JP2003057554A - レーザ顕微鏡 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 標本から得られる複数の光を同時に検出する
ことができるレーザ顕微鏡を提供する。 【解決手段】 １光子励起現象および２光子励起現象を
それぞれ発生させるレーザ光源１，２から出射されるレ
ーザビーム３，４を合成させるダイクロイックミラー５
と、合成されたビーム６を２次元的に走査させるガルバ
ノミラー８と、このビーム６を標本１４上に集光させる
とともに、この標本１４からの光が入射される対物レン
ズ１３と、ダイクロイックミラー５とガルバノミラー８
との間の光軸上に配設され、ビーム６と、ビーム３によ
る標本１４からの蛍光１５とを分離させる第１の波長分
離ミラー７と、対物レンズ１３と第１の波長分離ミラー
７との間の光軸上に配設され、ビーム３による標本１４
からの蛍光１５およびビーム６と、ビーム４による標本
１４からの非線形現象による蛍光１６とを分離させる第
２の波長分離ミラー１１とを備えている。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、１つの波長を有す
るレーザビームもしくはそれぞれ波長の異なる複数のレ
ーザビームを２次元的に走査させ、対物レンズを介して
レーザビームを標本上で集光させて、この標本から得ら
れる光を検出するレーザ顕微鏡に関する。

【０００２】

【従来の技術】このような顕微鏡を用いて観察するため
には、現在では様々な蛍光試薬で標本が染色されて行な
われている。このため、複数の蛍光試薬を用いて同一の
生体細胞組織（標本）を多重染色し、波長の異なる複数
のレーザビームを標本上に照射して、多重蛍光観察を行
なうことによって、生体細胞組織の様々な形態や機能の
解析が可能となっている。

【０００３】また、単一の波長（以下、１波長という）
の励起光（レーザビーム）を標本に照射して２つの異な
る波長（以下、２波長という）の蛍光を発生させる、１
波長励起２波長蛍光を発生させる試薬や、励起された蛍
光色素のエネルギで別の蛍光色素を励起させるエナジー
トランスファー（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅｓｏ
ｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ）など、
１波長の励起光に対して２波長の蛍光を測定して、これ
ら蛍光の蛍光量のレシオを求める手法も行なわれてい
る。

【０００４】一方、近年では、超短パルスレーザにより
出射されたレーザビームによる多光子励起現象を利用し
たレーザ顕微鏡が実用化されている。この多光子励起現
象を発生させる超短パルスレーザにより標本を励起する
には、近赤外波長で紫外光励起用の蛍光試薬を励起させ
て蛍光を発生させることができるので、標本への光障害
が少なく、標本深部の観察ができるなどの利点がある。
しかし、通常の共焦点光学系と同様の光学系を使って蛍
光を検出するのは、幾つものレンズやミラーなどを経由
させる必要があるために損失が大きく、検出光（蛍光）
が非常に弱くなってしまうという欠点がある。

【０００５】このため、特開２０００−３３００２９号
公報による技術は、蛍光を走査光学系および共焦点ピン
ホールに戻さずに分離して、短い光路で損失を少なく
し、効率的に検出する顕微鏡を提案したものである。

【０００６】この技術による顕微鏡は、共焦点用のレー
ザ光源および光検出器と、多光子励起現象を発生させる
レーザビームを出射させる超短パルスレーザ光源および
光検出器とを備えているが、対物レンズと走査光学系と
の間に配置された波長分離ミラーは、共焦点検出用と多
光子励起現象で発せられた蛍光の検出用とがそれぞれ別
に用意され、この波長分離ミラーを切り替えて、共焦点
を用いる場合と多光子励起現象により発せられた蛍光を
検出する場合とで選択して光を検出している。

【０００７】また、例えば、１波長励起２波長蛍光を発
生させる試薬としては、ＳＮＡＲＦ−１として知られて
いるものがあり、これはｐＨ測定用に用いられている。
このＳＮＡＲＦ−１を励起させるレーザビームの波長は
５３０ｎｍ、発生される蛍光の波長は５８０ｎｍ、６３
０ｎｍである。また、近年、カメレオン（商標）という
プローブを用いて２つの蛍光タンパク質であるＣＦＰ蛍
光およびＹＦＰ蛍光のエナジートランスファーを利用す
るカルシウムイオン濃度測定が行なわれるようになって
きている。これは、波長４４２ｎｍのレーザビームでＣ
ＦＰ蛍光を励起させ、この励起されたＣＦＰ蛍光のエネ
ルギでＹＦＰ蛍光を励起させる手法で、ＣＦＰ蛍光の波
長４８５ｎｍ、およびＹＦＰ蛍光の波長５３０ｎｍから
得られる蛍光量のレシオを測定するものである。

【０００８】これらＳＮＡＲＦ−１およびカメレオンで
標本を多重染色した場合に、この標本から発せられる複
数の蛍光を検出するレーザ顕微鏡の光学系について図９
を用いて説明する。

【０００９】図９に示すように、レーザ光源１０１ａ，
１０１ｂからそれぞれ出射されたレーザビーム１０３
ａ，１０３ｂは、ダイクロイックミラー１２３によって
合成される。この合成されたレーザビーム１０６は、波
長分離ミラー１０７によって反射され、ガルバノミラー
１０８によって２次元的に走査される。そして、このレ
ーザビーム１０６は、投影レンズ１０９、反射ミラー１
１０、結像レンズ１１２、対物レンズ１１３を介して標
本１１４上に集光され、標本１１４が励起される。

【００１０】このレーザビーム１０３ａによって励起さ
れた標本１１４からは、それぞれ異なる波長を有する蛍
光１１５ａ，１１５ｂが発せられる。また、レーザビー
ム１０３ｂによって励起された標本１１４からは、同様
に蛍光１１５ｃ，１１５ｄが発せられる。そして、これ
ら蛍光１１５ａ，１１５ｂ，１１５ｃ，１１５ｄは、対
物レンズ１１３、結像レンズ１１２などを順に遡って波
長分離ミラー（ダイクロイックミラー）１０７に入射さ
れる。

【００１１】これら蛍光１１５ａ，１１５ｂがそれぞれ
ＣＦＰ蛍光およびＹＦＰ蛍光であり、また、蛍光１１５
ｃ，１１５ｄがそれぞれＳＮＡＲＦ−１の蛍光であると
すると、検出される蛍光は、図１０の１点鎖線および２
点鎖線に示す特性が得られる。このため、図１０には、
これらＣＦＰ蛍光１１５ａ、ＹＦＰ蛍光１１５ｂ、およ
びＳＮＡＲＦ−１の蛍光１１５ｃ，１１５ｄが透過さ
れ、レーザビーム１０３ａ，１０３ｂが反射されるのに
必要なダイクロイックミラー１０７の特性が示されてい
る。ここで、ＳＮＡＲＦ−１の励起レーザは、波長５４
３ｎｍのＧｒｅｅｎ Ｈｅ：Ｎｅレーザとしている。

【００１２】このため、これらＣＦＰ蛍光１１５ａ、Ｙ
ＦＰ蛍光１１５ｂ、およびＳＮＡＲＦ−１の蛍光１１５
ｃ，１１５ｄは、このダイクロイックミラー１０７を透
過して、ミラー１１９によって反射され、ダイクロイッ
クミラー１２４ａに入射される。ダイクロイックミラー
１２４ａはＣＦＰ蛍光１１５ａを反射、分離し、以下同
様に、ダイクロイックミラー１２４ｂはＹＦＰ蛍光１１
５ｂを、ダイクロイックミラー１２４ｃはＳＮＡＲＦ−
１の蛍光１１５ｃを順番に反射、分離し、最後に、ＳＮ
ＡＲＦ−１の蛍光１１５ｄを透過、分離させる特性をそ
れぞれ有している。そして、これら蛍光１１５ａ，１１
５ｂ，１１５ｃ，１１５ｄは、それぞれ共焦点レンズ１
２０ａ，１２０ｂ，１２０ｃ，１２０ｄ、ピンホール１
２１ａ，１２１ｂ，１２１ｃ，１２１ｄを介して、フォ
トマルチプライヤ１２２ａ，１２２ｂ，１２２ｃ，１２
２ｄに入射され、光電変換される。

【００１３】

【発明が解決しようとする課題】しかし、このような複
雑な特性を有するダイクロイックミラー１０７は、非常
に製作が困難で、高価になり得る。また、ＹＦＰ蛍光の
波長５３０ｎｍ近傍で、蛍光が相当量カットされてしま
うという不具合があり、現実的ではない。

【００１４】したがって、多重染色、特に、１波長励起
２波長蛍光および／もしくはエナジートランスファーを
いくつか組み合わせて行なおうとすると、複数のレーザ
光源を必要とするので、複数のレーザビームと、これら
レーザビームの数よりもさらに多くの蛍光とを分離させ
る必要がある。また、従来の１光子励起現象による共焦
点レーザ走査型顕微鏡で行なおうとすると、近接するい
くつものレーザビームの波長および蛍光の波長を分離さ
せる波長分離ミラーの設計が困難で高価になる。そし
て、検出すべき蛍光の多くが波長分離ミラーによってカ
ットされてしまい、明るい観察および精度の高い測定が
困難であるという問題があった。

【００１５】また、特開２０００−３３００２９号公報
の技術では、出射されるレーザビームおよび波長分離ミ
ラーなどを切り替えて蛍光を検出しなければならないの
で、生体細胞組織の複数の形態および機能をリアルタイ
ムで観測および測定することが困難であるという問題が
あった。

【００１６】本発明は、このような課題を解決するため
になされ、生体細胞組織（標本）からの複数の光を同時
に検出することが可能で、標本の複数の形態および機能
をリアルタイムで観察および測定することが可能とな
る、特に、多重染色標本から発せられるそれぞれ異なる
波長を有する複数の蛍光を同時に効率よく検出すること
ができるレーザ顕微鏡を提供することを目的とする。

【００１７】

【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
に、本発明のレーザ顕微鏡は、１つの波長を有するレー
ザビーム、もしくはそれぞれ波長の異なる複数のレーザ
ビームを出射させるレーザ出射手段と、出射された前記
レーザビームを２次元的に走査させる走査光学系と、走
査された前記レーザビームを標本上に集光させ、この標
本からの光が入射される対物レンズと、前記レーザ出射
手段と前記走査光学系との間の光路上に配設され、前記
レーザビームと、前記標本から得られる線形現象による
光または反射光の少なくとも一方とを選択的に分離させ
る第１のビームスプリッタと、この第１のビームスプリ
ッタで分離された線形現象による光または反射光を検出
する第１の光検出器と、前記対物レンズと前記第１のビ
ームスプリッタとの間の光軸上に配設され、前記レーザ
ビーム並びに前記標本から得られる線形現象による光お
よび反射光と、前記標本から得られる非線形現象による
光とを選択的に分離させる第２のビームスプリッタと、
この第２のビームスプリッタで分離された非線形現象に
よる光を検出する第２の光検出器とを備えていることを
特徴とするものである。

【００１８】このような構成にすることにより、レーザ
ビームを標本に照射することにより、線形現象で発生し
た光（蛍光）または反射光を第１の光検出器で共焦点検
出すると同時に、非線形現象で発生した光（蛍光）を第
２の光検出器で検出することが可能となる。

【００１９】また、上記課題を解決するために、本発明
のレーザ顕微鏡は、それぞれ標本上で、線形現象を発生
させるのに用いる少なくとも１つのレーザ光源と、非線
形現象を発生させるのに用いる少なくとも１つの短パル
スレーザ光源とから出射されるレーザビームを合成させ
るレーザビーム合成光学系と、前記レーザビーム合成光
学系で合成されたレーザビームを２次元的に走査させる
走査光学系と、この走査光学系により走査されたレーザ
ビームを標本上に集光させるとともに、この標本からの
光が入射される対物レンズと、前記レーザビーム合成光
学系と前記走査光学系との間の光軸上に配設され、合成
された前記レーザビームと、前記レーザ光源から出射さ
れたレーザビームによる前記標本からの線形現象による
蛍光とを選択的に分離させる第１の波長分離ミラーと、
この第１の波長分離ミラーで分離された蛍光を検出する
第１の光検出器と、前記対物レンズと前記第１の波長分
離ミラーとの間の光軸上に配設され、前記レーザ光源か
ら出射されたレーザビームによる前記標本からの線形現
象による蛍光および合成された前記レーザビームと、前
記短パルスレーザ光源から出射されたレーザビームによ
る前記標本からの非線形現象による蛍光とを選択的に分
離させる第２の波長分離ミラーと、この第２の波長分離
ミラーで分離された蛍光を検出する第２の光検出器とを
備えていることを特徴とするものである。

【００２０】このような構成にすることにより、レーザ
光源から出射されたレーザビームにより標本から発生し
た線形現象による蛍光を第１の光検出器で共焦点検出す
ると同時に、超短パルスレーザ光源から出射されたレー
ザビームにより標本から発生した非線形現象による蛍光
を第２の光検出器で検出することが可能となる。

【００２１】また、上記課題を解決するために、前記第
１の波長分離ミラーと前記第１の光検出器との間の光軸
上に配設され、前記第１の波長分離ミラーで分離された
光をさらに異なる波長の光に分離させる少なくとも１つ
の第３の波長分離ミラーと、前記第３の波長分離ミラー
で分離された光を検出する第３の光検出器とをさらに備
えていることが好ましい。

【００２２】また、上記課題を解決するために、前記第
２の波長分離ミラーと前記第２の光検出器との間の光軸
上に配設され、前記第２の波長分離ミラーで分離された
光をさらに異なる波長の光に分離させる少なくとも１つ
の第４の波長分離ミラーと、前記第４の波長分離ミラー
で分離された光を検出する第４の光検出器とをさらに備
えていることが好ましい。

【００２３】このような構成にすることにより、レーザ
ビームにより励起された線形現象と非線形現象により標
本から発生した、異なる２つ以上の波長を有する蛍光を
検出することが可能となり、複数のレシオ測定を同時に
行なうことができる。

【００２４】

【発明の実施の形態】以下、図面を参照しながら本発明
の実施の形態について説明する。

【００２５】本実施の形態では、非線形現象、例えば２
光子励起現象を利用している。この２光子励起現象は、
一般に、後述の線形現象と比較して、やや高出力の長波
長光で標本を励起して、この標本から前記長波長光より
も波長の短い蛍光が放出されるものである。これに対
し、線形現象、例えば、１光子励起現象は、短波長光で
標本を励起して、この標本から前記短波長光よりも波長
の長い蛍光が放出されるものである。

【００２６】（第１の実施の形態）まず、第１の実施の
形態について図１を用いて説明する。本実施の形態によ
るレーザ顕微鏡は、パルス幅が数十ｆｓないし数百ｆ
ｓ、繰り返し周波数が数十ＭＨｚないし数百ＭＨｚのチ
タンサファイアレーザーが一般に使用される、標本１４
上で２光子励起現象を発生させる、極短パルスレーザ等
の短パルスレーザ光源（レーザ出射手段）２を備えてい
る。このレーザ光源２から出射されたレーザビーム４
は、予め偏光性を備えていてもよく、出射された後に図
示しない光学系によって偏光性が付与されてもよい。こ
の偏光性を有するレーザビーム４の光路上には、偏光ビ
ームスプリッタからなる第１のビームスプリッタ２８が
この光路に対して好ましくは４５°傾けられて配設され
ている。なお、この第１のビームスプリッタ２８は、レ
ーザ光源２から出射され、所定の偏光性を有するレーザ
ビーム４を所定の方向に反射させる特性を備えている。
この反射されたレーザビーム４は、第１のビームスプリ
ッタ２８によって直角に反射される。

【００２７】このビーム４の光路上には、１／４波長板
２９が設けられ、この波長板２９に入射されたビーム４
は円偏光とされて、レーザビーム（以下、ビームとい
う）６を出射させる。この出射されたビーム６の光路上
には、ガルバノミラー８が設けられている。このガルバ
ノミラー８は、入射されたビーム６を図示しない２次元
（Ｘ−Ｙ）的に偏向走査して所定の方向に反射させる。

【００２８】反射されたビーム６の光路上には、投影レ
ンズ９、ミラー１０、および結像レンズ１２が順次設け
られ、ビーム６がこの投影レンズ９に入射されて透過
し、ミラー１０で反射され、結像レンズ１２に入射され
る。この結像レンズ１２を出射されたビーム６の光路上
には、ダイクロイックミラーからなる第２のビームスプ
リッタ１１がこの光路に対して好ましくは４５°傾けら
れて設けられている。この第２のビームスプリッタ１１
に入射されたビーム６は、この第２のビームスプリッタ
１１を透過する。なお、この第２のビームスプリッタ１
１の特性については後述する。

【００２９】そして、この第２のビームスプリッタを出
射されたビーム６の光路上には、対物レンズ１３が設け
られている。この対物レンズ１３の前方には、生体組織
（以下、標本という）１４が設けられ、この標本１４上
で対物レンズ１３を出射されたビーム６が焦点を結ぶよ
うになっている。したがって、標本１４上にビーム６が
集光、照射されて、この標本１４から反射される反射光
３０と、２光子励起現象（非線形現象）が生じることに
よる蛍光１６とが発生される。

【００３０】反射光３０と蛍光１６とは、対物レンズ１
３を介して第２のビームスプリッタ（ダイクロイックミ
ラー）１１に入射される。なお、このダイクロイックミ
ラー１１は、レーザビーム４およびその反射光３０を透
過させ、２光子励起現象により発せられた蛍光１６を反
射させる特性を備えている。このため、この蛍光１６の
み、第２のビームスプリッタ１１でほぼ直角に反射され
て、反射光３０から分離される。

【００３１】反射された蛍光１６の光路上には、レンズ
１７が設けられている。このレンズ１７の前方には、フ
ォトマルチプライヤからなる第２の光検出器１８が配設
されている。このレンズ１７を透過した蛍光１６は、第
２の光検出器１８に入射されて、光電変換される。

【００３２】一方、反射光３０は、第２のビームスプリ
ッタ１１を透過し、結像レンズ１２、ミラー１０、投影
レンズ９、ガルバノミラー８を経て、再び１／４波長板
２９に入射される。前記標本１４から円偏光の状態で反
射された反射光３０は、１／４波長板２９によって前記
レーザビーム４に対して偏光方向が９０°ずれた直線偏
光にされる。このため、第１のビームスプリッタ（偏光
ビームスプリッタ）２８に再び入射され、透過される。

【００３３】この反射光３０の光路上には、この反射光
３０を所定の方向に反射させるミラー１９が設けられ、
反射光３０が反射される。この反射光３０の光路上に
は、反射光３０を集光させるレンズ２０およびピンホー
ル２１が順に配置されている。反射光３０は、レンズ２
０によってピンホール２１に集光される。なお、このピ
ンホール２１は、前記対物レンズ１３の焦点位置と共役
な位置に配置され、反射光３０は、ピンホール２１面に
結像し、焦点位置で反射された光のみがピンホール２１
を通過される。このピンホール２１を通過した反射光３
０の光路上には、フォトマルチプライヤからなる第１の
光検出器２２が配設されている。反射光３０は、第１の
光検出器２２に入射されて、光電変換される。

【００３４】それぞれ光電変換された２光子励起現象に
より発生された蛍光１６および反射光３０から得られる
電気信号は、図示しないコンピュータで処理され、デー
タとして処理および／もしくは画像として構築される。

【００３５】したがって、本実施の形態によれば、共焦
点反射光像と、２光子励起現象により発生された蛍光像
とを同時に得ることができる。

【００３６】（第２の実施の形態）次に、第２の実施の
形態について図２および図３を用いて説明する。以下、
同様な作用および機能を有する部材には、第１の実施の
形態で用いた符号と同じ符号を使用して、詳しい説明を
省略する。レーザ顕微鏡は、それぞれ標本１４上で、１
光子励起現象を発生させるレーザ光源１と、２光子励起
現象を発生させる、極短パルスレーザ等の短パルスレー
ザ光源２とを備えている。これらレーザ光源１，２の前
方には、それぞれのレーザ光源１，２から出射されるレ
ーザビーム３，４の光路に対して傾けられ、これらレー
ザビーム３，４を合成する機能を有するダイクロイック
ミラー５（レーザビーム合成光学系）が配設されてい
る。このダイクロイックミラー５は、１光子励起現象を
発生させるレーザ光源１から出射されたレーザビーム３
を所定の方向に反射させ、２光子励起現象を発生させる
短パルスレーザ光源２から出射されたレーザビーム４を
透過させる。このため、このダイクロイックミラー５に
入射されたレーザビーム３，４は合成され、１つの合成
されたレーザビーム（以下、ビームという）６にされ
る。

【００３７】このビーム６の光路上には、ダイクロイッ
クミラーからなる第１の波長分離ミラー７がこのビーム
６に対して好ましくは４５°傾けられて配設されてい
る。この第１の波長分離ミラー７の特性については後述
する。そして、入射されたビーム６は、直角に偏向され
る。また、このビーム６は、ガルバノミラー８によって
２次元に走査され、投影レンズ９に入射される。また、
この投影レンズ９によってミラー１０に入射されて所定
の方向に反射される。反射されたビーム６の光路上に
は、結像レンズ１２、およびダイクロイックミラーから
なる第２の波長分離ミラー１１が順次設けられている。
この第２の波長分離ミラー１１の特性については後述す
る。入射されたビーム６は、この第２の波長分離ミラー
１１を透過し、対物レンズ１３によって標本１４上で焦
点を結ぶようになっている。

【００３８】標本１４上では、１光子励起現象を発生さ
せるレーザビーム３で発せられた蛍光（以下、１光子励
起蛍光と称する）１５（線形現象）と、２光子励起現象
を発生させるレーザビーム４で発せられた蛍光（以下、
２光子励起蛍光と称する）１６（非線形現象）とが発生
される。このとき、図３の（ａ）に示すように、１光子
励起蛍光１５は、レーザビーム３が通過（透過）した領
域全体から発生されるのに対し、２光子励起蛍光１６
は、図３の（ｂ）に示すように、レーザビーム４の対物
レンズ１３の焦点位置のみから発生される。したがっ
て、２光子励起蛍光１６は、光軸方向（Ｚ方向）の分解
能を備えている。

【００３９】また、図２に示すように、１光子励起蛍光
１５と２光子励起蛍光１６とは、対物レンズ１３を介し
て第２の波長分離ミラー（ダイクロイックミラー）１１
に入射される。

【００４０】このダイクロイックミラー１１は、前記レ
ーザビーム３，４（ビーム６）、および１光子励起蛍光
１５を透過させ、２光子励起蛍光１６を反射させる特性
を備えている。このため、２光子励起蛍光１６のみ、第
２の波長分離ミラー１１によって反射（偏向）されて、
１光子励起蛍光１５から分離される。偏向された２光子
励起蛍光１６は、レンズ１７によって第２の光検出器１
８に入射され、光電変換される。なお、２光子励起現象
（多光子励起現象）は、対物レンズの焦点位置のみで発
生されるので、検出側にピンホールを配置しなくても共
焦点と同等の光軸方向の分解能を得ることができる。し
たがって、２光子励起蛍光１６を検出するには、その発
生時点でＺ方向の分解能を備えているので、共焦点ピン
ホールは不要である。

【００４１】一方、１光子励起蛍光１５は、第２の波長
分離ミラー（ダイクロイックミラー）１１を透過し、結
像レンズ１２、ミラー１０、投影レンズ９、ガルバノミ
ラー８を順次介して第１の波長分離ミラー（ダイクロイ
ックミラー）７に入射される。

【００４２】この第１の波長分離ミラー７は、前記レー
ザビーム３，４（ビーム６）を反射させ、１光子励起蛍
光１５を透過させる特性を備えている。このため、１光
子励起蛍光１５は、第１の波長分離ミラー７を透過した
後、ミラー１９で偏向され、レンズ２０に入射される。
なお、１光子励起蛍光１５は、Ｚ方向の分解能を備えて
いないため、対物レンズ１３の焦点位置と共役な位置に
共焦点ピンホール２１が配置されている。１光子励起蛍
光１５は、レンズ２０によってピンホール２１面に結像
され、対物レンズ１３の焦点位置から発生した蛍光のみ
がピンホール２１を通過して、第１の光検出器２２に入
射されて光電変換される。それぞれ光電変換された１光
子励起蛍光１５および２光子励起蛍光１６の信号は、図
示しないコンピュータで処理されて、データとして処理
および／もしくは画像として構築される。

【００４３】したがって、本実施の形態によれば、１光
子励起現象による共焦点蛍光像と、２光子励起現象によ
る２光子励起蛍光像とを同時に得ることができる。

【００４４】なお、本実施の形態において、線形現象
は、１光子励起蛍光１５に限ることはなく、標本からの
光が、入射されたレーザビームの出力にほぼ正比例して
増加するものであれば、構わない。また、非線形現象
は、２光子励起された蛍光１６に限ることはなく、３光
子励起された蛍光、ラマン光、第２高調波、第３高調波
などでも構わない。

【００４５】（第３の実施の形態）次に、第３の実施の
形態について図４を用いて説明する。以下、同様な作用
および機能を有する部材には、第１および第２の実施の
形態で用いた符号と同じ符号を使用して、詳しい説明を
省略する。レーザ顕微鏡は、それぞれ標本１４上で、１
光子励起現象を発生させる２つのレーザ光源１ａ，１ｂ
と、２光子励起現象を発生させる、極短パルスレーザ等
の短パルスレーザ光源２とを備えている。レーザ光源１
ｂから出射されるレーザビーム３ｂの光路上には、ミラ
ー２３ａが設けられている。このミラー２３ａは、入射
されたレーザビーム３ｂを所定の方向に反射させる。

【００４６】そして、これらレーザビーム３ａ，３ｂの
光路上には、それぞれレーザビーム３ａ，３ｂの光路に
対して傾けられ、これらレーザビーム３ａ，３ｂを合成
する機能を有するダイクロイックミラー２３が配設され
ている。このダイクロイックミラー２３は、レーザビー
ム３ａを透過させ、レーザビーム３ｂを所定の方向に反
射させるようになっている。このため、このダイクロイ
ックミラー２３に入射されたレーザビーム３ａ，３ｂ
は、１つの合成されたレーザビーム３にされる。

【００４７】また、短パルスレーザ光源２から出射され
たレーザビーム４と、レーザビーム３との光路上には、
これらレーザビーム３，４を合成させる機能を有するダ
イクロイックミラー５が配設されている。このダイクロ
イックミラー５は、レーザビーム３を所定の方向に反射
させ、レーザビーム４を透過させて、これらレーザビー
ム３，４を合成させる。この合成されたレーザビーム６
は、第１の波長分離ミラー７、ガルバノミラー８、投影
レンズ９、ミラー１０、結像レンズ１２、第２の波長分
離ミラー１１、および対物レンズ１３を順に介して標本
１４上に集光、照射される。

【００４８】この標本１４からは、１光子励起現象を発
生させるレーザビーム３ａ，３ｂで発せられた蛍光１５
ａ，１５ｂ（以下、１光子励起蛍光と称する）と、２光
子励起現象を発生させるレーザビーム４で発せられた蛍
光（以下、２光子励起蛍光と称する）１６とが発生され
る。これら１光子励起蛍光１５ａ，１５ｂおよび２光子
励起蛍光１６は、対物レンズ１３を介して第２の波長分
離ミラー１１に入射される。

【００４９】この第２の波長分離ミラー１１により偏向
された２光子励起蛍光１６は、第２の実施の形態と同様
に、レンズ１７によって第２の光検出器１８で検出され
る。

【００５０】一方、１光子励起蛍光１５ａ，１５ｂは、
第２の波長分離ミラー１１を透過し、さらに、結像レン
ズ１２、ミラー１０、投影レンズ９、ミラー８を介して
第１の波長分離ミラー７に入射される。

【００５１】この第１の波長分離ミラー７は、前記レー
ザビーム６を反射させ、これら１光子励起蛍光１５ａ，
１５ｂを透過させる特性を備えている。このため、１光
子励起蛍光１５ａ，１５ｂは、第１の波長分離ミラー７
を透過した後、ミラー１９で偏向される。これら１光子
励起蛍光１５ａ，１５ｂの光路上には、ダイクロイック
ミラーからなる第３の波長分離ミラー２４が所定の角度
傾けられて設けられている。この第３の波長分離ミラー
２４は、蛍光１５ａの波長と蛍光１５ｂの波長とを互い
に分離させる特性を備えている。すなわち、蛍光１５ａ
を透過し、蛍光１５ｂを反射する特性を備えている。こ
のため、互いに分離された蛍光１５ａ，１５ｂは、それ
ぞれレンズ２０ａ，２０ｂ、共焦点ピンホール２１ａ，
２１ｂを介してフォトマルチプライヤ２２ａ，２２ｂに
入射され、光電変換される。

【００５２】（第４の実施の形態）次に、第４の実施の
形態について図５および図６を用いて説明する。以下、
同様な作用および機能を有する部材には、第１ないし第
３の実施の形態で用いた符号と同じ符号を使用して、詳
しい説明を省略する。標本１４は、１波長励起２波長蛍
光の試薬Ａ，Ｂで２重染色されている。試薬Ａの励起波
長に近い発振波長を有するレーザ光源１と、試薬Ｂの励
起波長の２倍近くの発振波長を有する短パルスレーザ光
源２とから、それぞれレーザビーム３とレーザビーム４
とが出射され、第２および第３の実施の形態と同様に合
成されたレーザビーム６が標本１４上に集光、照射され
る。

【００５３】標本１４からは、１光子励起現象を発生さ
せるレーザビーム３で試薬Ａが発せられた１光子励起蛍
光１５ａ，１５ｂが発生され、２光子励起現象を発生さ
せるレーザビーム４で試薬Ｂが発せられた２光子励起蛍
光１６ａ，１６ｂが発生される。

【００５４】前記第２の波長分離ミラー（ダイクロイッ
クミラー）１１は、レーザビーム３，４および１光子励
起蛍光１５ａ，１５ｂを透過させ、２光子励起蛍光１６
ａ，１６ｂを反射させる特性を備えている。分離偏向さ
れた蛍光１６ａ，１６ｂは、レンズ１７に入射される。
このレンズ１７を出射された２光子励起蛍光１６ａ，１
６ｂの前方には、ダイクロイックミラーからなる第４の
波長分離ミラー２５が所定の角度傾けられて設けられて
いる。この第４の波長分離ミラー２５は、蛍光１６ａと
蛍光１６ｂとを互いに分離させる特性を備えている。す
なわち、蛍光１６ａを透過させ、蛍光１６ｂを反射させ
る特性を備えている。互いに分離された２光子励起蛍光
１６ａ，１６ｂの光路上には、それぞれバンドパスフィ
ルタ２６ａ，２６ｂが配設されている。これら２光子励
起蛍光１６ａ，１６ｂは、それぞれバンドパスフィルタ
２６ａ，２６ｂによってこれら蛍光１６ａ，１６ｂの波
長成分のみを透過させて、フォトマルチプライヤ１８
ａ，１８ｂで検出され、光電変換される。

【００５５】一方、第２の波長分離ミラーを透過した１
光子励起蛍光１５ａ，１５ｂは、第３の実施の形態と同
様に、第３の波長分離ミラー２４に入射される。この蛍
光１５ａは、このミラー２４を透過し、蛍光１５ｂは、
反射される。これら１光子励起蛍光１５ａ，１５ｂは、
レンズ２０ａ，２０ｂ、共焦点ピンホール２１ａ，２１
ｂに順次入射される。

【００５６】そして、これら１光子励起蛍光１５ａ，１
５ｂの光路上には、それぞれバンドパスフィルタ２７
ａ，２７ｂが配置されている。１光子励起蛍光１５ａ，
１５ｂは、それぞれバンドパスフィルタ２７ａ，２７ｂ
によって１光子励起蛍光１５ａ，１５ｂの波長成分のみ
が透過して、フォトマルチプライヤ２２ａ，２２ｂで検
出され、光電変換される。

【００５７】本実施の形態では、測定精度を向上させる
ため、１光子励起蛍光１５ａ，１５ｂ、および２光子励
起蛍光１６ａ，１６ｂがフォトマルチプライヤに入射さ
れる直前に前記バンドパスフィルタ２６ａ，２６ｂ，２
７ａ，２７ｂを設けて、ノイズ成分をカットし、それぞ
れの蛍光の波長成分のみを検出できるようにしている。

【００５８】そして、例えば、１波長励起２波長蛍光の
試薬には、カルシウムイオン濃度測定用試薬として知ら
れているＩｎｄｏ−１と、ｐＨ測定用試薬として知られ
ているＳＮＡＲＦ−１とがあり、これらによって標本１
４が多重染色されている。なお、Ｉｎｄｏ−１が励起さ
れる波長の励起極大は３５０ｎｍであり、励起により発
せられる蛍光の波長の蛍光極大は、４８０ｎｍ，４０５
ｎｍである。ＳＮＡＲＦ−１が励起される波長の励起極
大は５３０ｎｍであり、励起により発せられる蛍光の波
長の蛍光極大は、６３０ｎｍ，５８０ｎｍである。

【００５９】以下、ＳＮＡＲＦ−１をＧｒｅｅｎ Ｈ
ｅ：Ｎｅレーザから波長５４３ｎｍのレーザビームを出
射させて励起して、発せられた蛍光を共焦点ピンホール
を介してフォトマルチプライヤで検出し、Ｉｎｄｏ−１
をＴｉ：Ｓａレーザから波長７００ｎｍの超短パルスレ
ーザビームを出射させて２光子励起現象を発生させて、
発せられた蛍光をフォトマルチプライヤで検出する場合
について記載する。

【００６０】第１ないし第４の波長分離ミラー（ダイク
ロイックミラー）７，１１，２４，２５の特性は、それ
ぞれ図６の（ａ）ないし（ｄ）に示すように構成されて
いる。ここで、図６の（ａ）ないし（ｄ）は、それぞれ
縦軸がレーザビームおよび蛍光の透過率、横軸がこれら
の波長を表している。このため、まず、第１の波長分離
ミラー７は、図６の（ａ）に示すように、それぞれのレ
ーザビーム３，４の波長５４３ｎｍ，７００ｎｍを反射
させる（透過させない）特性を有し、これらレーザビー
ム３，４を反射させる。また、第２の波長分離ミラー１
１は、図６の（ｂ）に示すように、それぞれのレーザビ
ーム３，４の波長５４３ｎｍ，７００ｎｍを透過させる
特性を有し、これらレーザビーム３，４を透過させる。

【００６１】多重染色標本１４から発生された蛍光１５
ａ，１５ｂ，１６ａ，１６ｂは、それぞれ６３０ｎｍ，
５８０ｎｍ，４８０ｎｍ，４０５ｎｍの波長を有する。
このため、第２の波長分離ミラーは、図６の（ｂ）に示
すように、それぞれ６３０ｎｍ，５８０ｎｍの波長を有
する蛍光１５ａ，１５ｂを透過させ、４８０ｎｍ，４０
５ｎｍの波長を有する蛍光１６ａ，１６ｂを反射させる
ような特性を有する。また、第４の波長分離ミラー２５
は、図６の（ｄ）に示すように、４８０ｎｍの波長を有
する蛍光１６ａを透過させ、４０５ｎｍの波長を有する
蛍光１６ｂを反射させる特性を有する。また、第１の波
長分離ミラー７は、図６の（ａ）に示すように、それぞ
れ６３０ｎｍ，５８０ｎｍの波長を有する蛍光１５ａ，
１５ｂを透過させる特性を有する。そして、第３の波長
分離ミラー２４は、図６の（ｃ）に示すように、６３０
ｎｍの波長を有する蛍光１５ａを透過させ、５８０ｎｍ
の波長を有する蛍光１５ｂを反射させる特性を有する。

【００６２】したがって、それぞれフォトマルチプライ
ヤ２２ａ，２２ｂでＳＮＡＲＦ−１からの蛍光１５ａ，
１５ｂを、フォトマルチプライヤ１８ａ，１８ｂでＩｎ
ｄｏ−１からの蛍光１６ａ，１６ｂを検出することがで
きる。そして、図示しないコンピュータでそれぞれフォ
トマルチプライヤ２２ａ，２２ｂで検出される蛍光量の
レシオと、フォトマルチプライヤ１８ａ，１８ｂで検出
される蛍光量のレシオとを求めて、生体組織細胞の標本
１４のカルシウム濃度変化とｐＨ変化とを同時に測定す
ることができる。

【００６３】（第５の実施の形態）次に、第５の実施の
形態について図７を用いて説明する。本実施の形態は、
第４の実施の形態の変形例である。本実施の形態では、
カメレオン（商標）というプローブを用いてカルシウム
イオン濃度を測定するとともに、ＳＮＡＲＦ−１により
ｐＨ測定を同時に行なう場合について説明する。まず、
カメレオンを用いたカルシウムイオン濃度測定法につい
て説明する。これは、２つの蛍光タンパク質であるＣＦ
Ｐ蛍光およびＹＦＰ蛍光のエナジートランスファーを利
用するものである。例えば、波長４４２ｎｍのビームで
ＣＦＰ蛍光を励起し、励起されたＣＦＰ蛍光のエネルギ
でＹＦＰ蛍光を励起させる手法で、ＣＦＰ蛍光の波長４
８５ｎｍ、およびＹＦＰ蛍光の波長５３０ｎｍの蛍光量
のレシオを測定するものである。

【００６４】カメレオンを励起させる場合、波長４４２
ｎｍのＨｅ：Ｃｄレーザを用い、共焦点ピンホールを用
いてフォトマルチプライヤ２２ａ，２２ｂで光電変換す
る。また、ＳＮＡＲＦ−１を励起させる場合、波長１０
００ｎｍのＴｉ：Ｓａレーザを用い、２光子励起現象に
より発せられた蛍光をフォトマルチプライヤ１８ａ，１
８ｂで光電変換して行なう。

【００６５】なお、第１ないし第４の波長分離ミラー
（ダイクロイックミラー）７，１１，２４，２５の特性
は、それぞれ図７の（ａ）ないし（ｄ）に示すように構
成されている。ここで、図７の（ａ）ないし（ｄ）は、
それぞれ縦軸がレーザビームおよび蛍光の透過率、横軸
がこれらの波長を表している。このため、まず、第１の
波長分離ミラー７は、図７の（ａ）に示すように、それ
ぞれ波長４４２ｎｍ，１０００ｎｍを反射させる（透過
させない）特性を有し、これらレーザビーム３，４を反
射させる。また、第２の波長分離ミラー１１は、図７の
（ｂ）に示すように、それぞれ波長４４２ｎｍ，１００
０ｎｍを透過させる特性を有し、これらレーザビーム
３，４を透過させる。

【００６６】多重染色標本１４から発生された蛍光１５
ａ，１５ｂ，１６ａ，１６ｂは、それぞれ５３０ｎｍ，
４８５ｎｍ，５８０ｎｍ，６３０ｎｍの波長を有する。
このため、第２の波長分離ミラーは、図７の（ｂ）に示
すように、蛍光１５ａ，１５ｂを透過させ、蛍光１６
ａ，１６ｂを反射させる特性を有する。第４の波長分離
ミラー２５は、図７の（ｄ）に示すように、蛍光１６ａ
を透過させ、蛍光１６ｂを反射させる特性を有する。ま
た、第１の波長分離ミラー７は、図７の（ａ）に示すよ
うに、蛍光１５ａ，１５ｂの波長を透過させる特性を有
する。そして、第３の波長分離ミラー２４は、図７の
（ｃ）に示すように、蛍光１５ａを透過させ、蛍光１５
ｂを反射させる特性を有する。

【００６７】したがって、フォトマルチプライヤ２２
ａ，２２ｂで、励起されたＣＦＰ蛍光１５ｂを検出する
ことができるとともに、このＣＦＰ蛍光のエネルギを利
用して励起されたＹＦＰ蛍光１５ａを検出することがで
きる。また、フォトマルチプライヤ１８ａ，１８ｂで、
ＳＮＡＲＦ−１による蛍光を検出することができる。そ
して、図示しないコンピュータでこれら蛍光量のレシオ
をそれぞれ求めて、生体組織細胞の標本１４のカルシウ
ム濃度変化とｐＨ変化とを同時に測定することができ
る。

【００６８】（第６の実施の形態）次に、第６の実施の
形態について図８を用いて説明する。以下、同様な作用
および機能を有する部材には、第１ないし第５の実施の
形態で用いた符号と同じ符号を使用して、詳しい説明を
省略する。本実施の形態は、第１ないし第４の実施の形
態の変形例である。第３の実施の形態のように、標本１
４上で１光子励起現象を発生させる複数（ここでは、３
つ）のレーザ光源１ａ，１ｂ，１ｃが配設されている。
それぞれのレーザ光源１ａ，１ｂ，１ｃから出射される
レーザビーム３ａ，３ｂ，３ｃを合成し、合成されたレ
ーザビーム３にするために、ミラー２３が設けられてい
る。

【００６９】また、標本１４上で、２光子励起現象を発
生させる複数（ここでは、２つ）の短パルスレーザ光源
２ａ，２ｂが配設されている。それぞれの短パルスレー
ザ光源２ａ，２ｂから出射されるレーザビーム４ａ，４
ｂを合成し、合成されたレーザビーム４にするために、
ミラー３２が設けられている。

【００７０】また、第４の波長分離ミラー２５で分離さ
れた蛍光１６ｂの光路上には、ダイクロイックミラー２
５ａが配設され、蛍光１６をさらに分離させるようにな
っている。このミラー２５を透過もしくは反射されたビ
ームの光路上には、それぞれバンドパスフィルタとフォ
トマルチプライヤとが順次配設されている。

【００７１】また、第３の波長分離ミラー２４のさらに
前方に複数（ここでは、３つ）のミラー２４ａ，２４
ｂ，２４ｃが配置されている。２つのミラー２４ａ，２
４ｂは、ダイクロイックミラーからなり、ミラー２４ｃ
は、反射ミラーからなる。

【００７２】そして、これらミラー２４ａ，２４ｂ，２
４ｃで反射されたビームの光路上には、共焦点ピンホー
ルと、バンドパスフィルタと、フォトマルチプライヤと
がそれぞれ順次配設されている。

【００７３】本実施の形態では、それぞれ標本上で、１
光子励起現象を発生させるレーザ光源１を３つ、２光子
励起現象を発生させる短パルスレーザ光源２を２つ設け
たが、これらの数に限らず、ダイクロイックミラーの特
性を変えれば、組み合わせも自由に変化され得る。

【００７４】なお、第１ないし第６の実施の形態におい
ては、短パルスレーザ光源から出射されるレーザビーム
によって標本から発せられるのは、２光子励起現象によ
り発生される蛍光に限らず、例えば、３光子励起現象、
４光子励起現象などの多光子励起現象により発生される
蛍光、さらには、ラマン光、第２高調波、第３高調波な
どもあり得、これら蛍光、ラマン光、第２高調波、第３
高調波なども同様に検出することができる。このため、
標本で非線形現象を生じさせ、この現象により発生され
る光であれば、同様に、検出することができる。また、
各ダイクロイックミラーの特性において、波長による透
過と反射との関係は、互いに反対であっても構わない。
また、共焦点検出部分は、ダイクロイックミラーで互い
に異なる波長に分離する前にレンズとピンホールとを配
置する構成でも構わない。さらに、走査光学系は、ガル
バノミラーに限らず、レーザビームを２次元的に走査で
きるものであれば、他の方式でも構わない。

【００７５】これまで、いくつかの実施の形態について
図面を参照しながら具体的に説明したが、本発明は、上
述した実施の形態に限定されるものではなく、その要旨
を逸脱しない範囲で行なわれるすべての実施を含む。

【００７６】上記説明によれば、下記の事項の発明が得
られる。また、各項の組み合わせも可能である。

【００７７】［付記］ １．少なくとも１つのレーザ光源と、前記レーザ光源か
ら出射されたレーザビームを２次元に走査させる走査光
学系と、この走査光学系により走査されたレーザビーム
を標本上に集光、照射させるとともに、線形現象および
非線形現象により、この標本から得られる（発せられ
る）光を入射させる対物レンズと、前記標本から得られ
る光を選択的に分離させる第１のビームスプリッタと、
この第１のビームスプリッタで分離された光を検出する
第１の光検出器と、を具備したレーザ顕微鏡において、
前記対物レンズと第１のビームスプリッタとの間の光軸
上に配設され、前記標本から得られる光から、前記標本
にレーザビームが照射されて発せられた非線形現象によ
る所定の光を分離させる第２のビームスプリッタと、こ
の第２のビームスプリッタで分離された光を検出する第
２の光検出器とをさらに具備し、前記第２のビームスプ
リッタは、前記レーザ光源から出射されたレーザビー
ム、および前記標本から得られる線形現象による光また
は反射光と、前記標本から得られる非線形現象による光
とを分離させるように設定され、前記第１のビームスプ
リッタは、前記レーザ光源から出射されたレーザビーム
と、前記標本からの線形現象による光または反射光とを
分離させるように設定されたことを特徴とするレーザ顕
微鏡。

【００７８】２．少なくとも１つの１光子励起用のレー
ザ光源から出射されるレーザビームと、少なくとも１つ
の多光子励起用のパルスレーザ光源から出射されるレー
ザビームとを合成させるレーザビーム合成光学系と、前
記レーザビーム合成光学系で合成された複数のレーザビ
ームを２次元に走査させる走査光学系と、この走査光学
系により走査されたレーザビームを標本上に集光、照射
させるとともに、この標本から得られる光を入射させる
対物レンズと、前記レーザビーム合成光学系と前記走査
光学系との間の光軸上に配設され、前記標本から得られ
る光を選択的に分離させる第１の波長分離ミラーと、こ
の第１の波長分離ミラーで分離された光を検出する第１
の光検出器と、を具備したレーザ顕微鏡において、前記
対物レンズと第１の波長分離ミラーとの間の光軸上に配
設され、前記標本から得られる光から、前記標本にレー
ザビームが照射されて発せられた所定の光を分離させる
第２の波長分離ミラーと、この第２の波長分離ミラーで
分離された光を検出する第２の光検出器とをさらに具備
し、前記第２の波長分離ミラーは、合成された前記レー
ザビーム、および前記１光子励起用のレーザから出射さ
れたレーザビームによって前記標本から得られる所定の
光と、前記多光子励起用のレーザから出射されたレーザ
ビームによって前記標本から得られる所定の光とを分離
させるように設定され、前記第１の波長分離ミラーは、
合成された前記レーザビームと、前記１光子励起用のレ
ーザから出射されたレーザビームによって前記標本から
得られる所定の光とを分離させるように設定されたこと
を特徴とするレーザ顕微鏡。

【００７９】３．前記第１の波長分離ミラーと前記第１
の光検出器との間の光軸上に配設され、前記第１の波長
分離ミラーで分離された光をさらに異なる波長に分離さ
せる少なくとも１つの第３の波長分離ミラーと、前記第
３の波長分離ミラーで分離された光を検出する第３の光
検出器とをさらに具備したことを特徴とする付記項２に
記載のレーザ顕微鏡。

【００８０】４．前記第２の波長分離ミラーと前記第２
の光検出器との間の光軸上に配設され、前記第２の波長
分離ミラーで分離された光をさらに異なる波長に分離さ
せる少なくとも１つの第４の波長分離ミラーと、前記第
４の波長分離ミラーで分離された光を検出する第４の光
検出器とをさらに具備したことを特徴とする付記項２も
しくは３に記載のレーザ顕微鏡。

【００８１】この付記項４によって、１光子励起および
／もしくは２光子励起での２波長蛍光検出が可能とな
り、複数のレシオ測定を同時に行なうことができる。

【００８２】

【発明の効果】以上説明したように、本発明によれば、
生体細胞組織（標本）からの複数の光を同時に検出する
ことが可能で、標本の複数の形態および機能をリアルタ
イムで観察および測定することが可能となる、特に、多
重染色標本から発せられるそれぞれ異なる波長を有する
複数の蛍光を同時に効率よく検出することができるレー
ザ顕微鏡を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】第１の実施の形態に係わるレーザ顕微鏡の光学
系を説明するための概略図。

【図２】第２の実施の形態に係わるレーザ顕微鏡の光学
系を説明するための概略図。

【図３】第２の実施の形態に係わり、（ａ）は蛍光の発
生状態を説明するための概略図、（ｂ）は多光子励起現
象により励起される蛍光の発生状態を説明するための概
略図。

【図４】第３の実施の形態に係わるレーザ顕微鏡の光学
系を説明するための概略図。

【図５】第４の実施の形態に係わるレーザ顕微鏡の光学
系を説明するための概略図。

【図６】第４の実施の形態に係わり、（ａ）ないし
（ｄ）は、それぞれ図５に示す第１ないし第４の波長分
離ミラーの波長透過率特性を表すグラフ。

【図７】第５の実施の形態に係わり、（ａ）ないし
（ｄ）は、それぞれ図５に示す第１ないし第４の波長分
離ミラーの波長透過率特性を表すグラフ。

【図８】第６の実施の形態に係わるレーザ顕微鏡の光学
系を説明するための概略図。

【図９】従来技術に係わるレーザ顕微鏡の光学系を説明
するための概略図。

【図１０】従来技術に係わるダイクロイックミラーの特
性を表すグラフ。

【符号の説明】

１，２…レーザ光源、３，４…レーザビーム、５…ダイ
クロイックミラー、６…レーザビーム、７…第１の波長
分離ミラー、８…ガルバノミラー、１１…第２の波長分
離ミラー、１３…対物レンズ、１４…標本、１５…蛍
光、１６…蛍光、１８…第２の光検出器、２１…共焦点
ピンホール、２２…第１の光検出器

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 2G043 AA03 BA16 DA02 EA01 FA01 FA02 FA06 GA02 GB19 HA01 HA02 HA07 HA09 HA15 KA02 KA05 KA08 KA09 LA02 NA01 NA05 2H052 AA08 AA09 AC04 AC14 AC27 AC34

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 １つの波長を有するレーザビーム、もし
   くはそれぞれ波長の異なる複数のレーザビームを出射さ
   せるレーザ出射手段と、 出射された前記レーザビームを２次元的に走査させる走
   査光学系と、 走査された前記レーザビームを標本上に集光させ、この
   標本からの光が入射される対物レンズと、 前記レーザ出射手段と前記走査光学系との間の光路上に
   配設され、前記レーザビームと、前記標本から得られる
   線形現象による光または反射光の少なくとも一方とを選
   択的に分離させる第１のビームスプリッタと、 この第１のビームスプリッタで分離された線形現象によ
   る光または反射光を検出する第１の光検出器と、 前記対物レンズと前記第１のビームスプリッタとの間の
   光軸上に配設され、前記レーザビーム並びに前記標本か
   ら得られる線形現象による光および反射光と、前記標本
   から得られる非線形現象による光とを選択的に分離させ
   る第２のビームスプリッタと、 この第２のビームスプリッタで分離された非線形現象に
   よる光を検出する第２の光検出器とを具備したことを特
   徴とするレーザ顕微鏡。
2. 【請求項２】 それぞれ標本上で、線形現象を発生させ
   るのに用いる少なくとも１つのレーザ光源と、非線形現
   象を発生させるのに用いる少なくとも１つの短パルスレ
   ーザ光源とから出射されるレーザビームを合成させるレ
   ーザビーム合成光学系と、 前記レーザビーム合成光学系で合成されたレーザビーム
   を２次元的に走査させる走査光学系と、 この走査光学系により走査されたレーザビームを標本上
   に集光させるとともに、この標本からの光が入射される
   対物レンズと、 前記レーザビーム合成光学系と前記走査光学系との間の
   光軸上に配設され、合成された前記レーザビームと、前
   記レーザ光源から出射されたレーザビームによる前記標
   本からの線形現象による蛍光とを選択的に分離させる第
   １の波長分離ミラーと、 この第１の波長分離ミラーで分離された蛍光を検出する
   第１の光検出器と、 前記対物レンズと前記第１の波長分離ミラーとの間の光
   軸上に配設され、前記レーザ光源から出射されたレーザ
   ビームによる前記標本からの線形現象による蛍光および
   合成された前記レーザビームと、前記短パルスレーザ光
   源から出射されたレーザビームによる前記標本からの非
   線形現象による蛍光とを選択的に分離させる第２の波長
   分離ミラーと、 この第２の波長分離ミラーで分離された蛍光を検出する
   第２の光検出器とを具備したことを特徴とするレーザ顕
   微鏡。
3. 【請求項３】 前記第１の波長分離ミラーと前記第１の
   光検出器との間の光軸上に配設され、前記第１の波長分
   離ミラーで分離された光をさらに異なる波長の光に分離
   させる少なくとも１つの第３の波長分離ミラーと、 前記第３の波長分離ミラーで分離された光を検出する第
   ３の光検出器とをさらに具備したことを特徴とする請求
   項２に記載のレーザ顕微鏡。
4. 【請求項４】 前記第２の波長分離ミラーと前記第２の
   光検出器との間の光軸上に配設され、前記第２の波長分
   離ミラーで分離された光をさらに異なる波長の光に分離
   させる少なくとも１つの第４の波長分離ミラーと、 前記第４の波長分離ミラーで分離された光を検出する第
   ４の光検出器とをさらに具備したことを特徴とする請求
   項２もしくは３に記載のレーザ顕微鏡。