JPH04315119A

JPH04315119A - レーザ走査型蛍光顕微鏡

Info

Publication number: JPH04315119A
Application number: JP8244491A
Authority: JP
Inventors: Koji Ichie; 更治市江
Original assignee: Hamamatsu Photonics KK
Current assignee: Hamamatsu Photonics KK
Priority date: 1991-04-15
Filing date: 1991-04-15
Publication date: 1992-11-06
Anticipated expiration: 2014-06-21
Also published as: JP2907571B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、各種の蛍光色素を標識
として含む生物試料等の蛍光像を蛍光色素ごとに表示可
能なレーザ走査型蛍光顕微鏡に関する。

【０００２】

【従来の技術】図５に示すように、生物試料の標識用に
使われる蛍光色素の発光スペクトルは、比較的狭い発光
波長域と単一の発光ピークとを持つものが多い。

【０００３】図６は、このような多種類の蛍光色素によ
り標識した試料につき、そのそれぞれの蛍光発光像を得
るための装置をしめす。図示のように落射蛍光顕微鏡１
０１を用い、バンドパスフィルタ１０２及びダイクロイ
ックビームスプリッタ１０３を組み合わせたブロックを
蛍光色素の種類に合わせて交換していた。つまり、光源
１０５からの光をダイクロイックビームスプリッタ１０
３によって試料１０６上に導くとともに試料１０６から
の蛍光を前述のブロックをとおしてカメラ１０４で観察
する。カメラ１０４で得られた複数の画像は後に重ね合
わされる。

【０００４】図７は、各蛍光色素ごとの蛍光発光像を得
るための別の装置を示す。このような装置では、バンド
パスフィルタ２０２ａ、２０２ｂ及びダイクロイックビ
ームスプリッタ２０３ａ、２０３ｂを組み合わせること
により、各蛍光色素の発光スペクトルのピークに対応さ
せて光束を分割することとしている。分割された各光束
は、複数のビデオカメラ２０４ａ、２０４ｂのそれぞれ
で蛍光像に変換される。これにより、蛍光色素の種類ご
とに同時に蛍光像を撮ることができ、これを重ね合わせ
るならば、試料のどの部分がその蛍光色素で標識された
か知ることができる。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】しかし、図６のような
装置では、一般に蛍光像の発光輝度が低いことに起因し
て、一枚の画像を撮るのに比較的長い時間（数十秒〜数
分間）を要する（ＳＣＩＥＮＣ，　ＶＯＬ．　２３０，
　ＤＥＣ　１９８５，　ｐｐ１４０１−１４０３　等参
照）。したがって、時間的に変動する試料の画像を蛍光
色素の種類と同じ枚数だけ撮る場合、撮影時の試料の変
形に起因して画像が変動し、これらを完全に重ね合わせ
ることができないといった問題があった。

【０００６】また、図７のような装置では、蛍光色素の
種類と同一台数のビデオカメラが必要となり、ビデオカ
メラ相互の位置、倍率等を光学的に完全に一致させるこ
とは困難である。特に、ビデオカメラの感度を上げるた
めイメージイメージインインテンシファイアを介在させ
た場合には、個々のイメージイメージインインテンシフ
ァイアの非直線的な歪みが重畳するため、完全な画合せ
は望むべくもないといった問題があった。

【０００７】更に、図６及び図７の装置に共通する問題
として、多重蛍光スペクトルを完全に分離するために各
蛍光スペクトルがオーバーラップしない波長のみを選択
して撮像する必要があり、各光束の光路に対し非常に狭
い波長域のみを通す特性を持たせなければならなず、光
束の利用効率が低いという問題があった。

【０００８】そこで、本発明は、多種類の蛍光色素を含
む試料からの発光画像を、時間的ずれなく高いＳ／Ｎ比
で、蛍光色素ごとに分離識別可能なレーザ走査型蛍光顕
微鏡を提供することを目的とする。

【０００９】

【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
、本発明に係るレーザ走査型蛍光顕微鏡は、集光された
光スポットを試料上で走査する走査手段と、試料から発
生した蛍光を検出し電気信号に変換する光検出手段と、
走査手段に同期して検出手段からの電気信号を読み出す
制御手段とを備える。ここに、光検出手段は、総合分光
感度特性が所定のスペクトル波長域で単調増加する第１
の光検出器と、総合分光感度特性が前記所定のスペクト
ル波長域で単調減少する第２の光検出器と、試料からの
蛍光を前記第１及び第２の光検出器に個別に導く光学手
段とを含む。また、制御手段は、第１及び第２の光検出
器からの電気信号の強度比に基づいて、試料からの蛍光
がどの種類の蛍光色素によるものかを判別する判別手段
を備える。なお、総合分光感度特性とは、光検出器及び
光学手段を結合した系の全体的な分光感度特性をいい、
例えば光検出器の分光感度特性、各光検出部分の前に置
かれる分波鏡その他の分光分波特性、フィルタその他の
分光透過率特性等の組み合わせによって決定されるもの
である。

【００１０】

【作用】上記レーザ走査型蛍光顕微鏡によれば、第１の
光検出器の総合分光感度特性は所定のスペクトル波長域
で単調増加し、第２の光検出器の総合分光感度特性は同
スペクトル波長域で単調減少する。したがって、第１及
び第２の光検出器からの電気信号の強度比に基づいて発
光の中心波長を特定することができ、複数種の蛍光色素
のそれぞれの発光スペクトルが比較的狭い発光波長域と
単一の発光ピークとを持つものと仮定するならば、これ
らの蛍光色素の種類を特定又は判別することができる。このような蛍光色素の判別を走査手段に同期して行えば
、蛍光色素の種類ごとにその強度に応じた蛍光画像を時
間的ずれなく得ることができる。

【００１１】

【実施例】以下、本発明の一実施例を添付図面を参照し
つつ説明する。

【００１２】図１は、実施例のレーザ走査型蛍光顕微鏡
の光学系を示した概略図である。図示のように、連続発
振レーザ光源１からの励起用のレーザ光束は、結像レン
ズ７、ピンホール８、コリメータ９及ダイクロイックミ
ラー１０を直進して、第１のスキャナ２に設けられたガ
ルバノメータミラーに入射する。この第１のスキャナ２
で偏向されたレーザ光束は、リレーレンズ３４、３５を
へて第２のスキャナ３に設けられたガルバノメータミラ
ーに入射し、再び偏向される。第２のスキャナ３の出射
側には、接眼レンズ３６を介して対物レンズ１５が配置
されており、これらによって試料６上にレーザスポット
光が形成される。このレーザスポット光は、走査手段で
ある第１及び第２のスキャナ２、３によって、試料上を
それぞれＸ方向及びＹ方向に走査される。

【００１３】試料６から出射した蛍光は、第２のスキャ
ナ３及び第１のスキャナ２で順次偏向された後、ダイク
ロイックミラー１０に入射する。このダイクロイックミ
ラー１０は、レーザ光束の波長よりも長波長域の光束の
みを反射するので、レーザ光束の波長よりも長い波長を
有する蛍光はダイクロイックミラー１０で反射されて、
結像レンズ１１及びピンホール１２を介してダイクロイ
ックミラー１３に入射する。このダイクロイックミラー
１３で２分割された蛍光は、それぞれフィルタ１４、１
６を経てフォトマルチプライア等からなる第１及び第２
の光検出器１５、１７に入射し、それぞれが同時に電気
信号に変換される。第１の光検出器１５側の光路の総合
分光感度特性は、第１の光検出器１５自体の分光感度特
性のみならず、フィルタ１４の分光透過率特性、ダイク
ロイックミラー１３の分光分波特性等の組み合わせによ
って与えられる。また、第２の光検出器１７側の光路の
総合分光感度特性も、光検出器１７、フィルタ１６、ダ
イクロイックミラー１３等の分光特性の組み合わせによ
って与えられる。以下に詳細は説明するが、第１の光検
出器１５側の光路の総合分光感度特性は、所定のスペク
トル波長域で波長とともに単調増加し、第２の光検出器
１７側の光路の総合分光感度特性は、同波長領域で波長
とともに単調減少する。

【００１４】図２は、実施例のレーザ走査型蛍光顕微鏡
の制御系を示した概略図である。光検出器１５、１７か
らの電気信号は、Ａ／Ｄコンバータ２１、２３によって
ディジタル信号に変換された上で、スキャナ２、３の駆
動信号に同期させて一対の画像メモリー２５、２７の同
一番地の画素に順次書き込まれ、画像信号として保存さ
れる。判別手段である制御解析装置３０は各画像メモリ
ー２５、２７に保存された一対のデータに基づいて蛍光
色素の種類を各画素ごとに判別する。各画素ごとに得ら
れた蛍光色素の種類に関するデータは、画像としてまと
められ、例えば特定種類の蛍光色素の濃度分布としてデ
ィスプレイ３２に表示される。

【００１５】以下、実施例のレーザ走査型蛍光顕微鏡の
動作について説明する。第１及び第２のスキャナ２、３
は、制御解析装置３０からの駆動信号に基づいて試料６
上に照射されたレーザスポット光を走査する。試料６か
らは、試料作成に使用された蛍光色素の分布に応じた蛍
光が発生する。この蛍光は、第１及び第２の光検出器１
５、１７で同時に検出されるが、そのピーク波長の位置
に応じて各光検出器１５、１７の出力比が異なったもの
となる。

【００１６】図３は、各光検出器１５、１７の光路の総
合分光感度特性と蛍光色素の発光スペクトルとを対比し
たものである。第１の光検出器１５側の総合分光感度特
性は、適当なスペクトル波長域λ１　〜λ２　をカバー
し、かつ、その感度が波長とともに短調に増加する（図
３（ａ）の一点鎖線）。一方、第２の光検出器１７側の
総合分光感度特性は、スペクトル波長域λ１〜λ２　を
カバーし、かつ、その感度が波長とともに短調に減少す
る（図３（ａ）の実線）。蛍光色素としては、予め発光
スペクトル分布の分かったものを使用する。つまり、上
記スペクトル波長域λ１　〜λ２　内の適当な領域をカ
バーし、かつ、異なるピーク波長を有する３種の蛍光色
素を使用する（図３（ｂ））。

【００１７】図３（ｂ）に示すような蛍光色素を試料の
作成に用いた場合、図３（ａ）の特性を有する各光検出
器１５、１７の出力比は、検出された蛍光色素の種類ご
とにほぼ一定の値を示し、その蛍光強度の絶対値にほと
んど依存しない。具体的には、図３（ｂ）に示す３つの
蛍光色素について各光検出器１５、１７で得られる出力
比は、第１の色素で約１：４となり、第２の色素で約１
：１となり、第３の色素で約４：１となる。

【００１８】したがって、２つの画素メモリ２５、２７
に蓄積された画像信号について各画素ごとに比をとれば
、２組の光検出系を用いるだけで多数の蛍光色素の発光
像を分離識別することができる。また、総合分光感度特
性に基づいて、各画素における蛍光色素の種類とその蛍
光強度とを検出することができるので、各蛍光色素ごと
の蛍光強度の分布を得ることもできる。さらに、これら
を各画素ごとに重ね合せるならば、試料の全体像を再現
することができる。制御解析装置３０は、画像信号の強
度比、蛍光色素の種類等を解析し、試料の蛍光強度分布
、蛍光色素の識別等をディスプレイ３２に表示する。

【００１９】以上の説明から明らかなように、実施例の
装置では、試料からの光路を２系統に分けるだけでそれ
ぞれの画像信号から多種類の蛍光色素の発光画像を分離
識別することができる。また、多種類の蛍光色素の多波
長蛍光画像が同時に全く画像ずれなく分離識別できる。さらに、蛍光光束を無駄なく利用できるので、短時間で
Ｓ／Ｎ比の良い画像を得ることができる。

【００２０】本発明は上記実施例に限られるものではな
い。図１のピンホール１２を用いていわゆるコンフォー
カルモードのレーザ走査型蛍光顕微鏡とすることで、試
料の蛍光像を３次元的に分解することもできる。この場
合、ピンホール１２の径及び位置を調整し、蛍光の光ス
ポットの中心部のみを透過するように配置する。試料６
の位置を光軸方向に上下することにより、Ｚ軸方向の蛍
光分布を求めることができる。これにより、２次元的に
観察していた状態では重なり合っていた蛍光が重なり合
うことなく識別できるので、蛍光色素の種類の識別がよ
り確実かつ容易になる。なお、２次元的観察のみ行う場
合には、ピンホール１２を省略することができる。

【００２１】また、Ａ／Ｄコンバータ２１、２３の一方
を省略し、残りのＡ／Ｄコンバータの入出力をスイッチ
し、２つの画像メモリー２５、２７内の同一番地に交互
に画像信号を保存すれば、試料の変形に起因するずれの
効果が半画素分の走査時間に対応するものとなり、実用
上の問題が発生しない。

【００２２】さらに、画像メモリー２５、２７の一方を
省略し、Ａ／Ｄコンバータ２１、２３と残りの画像メモ
リーとの間に割算回路、判別回路、加算回路等を設け、
画像メモリーに入力する画像信号として蛍光強度のデー
タに蛍光色素の識別ビットを付加してもよい。識別され
た蛍光色素の発光色に応じて疑似カラーを着けて提示す
れば、肉眼で観察したものとかわらない画像を再現する
ことができる。

【００２３】また、３つ以上の光検出器を準備してもよ
い。３の光検出器を設けた場合、検出されるべきスペク
トル波長域における各光検出器の総合分光感度特性を図
４のようなものとすることができる。各光検出器からの
３つの電気信号を比較することで、蛍光色素の種類検出
の確度をより高くすることができる。

【００２４】

【発明の効果】以上のように、本発明のレーザ走査型蛍
光顕微鏡によれば、第１及び第２の光検出器の総合分光
感度特性がそれぞれ単調増加及び単調減少しているので
、各光検出器からの電気信号の強度比に基づいて発光波
長を特定することができ、さらには蛍光色素の種類を特
定することができる。よって、多種類の蛍光色素を含む
試料からの発光画像を、時間的ずれなく高いＳ／Ｎ比で
、蛍光色素ごとに判別することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例のレーザ走査型蛍光顕微鏡の光学系の構
成図である。

【図２】実施例のレーザ走査型蛍光顕微鏡の制御系の構
成図である。

【図３】図１及び図２の光検出噐の総合分光感度特性と
、試料作成に用いた蛍光色素の蛍光強度分布との関係を
示した図である。

【図４】３つの光検出噐を用いた場合の総合分光感度特
性を示した図である。

【図５】蛍光色素の一般的な蛍光強度分布を示した図で
ある。

【図６】多種類の蛍光色素により標識した試料の蛍光発
光像を個別に検出するための従来装置をしめす。

【図７】蛍光発光像を検出するための別の従来装置をし
めす。

【符号の説明】

２、３…走査手段１０、１３、１４、１５、１６、１７…光検出手段２１
、２３、２５、２７、３０…制御手段１７…第１の光検
出器１５…第２の光検出器１３…光学手段３０…判別手段

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】集光された光スポットを試料上で走査する
走査手段と、試料から発生した蛍光を検出し電気信号に
変換する光検出手段と、前記走査手段に同期して前記光
検出手段からの電気信号を読み出す制御手段とを備える
レーザ走査型蛍光顕微鏡であって、前記光検出手段は、
総合分光感度特性が所定のスペクトル波長域で単調増加
する第１の光検出器と、総合分光感度特性が前記所定の
スペクトル波長域で単調減少する第２の光検出器と、試
料からの蛍光を前記第１及び第２の光検出器に個別に導
く光学手段とを含み、前記制御手段は、前記第１及び第
２の光検出器からの電気信号の強度比に基づいて、試料
からの蛍光がどの種類の蛍光色素によるものかを判別す
る判別手段を備えることを特徴とするレーザ走査型蛍光
顕微鏡。
【請求項２】　　前記走査手段は、光源からのレーザ光
束を偏向する偏向光装置と、該レーザ光束を試料上に光
スポットとして集光する対物レンズとを備えることを特
徴とする請求項１記載のレーザ走査型蛍光顕微鏡。
【請求項３】　　前記走査手段による前記光スポットの
走査情報と前記判別手段による蛍光色素の種類に関する
情報とに基づいて、試料中の蛍光色素の分布をその種類
ごとに２次元的に表示する表示装置をさらに備えること
を特徴とする請求項１記載のレーザ走査型蛍光顕微鏡。
【請求項４】　　前記光検出手段は、総合分光感度特性
が前記所定のスペクトル波長域よりも長波長側に隣接す
る別のスペクトル波長域で単調増加する第３の光検出器
を備え、前記第１の光検出器は、その総合分光感度特性
が前記別のスペクトル波長域で単調減少することを特徴
とする請求項１記載のレーザ走査型蛍光顕微鏡。