CN103852877B - 一种超高分辨率非线性光学显微系统 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种超高分辨率非线性光学显微系统，本发明涉及激光检测领域，该系统结合非线性光学技术和受激发射减损显微技术，采用一束波长较长的短脉冲红外激光作为多光子激发光源，另外一束同步短脉冲激光泵浦倍频泵浦光参量振荡器，产生的宽调谐范围的超短激光脉冲经单模光纤，脉冲宽度拉伸至200ps，作为受激发射减损光源，激发光用于激发荧光分子，受激发射减损光将激发光斑焦点外围的荧光猝灭，使非线性光学显微系统得以突破光波衍射极限。在本发明中，非线性光学采用波长较长的红外激光作为多光子激发光源，其受散射影响小，故穿透深度要高，有利于生物活体组织的超高分辨层析成像。

Description

一种超高分辨率非线性光学显微系统

技术领域

本发明涉及激光检测领域，尤其涉及一种超高分辨率非线性光学显微系统。

背景技术

远场光学显微镜的空间分辨率一直受限于衍射极限。光波由于其波动特性会发生衍射，因而光束不能无限聚焦，200nm是远场光学显微镜的理论分辨极限。而随着生命科学的迅速发展，研究已深入到单细胞、亚细胞和单分子这样的层次，光学显微镜的空间分辨率已经成为最为关键的核心问题。

尽管近场扫描光学显微镜（Near-fieldScanningOpticalMicroscopy，NSOM）突破了衍射极限，不再受到光波的限制，分辨率可以达到纳米级别，但是它只适用于表面二维高分辨率测量，不能直接观测细胞内部。

近年来，基于现代测量技术的发展和近期物理学家带来的技术革新，远场光学显微镜得到了革命性的进展，分辨率提高到纳米尺度，其中主要包括受激发射减损显微镜（StimulatedEmissionDepletion（STED）Microscopy），饱和结构光学显微镜（SaturatedStructuredIlluminationMicroscopy，SSIM），基于探针定位技术的光敏定位显微镜（PhotoActivatedLocalizationMicroscopy，PALM）和随机光学重建显微镜（StochasticOpticalReconstructionMicroscopy，STORM）。

这些技术使得光学显微镜得以突破光波衍射极限的限制，直接在单分子水平上对生物细胞内部进行细微的观察研究。超高分辨光学显微方法的发展遇到的一个瓶颈问题就是很难实现生物活体组织的成像。究其本质，是因为这些显微方法都是基于单光子激发荧光技术，具有较差的光学穿透性，无法满足实际应用中的多种需要。

发明内容

本发明提供了一种超高分辨率非线性光学显微系统，本发明突破了传统非线性光学显微的衍射极限限制，适合于生物活体组织的超高分辨层析成像，提高了光学穿透性，详见下文描述：

一种超高分辨率非线性光学显微系统，所述超高分辨率非线性光学显微系统包括：第一飞秒激光器，第二飞秒激光器，倍频泵浦光参量振荡器，单模光纤，螺旋相位板或相位调制器，延迟装置，第一双色分光镜，第二双色分光镜，物镜，滤光片，雪崩式光电二极管或光电倍增管和样品台，

所述第一飞秒激光器生成第一飞秒激光，用于非线性激发荧光染料或荧光蛋白；所述第二飞秒激光器生成第二飞秒激光，作为所述倍频泵浦光参量振荡器的泵浦光源，且所述第一飞秒激光器和所述第二飞秒激光器锁相同步；

所述倍频泵浦光参量振荡器产生宽调谐范围的超短激光脉冲，作为受激发射减损光；所述受激发射减损光经所述单模光纤后，脉冲宽度拉伸至200ps以上；所述螺旋相位板或相位调制器调制所述受激发射减损光的空间相位，使之在聚焦处的强度分布为空心环状；所述延迟装置用于调节所述第二飞秒激光到达样品的时间；

所述第一双色分光镜将调节后的第二飞秒激光和调制后的受激发射减损光合束；所述第二双色分光镜用于分离荧光和杂散光；所述物镜将调节后的第二飞秒激光和调制后的受激发射减损光共线聚焦于样品，并收集荧光；

所述滤光片为带通滤光片，通过所述荧光；所述雪崩式光电二极管或光电倍增管探测所述荧光，获得单点荧光信号的光强；所述样品台对样品进行扫描，获取超高分辨率荧光显微图像。

所述第一飞秒激光为超短脉冲激光。

所述第二飞秒激光为超短脉冲激光。

本发明提供的技术方案的有益效果是：该系统结合了非线性光学技术和受激发射减损显微技术，采用波长较长的短脉冲红外激光作为多光子激发光源，其受散射影响小，提高了穿透性，有利于生物活体组织的超高分辨层析成像。

附图说明

图1：本系统的光路示意图；

图2：荧光分子能级跃迁、自发辐射和受激辐射示意图。

附图中，各标号所代表的部件列表如下：

1：第一飞秒激光器；2：第二飞秒激光器；

3：倍频泵浦光参量振荡器；4：单模光纤；

5：螺旋相位板或相位调制器；6：延迟装置；

7：第一双色分光镜；8：第二双色分光镜；

9：物镜；10：滤光片；

11：雪崩式光电二极管或光电倍增管；12：样品台。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明实施方式作进一步地详细描述。

非线性光学采用波长较长的红外激光作为多光子激发光源，其受散射影响小故穿透深度要高，因此能实现生物活体组织的层析成像。选择非线性光学与受激发射减损显微方法（STED）相结合，可以实现生物在体较厚组织的超高分辨成像。STED原理是通过两束激光，减少荧光光点的衍射面积。第一束激光用于激发荧光分子，第二束激光将激发光斑焦点外围的荧光猝灭，只有焦点中心能检测到荧光。这样，分辨尺度由激发光斑的大小缩小到焦点中心的大小，从而突破衍射极限的限制。

为了突破传统非线性光学显微的衍射极限限制，适合于生物活体组织的超高分辨层析成像，提高光学穿透性，本发明实施例提供了一种超高分辨率非线性光学显微系统，参见图1和图2，详见下文描述：

该超高分辨率非线性光学显微系统包括：第一飞秒激光器1，第二飞秒激光器2，倍频泵浦光参量振荡器3，单模光纤4，螺旋相位板或相位调制器5，延迟装置6，第一双色分光镜7，第二双色分光镜8，物镜9，滤光片10，雪崩式光电二极管或光电倍增管11和样品台12。

第一飞秒激光器1生成第一飞秒激光，用于多光子激发生物标识荧光物质，包括：双光子激发和三光子激发等，第二飞秒激光器2生成第二飞秒激光，作为倍频泵浦光参量振荡器3的泵浦光源，且第二飞秒激光器2和第一飞秒激光器1锁相同步。倍频泵浦光参量振荡器3产生宽调谐范围的超短激光脉冲，脉冲宽度约130fs，经单模光纤4后，脉冲宽度拉伸至200ps以上，作为受激发射减损光。螺旋相位板或相位调制器5调制受激发射减损光的空间相位，使之在聚焦处的强度分布为空心环状。延迟装置6用于调节第二飞秒激光到达样品的时间。第一双色分光镜7将调节后的第二飞秒激光和调制后的受激发射减损光合束；第二双色分光镜8用于分离荧光和杂散光；物镜9将调节后的第二飞秒激光和调制后的受激发射减损光共线聚焦于样品，并收集荧光；滤光片10为带通滤光片，对杂散光进行滤光（通过荧光），阻止调节后的第二飞秒激光、受激发射减损光和调制后的背景自发荧光；雪崩式光电二极管或光电倍增管11探测荧光，获得单点荧光信号的光强；样品台12为三维纳米平移台，通过移动纳米平移台，对样品进行扫描，获取超高分辨率荧光显微图像。

下面结合具体的实例详细描述该超高分辨非线性激发荧光显微系统的工作原理：

第一飞秒激光器1产生波长为800nm的第一飞秒激光，脉冲宽度约130fs，重复频率为76MHz，用于双光子激发荧光探针GFP（具体为绿色荧光蛋白GFP，用于观察CHO细胞中的GFP标识的caveolin蛋白超高分辨成像），参见图2，双光子激发荧光分子使之跃迁到激发态，处于激发态的荧光分子一般通过自发辐射发出荧光从而跃迁回到基态。而在受激发射减损光的作用下，绝大部分荧光分子发生受激辐射，发出与受激发射减损光相同频率的光波，向低能态跃迁从而大幅度减少了荧光产量，实现了荧光淬灭。

第二飞秒激光器2产生波长为800nm的第二飞秒激光，作为倍频泵浦光参量振荡器3的泵浦光源。第二飞秒激光器2与第一飞秒激光器1锁相同步，重复频率相同，相位锁定。倍频泵浦光参量振荡器3产生波长为580nm的超短激光脉冲，脉冲宽度约130fs，经40m长的单模光纤，光脉冲的不同频率成分在光纤中会以不同的速度传播，在传输一段距离后会发生脉冲展宽，在本发明实施例中，经过40m长的单模光纤后脉冲宽度将展宽到200ps左右，用作受激发射减损光。

螺旋相位板或相位调制器5调制波长为580nm的受激发射减损光的空间相位，使之在聚焦处的强度分布为空心环状。在调制后的受激发射减损光作用下，激发光斑焦点外围的荧光分子发生受激辐射从而被淬灭，只有焦点中心能检测到荧光。这样，分辨尺度由激发光斑的大小缩小到焦点中心的大小，从而突破衍射极限的限制。延迟装置6用于调节波长为800nm的第二飞秒激光到达样品的时间，使之与调制后波长为580nm的受激发射减损光同时到达样品。第一双色分光镜7将调节后波长为800nm的第二飞秒激光和调制后波长为580nm的受激发射减损光合束。第二双色分光镜8用于分离荧光和杂散光；物镜9将调节后的第二飞秒激光和调制后的受激发射减损光共线聚焦于样品，并收集荧光。

滤光片10为带通滤光片，让GFP480–530nm的荧光通过，阻止调节后的第二飞秒激光、受激发射减损光和调制后的背景自发荧光；雪崩式光电二极管或光电倍增管11探测荧光，获得单点荧光信号的光强；样品台12为三维纳米平移台，通过移动纳米平移台，对样品进行扫描，扫描速度为1ms/pixel，获取超高分辨率荧光显微图像。

本发明实施例对各器件的型号除做特殊说明的以外，其他器件的型号不做限制，只要能完成上述功能的器件均可。

本领域技术人员可以理解附图只是一个优选实施例的示意图，上述本发明实施例序号仅仅为了描述，不代表实施例的优劣。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种超高分辨率非线性光学显微系统，其特征在于，所述超高分辨率非线性光学显微系统包括：第一飞秒激光器，第二飞秒激光器，倍频泵浦光参量振荡器，单模光纤，螺旋相位板，延迟装置，第一双色分光镜，第二双色分光镜，物镜，滤光片，雪崩式光电二极管或光电倍增管和样品台，

所述第一飞秒激光器生成第一飞秒激光，用于非线性激发荧光蛋白；所述第二飞秒激光器生成第二飞秒激光，作为所述倍频泵浦光参量振荡器的泵浦光源，且所述第一飞秒激光器和所述第二飞秒激光器锁相同步；

所述倍频泵浦光参量振荡器产生宽调谐范围的超短激光脉冲，作为受激发射减损光；所述受激发射减损光经所述单模光纤后，脉冲宽度拉伸至200ps以上；所述螺旋相位板调制所述受激发射减损光的空间相位，使之在聚焦处的强度分布为空心环状；所述延迟装置用于调节所述第二飞秒激光到达样品的时间；

所述第一双色分光镜将调节后的第二飞秒激光和调制后的受激发射减损光合束；所述第二双色分光镜用于分离荧光和杂散光；所述物镜将调节后的第二飞秒激光和调制后的受激发射减损光共线聚焦于样品，并收集荧光；

所述滤光片为带通滤光片，通过所述荧光；所述雪崩式光电二极管或光电倍增管探测所述荧光，获得单点荧光信号的光强；所述样品台对样品进行扫描，获取超高分辨率荧光显微图像。

2.根据权利要求1所述的一种超高分辨率非线性光学显微系统，其特征在于，所述第一飞秒激光为超短脉冲激光。

3.根据权利要求1所述的一种超高分辨率非线性光学显微系统，其特征在于，所述第二飞秒激光为超短脉冲激光。