JPH05509417A - 共焦点走査光学顕微鏡 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は光学共焦点走査顕微鏡に関する。

発明の背景 英国特許公報第２１８４３２１Ａ号は、特に螢光または反射標本の研究のための 共焦点走査光学顕微鏡を開示する。この機器は標本上の走査されたースポットに 光の焦点を合わせることに依存し、その照射されたスポットはデスキャンの後検 出器前部の共焦点開口上に結像される。

像が標本からの螢光で形成される場合は、標本上に配向された光の波長は螢光を 励起させるような方法で選択される。放たれた光は適当なビームスプリッタによ って、励起する光から分離され、かつ検出器が螢光によって発せられた光にのみ 応答するような方法で波長選択性フィルタを通過する。この設計に基づく機器は 商業的に入手可能である。

それらは適当なビームスプリッタおよびフィルタによって、放たれた光を異なる 波長域のビームに細分する設備（ｐｌｏｗｉｓｉｏｎ）を含む。この分割の後、 ２つの検出機で識別可能な異なる螢光色を発する２つの染料が用いられ得る。代 替的に、容認された光学の実務に従って、適当なビームスプリッタの使用により 螢光像と同時に反射像が得られる。

先行技術の機器は満足に作用するが、−走査スポットの使用に依存するすべての 共焦点走査顕微鏡は、システムのすべての分光選択性が発せられたまたは反射さ れたビームを異なる波長の部分に分離することにあるという欠点を被る。もし２ つの染料の螢光発光スペクトル間にかなりの重畳があれば、それらは識別するこ とができない。たとえば、バカラオ（Ｂａｃａ　ｌ　１ａｏ）他は、１９９０年 プレナム・プレス（Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅ＋ｓ）出版の［共焦点顕微鏡使用法ハ ンドブック（丁ｈｅ　）Ｉａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｃｏｎｆｏｃｘｌ　Ｍｉｃ＋ ｏｓｃｏｐ７　）　Ｊ　ｌこおいて、通常使用されている染料フルオレセインお よびローダミンはこの形式のシステムでは効果的に分離できないとコメントして いる。許容可能な分離を達成するために、励起の波長を変化させることが必要で ある。これはある種類のレーザ光をスペクトル的に異なる特性の他の種類に変化 させることにより得られる。まずある種類の励起でシステムを動作することによ り像が得られ、それから異なる種類の励起ビームで３１！２の像が得られる。こ の動作は速度が遅く面倒である。

アワムラ、オデおよびヨネザワ（Ａｖｕ＋ａｒｘ　、Ｏｄｅ　ａｎｄ　ＹＱｎｅ ｘａｖａ）は、赤、緑および青レーザビームが標本上で独立的に走査され、かつ 反射されたビームはダイクロイックフィルタによって分離され、かつその各々は ３つの分離した直線ＣＣＤ検出器アレイの１つの上で走査動作を実行する顕微鏡 を記述した。この記述は５ＰＩＦ国際光学技術学会（１９８７）の予稿集７６５ 号５３−６０頁に発表された。原則として、アワムラ他のシステムは螢光顕微鏡 として使用され得る。それからこれは１種類以上の染料が各ライン走査の間に迅 速に連続して励起することを許容するであろう。しがしながら、２つの染料が同 一の発光スペクトルを有する場合、または１つのレシオメトリック染料の発光ス ペクトルが単一波長でモニタされるべき場合は、アワムラ他のシステムはホワイ ト（Ｗｈｉｔｅ）　（英国特許出願番号第２１８４３２１Ａ号）のものに対して 有利な点がない、なぜならどちらのシステムも２つの発光信号を分離できないか らである。

及盟 この発明に従って、共焦点走査光学顕微鏡が提供され、これは 一光学走査システムと、 一走査システムを通過した後、テスト中の標本が照射のエレメントの２つ以上の 別個のかつ分離した領域で走査されるように、任意に異なるスペクトル成分およ び異なる配向の２つ以上の入力ビームを同時に発生するための手段と、さらに 一走査手段によるデスキャンの後、２つ以上の出力ビームをそれぞれ受けるため の２つ以上の検出器を含み、各々の検出器は照射されたエレメントの領域のうち の１つがら導出された出力光に実質的に限定される出力ビームを受ける。

この発明は容認された実務に従って、可能な励起率の像の測定を行なうために、 励起波長が異なるが発光波長は同一である２つ以上の顕微鏡チャネルを考慮する 。

この発明はまた容認された実務に従って、可能な発光率の像の測定を行なうため に、励起波長は同一だが発光波長は異なる２つ以上の顕微鏡チャネルを考慮する 。

この発明はこうして多くの種類の走査光学顕微鏡に応用可能である。これは、走 査システムの各掃引の間に２つ以上のスペクトル的に別個の励起スポットまたは バーが標本上で共に走査されることが可能な手段を提供する。各スポットからの 発光は、検出器へと続く静止共焦点開口へ個々に別々に通過し、各スポットにつ いて少なくとも１つの開口および検出器が存在する。

標本の螢光または反射のために各スポットから発せられたビームは、確立された 実務に従って検出器の間でスペクトル的にろ波されるかもしくは細分化されても よく、または検出器へ非選択的に通過させてもよい。したがって−走査サイクル で、各々の像が励起および発光周波数の両方において他の像と異なり得る２つ以 上の完全な像を得ることが可能である。

この発明は「多重化光学システム」と考えられてもよい、なぜならそれは同一の 走査システムおよび対物レンズを通過する独立しているが平行に近いビーム経路 の２つ以上の組を含むからであり、光学経路は共に折り畳まれているという言葉 どおりに多重化されている。

実施例の説明 この発明のさらなる特徴および利点が添付の図面を参照して以下の実施例の説明 から明らかとなるであろう、その図面は 図１はこの発明の多重化光学システムを組入れる共焦点走査顕微鏡の概略図であ り、 図２は図１の上部についての代替的かつ好ましい光学的配置を示す概略図であり 、さらに 図３は異なるスペクトル特性を有するいくつかのビームがそれによって一つの（ たとえば多ライン）レーザから得られる、この発明での使用のための光学手段を 示す概略図である。

図面を参照して、この発明は、拡張された発光ビーム経路を有するレーザ共焦点 走査顕微鏡において多数の独立した光学チャネルが励起のために同時に使用され ることを許容する光学アセンブリを提供するが、この種類の顕微鏡への応用に限 定はされない。この発明は光のバーまたはスリットが標本上で走査される共焦点 顕微鏡、および一つのスポットが走査される共焦点顕微鏡に用いられることが可 能である。

図１において、図面を単純にするために２つの独立した光経路のみが示されるが 、実務ではその数についての制限はない。

２つのレーザＬ１およびＬ２からの異なるスペクトル特性を有する光は、ビーム スプリッタＢＳＩ上に向けられる。

２つのビームは互いに対してわずかに角度があり、その角度は明確さのために図 中では誇張される。２つのビームは示されるように走査システム中に反射され、 それは両方のビームの角走査を同時に生じる。ビームの角分離は走査全体を通じ て維持され、典型的には接眼レンズＥおよび対物レンズＯの適当な顕微鏡光学系 を通過した後、標本上で２つの別個の移動する光のスポットＳ１およびＳ２の形 成を結果として生じる。

反射または螢光のために８１で標本から光が発せられ、この発せられた光の一部 は光学システムを通過して戻り、デスキャン、つまり走査システムによって静止 ビームへ再変換され、ビームスプリッタＢＳＩを通過し、かつ検出器Ｄ１へと続 く共焦点開口Ａ１上に落ちる。Ｓ２からの光は類似しているが別個の経路に沿っ て光学システムを通過し、検出器Ｄ２上に落ちる。好ましい角分離は光学チャネ ルの満足のいく分離と両立して可能な限り小さい。イメージレジストレーション を許容するために、Ｓｌと８２とに対応するスポットによって標本中の所与のポ イントを走査する間の時間の僅差は、適当な慣用的電子手段、たとえばイメージ 処理ソフトウェアによって補償され得る。２つ以上のスポットが同一の走査線上 にあるべきであるということはこのシステムの機能にとって本質的ではない。

図２の好ましい実施例において、走査装置および顕微鏡は図中で示されないが、 図１のものと同一であると考えられるべきである。レーザＬ１およびＬ２からの ビームは小さな角度で再びビームスプリッタＢＳｌ上へ通過する。ビームスプリ ッタＢＳＩを通過した後に戻ってくるビームは、第２のビームスプリッタＢＳＩ へと通過し、それは二色性特性を有し、その結果一方のビームＢ１の光の大半は 共焦点開口Ａ１へと、それから検出器Ｄ１へと通過し、一方他方のビームＢ２は Ａ２およびＤ２へと優先的に反射される。

この修正は、発光周波数の選択を達成するために第２のビームスプリッタＢＳ２ の使用を許容するので好まれ、かつまた既存の機器をわずかに修正するだけで実 現され得る。

発せられたビームを波長ごとに分離することは、波長選択性フィルタＦ１および Ｆ２を加えることにより改良され得る。

各々が適切な開口Ａ１またはＡ２上へと向かう発光ビームの照準は、ＢＳ２と検 出器Ｄ１またはＤ２との間に置かれた鏡（図示せず）の使用によって便利に達成 され得る。

付加的腕および二色性反射器は、入力ビームＬ１とＬ２との間に適切な角度を設 ける便利な手段を与える。たとえば、図３はそれにより１つの多ラインレーザＬ からの光が異なるスペクトル成分および角度を有するビームに分離され得る、多 くの可能な手段のうちの１つを図示する。

この場合、ガラスまたは他の透明材料の側面が平行のブロックＢが使用されて、 波長に従ってビームの小さな横方向の分離を生じる。ビーム間の角度はそれから ビームをプリズムＰを通過させることによって調節され、そこでビームはプリズ ムの分散力のために異なる角偏差を受ける。プリズムの適切な配向によって、各 々−周波数に対応する平行ビームが発生し、それらはビームスプリッタＢＳＩに 向かって収束する。収束の角度はプリズムの角度とその屈折率および分散力とに よって決定される。図中で実線Ｓはより短い波長のビームを示し、それはより長 い波長の光に対応する点線りで示されるビームよりもより強く屈折する。

これまで定義されたこの発明の範囲内で、上に説明されかつ図示された配置のさ まざまな修正が可能である。

ｎ７　Ｄｉ 要約 テスト中の標本が照射の別個のスポツトまた（よス１）・ソト（３１，Ｓ２）で 同時に走査され、力）つ反射また（よ螢光のために標本から発せられた２つの出 力ビーム力くデスキャンされて別々の静止共焦点開口（Ａｌ、Ａ２）および検出 器（Ｄｉ、Ｄ２）へと通過する、共焦点走査光学顕微鏡である。

国際調査報告 ｍ−１ｍ＋＠ｓａｌ　Ａ＋ｍｉ−＼・　ｐｒ丁ｔｔ：ｏ　ｏ＋１ｎ１１ｔｃ国際 調査報告　。８９１０１１７６

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．共焦点走査光学顕微鏡であって、 −光学走査システムと、 −走査システムを通過した後、テスト中の標本が照射のエレメントの２つ以上の 別個のかつ分離した領域で走査されるように、任意に異なるスペクトル成分のお よび異なる配向の２つ以上の入力ビームを同時に発生するための手段と、 −走査手段によるデスキャンの後、２つ以上の出力ビームをそれぞれ受けるため の２つ以上の検出器とを含み、各々の検出器は照射されたエレメントの領域のう ちの１つから導出された出力光に実質的に限定される出力ビームを受ける、顕微 鏡。
2. ２．２つ以上のビームは励起波長は異なるが発光波長は同−である２つ以上の顕 微鏡チャネルを規定する、請求項１に記載の顕微鏡。
3. ３．２つ以上のビームは励起波長は同一だが発光波長は異なる２つ以上の顕微鏡 チャネルを規定する、請求項１に記載の顕微鏡。
4. ４．２つ以上のビームは異なる励起波長と異なる発光波長とを有する２つ以上の 顕微鏡チャネルを規定する、請求項１に記載の顕微鏡。
5. ５．各エレメントの領域からの発光は検出器へと続く静止共焦点開口へ個々に別 々に通過し、各々の領域について少なくとも１つの開口および検出器が存在する 、請求項１ないし４のいずれかに記載の顕微鏡。
6. ６．エレメントの領域はスポットまたはバーの形である、請求項１に記載の顕微 鏡。
7. ７．バーはスリットの像によって発生するスリット走査共焦点顕微鏡である、請 求項６に記載の顕微鏡。
8. ８．入力ビームは互いに対して小角度で設定される、請求項１ないし７のいずれ かに記載の顕微鏡。
9. ９．入力ビームは多ラインレーザからの光を分割することによって得られる、請 求項１ないし８のいずれかに記載の顕微鏡。
10. １０．ビームスプリッタが出力ビームの分離のために設けられる、請求項１ない し９のいずれかに記載の顕微鏡。
11. １１．出力ビームを波長ごとに分離することは１つ以上の波長選択性フィルタに よって促進される、請求項１ないし９のいずれかに記載の顕微鏡。
12. １２．別個の入力ビームは多波長ビームをプリズムに通過させることによって得 られる、請求項１ないし１１のいずれかに記載の顕微鏡。
13. １３．異なる走査されたエレメントの領域に関する経路長時間の差は電子的に補 償される、請求項１ないし１２のいずれかに記載の顕微鏡。