CN108267445A - 三维双光子光片显微及光谱多模式成像装置及方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种三维双光子光片显微及光谱多模式成像装置及方法，采用飞秒锁模激光器作为光源，以物镜在样本处形成聚焦的高斯光束，通过扫描振镜的扫描，形成虚拟光片照明层，在垂直于光片照明层方向进行成像。利用飞秒激光器的非线性倍频效应，实现样本的双光子荧光光片成像。另外，通过二向色分束镜将探测光路分为不同波长的两束，荧光被透过进行双光子光片荧光成像，近红外光被反射，并由光栅分光线型光束并由面阵CCD探测解析可同时获得被测样本的三维光谱图像。通过线性位移台带动被测样本与光片照明层产生相对运动，从而获得样本的三维光谱图像。通过多种成像模式有机结合，可以为生物医学、环境监测等领域提供更丰富的光学和光谱学信息。

Description

三维双光子光片显微及光谱多模式成像装置及方法

技术领域

本发明涉及一种光学显微及光谱成像装置，特别涉及一种三维双光子光片显微及光谱多模式成像方法及装置。

背景技术

光片显微成像是近二十年来得到飞速发展和广泛应用的光学成像方法。光片显微成像（light-sheet microscopy）的本质是于目标三维样本之中形成一个微米级厚度的光片，该光片照明到的目标样本发出的光信号在照明方向的正交方向上被面阵光电探测器收集，形成目标样本一整个切面的图像。光片显微成像的优势在于同时获得二维图像，经过扫描后可以快速获得三维图像，在各种高分辨的三维成像方法中是最为便捷和快速的成像方法，另外不对当前光片以外的样本产生照明，避免了多余的光漂白和光毒性的发生。光片的产生最早是基于圆柱透镜，产生的光片厚度不均匀性较大。2008年，Keller P. 和StelzerE.等人提出了基于扫描振镜的光片产生方式，称为数字扫描型光片显微成像方法(digitalscanned laser light sheet microscopy)。这种光片产生方式本质是用高斯光束扫描形成的虚拟光片，带来的优势为可以将各种光束调制方法添加在光束中，例如，对光束进行贝塞尔调制、艾里光束调制、结构光照明、双/多光子照明等，以实现更高分辨率、更均匀的视场等不同要求。双光子光片显微系统相较传统光片显微系统，分辨率更高，穿透深度更大，并且由于照明光束的频率一般在近红外波段，光毒性和光漂白降到更低。

光谱检测不同于光学显微或荧光显微成像，不通过直接的图像观察来确定物质结构的存在与否和形态特征，而是通过物质返回的光谱信息，来判断物质结构中官能团的构成情况。近红外光谱是常用的吸收光谱检测波段，可以反映物质中的绝大多数有机化合物的组成和结构信息，并且可测量形式灵活，因此近红外光谱检测与分析广泛应用于生物医学、医药临床、环境监测、农业、食品、石油化工等领域。近红外光谱成像在近红外光谱检测的基础上增加检测点的数量，以形成大视场内的二维或三维光谱图像，提供有空间分辨的区域性的物质光谱信息。

光学显微成像和光谱成像同为光学方法，适合的领域有较多相似之处，但又提供两类完全不同的信息。如果能够将光学显微成像和光谱成像以合适的方法结合起来，将形成一个多功能显微成像检测仪，成为生物医学、环境监测、食品、农业等领域的有力研究工具。

发明内容

本发明的目的在于提供一种三维双光子光片显微及光谱多模式成像装置及方法，该装置及方法能够实现光片显微成像、双光子光片显微成像、光谱成像、双光子光片显微及光谱融合多模式成像，可广泛适用于生物医学、环境监测、食品、农业等领域的研究。

本发明的技术方案如下：一种三维双光子光片显微及光谱多模式成像装置，包含宽光谱飞秒锁模激光器、飞秒激光光片照明层发生单元、光片显微三维成像单元、光谱三维成像单元、合束分束单元、三维位移单元，

所述飞秒激光光片照明层发生单元：包括单模光纤、光纤准直器、准直透镜、扫描振镜、f-θ透镜、镜筒透镜和聚焦透镜；宽光谱飞秒锁模激光器产生的宽光谱飞秒激光源依次经过光纤滤波、光纤准直器后得到基横模准直光源，并通过扫描振镜、f-θ透镜、镜桶透镜和聚焦透镜，在被测生物样本上形成一个线型光源；其中，扫描振镜和f-θ透镜，可将被线光源随着被测样本表面进行快速扫描，从而线型光源可进一步变成一个虚拟光片照明层；

所述光片显微三维成像单元：包括三维精密扫描载物平台、成像物镜、滤光片、聚焦透镜和用于成像的CCD；被聚焦透镜聚焦的光片层在被测样本表面产生非线性双光子效应产生的荧光被成像透镜收集变成平行光，再经过滤光片滤波及聚焦透镜投射到CCD；CCD通过同步扫描振镜及三维精密扫描载物平台的运动数据的采集，获得被测样本的三维图像；

所述合束分束单元：被测样本产生的光被成像透镜收集后变成了平行光，其经过二色分束镜后可将双光子光谱成分及激光光源成分分开传输；使双光子荧光通过二色分束镜进入后方的荧光探测单元，单光子、长波长、宽谱成分被反射，进入后方光谱探测单元；

所述光谱三维成像单元：包括二色分束镜、分光光栅和面阵CCD ，二色分束镜将激光源光谱成分反射到达分光光栅，使每一时刻的线型光的任意一个像素点的光谱被分光光栅分开，并打到面阵CCD上， 配合扫描透镜及三维精密扫描载物平台在垂直方向的扫描完成对被测样本的三维扫描，得到被测样本的光谱三维图像。

所述二向色分光镜为短通分色镜，截止波长650 nm。所述滤光片为截止频率是520nm的长通滤光片。

一种采用三维双光子光片显微及光谱多模式成像装置的成像方法，采用宽光谱飞秒锁模激光器作为宽光谱飞秒激光源，在扫描振镜的驱动下，通过f-θ透镜、镜筒透镜和聚焦透镜聚焦后，产生由汇聚的高斯光束经扫描而形成的光片照明层，在垂直于光片照明层的方向进行成像，通过线性位移的三维精密扫描载物平台带动被测样本与光片照明层产生相对运动，从而获得被测样本的三维图像；利用宽光谱飞秒锁模激光器的非线性效应，实现双光子光片成像；另外，通过二色分束镜将探测光路分为不同波长的两束，荧光被透过进行双光子光片荧光成像，近红外光被反射，通过分光光栅的分光线型光束由面阵CCD探测解析可同时获得被测样本的三维光谱图像。

基于以上技术方案，本发明的有益效果在于：

本发明提供一种新型的多模式光片显微成像和光谱成像的方法和装置，利用飞秒激光器同时具有非线性和宽光谱的特点，可以在同一系统中将光片显微成像和光谱成像有机结合，同时实现双光子光片显微三维成像、三维光谱成像、双光子光片显微和光谱融合成像，形成一个多功能的光学光谱学成像仪器，能够适用于多种领域，成为生物医学、环境监测、食品、农业等研究的有力工具。

附图说明

图1为本发明实施的一个测量装置的结构示意图。

具体实施方式

下面结合附图与实施例对本发明作进一步说明。

如图1所示,本发明的三维双光子光片显微及光谱多模式成像装置，包含宽光谱飞秒锁模激光器、飞秒激光光片照明层发生单元、光片显微三维成像单元、光谱三维成像单元、合束分束单元、三维位移单元.

A.飞秒激光光片照明层发生单元：其中包括宽光谱光纤激光源0，经过单模光纤1、光纤准直器2、准直透镜3、扫描振镜4、f-θ透镜5、镜筒透镜6和聚焦透镜7。宽光谱飞秒锁模激光器产生的宽光谱飞秒激光源0依次经过光纤1滤波、光纤准直器2后得到基横模准直光源，并通过扫描振镜4、f-θ透镜5、镜桶透镜6和聚焦透镜7，在被测样本上形成一个线型光源；其中，扫描振镜4和f-θ透镜5，可将被线光源随着被测样本表面进行快速扫描，从而线型光源可进一步变成一个虚拟光片照明层。

B. 光片显微三维成像单元：其中包括三维精密扫描载物平台8、成像物镜9、滤光片13、聚焦透镜14和用于成像的CCD15。被聚焦透镜聚焦7的光片层在被测生物样本表面产生非线性双光子效应产生的荧光被成像透镜9收集变成平行光，再经过滤光片13滤波及聚焦透镜14投射到CCD15；CCD15通过同步扫描振镜4及三维精密扫描载物平台8的运动数据的采集，获得被测样本的三维图像。

C. 合束分束单元：被测样本产生的光被成像透镜9收集后变成了平行光，其经过二色分束镜10后可将双光子光谱成分及激光光源成分分开传输；双光子荧光通过二色分束镜进入后方的荧光探测单元，单光子、长波长、宽谱成分被反射，进入后方光谱探测单元。

D. 光谱三维成像单元：其中包括二色分束镜10、分光光栅11和面阵CCD 12。二色分束镜10将激光源光谱成分反射到达分光光栅11，使每一时刻的线型光的任意一个像素点的光谱被分光光栅11分开，并打到面阵CCD12上， 配合扫描透镜4及三维精密扫描载物平台8在垂直方向的扫描完成对被测样本的三维扫描，得到被测样本的光谱三维图像。

本实施例所采用的主要器件参数为：宽光谱飞秒激光源0的中心波长为1030 nm，谱宽100 nm。二向色分光镜10为短通分色镜，截止波长650 nm。滤光片13为截止频率是520nm的长通滤光片。

本发明的具体实施过程为：

宽光谱的飞秒激光源0经过光纤1滤波，光纤准直器2及准直透镜3后可得到基横模准直光源，直径约为1 mm。并通过f-θ透镜5和镜筒透镜6扩束，之后通过聚焦物镜7，可在被测生物样本上形成一个线形高斯光束光源。同时通过引入扫描振镜4和f-θ透镜5，可将被线光源随着被测样本表面进行快速扫描，从而线型光源可进一步变成一个虚拟光片照明层。

被聚焦透镜7聚焦的光片层在被测样本表面产生非线性双光子效应，产生515nm的倍频光片层，经同步扫描振镜4的扫描而产生虚拟光片照明层的515nm激发光入射至被测生物样本。被测生物样本表达黄色荧光蛋白，在514nm处为最大激发波长，经515nm光片照明层激发的该层样本产生的荧光被成像物镜9收集。通过二色分束镜10，再经过滤光片13滤波及聚焦透镜14投射到CCD15。及三维精密扫描载物平台8的运动进行数据采集，可在CCD15处获得被测样本的三维图像。

同时，原飞秒激光源光谱成分（中心波长1030nm）则被二向色分光镜10反射后入射至一个分光光栅11上，那么线型光源上的每一个点都会被分光光栅11进行分光并形成线型光谱。整个线光源的光谱则会形成一个面，可用一个面阵CCD12进行接收。通过同步扫描振镜4及三维精密扫描载物平台8的运动，可获得被测样本中每个点的光谱数据，从而在获得三维图像的同时能得到光谱三维图像。

上述实施例仅用于说明本发明，在本发明技术方案基础上所做的仪器和部件的等同变换，均不应排出在本发明的保护范围之外。

Claims (4)

1.一种三维双光子光片显微及光谱多模式成像装置，包含宽光谱飞秒锁模激光器、飞秒激光光片照明层发生单元、光片显微三维成像单元、光谱三维成像单元、合束分束单元、三维位移单元，其特征在于：

所述飞秒激光光片照明层发生单元：包括单模光纤、光纤准直器、准直透镜、扫描振镜、f-θ透镜、镜筒透镜和聚焦透镜；宽光谱飞秒锁模激光器产生的宽光谱飞秒激光源依次经过光纤滤波、光纤准直器后得到基横模准直光源，并通过扫描振镜、f-θ透镜、镜桶透镜和聚焦透镜，在被测样本上形成一个线型光源；其中，扫描振镜和f-θ透镜，可将被线光源随着被测样本表面进行快速扫描，从而线型光源可进一步变成一个虚拟光片照明层；

所述光片显微三维成像单元：包括三维精密扫描载物平台、成像物镜、滤光片、聚焦透镜和用于成像的CCD；被聚焦透镜聚焦的光片层在被测样本中产生非线性双光子效应产生的荧光被成像透镜收集，再经过滤光片滤波及聚焦透镜投射到CCD；CCD通过同步扫描振镜及三维精密扫描载物平台的运动数据的采集，获得被测样本的三维图像；

所述合束分束单元：被测样本产生的光被成像透镜收集后变成了平行光，其经过二色分束镜后可将双光子光谱成分及激光光源成分分开传输；使双光子荧光通过二色分束镜进入后方的荧光探测单元，单光子、长波长、宽谱成分被反射，进入后方光谱探测单元；

所述光谱三维成像单元：包括二色分束镜、分光光栅和面阵CCD ，二色分束镜将激光源光谱成分反射到达分光光栅，使每一时刻的线型光的任意一个像素点的光谱被分光光栅分开，并打到面阵CCD上， 配合扫描透镜及三维精密扫描载物平台在垂直方向的扫描完成对被测样本的三维扫描，得到被测生物样本的光谱三维图像。

2.根据权利要求1所述的三维双光子光片显微及光谱多模式成像装置，其特征在于：所述二向色分光镜为短通分色镜，截止波长650 nm。

3.根据权利要求1所述的三维双光子光片显微及光谱多模式成像装置，其特征在于：所述滤光片为截止频率是520nm的长通滤光片。

4.一种采用权利要求1-3任一所述的三维双光子光片显微及光谱多模式成像装置的成像方法，其特征在于：采用宽光谱飞秒锁模激光器作为宽光谱飞秒激光源，在扫描振镜的驱动下，通过f-θ透镜、镜筒透镜和聚焦透镜聚焦后，产生由汇聚的高斯光束经扫描而形成的光片照明层，在垂直于光片照明层的方向进行成像，通过线性位移的三维精密扫描载物平台带动被测生物样本与光片照明层产生相对运动，从而获得被测生物样本的三维图像；利用宽光谱飞秒锁模激光器的非线性效应，实现双光子光片成像；另外，通过二色分束镜将探测光路分为不同波长的两束，荧光被透过进行双光子光片荧光成像，近红外光被反射，通过分光光栅的分光线型光束由面阵CCD探测解析可同时获得被测样本的三维光谱图像。