CN103885166A

CN103885166A - 基于布拉格衍射晶体的超高分辨非线性激发荧光显微系统

Info

Publication number: CN103885166A
Application number: CN201410123816.3A
Authority: CN
Inventors: 李奇峰; 陈达; 沙乾坤; 王洋
Original assignee: Tianjin University
Current assignee: Tianjin University
Priority date: 2014-03-28
Filing date: 2014-03-28
Publication date: 2014-06-25

Abstract

本发明公开了一种基于布拉格衍射晶体的超高分辨非线性激发荧光显微系统，本发明涉及激光检测领域，该系统结合非线性光学技术和受激发射减损显微技术，采用波长较长的红外激光作为多光子激发光源，采用一束连续激光作为减损光源，激发光源用于激发荧光分子，受激发射减损光将激发光斑焦点外围的荧光猝灭，使非线性光学显微系统得以突破光波衍射极限。本发明引入了布拉格衍射晶体，将飞秒激光的重复频率降到4MHz以下，显著提高了荧光分子的荧光量子产率。同时，布拉格衍射晶体将连续的受激发射减损光调制成与飞秒激光相同重复频率的同步脉冲激光，在简化装置的基础上，减少了入射光的能量，降低了对样品的光漂白。

Description

基于布拉格衍射晶体的超高分辨非线性激发荧光显微系统

技术领域

本发明涉及激光检测领域，尤其涉及一种基于布拉格衍射晶体的超高分辨非线性激发荧光显微系统。

背景技术

常规光学显微镜的空间分辨率一直受限于衍射极限。光波由于其波动特性会发生衍射，因而光束不能无限聚焦，200nm是常规光学显微镜的理论分辨极限。而随着生命科学的迅速发展，研究已深入到单细胞、亚细胞和单分子这样的层次，光学显微镜的空间分辨率已经成为最为关键的核心问题。

近年来，基于现代测量技术的发展和近期物理学家带来的技术革新，远场光学显微镜得到了革命性的进展，分辨率提高到纳米尺度，其中主要包括：受激发射减损显微镜（Stimulated Emission Depletion（STED）Microscopy），饱和结构光学显微镜（SaturatedStructured Illumination Microscopy，SSIM），基于探针定位技术的光敏定位显微镜（PhotoActivated Localization Microscopy，PALM）和随机光学重建显微镜（Stochastic OpticalReconstruction Microscopy，STORM）。

这些技术使得光学显微镜得以突破光波衍射极限的限制，直接在单分子水平上对生物细胞内部进行细微的观察研究。超高分辨光学显微方法的发展遇到的一个瓶颈问题就是很难实现生物活体组织的成像。究其本质，是因为这些显微方法都是基于单光子激发荧光技术，具有较差的光学穿透性，无法满足实际应用中的多种需要。

发明内容

本发明提供了一种基于布拉格衍射晶体的超高分辨非线性激发荧光显微系统，本发明突破了传统非线性光学显微的衍射极限限制，减少了荧光蛋白或者染料分子的光漂白效应，详见下文描述：

一种基于布拉格衍射晶体的超高分辨非线性激发荧光显微系统，所述超高分辨非线性激发荧光显微系统包括：飞秒激光器、连续激光器、分束片、光电二极管、第一双色分光镜、布拉格衍射晶体、第二双色分光镜、延迟装置、螺旋相位板或相位调制器、第三双色分光镜、第四双色分光镜、物镜、滤光片、雪崩式光电二极管或光电倍增管和样品台，

所述飞秒激光器生成飞秒激光；所述连续激光器产生连续的受激发射减损光；所述分束片反射第一束飞秒激光至所述光电二极管，所述光电二极管接收所述第一束飞秒激光，作为所述布拉格衍射晶体的触发源；

所述第一双色分光镜实现第二束飞秒激光和连续的受激发射减损光的合束；所述布拉格衍射晶体降低所述第二束飞秒激光的重复频率，同时，将所述连续的受激发射减损光调制成与所述第二束飞秒激光相同重复频率的同步脉冲激光，从而减少对样品的照度，降低光漂白效应；

所述第二双色分光镜将所述第二束飞秒激光和调制后的受激发射减损光分离；所述延迟装置用于调节所述调制后的受激发射减损光到达样品的时间；所述螺旋相位板或相位调制器调制所述调制后的受激发射减损光的空间相位；所述第三双色分光镜将所述调制后的受激发射减损光和所述第二束飞秒激光合束；所述第四双色分光镜用于分离荧光和杂散光；

所述物镜将所述第二束飞秒激光和所述调制后的受激发射减损光共线聚焦于样品，并收集荧光；所述滤光片为带通滤光片，通过所述荧光；所述雪崩式光电二极管或光电倍增管探测所述荧光，获得单点荧光信号的光强；所述样品台对样品进行扫描，获取超高分辨率荧光显微图像。

所述飞秒激光为超短脉冲激光，用于非线性激发荧光染料或荧光蛋白。

所述受激发射减损光为连续激光，用于荧光淬灭。

本发明提供的技术方案的有益效果是：该系统通过布拉格衍射晶体将飞秒激光的重复频率降到4MHz以下，显著提高了荧光分子的荧光量子产率。同时，布拉格衍射晶体将连续的受激发射减损光调制成与飞秒激光相同重复频率的同步脉冲激光，不仅简化了装置，还减少了入射光的能量，降低了对样品的光漂白。

附图说明

图1：本系统的光路示意图；

图2：荧光分子跃迁和弛豫时间示意图；

图3：第二束飞秒激光、荧光和调制前后受激发射减损光的时间序列示意图。

其中(a)是第二束飞秒激光、荧光和调制前连续的受激发射减损光的时间序列示意图；(b)是第二束飞秒激光、荧光和调制后与第二束飞秒激光同步的受激发射减损光的时间序列示意图。

附图中，各标号所代表的部件列表如下：

1：飞秒激光器； 2：连续激光器；

3：分束片； 4：光电二极管；

5：第一双色分光镜； 6：布拉格衍射晶体；

7：第二双色分光镜； 8：延迟装置；

9：螺旋相位板或相位调制器； 10：第三双色分光镜；

11：第四双色分光镜； 12：物镜；

13：滤光片； 14：雪崩式光电二极管或光电倍增管；

15：样品台。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明实施方式作进一步地详细描述。

非线性光学采用波长较长的红外激光作为多光子激发光源，其受散射影响小故穿透深度要高，因此能实现生物活体组织的层析成像。选择非线性光学与受激发射减损显微方法相结合，可以实现生物活体组织的超高分辨成像。STED的原理是通过两束激光，减少荧光光斑的衍射面积。第一束激光用于激发荧光分子，第二束激光将激发光斑焦点外围的荧光猝灭，只有焦点中心能检测到荧光。这样，分辨尺度由激发光斑的大小缩小到焦点中心的大小，从而突破衍射极限的限制。

相对于单光子激发的荧光显微成像，多光子激发所需要的入射激光的能量大大增加，荧光蛋白或者染料分子的光漂白现象非常严重，这也是超高分辨非线性光学显微应用受到限制的原因所在。

为了突破传统非线性光学显微的衍射极限限制，减少荧光蛋白或者染料分子的光漂白效应，本发明实施例提供了一种基于布拉格衍射晶体的超高分辨非线性激发荧光显微系统，参见图1和图2，本发明实施例引入了布拉格衍射晶体6，详见下文描述：

该超高分辨非线性激发荧光显微系统包括：飞秒激光器1、连续激光器2、分束片3、光电二极管4、第一双色分光镜5、布拉格衍射晶体6、第二双色分光镜7、延迟装置8、螺旋相位板或相位调制器9、第三双色分光镜10、第四双色分光镜11、物镜12、滤光片13、雪崩式光电二极管或光电倍增管14和样品台15。

飞秒激光器1生成飞秒激光，用于多光子激发生物标识荧光物质，包括双光子激发和三光子激发等；连续激光器2产生受激发射减损光，将激发光斑焦点外围的荧光猝灭；分束片3反射第一束飞秒激光（其中，第一束飞秒激光约占总飞秒激光的1%，透过的大部分飞秒激光能量作为第二束飞秒激光）；光电二极管4接收分束片3反射的第一束飞秒激光，作为布拉格衍射晶体6的触发源；第一双色分光镜5实现第二束飞秒激光和连续的受激发射减损光的合束。布拉格衍射晶体6将第二束飞秒激光的重复频率降到4MHz以下，同时，将连续的受激发射减损光调制成与第二束飞秒激光相同重复频率的同步脉冲激光；第二双色分光镜7将第二束飞秒激光和调制后的受激发射减损光分离；延迟装置8用于调节调制后的受激发射减损光到达样品的时间；螺旋相位板或相位调制器9调制调制后的受激发射减损光的空间相位，使之在聚焦处的强度分布为空心环状；第三双色分光镜10将调制后的受激发射减损光和第二束飞秒激光合束；第四双色分光镜11用于分离荧光和杂散光；物镜12将第二束飞秒激光和调制后的受激发射减损光共线聚焦于样品，并收集荧光；滤光片13为带通滤光片，对杂散光进行滤光（通过荧光），阻止第二束飞秒激光和调制后的受激发射减损光；雪崩式光电二极管或光电倍增管14探测荧光，获得单点荧光信号的光强；样品台15为三维纳米平移台，通过移动纳米平移台，对样品进行扫描，获取超高分辨率荧光显微图像。

下面结合具体的实例详细描述该超高分辨非线性激发荧光显微系统的工作原理：

飞秒激光器1产生860nm飞秒激光，脉冲宽度约130fs，重复频率为76MHz，用于双光子激发荧光探针Atto425（用于观察CHO细胞中Atto425标识的caveolin蛋白超高分辨成像）。连续激光器2产生波长为532nm的连续受激发射减损光。分束片3反射第一束飞秒激光（约1%的860nm飞秒激光，透过的大部分飞秒激光能量作为第二束飞秒激光）。光电二极管4接收分束片3反射的第一束飞秒激光，作为布拉格衍射晶体6的触发源。第一双色分光镜5实现波长为860nm的第二束飞秒激光和波长为532nm的连续受激发射减损光的合束。

布拉格衍射晶体6将波长为860nm的第二束飞秒激光的重复频率降到237kHz，同时，将波长为532nm的连续受激发射减损光调制为与波长为860nm的第二束飞秒激光相同重复频率的同步脉冲激光，脉冲宽度约为13ns。

本发明实施例中，当波长为860nm的第二束飞秒激光的重复频率从76MHz降到237kHz，Atto425的荧光量子产率提高了15-25倍。这是因为当重复频率降低时，脉冲的间隔被拉大，荧光分子就有足够的时间从三重态弛豫到基态，不仅避免了三重态荧光分子被漂白，还使得下一次待激发的基态荧光分子数增加，从而增加了荧光产率。对于大多数荧光分子，参见图2，荧光分子的激发态S1的荧光寿命为ns量级，部分激发的荧光分子会无辐射跃迁到三重态T0，而从三重态T0弛豫到基态S0的时间是μs量级。当飞秒激光的重复率在76MHz，脉冲间隔大约为13ns，比荧光分子的三重态T0的寿命短三个数量级，在此情况下，处于三重态的荧光分子的光漂白概率显著增加。在本发明实施例中，通过使用布拉格衍射晶体，第二束飞秒激光的重复频率从76MHz降低到237kHz，这就把第二束飞秒激光的脉冲间隔从13ns拉伸到约4μs，并且允许处于三重态的荧光分子在下一个激发脉冲到来前弛豫到基态，从而降低了光漂白效应，增加了荧光量子产率。

本发明实施例中，通过引进布拉格衍射晶体，将波长为532nm的连续受激发射减损光调制为与波长为860nm的第二束飞秒激光相同重复频率的同步脉冲激光，降低了光漂白效应。由于调制前的受激发射减损光为连续激光，参见图3(a)，降低重复频率后的第二束飞秒激光脉冲间隔约是4μs，而荧光分子的荧光寿命在3～5ns的范围内，因此在4μs的时间内，只有前10ns的受激发射减损光可以有效的抑制激发光斑焦点外围的荧光分子，其余的受激发射减损光没有起到抑制荧光的作用，反而增加了入射光的能量，加剧了光漂白效应。引进布拉格衍射晶体后，532nm的连续受激发射减损光通过布拉格衍射晶体时，会调制成与飞秒激光相同重复频率的同步脉冲激光，脉冲宽度约为13ns，参见图3(b)，当飞秒激光出现时布拉格衍射晶体开启受激发射减损光，当荧光耗尽时，布拉格衍射晶体关闭受激发射减损光。调制后的受激发射减损光抑制荧光的效果与调制前相同，但减少了入射激光近3个数量级的能量，降低了光漂白效应。该方法的另一个优点是，由于使用相同的布拉格衍射晶体，调制后的脉冲受激发射减损光自动与第二束飞秒激光同步，因此不需要额外的同步设备。

第二双色分光镜7将通过布拉格衍射晶体6选取的第二束飞秒激光和调制后的受激发射减损光分离。延迟装置8用于调节调制后的532nm激光到达样品的时间，使之同时与第二束860nm激光到达样品。

旋相位板或相位调制器9，调制调制后的532nm激光的空间相位，使之在聚焦处的强度分布为空心环状。第三双色分光镜10将调制后的受激发射减损光和第二束激发光合束。第四双色分光镜11用于分离荧光和杂散光。物镜12将第二束飞秒激光和调制后的受激发射减损光共线聚焦于样品，并收集荧光。滤光片13为带通滤光片，让460–500nm的荧光通过，阻止第二路飞秒激光、受激发射减损光和其他背景杂散光。样品台15为三维纳米平移台，扫描速度为1ms/pixel，通过移动纳米平移台，对样品进行扫描，获取超高分辨率荧光显微图像。通过上述的试验，超高分辨非线性光学成像的空间分辨率在50nm左右。

本发明实施例对各器件的型号除做特殊说明的以外，其他器件的型号不做限制，只要能完成上述功能的器件均可。

本领域技术人员可以理解附图只是一个优选实施例的示意图，上述本发明实施例序号仅仅为了描述，不代表实施例的优劣。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种基于布拉格衍射晶体的超高分辨非线性激发荧光显微系统，其特征在于，所述超高分辨非线性激发荧光显微系统包括：飞秒激光器、连续激光器、分束片、光电二极管、第一双色分光镜、布拉格衍射晶体、第二双色分光镜、延迟装置、螺旋相位板或相位调制器、第三双色分光镜、第四双色分光镜、物镜、滤光片、雪崩式光电二极管或光电倍增管和样品台，

所述第一双色分光镜实现第二束飞秒激光和所述受激发射减损光的合束；所述布拉格衍射晶体降低所述第二束飞秒激光的重复频率，同时，将所述连续的受激发射减损光调制成与所述第二束飞秒激光相同重复频率的同步脉冲激光；

2.根据权利要求1所述的一种基于布拉格衍射晶体的超高分辨非线性激发荧光显微系统，其特征在于，所述飞秒激光为超短脉冲激光，用于非线性激发荧光染料或荧光蛋白。

3.根据权利要求1所述的一种基于布拉格衍射晶体的超高分辨非线性激发荧光显微系统，其特征在于，所述受激发射减损光为连续激光，用于荧光淬灭。