进行调整；

玻璃棒，用于对经过调整后的耗尽光进行展宽，使得所述耗尽光的脉冲宽度为1皮秒；

保偏光纤，用于对脉冲宽度为1皮秒的耗尽光进一步展宽，使得所述耗尽光的脉冲宽度为200皮秒；

空间光调制器，用于产生圆环形光斑并作为像差校正系统；

第一物镜L3，对脉冲宽度为200皮秒的耗尽光进行调整，使得其光斑的直径等于空间光调制器中液晶面板的宽度；

反射镜组，设置在所述第一物镜L3的出射光与所述空间光调制器的入射光之间，用于对所述第一物镜L3的出射光进行调整使其以3°～9°的入射角进入所述空间光调制器，

第二透镜组，用于将所述空间光调制器SLM的出射光进行透射；

反射镜M4，设置在所述第二透镜组的透射光路上，其入射光为所述第二透镜组的出射光；

单模光纤，设置在所述第二激光器Laser2的出射光路上，用于对所述皮秒激光进行模式调整；

第二半波片，设置在所述第一激光器Laser1的出射光路上，用于使得所述皮秒激光为线偏振光并调整线偏振光的方向；

后向反射镜，用于对经过所述第二半波片调整后的皮秒激光进行反射，控制激发光和耗尽光脉冲之间的延迟时间；

反射镜M5，其入射光为所述后向反射镜的反射光；

第一双色镜，其第一入射光为经过所述反射镜M4反射的耗尽光，其第二入射光为经过所述反射镜M5反射的激发光，用于对所述耗尽光进行反射，对所述激发光进行透射，并调整所述耗尽光和所述激发光的方向使其重叠；

第二双色镜，设置在所述第一双色镜的出射光路上，用于对所述激发光和所述耗尽光进行透射，并对荧光进行反射；

扫描系统，设置在所述第二双色镜的出射光路上，用于对重叠的激发光和耗尽光进行同步扫描，实现面阵扫描；

四分之一玻片，用于对经过扫描后的激光进行调整，使其为圆偏振光；

空间物镜L6，用于对所述圆偏振光进行聚焦并收集样品反馈的荧光信号；

第二脉冲分束器，用于将经过所述第二双色镜反射后的荧光分成两部分，一部分光反射进入自适应光学像差校正系统，用于对系统像差进行实时校正；另一部分光被透射；

光电倍增管，用于对被所述第二脉冲分束器透射后的荧光进行放大并进行超分辨成像。

2.如权利要求1所述的超分辨成像系统，其特征在于，所述空间光调制器SLM的入射角为6°。

3.如权利要求1所述的超分辨成像系统，其特征在于，还包括设置在所述第一激光器Laser1与所述第一半波片之间且用于保护激光器的光隔离器。

4.如权利要求1所述的超分辨成像系统，其特征在于，同步触发第一激光器和第二激光器，并保持两束激光脉冲峰值之间的间隔为160ps-200ps。

5.如权利要求4所述的超分辨成像系统，其特征在于，所述间隔为180ps。

6.如权利要求1-5任一项所述的超分辨成像系统，其特征在于，在所述空间光调制器上同时加载用于产生环形光的螺旋灰阶相位图和用于相干自适应光学像差校正的灰阶相位图。

7.如权利要求1-5任一项所述的超分辨成像系统，其特征在于，所述第一脉冲分束器将激光按照9:1分成两路，小部分光透射进入光谱仪，大部分光反射作为耗尽光。

8.如权利要求1-5任一项所述的超分辨成像系统，其特征在于，所述第二脉冲分束器将荧光按照9:1分成两部分，一部分光反射进入自适应光学像差校正系统，用于对系统像差进行实时校正；另一部分光被透射。