CN104407436A - 一种基于轴向超高速扫描的三轴数字扫描光片显微镜 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种基于轴向超高速扫描的三轴数字扫描光片显微镜，主要涉及荧光显微镜领域。通过在激发光路中设置光束光路快速变焦装置，用于快速调制光的焦点位置；和快速光强调制装置，用于快速调制光强；发明了一种在不改变光片厚度的条件下，可以增加并且调节扫描范围的光片显微镜。这项新技术能够提供亚微米级的z轴分辨率，在深层组织中(大于500μm)170×170μm²大小的视野以及高达1毫秒的时间分辨率。2P3A-DSLM解决了小型模式生物体的亚细胞结构以及活体动态过程的长时间成像问题。

Description

一种基于轴向超高速扫描的三轴数字扫描光片显微镜

技术领域

本发明涉及一种基于轴向超高速扫描的三轴数字扫描光片显微镜，主要涉及荧光显微镜技术领域。

背景技术

背景技术：

最近出现的光片荧光显微镜技术(light-sheet fluorescent microscopy，LSFM)已经给生物三维成像技术带来了革命性变化。LSFM具有高时间分辨率以及很小的光损伤等特点，使得通过荧光成像对小型模式生物或组织的长时间观察成为可能。

光片显微镜使用一层光束从样品侧面激发荧光样品，通过照相设备检测成像，其入射照明光路和照相设备接收荧光光路互相垂直。传统光片显微镜分类：从激光光源讲：分为连续光光片显微镜和双光子光片显微镜。前者的好处是造价低，结构简单。缺点是：穿透能力很弱，不适合深层组织成像。后者的好处是成像深度深，可以做活体组织成像。从系统构架来讲：分为水平构架，垂直构架和倒置构架三种。水平构架中，光片照明的物镜和信号接收的物镜都是水平放置，即整个光路平面与水平面垂直，而样本固定在一个琼脂糖柱里竖直放置。这种构架的好处是，系统稳定，样本可以360度自由移动。缺点是样本制备相对繁琐。垂直构架中，接收信号的物镜垂直放置，与普通的正置显微镜相同。而激发光片的物镜水平放置，使得产生的光片与水平面平行。优点是可以与现有的传统正置显微镜兼容。缺点是激发光物镜的光片厚度较厚，无法进行亚细胞结构观察。倒置构架中，激发物镜和发射物镜成垂直的V字形倒置在样本之上，形成的光片和成像面都与水平面成45度并互相垂直。该构架的好处是可以与传统的样本制备标准兼用。劣势是结构不够稳定，并且样本不能随意转动。从光片形成方式来讲，分为柱面镜式和扫描式。柱面镜式是通过一个柱面镜让一束激光在一个方向上聚焦，而另一个方向上保持准直而形成光片。这种方法的好处是结构简单，劣势是单位面积下的光功率较低，不适合做多光子扫描显微镜。扫描式是通过扫描器件，将一束准直的高斯光束在y轴方向上快速扫描，进而在照相机一次曝光时间内形成均匀的片状光。优点是单位时间内的光功率强，可以做双光子成像。缺点是结构相对复杂。

Truong等人通过将双光子技术和光片显微镜结合起来实现了双光子数字扫描光片显微镜(2P-DSLM)，该系统能够在高散射的果蝇胚胎或者快速跳动的斑马鱼心脏中进行深层组织成像[1]。与经典的光片荧光显微镜结构相似，双光子数字扫描光片显微镜使用一个低数值孔径的物镜(NA＜0.1)来实现长时间均匀照明，然而这导致产生的光片过厚，从而降低轴向分辨率和图像的对比度。另一方面，Betzig和他的同事利用贝塞尔光束来产生一个纤薄的单光子光片，得到了相当不错的轴向分辨率[2]。然而，这样的系统中，视野和穿透深度是非常有限的。常规的LSFM显微镜或者双光子数字扫描光片显微镜还有一个非常显著的问题，就是在工作的时候，其光片的厚度主要是由扫描的数值孔径NA决定，当增加扫描范围的时候，必然会增加光片厚度。目前有关于光片显微镜的专利文献比如CN102455501A，其利用机械移动的透镜组进行光学变焦，变焦频率十分低，导致不能实现快速拍照，限制了其实际产业方面应用范围；并且其只能通过改变数值孔径来改变照射区域的大小。在其增加扫描范围的时候，也不能避免光片厚度的增加。

引用文献：

1.Truong TV，Supatto W，Koos DS，Choi JM，Fraser SE.Nat Methods2011；8：757-760.

2.Gao L，Shao L，Higgins CD et al.Cell 2012；151：1370-1385.

发明内容

为了克服现有技术的缺陷，我们发明了一种在不改变光片厚度的条件下，可以增加并且调节扫描范围的光片显微镜。为了同时获得高轴向分辨率和大视野，我们利用激发光路快速变焦装置和快速光强调制装置制作了基于轴向超高速扫描的新型三轴数字扫描光片显微镜(下文称2P3A-DSLM)。这项新技术能够提供亚微米级的Z轴分辨率，在深层组织中(大于500μm)170×170μm²大小的视野以及高达1毫秒的时间分辨率。2P3A-DSLM解决了小型模式生物在体的亚细胞结构以及动态过程的活体成像问题。

根据本发明，一种基于轴向超高速扫描的三轴数字扫描光片显微镜包括：激发光源，其发射的光束沿着X轴方向照射到样品上；成像设备，其沿着Z方向检测样品上发射和/或反射的光，Z方向与x方向基本垂直；扫描仪，用于Y方向形成光片和/或Z方向改变光片的位置，所述Y方向沿着与X和Z方向基本垂直的方向延伸；其特征在于：激发光路快速变焦装置，用于快速调制光的焦点位置；快速光强调制装置，用于快速调制光强；所述激发光路快速变焦装置和快速光强调制装置处于激发光路中。

激发光路快速变焦装置和快速光强调制装置在激发光路中的位置及顺序并不限制，只要能够实现其功能即可。

其中优选的技术方案激发光路快速变焦装置选自可调声学梯度折射率指数透镜(TAG)、电控可变焦透镜、微机械可变反射镜(MEMSMIRROR)中的一种。

其中优选的技术方案快速光强调制装置包括电光调制器，优选高速普克尔斯盒。

其中优选的技术方案快速变焦装置的变焦频率在100Hz以上，优选1kHz以上，更优选500kHz以上。

其中优选的技术方案快速变焦装置在所述光片荧光显微镜的激发物镜后焦面的共轭范围内。

其中优选的技术方案所述的共轭范围是共轭距离的80％到120％。

其中优选的技术方案所述二维扫描镜包括单个二维扫描镜。

其中优选的技术方案所述二维扫描镜包括一组的两个一维扫描镜。

其中在发射光路中，优选的技术方案进一步包括发射光路快速变焦器件，使得成像物镜的成像面与三维快速变化的光片位置始终匹配。

其中优选的技术方案在于激发光路中，用作光片垂直方向扫描的扫描反射镜与发射光路中快速变焦透镜连用；可以实现不同成像焦面的快速切换。

其中优选的技术方案所述快速声光调制装置的调制频率是变焦装置频率的10倍以上。

其中优选的技术方案所述光片显微镜用于mt-cpYFP转基因秀丽隐杆线虫连续的三维成像。

其中优选的技术方案所述快速调焦装置是TAG，电光调制器是高速普克尔斯盒。

其中优选的技术方案当激发物镜的放大倍数为40倍，数值孔径为0.8的条件下，通过调节TAG强度，可以控制XY平面扫描区域在10x10μm²到170×170μm²的范围内。

其中优选的技术方案所述所述快速光强调制装置的频率是10kHz以上，优选10MHz。

其中优选的技术方案所述激发光源选自双光子飞秒激光光源或三光子飞秒激光光源。

在所述超高速扫描的三轴数字扫描光片显微镜，其快速变焦装置使得光片沿着光轴方向得到扩展，在成像设备一次曝光时间内；使得光片等效被拉长；并且根据不同的样本大小实时调节光片的长度。快速变焦装置与快速光强调制装置连用，补偿了样品的吸收和散射造成的照明光沿着轴向的衰减。快速变焦装置、快速光强调制装置与二维扫描镜连用，可以实现在三维任意形状、任意位置的光片照射，从而实现随机位置光激活或随机位置光漂白恢复技术。其中快速声光调制装置和快速变焦装置的频率匹配属于本领域的常规技术知识。

其中所述在发射光路中，包括光路快速变焦器件，用于快速调制光的焦点位置，使得成像物镜的成像面与三维快速变化的光片位置始终匹配。

由上所述，本发明具备以下突出的特点：

在不移动样品的条件下，可以实现快速的三维扫描。

在1毫秒之内，当激发物镜的放大倍数为40倍时，可形成170×170μm²的光片；当激发物镜的放大倍数为20倍时，可形成680×680μm²的光片。

在相机速率足够的情况下，可以达到1000张每秒的二维扫描速度，或者达到100层每秒的三维扫描速度。

在光片厚度小于1微米并且基本保持不变的情况下，可以使光片的扫描区域根据变焦的大小相比于常规的光片荧光显微镜扩展1-100倍；

在不改变光片厚度的前提下，可以任意改变光片的尺寸，面积，大小。同时，在扫描的过程中，可以对光强的损耗进行动态的补偿。

通过扫描镜，可变焦透镜和电光调制器的连用，可以补偿光沿着入射方向在样品中的衰减，使得整个成像区域获得最好的成像质量。

双光子和可变焦透镜的连用，可以使得光片厚度降到最低。从而提高轴向分辨率。

相同条件下，2P3A-DSLM的光漂白速度是常规的2P-LSM的50％左右。

附图说明

图1，常规的光片显微镜基本结构及原理示意图。

图2，2P3A-DSLM的结构示意图。

图3，2P3A-DSLM的光片大小能够通过调节TAG调制强度来调整，尺寸范围从10x10μm²到170×170μm²，所用条件为：激发物镜放大倍数为40倍，数值孔径为0.8。

图4，普克尔斯盒对照明的补偿能有效克服整个视野深度的非均匀照明。在补偿之前，照明强度随着穿透深度的增加而衰退。在用普克尔斯盒动态调整照明功率之后，光照强度在整个穿透深度范围内都变得非常均匀。最右边的图表示的是调制前和调制后在图中直线上的强度分布曲线。比例尺：100μm。

图5，所示的是不同TAG调制强度(0％～35％)下的光片侧视图。比例尺：50μm。

图6，空间分辨率和极限视野深度的关系。在不同的TAG调制强度下用900nm的激光去激发嵌在琼脂凝胶的直径为50nm的绿色荧光小球。沿着轴向100nm步进收集每个小球的荧光图像。

图7，2P3A-DSLM与2P-LSM在实验和理论上的光漂白程度对比。

图8，2P3A-DSLM，2P-DSLM以及Static light-sheet理论上的光损伤对比。

图9，光片显微镜不同的光片厚度所能达到的分辨率的分析。

具体实施方式

为了本发明的技术方案、目的和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图对本发明做进一步的说明。本发明中涉及到的光学显微镜部件，除特殊说明的以外，均为常规的光学部件。

图1是现有的常见光片显微镜的结构及功能示意图，其由X方向的片光源照射xy平面内的物体，检测方向基本垂直于片光源的照射方向。如图1所示，其通常包括光源，柱面镜或扫描仪，激发物镜，检测物镜，相机等部件，根据不同的功能可以选择不同的部件。透镜1和透镜2用来进行扩束。透镜3和透镜4进行第二次扩束，并将扫描仪的扫描角度共轭到激发物镜后焦面上去。聚焦的厚度一般和数值孔径NA成反比。当需要大的扫描范围的时候，需要小的数值孔径。但是随着聚焦厚度的增加，其降低了XY平面的分辨率。

实施例1：

图2是2P3A-DSLM的一个结构示意图。如图所示，在传统光片显微镜的基础上，在激发光路设置快速变焦装置，用于快速调制光的焦点位置；设置快速光强调制装置，用于快速调制光强；快速变焦装置是TAG。反射式扩束镜根据实际情况，可以先进行一次扩束，使光斑符合TAG孔径要求，并减小色差。透镜1和透镜2用来将TAG透镜的变焦平面共轭到显微镜物镜后焦面上去。透镜3和透镜4进行第二次扩束，并将扫描仪的扫描角度共轭到激发物镜后焦面上去。

实施例2：

快速变焦装置是电控可变焦透镜、微机械可变反射镜(MEMSMIRROR)中的一种。

实施例3：

快速光强调制装置是普克尔斯盒(Conoptics，350-160LA)。

实施例4：

根据实施例1结构的2P3A-DSLM，，所述快速变焦装置是TAG，快速光强调制装置是普克尔斯盒，利用一个检流计扫描振镜(galvo scanning mirror，GSM)，即扫描器，用来实现激光束与照明物镜轴向(x轴)垂直的方向(y轴)的扫描。使用双光子作为光源。

实施例5：

根据实施例1结构的2P3A-DSLM，使用TAG作为快速调焦装置。TAG使用声波径向激发一个充满液体的圆柱形谐振腔并使液体的折射率产生连续变化，使得轴向焦平面快速变化，达到10μs。这里我们用它来实现飞秒激光(140fs，重复频率80MHz，Chameleon Version II，Coherent)沿着光轴方向在照明物镜(40×NA 0.8，Nikon)前端的快速变焦。一个检流计扫描振镜(galvo scanning mirror，GSM)，即扫描器，用来实现激光束与照明物镜轴向(x轴)垂直的方向(y轴)的扫描。

实施例6：

根据实施例1结构的2P3A-DSLM，可以通过分别以450kHz和1kHz的频率驱动TAG和GSM。使用双光子作为光源，我们就能在1ms内得到一个超薄的双光子光片。如图3所示，光片的尺寸可以通过调节TAG(x方向)的调制强度以及GSM(y方向)的扫描振幅来调整。这两个因素都会增加光片的照度不匀程度。为了补偿照度不匀，我们使用了一个超高速普克尔斯盒(Conoptics，350-160LA)来动态调节照射功率，有效地消除轴向的非均匀照射。

实施例7：

根据实施例5结构的2P3A-DSLM，使用双光子作为光源，40倍放大物镜，我们研究了普克尔斯盒对于整个视野深度的非均匀照明的补偿，如图4所示，普克尔斯盒对照明的补偿能有效克服整个视野深度的非均匀照明。在补偿之前，照明强度随着渗透深度的增加而衰退。在用普克尔斯盒动态调整照明功率之后，光照强度在整个渗透深度范围内都变得非常均匀。最右边的图表示的是调制前和调制后在图中直线上的强度分布曲线。比例尺：100μm。

实施例8：

根据实施例5结构的2P3A-DSLM，我们通过对异硫氰酸荧光素(FITC)溶液的成像对这套系统的性能进行了定量分析(图5)。当TAG的调制强度增加到35％时，x方向的视野深度呈直线上升趋势，增加到170μm。当视野深度在5μm到170μm之间时，光片厚度在近端和中间都保持在低于1μm。在35％的TAG调制强度下，光片厚度在视野深度170μm的远端增加到1.5μm，依然低于普通的光片显微镜(2～8μm)。因为照明物镜的校正范围是有限的，当TAG调制强度超过35％时，光片在z方向上会突然扩展。降低照明物镜的数值孔径和放大倍率，能够使视野深度的调节范围更大，但这样会增加光片的厚度并且牺牲系统的空间分辨率。通过对FITC溶液的成像，我们定量分析了2P3A-DSLM在不同视野深度下所产生的光片厚度。图5所示的是不同TAG调制强度(0％～35％)下的光片侧视图。比例尺：50μm。

实施例9：

根据实施例1结构的2P3A-DSLM，我们利用测量嵌在琼脂糖凝胶中的荧光玻璃小珠的方法来评估在不同TAG调制强度下的系统轴向(y-z平面)和侧向(x-y平面)分辨率，如图6所示。荧光玻璃小珠在不同TAG调制强度下的侧向半高宽范围是420nm～450nm，接近阿贝极限。当TAG调制强度在0％～35％时，荧光玻璃小珠的的轴向半高宽在激发场的近端和中部维持在700nm～800nm。除了35％的TAG调控强度之外，轴向分辨率在激发场远端都保持在1μm以下。这些实验数据与理论分析吻合地很好，表明我们的系统比传统的光片显微镜乃至配有高数值孔径的双光子点扫描显微镜都具有更高的分辨率。

实施例10：

根据实施例1结构的2P3A-DSLM，，我们通过活体亚细胞结构和动态成像测试了该系统在生物学研究方面的性能。线粒体是真核细胞中关键的细胞器，其直径在0.5～1μm之间。在活细胞中，单个线粒体产生的超氧化合物瞬时爆发现象被称为“线粒体闪烁”。这里我们定时监测3天龄的mt-cpYFP转基因秀丽隐杆线虫的咽部线粒体动态过程。在记录帧速率为5Hz和像素2048x2048的图像时，我们能够分辨出线粒体闪烁发生过程的波峰。另外，我们成功地对分离后体外培养的老鼠心肌细胞进行了二维空间上的钙火花成像，帧速率为820Hz，帧尺寸为2048x256像素。

实施例11：

由于染色体尺寸太小，通常都需要使用一个高数值孔径、高放大倍率的物镜在单细胞或者胚胎发育的早期观察细胞分裂过程中的染色体分离。根据实施例1结构的2P3A-DSLM，，我们利用2P3A-DSLM，能够同时观察3天龄的斑马鱼心脏的数百个细胞核，并且清晰地看到一些分裂期细胞的染色体结构。这主要得益于这一新型成像技术产生的纤薄光片，从而得到低背景噪音和高对比度的荧光图像。

实施例12：

低曝光量是对生物样本长时间成像的关键。通过对mt-cpYFP转基因秀丽隐杆线虫连续的三维成像。根据实施例1结构的2P3A-DSLM，我们对比了2P3A-DSLM和常规2P-LSM的光漂白效应。经过15分钟的记录，我们的系统没有出现明显的漂白，这与已经被漂白超过50％的2P-LSM形成鲜明对比。这主要是因为在同样的点扩展函数轴向宽度和信号速率条件下，2P3A-DSLM需要的照明数值孔径更小，能有效减少激发光的峰值强度以及二阶光损伤

实施例13：

根据实施例5结构的2P3A-DSLM，进一步包括发射光路快速变焦器件，使得成像物镜的成像面与三维快速变化的光片位置始终匹配

实施例14：

根据实施例1结构的2P3A-DSLM，，我们计算了光片显微镜不同的光片厚度所能达到的分辨率的对比。如图7所示，所有光片显微镜都要用到两个正交的物镜。因此，探测系统中的点扩展函数由激发强度分布g(x，y，z)和探测物镜的模糊函数d(x，y，z)所决定：

P(x，y，z)＝g(x，y，z)d(x，y，z)         (3.1)

x，y，z三个方向的定义与正文中的相同。我们可以通过计算横向(x，y)和轴向(z)点扩展函数的半高宽来理论地估计系统的光学分辨率。

横向的照明是均匀的，因此g(x，y)＝1。因此，x和y方向上的点扩展函数被d_lateral(x，y)唯一决定。艾里公式给出了探测物镜焦平面的径向模糊函数：

$P_{\mathrm{lateral}}\left(r\right)=d_{\mathrm{lateral}}\left(r\right)={\left[\frac{2J_1\left(\frac{2\mathrm{\π}}{\mathrm{\λ}}\mathrm{nr}\sin \mathrm{\α}\right)}{\frac{2\mathrm{\π}}{\mathrm{\λ}}\mathrm{nr}\sin \mathrm{\α}}\right]}^2---\left(3.2\right)$

其中λ为荧光波长，n为折射率，α为物镜孔径角，r：

$r=\sqrt{x^2+y^2}---\left(3.3\right)$

我们所用的荧光(EGFP)波长为515nm，探测物镜的数值孔径(NA)为0.8，我们能算出横向点扩展函数的半高宽：FWHM_lateral为396nm。

在轴向上，激发是高度集中的，强度分布可以被近似为一个高斯光束：

$g\left(z\right)=\exp (-\frac{z^2}{2{\mathrm{\σ}}^2})---\left(3.4\right)$

其中σ表示高斯函数的标准偏差，可以由z轴上激发截面的半峰宽(σez)来计算，如下：

${\mathrm{\σ}}_{\mathrm{ez}}=\frac{1}{2\sqrt{2\ln 2}}{\mathrm{FWHM}}_{\mathrm{ez}}---\left(3.5\right)$

沿着z轴的模糊函数daxial(z)为：

$d_{\mathrm{axial}}\left(z\right)={\left[\frac{\sin \left(\frac{2\mathrm{\π}}{\mathrm{\λ}}{\mathrm{nz}\sin }^2\frac{\mathrm{\α}}{2}\right)}{\frac{2\mathrm{\π}}{\mathrm{\λ}}{\mathrm{nz}\sin }^2\frac{\mathrm{\α}}{2}}\right]}^2---\left(3.6\right)$

因此轴向的点扩散函数为：

$P_{\mathrm{axial}}\left(z\right)=\exp (-\frac{z^2}{2{{\mathrm{\σ}}_{\mathrm{ez}}}^2})\·{\left[\frac{\sin \left(\frac{2\mathrm{\π}}{\mathrm{\λ}}{\mathrm{nz}\sin }^2\frac{\mathrm{\α}}{2}\right)}{\frac{2\mathrm{\π}}{\mathrm{\λ}}{\mathrm{nz}\sin }^2\frac{\mathrm{\α}}{2}}\right]}^2---\left(3.7\right)$

通过改变光片厚度(σ_ez)，我们得到了相应的点扩散函数Paxial(z)以及其轴向的半峰宽FWHMaxial.图形展示的是FWHMaxial(z轴分辨率)和σ_ez(z轴光片厚度)的关系。在宽视野照明下，σ_ez趋于无穷，对应约1.7μm的轴向分辨率。在达到和我们一样的x方向渗透深度(170μm)条件下，常规单视角光片显微镜的光片厚度为2～8μm，其相应轴向分辨率为1.3～1.7μm，与宽场照明相比只有轻微地增加。我们的2P3A-DSLM系统沿x方向的光片厚度为800nm-900nm，将轴向分辨率显著提高，达到了700～800nm，远高于目前的单视野光片显微镜。同样清楚地是，少于2μm的光片厚度能显著提高轴向分辨率，而更厚的光片对轴向分辨率的改善贡献很小。

实施例15：

根据实施例1结构的2P3A-DSLM，我们计算了2P3A-DSLM和2P-LSM的光漂白程度。为了比较2P3A-DSLM和2P-LSM的光漂白程度，我们必须确保这两个系统具有同样的时间和空间分辨率，以及产生相似生物样本和相似信号速率的荧光图像。模型如图8所示，理论上，2P3A-DSLM的平均功率为P，激发强度I，(illumination)照明数值孔径NA，发射数值孔径NAe，腰宽wo，瑞利散射范围b和信号速率S。相比之下，2P-LSM的平均功率P’，激发强度I’，激发和发射数值孔径NA’，腰宽wo’，瑞利散射范围b’和信号速率S’。腰宽与数值孔径成反比；瑞利散射范围与数值孔径的平方成反比：

2P3A-DSLM： $w_0=\frac{\mathrm{\λ}}{\mathrm{\π}\left(\mathrm{NA}\right)}---\left(6.1\right)$

$b=\frac{2\mathrm{n\λ}}{\mathrm{\π}{\left(\mathrm{NA}\right)}^2}---\left(6.2\right)$

2P-LSM： ${w_0}^{\′}=\frac{\mathrm{\λ}}{\mathrm{\π}\left({\mathrm{NA}}^{\′}\right)}---\left(6.3\right)$

$b^{\′}=\frac{2\mathrm{n\λ}}{\mathrm{\π}{\left({\mathrm{NA}}^{\′}\right)}^2}---\left(6.4\right)$

其中λ是激光的波长，n是介质的反射系数。为了达到相同的横向分辨率与轴向激光聚焦尺寸，2P3A-DSLM中的wo必须等于2P-LSM中的b’，2P3A-DSLM的发射数值孔径NAe必须等于2P-LSM的发射数值孔径NA’：

$w_0=b^{\′}=\frac{\mathrm{\λ}}{\mathrm{\π}\left(\mathrm{NA}\right)}=\frac{2\mathrm{n\λ}}{\mathrm{\π}{\left({\mathrm{NA}}^{\′}\right)}^2}---\left(6.5\right)$

NA_e＝NA′            (6.6)

由等式(6.5)，我们可以得出：

${\mathrm{NA}}^{\′}=\sqrt{2\mathrm{nNA}}---\left(6.7\right)$

正如附录的实验数据所示，2P3A-DSLM的激发轴向半高宽约为800nm，根据FWHM与NA的关系式， ${\mathrm{FWHM}}_{2p}=\frac{\sqrt{\ln 2}\·\mathrm{\λ}}{\mathrm{\π}\left(\mathrm{NA}\right)}---\left(6.8\right)$

我们计算得到的有效照明数值孔径NA约为0.3.根据等式(6.7)，为了达到相同的轴向激光聚焦尺寸，我们需要2P-LSM中物镜的NA’约为0.9。因此，这里令NA∶NA’＝1∶3。由于激发光强I正比于NA的平方，2P3A-DSLM中I的峰值强度略低于相同分辨率下记录的2P-LSM中I’的9倍。取决于峰值激发光强的超二阶效应是在体非线性成像中光损伤的主要机制。因此，同样的对于2P-DSLM，我们的系统表现出大幅衰减的峰值激发光强以及最小化的光漂泊与光损伤.实验中，应用相同的飞秒激光(Coherent Chameleon)与物镜(Nikon 40X NA 0.8)，将我们的2P3A-DSLM与OLYMPUS F1000 2P-LSM相对比。2P-LSM的物镜与2P3A-DSLM的检测物镜被应用全部的回孔径以达到相同的横向分辨率，2P3A-DSLM的照明物镜被应用部分的回孔径以实现约0.3的NA.这种排布保证了两种情况下相同的激发深度。2P3A-DSLM中的TAG维持在20％的调制以实现100μm视场深度，与的光场尺寸相一致。3D堆栈的轴向拍摄步伐为500nm每片.两个系统的时域分辨率保持在500ms每帧，40s每卷。应用这些系统，我们连续捕捉到mt-cpYFP-转基因秀丽隐杆线虫的3D时序图。

实施例16：

此外，根据实施例1结构的2P3A-DSLM，我们还通过理论分析比较了2P3A-DSLM，2P-LSM和静态光片显微镜的光损伤。在同样的信号速率下，2P3A-DSLM与2P-LSM和静态光片显微镜相比，显示出更小的线型光损伤，相同的二阶光损伤，和较高的超二阶光损伤。如图9所示，2P3A-DSLM，2P-DSLM以及Static light-sheet理论上的的光损伤对比。参考文献中，作者将含静态光片的2P-DSLM与2P-DSLM相对比。在此基础上，我们将这些对比拓展到2P3A-DSLM上。我们对比2P3A-DSLM光片，由球形聚焦的高斯光束生成图像(取z，y轴的特征宽度均为w₀，瑞利距离为b)；传统的2P-DSLM(取z，y轴的特征宽度均为Nw₀，瑞利距离扩大为N²b)；以及静态光片显微镜(同样取z轴的特征宽度为Nw₀，瑞利距离为N²b，但y轴的特征宽度在Mw₀范围内均匀分布)之间的关系(A-C)。为了简化计算，我们假设瑞利范围为N²b中的光束宽度保持不变。为了得到相同的均匀照明视场的尺寸，2P3A-DSLM需要在x方向上利用TAG调谐将其N²次，以及y方向上利用GSM扫描将其扩展M次。激发强度与平均激发功率成正比，与激光束的横断面积成反比，因此：

2P3A-DSLM： $I_1\∝\frac{P_1}{w_0^2}---\left(7.1\right)$

2P-DSLM： $I_2\∝\frac{P_2}{{N^{2}w}_0^2}---\left(7.2\right)$

Static light-sheet： $I_3\∝\frac{P_3}{{\mathrm{MNw}}_0^2}---\left(7.3\right)$

单位时间内的激发体积：

2P3A-DSLM：v₁＝w₀ ²b           (7.4)

2P-DSLM：v₂＝N⁴w₀ ²b            (7.5)

Static light-sheet：v₃＝MN³w₀ ²b         (7.6)

每个周期内的双光子平均激发信号速率与强度的平方和激发体积的乘积成正比：

2P3A-DSLM： ${\mathrm{SR}}_1\∝{I_1}^2{V}_1=\frac{{P_1}^2}{w_0^4}\·{w_0}^{2}b---\left(7.7\right)$

2P-DSLM： ${\mathrm{SR}}_2\∝{I_2}^2{V}_2=\frac{{P_2}^2}{{N^{4}w}_0^4}\·{{N^{4}w}_0}^{2}b---\left(7.8\right)$

Static light-sheet： ${\mathrm{SR}}_3\∝{I_3}^2{V}_3=\frac{{P_3}^2}{{{M^{2}N}^{2}w}_0^4}\·{{{\mathrm{MN}}^{3}w}_0}^{2}b---\left(7.9\right)$

在等式7.7-7.9中，我们推断出如果我们在2P3A-DSLM，2P-DSLM和static light-sheet中在同样的检测效率(SR₁＝SR₂＝SR₃)的情况下获得相同的信号速率，那么激发强度比为：

I₁∶I₂∶I₃＝1∶N^-2∶M^-1/2N^-3/2       (7.10)

通常，光损伤被分为三种类型：线性，二次方和超二次方，这分别与吸收一个，两个或超过两个光子的效果对应。在飞秒激光器具有相同的脉冲宽度和重复率的情况下，整个样本在激发光路上的线性，二次和超二次损伤分别与IV，I²V和I^xV成正比。利用等式7.4-7.6和等式7.11，我们得出：

线性光损伤：I₁V₁∶I₂·V₂∶I₃·V₃＝1∶N²∶M^1/2N^3/2      (7.11)

二次光损伤：I₁ ²·V₁∶I₂ ²·V₂∶I₃ ²·V₃＝1∶1∶1(7.12)

超二次光损伤：I₁ ^x·V₁∶I₂ ^x·V₂∶I₃ ^x·V₃＝1∶N^-2x+4∶M^-x/2+1N^-3x/2+3(7.13)

当M＞＞N(我们试验中，M约为200，N约为4)和x＞2时，2P3A-DSLM与2P-DSLM和staticlight sheet相比，对样本具有更低的线性光损伤，相同的二次光损伤但是更高的超二次光损伤。这已经考虑到样本暴露在瑞利范围体积内。

然而，在TAG轴向扫描时，2P3A-DSLM中的瑞利范围之外的样本区域将被暴露在激光能量下，这在2P-DSLM和静态光片设备中是不存在的。这样的激光强度并不诱导显著的二次和超二次伤害，但是会引起更多的线性发热效应。因此，2P3A-DSLM对样本的所有线性损伤由这两种成分组成。这在不同的z轴截面间隔，视野尺寸和生物样本上是不同的，需要视具体情况分析。

总而言之，我们研制出的2P3A-DSLM同时具有对深层组织成像的大视野，微弱光漂白，高轴向和时间分辨率等特点。我们展示了其在活体模式生物中分辨亚细胞结构以及追踪单线粒体动态过程等方面的优异性能。本发明具体实施方式中的具体实施例，仅仅是对于本发明的进一步说明，并不构成本发明的限制因素。

Claims (16)

1.一种基于轴向超高速扫描的三轴数字扫描光片显微镜包括：

激发光源，其发射的光束沿着X轴方向照射到样品上；

成像设备，其沿着Z方向检测样品上发射和/或反射的光，Z方向与x方向基本垂直；

扫描仪，用于Y方向形成光片和/或Z方向改变光片的位置，所述Y方向沿着与X和Z方向基本垂直的方向延伸；

其特征在于：

激发光路快速变焦装置，用于快速调制光的焦点位置；

快速光强调制装置，用于快速调制光强；

所述激发光路快速变焦装置和快速光强调制装置位于激发光路中。

2.根据权利要求1所述的光片显微镜，其特征在于激发光路快速变焦装置选自可调声学梯度折射率指数透镜(TAG)、电控可变焦透镜、微机械可变反射镜(MEMSMIRROR)中的一种。

3.根据权利要求1-2所述的光片显微镜，其特征在于快速光强调制装置包括电光调制器。优选高速普克尔斯盒。

4.根据权利要求1-3所述的光片显微镜，其特征在于快速变焦装置的变焦频率在100HZ以上，优选1KHZ以上，更优选500kHZ以上。

5.根据权利要求1-4所述的光片显微镜，其特征在于快速变焦装置在所述光片荧光显微镜的激发物镜后焦面的共轭范围内。

6.根据权利要求5所述的光片显微镜，其特征在于共轭范围是共轭距离的80％到120％。

7.根据权利要求1-6所述的光片显微镜，其特征在于所述二维扫描镜包括单个二维扫描镜。

8.根据权利要求1-7所述的光片显微镜，其特征在于所述二维扫描镜包括一组的两个一维扫描镜。

9.根据权利要求1-8所述的光片显微镜，其特征在于在发射光路中，进一步包括发射光路快速变焦器件，使得成像物镜的成像面与三维快速变化的光片位置始终匹配。

10.根据权利要求1-9所述的光片显微镜，其特征在于激发光路中，用作光片垂直方向扫描的扫描反射镜与发射光路中快速变焦透镜连用；可以实现不同成像焦面的快速切换。

11.根据权利要求1-10所述的光片显微镜，其特征在于所述快速声光调制装置的调制频率是变焦装置频率的10倍以上。

12.根据权利要求1-11所述的光片显微镜，其特征在于所述光片显微镜用于mt-cpYFP转基因秀丽隐杆线虫连续的三维成像。

13.根据权利要求1所述的光片显微镜，其特征在于所述快速调焦装置是TAG，电光调制器是高速普克尔斯盒。

14.根据权利要求13所述的光片显微镜，其特征在于当激发物镜的放大倍数为40倍，数值孔径为0.8的条件下，通过调节TAG强度，可以控制XY平面扫描区域在10x10μm²到170×170μm²的范围内。

15.根据权利要求1-14所述的光片显微镜，其特征在于所述所述快速光强调制装置的频率是10kHz以上，优选10MHz以上。

16.根据权利要求1-15所述的光片显微镜，其特征在于所述激发光源优选自双光子飞秒激光光源或三光子飞秒激光光源。