WO2010150468A1

WO2010150468A1 - 蛍光分析装置および蛍光検出装置

Info

Publication number: WO2010150468A1
Application number: PCT/JP2010/003729
Authority: WO
Inventors: 高橋智; 芳賀孝信; 曽根原剛志
Original assignee: 株式会社日立ハイテクノロジーズ
Priority date: 2009-06-25
Filing date: 2010-06-04
Publication date: 2010-12-29
Also published as: US8680484B2; JP5337676B2; JP2011027706A; US20120097864A1

Abstract

　基板の各反応領域に捕捉された蛍光体種を簡便に識別して検出する方法・装置、特に少ない画素数で、複数の蛍光体からの強度を識別して計測する方法・装置を提供する。　４種以上の複数の蛍光体からの蛍光強度を、少なくともそれぞれの蛍光極大波長帯ごとに異なる比率に分割する分離部と、異なる比率で分割された光をそれぞれ検出する画素を有する少なくとも１個の検出器と、により分割検出する。検出された同一箇所からの検出蛍光強度の比率から蛍光体の種類を判定し、蛍光強度を測定する。

Description

蛍光分析装置および蛍光検出装置

　本発明は、光分析装置に関し、例えば、ＤＮＡ，ＲＮＡ、又はタンパク質，細胞等の生体関連物質に光を照射して光分析する光計測・分析装置に関するものである。

　従来から、基板の表面に配置された物体に対して励起光を照射して物体の形状を観察する方法が提案されている。例えば、特許文献１には、励起光源から出力された励起光を透明な基板に照射し、その内部で励起光を全反射させることにより、基板表面にエバネセント波を生成し、基板上の試料によるエバネセント波の散乱光を検出する装置が記載されている。ただし、特許文献１に記載の装置では散乱光を分光していない。

　また、例えば、特許文献２には、エバネセント波で励起された試料成分からの蛍光及び散乱光を分光する装置が記載されている。ただし、特許文献２に記載の装置では試料成分が流路境界面に捕捉されていない。

　一方、基板表面に複数の生体分子を捕捉し、特許文献１と同様に基板表面の一定範囲にエバネセント波を生成し、そのエバネセント波によって励起された生体分子の発光を画像化する装置がある。基板上に非蛍光性の生体分子を捕捉し、蛍光性の分子を含む反応液を基板上に流入させ、生体分子捕捉位置からの蛍光を観測するものである。これにより、生体分子と反応液中の分子との結合反応を観察することができる。例えば、始めに基板に非修飾一本鎖のＤＮＡを捕捉し、塩基種ごとに異なる蛍光体で修飾された蛍光修飾塩基を含む反応液を導入し、一本鎖ＤＮＡに対して相補な塩基を結合させながら、分子捕捉位置からの蛍光を分光すれば、捕捉されたＤＮＡの配列を解読することが可能である。

　近年、非特許文献２にあるように、基板にＤＮＡなどを捕捉してその塩基配列を決定することが提案されている。基板表面にランダムに分析すべき試料ＤＮＡ断片を１分子ずつ捕捉し、ほぼ１塩基ずつ伸長させて、その結果を蛍光計測より検出することにより塩基配列を決定するものである。具体的には、ＤＮＡポリメラーゼの基質として鋳型ＤＮＡに取り込まれてＤＮＡ鎖伸長反応を保護基の存在により停止することができ、かつ検出され得る標識を持つ４種のｄＮＴＰの誘導体（ＭｄＮＴＰ）を用いてＤＮＡポリメラーゼ反応を行わせる工程、次いで取り込まれたＭｄＮＴＰを蛍光等で検出する工程、及びＭｄＮＴＰを伸長可能な状態に戻す工程を１サイクルとし、それを繰り返すことにより試料ＤＮＡの塩基配列を決定する。本技術では、ＤＮＡ断片を１分子ずつ配列決定することができるため、同時に数多くの断片を解析することができ、解析スループットを大きくすることができる。また、本方式では、単一ＤＮＡ分子毎に塩基配列が決定できる可能性があるため、従来技術の問題であったクローニングやＰＣＲ等での試料ＤＮＡを精製、増幅が不要にできる可能性があり、ゲノム解析や遺伝子診断の迅速化が期待できる。なお、本方法では、分析すべき試料ＤＮＡ断片分子が基板面にランダムに捕捉されるため、捕捉されたＤＮＡ断片分子数に対して数１００倍の画素数を有する高価なカメラが必要となる。つまり、ＤＮＡ断片分子同士の間隔が平均１マイクロメータになるように調整した場合、より大きな間隔同士の分子もいれば、より近接した間隔の分子同士も存在し、これらを互いに分離して検出するには、基板面に換算して、より細かな間隔で蛍光像を検出する必要がある。通常、数１０分の１の間隔で計測する必要がある。

　また、一方、非特許文献３および特許文献３では、全反射エバネッセント照射検出方式よりも励起光照射体積の一層の低減が可能となるナノ開口エバネッセント照射検出方式によって、蛍光検出の感度を更に向上させている。２枚のガラス基板，ガラス基板Ａとガラス基板Ｂを平行に配置し、ガラス基板Ａのガラス基板Ｂと対面する側の表面に、径５０ｎｍのナノ開口を有する膜厚約１００ｎｍの平面状のアルミニウム薄膜を積層する。アルミニウム薄膜は遮光性能を有している必要がある。２枚のガラス基板の中間に反応槽を構成し、反応槽に溶液を充填することによって、２枚のガラス基板の間に溶液層を形成する。反応槽には溶液の注入口と排出口があり、注入口から溶液を注入し、排出口から溶液を排出させることで、溶液をガラス基板およびアルミニウム薄膜と平行方向にフローさせることができる。これにより、溶液層の溶液を任意の組成に交換することが可能である。Ａｒイオンレーザから発振した波長４８８ｎｍの励起光を、ガラス基板Ｂと反対方向より、ガラス基板Ａに対して垂直に、対物レンズで絞って照射すると、ナノ開口内部の底平面近傍の溶液層に励起光のエバネッセント場が形成され、それ以上先の溶液層内部に励起光が伝播することはない。一方、蛍光発光は、前記対物レンズを用いて２次元ＣＣＤ上に結像することによって検出される。エバネッセント場では、励起光強度がナノ開口底平面から離れるに従って指数関数的に減衰し、ナノ開口底平面から３０ｎｍ程度の距離で励起光強度が１／１０となる。更に、ナノ開口エバネッセント照射検出方式では、全反射エバネッセント照射検出法と異なり、ガラス基板と平行方向の励起光照射幅が開口径すなわち５０ｎｍに限定されるため、励起光照射体積が一層低減される。このため、遊離の蛍光体の蛍光発光や水のラマン散乱を始めとする背景光を飛躍的に低減することが可能となる。その結果、より高濃度の遊離の蛍光体存在下で、対象とする生体分子に標識された蛍光体だけを選択的に検出することが可能となり、非常に高感度な蛍光検出を実現できる。本文献では、以上の蛍光検出方式をＤＮＡ分子の伸長反応によるｄＮＴＰの取り込み計測に応用している。

　以降では、試料成分捕捉面のように、エバネッセント場が開始される平面をエバネッセント場境界平面と呼ぶ。

特開平９－２５７８１３号公報特開２００５－７００３１号公報米国特許第６９１７７２６号公報

Nature Vol. 374, 555-559 (1995). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.100, pp3960, 2003 SCIENCE 2003, Vol.299, pp. 682-686. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.102, pp5932, 2005

　基板表面上に捕捉された生体分子の蛍光を画像化することにより生体分子を分析する装置においては、一般に基板上の個々の捕捉された領域（スポット）ごとに異なる種類の生体分子を捕捉し、各スポットからの蛍光を画像化によって分離して検出する。できる限り短時間で多数種の生体分子を分析し、また、消費される試薬量を低減するには、スポットは光学的に分解可能な範囲でできる限り基板上に高密度に生体分子を捕捉するのが好ましい。また、１スポットあたりの試薬消費量を低減するためには、１スポット内に捕捉する生体分子数は少ないほど好都合であり、１分子が理想的である。非特許文献１に記載されているように、蛍光検出法は１分子をも検出する感度を有しているけれども、少数分子からの蛍光を分光検出して良好なＳ／Ｎを得るには、損失の少ない分光イメージング法が好ましい。したがって、プリズムや回折格子などの分散素子による分散分光イメージング法、もしくはダイクロイックミラーで分光して複数のイメージセンサで画像を取得する方法（ダイクロ／マルチセンサ分光イメージング法）が好ましい。また、蛍光体からの発光が同時に行われないか、または同時に測光する必要がない場合は、非特許文献２に記載されているように、蛍光体専用の透過フィルタを使い、逐次的にフィルタを交換，測光を繰り返してもよい。

　上記複数のスポットは光学的に分解可能な範囲でできる限り基板上に高密度に配置するのが好ましいが、ダイクロ／マルチセンサ分光イメージング法では、使用する蛍光標識物の種類の数だけイメージセンサが必要になるため、検出装置のコストが高くなるという問題がある。また、蛍光像を通常のダイクロイックミラーなどで分割するため、Ｓ／Ｎが必ずしも大きくならない場合も多い。分光フィルタを逐次的に変更して測光する場合は、イメージセンサが１個で済むが、フィルタを変更する機構部が必要で、機械的な故障の可能性が大きくなるとともに、装置コスト高につながる。また、フィルタの変更に要する時間が比較的長いため、早い反応に基づく蛍光変化に対応できず、同時測定が１波長帯であるため同時に異なる蛍光波長の光を検出することができないという課題がある。分散分光イメージング法にすれば、最小限の（たとえば１個）のイメージセンサで検出できるというメリットがあるが、スポット同士の間隔が狭くなると、スポットから発する蛍光を波長分散させたときの蛍光像が近接する別のスポットの蛍光像と重なってしまい、蛍光識別精度が低下する。そのため蛍光検出精度を向上させるには、基板上に生体分子を捕捉したスポット同士の間隔を広くしなければならなくなり、高密度化しにくいという問題があった。

　また従来の光学系においては、生体分子が基板上にランダムに捕捉された場合、基板上のスポット数に対して、数１００倍以上の画素数が必要であり、検出速度が低下すると共に、高価な２次元センサが必要になるという問題点があった。さらに、また、より高解像度で蛍光像を検出しなければならないため、開口数ＮＡの大きな集光レンズを使う必要があり、高価な系になるという問題点があった。

　本発明の目的は、少ない画素数で、複数の蛍光体からの強度を識別して計測する装置に関する。また、例えば基板上に捕捉するＤＮＡ断片の分子からの蛍光像を２次元センサにて蛍光検出する際、安価に、または操作性の良い検出方法を提供することに関する。

　オリゴヌクレオチド等の生体関連分子が捕捉される基板に蛍光測定用の光を照射し、生じる蛍光を集光し、２次元検出器に結像させ、２次元検出器にて蛍光検出する装置であって、生体関連分子が捕捉されうる領域が複数設けられた基板と、該分子は、複数種の蛍光体または色素等により検出可能なように個別または同時に標識され、光励起用の光源と、照射光学系と蛍光集光系と、集光した光を指定の波長範囲において、特定の波長ごとに実質的に異なる比率で分割する分割部と、分割された光を複数の検出画素を有する検出器で検出し、分割された対応する画像位置の強度の比率を算定し、該比率から複数種の蛍光体を識別するデータ処理手段とを具備するものである。

　本発明により、試料基板からの蛍光像測定で、複数の蛍光体の強度を算出するのに、従来同じ数の検出器を要していたものが、蛍光体の種類よりも少ない検出器で可能になり、効率よく検出することができる。特に、１個の検出器で３種類，４種類、それ以上の蛍光体を識別し、蛍光強度を測定することができ、総合的に安価にシステムを構築することが可能になる。

　また、プリズム，回折格子などを使った分散方式の場合、分散させた蛍光を多数の検出画素にて検出する必要があり、また近接する他の部分の蛍光像と重ならないようにするため、ひとつの捕捉領域からの蛍光を検出するのに、十分大きな画素数を検出器内に確保する必要があるが、本発明では、分散させる必要がなく、近接するほかの部分との重なりの影響が少なくなる。そのため、オリゴヌクレオチド等の捕捉された領域の間隔を狭くすることができ、より多くの試料からの蛍光を同時に解析することが可能になる。高密度に配置された基板が使用でき、試料解析の高スループット化とシステムの簡便化を同時に実現できる。

　また、例えば、測定すべきオリゴヌクレオチドが捕捉された領域数が同じ場合、少ない画素数で、効率よく検出でき、２次元センサの価格を安価することができるようになる。また、光学分解能をオリゴヌクレオチドが捕捉される領域同士の間隔程度にすることができるため、大きな開口数の集光レンズを使う必要が無くなり、安価なレンズを使用することができ、液浸レンズも使う必要が無いので、操作性が向上できる。

本発明の第１の実施例の蛍光分析方法を使った蛍光検出装置の構成図。第１の実施例での基板の構造図。第１の実施例でのフィルタ，ミラーの特性図。第１の実施例での各蛍光体からの蛍光検出の説明図。第１の実施例での蛍光体ごとの蛍光強度比算定結果の説明図。第１の実施例での別のダイクロイックミラーの別の例（模式図）。本発明の第２の実施例の蛍光検出装置の構成図。本発明の第４の実施例の蛍光検出装置の構成図（蛍光分離部）。本発明の第４の実施例で使用するダイクロイックミラーの特性図（模式図）。本発明の第５の実施例の基板とエバネッセント照明のためのプリズムとの接合部の構造図。本発明の第５の実施例の基板とエバネッセント照明のためのプリズムとの接合部の構造図。本発明の第５の実施例の基板とエバネッセント照明のためのプリズムとの接合部の構造図。本発明の第６の実施例の基板の構造図。本発明の第７の実施例の蛍光検出装置の構成図。本発明の第７の実施例の蛍光体の特性とダイクロイックミラーの特性図。本発明の第７の実施例の蛍光検出装置の画像取得の説明模式図。本発明の第７の実施例の各輝点の蛍光強度比算定結果の一例。本発明の第８の実施例の別の画像分割検出方式の説明模式図。本発明の第９の実施例の各輝点の蛍光強度測定・配列決定の模式図。本発明の第１１の実施例の（Ａ）励起用レーザの波長と蛍光体の励起スペクトルおよび（Ｂ）蛍光スペクトル特性図。本発明の第１１の実施例で使用するダイクロイックミラーの特性図（模式図）。本発明の第１１の実施例の（Ａ）ダイクロイックミラー透過および反射後の蛍光体の蛍光スペクトルと（Ｂ）蛍光体の蛍光強度比算定結果の説明図。本発明の第１２の実施例のＦＲＥＴ効率と各蛍光体の強度比の関係の算定結果の説明図。本発明の第１２の実施例の（Ａ）蛍光検出装置の構成図と（Ｂ）使用するダイクロイックミラーの特性図（模式図）。本発明の第１２の図２４の構成とダイクロイックミラーを用いたときに予想されるＦＲＥＴ効率と各蛍光体の強度比の関係の算定結果説明図。本発明の第１３の実施例で使用するダイクロイックミラーの特性図（模式図）と（Ｂ）予想されるＦＲＥＴ効率と各蛍光体の強度比の関係の算定結果説明図と（Ｃ）ＦＲＥＴ効率５０％における強度比算定結果の説明図。本発明の第１４の実施例の蛍光検出装置の構成図。本発明の第１５の実施例の（Ａ）蛍光体の蛍光スペクトルとロングパスフィルタの特性図（模式図）と（Ｂ）予想されるＦＲＥＴ効率と各蛍光体の強度比の関係の算定結果説明図。（Ａ）（Ｂ）本発明の第１５の実施例のロングパスフィルタの別の例と蛍光スペクトルの特性図（模式図）。本発明の第１５の実施例のダイクロイックミラーの別の例と蛍光スペクトルの特性図（模式図）。（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）本発明の第１５の実施例の別の蛍光体の例の蛍光スペクトルの特性図とロングパスフィルタとダイクロイックミラーの特性図（模式図）。

　以下、本発明を実施の形態例により説明するが、本発明は本例に限定されるものではない。

　基板表面に分析すべき試料ＤＮＡ断片を１分子ずつ均等間隔で捕捉し、ほぼ１塩基ずつ伸長させて、取り込まれた蛍光標識を１分子ごと検出して塩基配列を決定する装置，方法について説明する。具体的には、ＤＮＡポリメラーゼの基質として鋳型ＤＮＡに取り込まれてＤＮＡ鎖伸長反応を保護基の存在により停止することができかつ検出され得る標識を持つ４種のｄＮＴＰの誘導体を用いてＤＮＡポリメラーゼ反応を行わせる工程、次いで取り込まれたｄＮＴＰ誘導体を蛍光検出等で検出する工程、及びｄＮＴＰ誘導体を伸長可能な状態に戻す工程を１サイクルとし、それを繰り返すことにより試料ＤＮＡの塩基配列を決定する。なお、本操作は単分子蛍光検出を行うため、測定はＨＥＰＡフィルタなどを介したクリーンルーム様の環境にて行うのが望ましい。

　（装置構成）
　図１は、本発明の蛍光分析方法を使ったＤＮＡ検査装置の構成図である。装置は顕微鏡に類似する装置の構成であり、基板８に捕捉するＤＮＡ分子の伸長状態を蛍光検出にて測定する。

　基板８は、図２に示すような構造をしている。基板８は少なくともその一部が透明材質でできており、材質としては合成石英などが使用できる。基板８には反応領域８ａがあり、この部分は透明材質であり、この部分に試薬などが接触する。反応領域８ａ内にＤＮＡが捕捉される領域８ｉｊが複数形成されている。領域８ｉｊの個々の大きさは直径１００ｎｍ以下である。この領域にはＤＮＡを捕捉するための表面処理を施す。その表面処理は、例えば、ストレプトアビジンを結合させておき、ビオチン化ＤＮＡ断片を反応させることで、捕捉する。また、ポリＴのオリゴヌクレオチドを捕捉しておき、ＤＮＡ断片の一端をポリＡ化処理して、ハイブリダイゼーション反応にて捕捉することもできる。この際、ＤＮＡ断片濃度を適当に調製することで、個々の領域８ｉｊに単一分子のＤＮＡのみが入るようにすることができる。なお、領域８ｉｊをより小さくしていくことで、領域内に捕捉できる分子が１個になるようにすることができる。以後このような状態の基板を計測する。このような基板では、すべての領域８ｉｊに単一分子のＤＮＡが捕捉されている場合、領域８ｉｊの一部のみＤＮＡが捕捉されている場合がある。一部のみＤＮＡが捕捉されている場合は、残りの領域８ｉｊには捕捉されておらず、空きの状態となる。なお、領域８ｉｊ同士の間隔ｄｘは２マイクロメータ、間隔ｄｙは２マイクロメータとする。領域８ｉｊはこのように、格子構造（２次元の格子構造）を形成し、その格子点の位置に領域８ｉｊが配置される。このような、均等間隔の基板の作成法は、例えば、特開２００２－２１４１４２号公報に記載の手法などで、作成する。なお、ｄｘ，ｄｙは領域８ｉｊの個々の大きさより大きく、０.２～１０マイクロメータ以下、さらには０.５～６マイクロメータ程度が好ましい。なお、格子構造は正方格子構造，長方格子構造，三角格子構造などにしてもよい。基板の反応領域８ａは１mm×１mmの大きさとする。反応領域８ａの大きさは、それより大きくても可であるし、０.５mm×０.５mmの大きさのものを一定間隔で、１次元または２次元に複数個並べたようなものでもよいし、長方形，丸型，三角形，六角形の形状などでもよい。なお、領域８ｉｊには金属構造体を配置してもよい。金属構造体は半導体プロセスにて作成することもできる。電子線描画，光リソグラフィー，ドライエッチング，ウェットエッチングなどの手法にて作製できる。金属構造体は、金，銀，アルミ，クロム，チタン，タングステン，白金等で、励起光の波長以下の大きさを有する形状であり、直方体，円錐，円柱，三角柱，一部が突起状のものを有する構造、あるいは、これらを２個または複数個近接して並べた構造など、また金属微粒子なども使用可能である。たとえば、直径１０ｎｍから１００ｎｍ程度の大きさの金の膜状のドットを上記ｄｘ，ｄｙの間隔、たとえば、１×１，１×２，１×３，２×３，２×４，３×５，３×６（マイクロメータ×マイクロメータ）などの間隔の格子上に構築できる。直径２０ｎｍ程度のドットに、大きさ２０ｎｍ程度の蛋白や蛍光物質，リンカーをその上部に捕捉すれば、確率的にその大きさからドットあたり１分子を捕捉し、格子状に単一分子を配置することが可能になる。また、周知の手法でドットに選択的なリンカーを結合させ、それにオリゴヌクレオチド，たんぱく質などを捕捉することで、ドットに目的の分子を捕捉することが可能であり、これを使うことができる。

　ｄＮＴＰの蛍光標識として種々の蛍光体を使うことができる。たとえば、Ｂｏｄｉｐｙ－ＦＬ－５１０，Ｒ６Ｇ，ＲＯＸ，Ｂｏｄｉｐｙ－６５０を使用し、これらそれぞれ異なる４種の蛍光体で標識された３′末端がアリル基で修飾された４種のｄＮＴＰ（３′－Ｏ－ａｌｌｙｌ－ｄＧＴＰ－ＰＣ－Ｂｏｄｉｐｙ－ＦＬ－５１０，３′－Ｏ－ａｌｌｙｌ－ｄＴＴＰ－ＰＣ－Ｒ６Ｇ，３′－Ｏ－ａｌｌｙｌ－ｄＡＴＰ－ＰＣ－ＲＯＸ，３′－Ｏ－ａｌｌｙｌ－ｄＣＴＰ－ＰＣ－Ｂｏｄｉｐｙ－６５０）を使用する。これ以外の蛍光体で修飾したｄＮＴＰを使用することもできる。

　蛍光励起用のレーザ装置１０１ａ（Ａｒレーザ、４８８ｎｍ：Ｂｏｄｉｐｙ－ＦＬ－５１０，Ｒ６Ｇ励起用）からのレーザ光をλ／４波長板１０２ａを通して円偏光とする。蛍光励起用のレーザ装置１０１ｂ（Ｈｅ－Ｎｅレーザ、５９４.１ｎｍ：ＲＯＸ，Ｂｏｄｉｐｙ－６５０励起用）からのレーザ光をλ／４波長板１０２ｂを通して円偏光とする。両レーザ光をミラー１０４ｂとダイクロイックミラー１０４ａ（５２０ｎｍ以下を反射）で重ね合わせ、ミラー５を介して全反射照明用の石英製プリズム７に図のように入射面に垂直に入射し、ＤＮＡ分子を捕捉する基板８の裏側から照射する。石英製プリズム７と基板８はマッチングオイル（無蛍光グリセリン等）を介して接触させており、レーザ光はその界面で反射することなく、基板８に導入される。基板８表面は反応液（水）で覆われており、その界面にてレーザ光は全反射し、エバネッセント照明となる。これにより、高いＳ／Ｎで蛍光測定が可能になる。

　なお、基板の近傍には、温調器が配置されているが、図では省略した。また、通常観察のため、プリズム下部よりハロゲン照明，ＬＥＤ照明ができる構造としているが、図ではこれを省略している。

　また、レーザ装置１０１ａ，１０１ｂとは別にレーザ装置１００（ＹＡＧレーザ、３５５ｎｍ）を配置し、ダイクロイックミラー１０３（４００ｎｍ以下を反射）でレーザ装置１０１ａ，１０１ｂのレーザ光と重ね合わせ同軸にして照射できるようにする。本レーザは、取り込まれたｄＮＴＰ誘導体の蛍光検出後、ｄＮＴＰ誘導体を伸長可能な状態に戻す工程に使用するものである。

　基板８の上部には、試薬などを流し、反応させるためのフローチャンバ９が構成されている。チャンバには試薬導入口１２があり、分注ノズル２６を有する分注ユニット２５，試薬保管ユニット２７，チップボックス２８により、目的の試薬液の注入などを行う。試薬保管ユニット２７には、試料液容器２７ａ，ｄＮＴＰ誘導体溶液容器２７ｂ，２７ｃ，２７ｄ，２７ｅ（２７ｃ，ｄ，ｅは予備）及び洗浄液容器２７ｆ等が用意される。チップボックス２８内の分注チップを分注ノズル２６に取り付け、適当な試薬液を吸引し、チャンバ導入口から基板の反応領域に導入し、反応させる。廃液は廃液チューブ１０を介して廃液容器１１に排出される。これらは制御ＰＣ２１により自動的に行われる。

　フローチャンバは光軸方向に透明材で形成され、蛍光検出される。蛍光１３は、自動ピントあわせ装置２９で制御される集光レンズ（対物レンズ）１４で集められ、フィルタユニット１５で必要な波長の蛍光を取り出し、不必要な波長の光を除去するフィルタユニット１５を透過する蛍光はダイクロイックミラー３２により、波長ごとに異なる比率で分割された光束に分離される。分離された光束をそれぞれ、補助フィルタ１７ａ，１７ｂを通し、その像を結像レンズ１８ａ，１８ｂで、２次元センサカメラ１９ａ，１９ｂ（高感度冷却２次元ＣＣＤカメラ）に結像させ、検出する。カメラの露光時間の設定，蛍光画像の取り込みタイミングなどの制御は、２次元センサカメラコントローラ２０ａ，２０ｂを介して制御ＰＣ２１が行う。なお、フィルタユニット１５には、レーザ光除去用のノッチフィルタ２種（４８８ｎｍ，５９４.１ｎｍ）、検出する波長帯を透過させるバンドパス干渉フィルタ（透過帯域：５１０－７００ｎｍ）を組み合わせて用いる。レーザ光除去用のノッチフィルタの概略特性を図３（Ａ）に、バンドパス干渉フィルタ（及び補助フィルタ１７ａ，１７ｂ）を図３（Ｂ）に、ダイクロイックミラー３２を図３（Ｃ）に示す。

　なお、装置は、調整などのため、透過光観察用鏡筒１６とＴＶカメラ２３とモニタ２４を備えており、ハロゲン照明などで基板８の状態をリアルタイムで観察できるようになっている。

　図２にあるように、基板８には位置きめマーカ３０，３１が刻印されている。マーカ３０，３１は領域８ｉｊの並びと平行に配置され、その間隔が規定されている。そこで、透過照明での観測でマーカを検出することで、領域８ｉｊの位置を計算することができる。

　本実施例で使用する２次元センサカメラとして、ＣＣＤエリアセンサを使用する。種々の画素サイズ，画素数のＣＣＤエリアセンサを使うことができる。たとえば、画素サイズが７.４×７.４マイクロメータで、画素数２０４８×２０４８画素の冷却ＣＣＤカメラを使用する。なお、２次元センサカメラとしては、ＣＣＤエリアセンサの他、Ｃ－ＭＯＳエリアセンサなどの撮像カメラなどを一般に使うことができる。ＣＣＤエリアセンサにも、構造によって、背面照射型，正面照射型があり、どちらも使用できる。また、素子内部に信号の増倍機能を有する電子増倍型ＣＣＤカメラなども高感度化を図る上で有効である。また、センサは冷却型が望ましく、－２０℃程度以下にすることで、センサの持つダークノイズを低減でき、測定の精度を高めることができる。

　反応領域８ａからの蛍光像を一度に検出してもいいし、分割することもできる。この場合、基板の位置を移動させるためのＸ－Ｙ移動機構部をステージ下部に配置し、制御ＰＣで照射位置への移動，光照射，蛍光像検出を制御する。本例ではＸ－Ｙ移動機構部は図示していない。

　（反応の工程）
　段階的伸長反応の工程を以下に示す。反応工程は非特許文献２および非特許文献４を参考に行った。ストレプトアビジンを加えたバッファを導入口１２よりチャンバに導入し、ストレプトアビジンを金属構造体に捕捉されているビオチンに結合させ、ビオチン－アビジン複合体を形成させる。ターゲットであるビオチン修飾一本鎖鋳型ＤＮＡにプライマをハイブリさせ、前記鋳型ＤＮＡ－プライマ複合体と大過剰のビオチンを加えたバッファをチャンバへ導入し、ビオチン－アビジン結合を介して、単分子の前記鋳型ＤＮＡ－プライマ複合体を格子点に配置された金属構造体に捕捉する。捕捉反応後に、余剰な鋳型ＤＮＡ－プライマ複合体およびビオチンを洗浄用バッファにてチャンバより洗い流す。次に、それぞれ異なる４種の蛍光体で標識された３′末端がアリル基で修飾された４種のｄＮＴＰ（３′－Ｏ－ａｌｌｙｌ－ｄＧＴＰ－ＰＣ－Ｂｏｄｉｐｙ－ＦＬ－５１０，３′－Ｏ－ａｌｌｙｌ－ｄＴＴＰ－ＰＣ－Ｒ６Ｇ，３′－Ｏ－ａｌｌｙｌ－ｄＡＴＰ－ＰＣ－ＲＯＸ，３′－Ｏ－ａｌｌｙｌ－ｄＣＴＰ－ＰＣ－Ｂｏｄｉｐｙ－６５０）およびThermo Sequenaseポリメラーゼを加えたThermo Sequenase Reactionバッファを導入口１２よりチャンバへ導入し、伸長反応を行う。鋳型ＤＮＡ－プライマ複合体に取り込まれたｄＮＴＰは、３′末端はアリル基で修飾されているため、前記鋳型ＤＮＡ－プライマ複合体に１塩基以上取り込まれることはない。伸長反応後、未反応の各種ｄＮＴＰおよびポリメラーゼを洗浄用バッファで洗い流し、Ａｒレーザ光源１０１ａ，Ｈｅ－Ｎｅレーザ光源１０１ｂのそれぞれの光源から発振するレーザ光を同時にチップに照射する。レーザ照射により鋳型ＤＮＡ－プライマ複合体に取り込まれたｄＮＴＰに標識された蛍光体を励起し、そこから発する蛍光を検出する。鋳型ＤＮＡ－プライマ複合体に取り込まれたｄＮＴＰに標識された蛍光体の蛍光波長を特定することにより、前記ｄＮＴＰの塩基種を特定できる。なお、エバネッセント照射であり、反応領域表面近傍のみが励起光照射領域となるため、前記表面以外の領域に存在する蛍光体を励起することは無く、背景光の少ない測定ができる。そのため、上記では、伸長反応後洗浄しているが、蛍光標識ｄＮＴＰ濃度が小さい場合、洗浄不要で測定が可能になる場合もある。

　次に、ＹＡＧレーザ光源１００より発振するレーザ光をチップへ照射し、前記複合体に取り込まれたｄＮＴＰに標識された蛍光体を光切断により取り除く。次いで、パラジウムを含んだ溶液を流路内に導入し、パラジウム触媒反応により、前記複合体に取り込まれたｄＮＴＰの３′末端のアリル基を水酸基に変える。前記３′末端のアリル基を水酸基に変えることにより、前記鋳型ＤＮＡ－プライマ複合体の伸長反応が再開可能となる。前記触媒反応後に、洗浄用バッファにてチャンバを洗浄する。これを繰り返すことにより、捕捉された一本鎖鋳型ＤＮＡの配列を決定する。

　本システムでは、反応領域８ａの複数の領域８ｉｊからの発光を同時計測できるため、領域８ｉｊにそれぞれ異なる鋳型ＤＮＡを捕捉する場合、前記複数の異なる鋳型ＤＮＡ－プライマ複合体に取り込まれたｄＮＴＰの塩基種を、つまり複数の鋳型ＤＮＡの配列を同時に決定できる。

　（蛍光検出と蛍光体識別）
　基板上に捕捉された上記蛍光体の蛍光を検出して蛍光体の種類つまりは塩基の種類を識別して強度を測定する方式について説明する。

　図１では、ＣＣＤカメラ１９ａ，１９ｂへの結像倍率を１４.８倍とし、ＤＮＡが捕捉されるべき複数の領域８ｉｊ（格子点）を蛍光計測する。この場合、ｄｘ＝２マイクロメータの距離を４分割してＣＣＤ画素で検出する。

　例えば、分散素子を使って波長分散させる場合、格子点の最も近接する間隔は２マイクロメータであり、蛍光発光波長範囲である５００－７００ｎｍを、その範囲に分散させると、１画素あたり５０ｎｍとなる。４種の蛍光体の各蛍光極大波長は約５１０ｎｍ，約５５０ｎｍ，約６１０ｎｍ，約６５０ｎｍであるため、上記画素では蛍光が重なってしまい、区別して識別することは困難である。さらに、実際の結像画像では、個々の領域８ｉｊは１画素に収まらず、数画素にわたって結像され、重なりがより大きくなるので、識別がさらに困難になる。

　本実施例では、蛍光体分子が捕捉されたドットの像，蛍光体分子個々に存在する位置からの発光像，個々の蛍光発光点の像を分散させることなく結像させるので、そのような制約はなくなる。図４に各蛍光体からの蛍光検出の概要を図示する。図４（Ａ）は、各蛍光体の蛍光発光スペクトルを、図４（Ｂ）は、本実施例のフィルタユニット１５，ダイクロイックミラー３２，補助フィルタ１７ａ，１７ｂの通過後の、２次元ＣＣＤカメラ１９ａ，１９ｂに到達する各蛍光体の蛍光スペクトル成分である。図のように、各蛍光体の蛍光成分が、２次元ＣＣＤカメラ１９ａ，１９ｂにそれぞれ異なる比率で到達することになる。２次元ＣＣＤカメラでは波長方向の情報はなく、輝点の輝度情報のみが得られる。具体的には図４（Ｂ）に示すスペクトルの積分値が検出光強度として算出される。その結果、図５に示すような２次元ＣＣＤカメラ１９ａ，１９ｂで検出される光強度となり、蛍光体ごとにその比率が異なる。この比率から蛍光体の種類が識別でき、蛍光体の強度つまり蛍光体が捕捉されたドットからの蛍光強度は両ＣＣＤカメラの相当する輝点の強度の合計値として算出される。このように、波長ごとに異なる比率で分割するダイクロイックミラーを使用し、ひとつの輝点の蛍光強度を分割し、それらを異なる画素にて検出することで、４種の蛍光体を識別し、蛍光検出することができる。制御ＰＣ２１では、各ＣＣＤカメラの画像から、領域８ｉｊからの蛍光輝点を抽出し、その強度の比を算定し、蛍光輝点がどの蛍光体の蛍光なのかを判定することで、塩基の種類が識別でき、配列解析ができる。

　なお、使用できる蛍光体は本実施例に示すものに限らず、所定の励起光をつかい、異なる蛍光特性を有する蛍光体の組み合わせであれば同様に使用できる。一般には、蛍光極大波長が各々異なる種類の組み合わせであればよい。

　また、２次元ＣＣＤカメラは２つである必要はなく、１個でもよい。この場合は分割された像を同じ２次元ＣＣＤカメラに結像させる際、画像を横にずらすなどして位置が異なるようにすればよい。

　本例では、４種の蛍光体であるが、３種でも、また５種，６種以上の組み合わせも可能である。

　本例では、ダイクロイックミラー３２として、指定の波長範囲において、透過率が、実質的にほぼ０からほぼ１００％までのほぼ線形的な特性を有する２色性ミラーを使用するが、ほぼ１０からほぼ８０％までのほぼ線形的な特性であってもよい。また使用する複数の蛍光体の各蛍光極大波長ごとに透過率・反射率が異なる特性の分割ミラーであってもよい。たとえば、蛍光極大波長ごとに階段状に変化する特性のミラー（図６に模式的に図示）でも同様に可能である。対象とする複数の蛍光体の蛍光極大波長または最大ピークを示す波長ごとに異なる比率に分割できる効能を有していればよい。

　なお、蛍光測定では、背景光が存在するが、上記では、背景光成分を差し引いた信号成分での説明である。

　また、石英製プリズム７に対してレーザ光をその入射面に垂直つまり入射角度０度で入射している。これにより、基板とプリズムを一体化して移動させても、対物レンズ観察視野からレーザ照射位置がずれないため、基板とプリズムを一体化することができ、プリズムと基板とのカップリング方式を種々選ぶことが可能になる。オイルカップリングのほか、光学接着も可能になり、装置構成を容易に選ぶことができる。

　なお、本実施例では、基板の各々の反応領域に結合している蛍光分子が１分子であり、複数の異なる蛍光分子が同じ位置にいないため、本発明のような装置及び方法で効率よく蛍光体種つまりは塩基種が識別でき、しかも高密度な基板に対応できる。

　本実施例によれば、複数の測定対象物を精密配置し、複数の検出画素を備えた複数の検出器の特定画素に各測定対象物をそれぞれ結像させ、検出器ごとの強度比を測定することで、より多い種類の蛍光体を識別し、その蛍光強度を算定することができる。特に検出器である２次元ＣＣＤカメラを１台または２台で、標識物である蛍光体３種、または４種以上を識別検出することができる。これにより、装置コストを抑えることができる。１分子ごとに検出することもできる。

　なお、本実施例では、検出する波長帯域が５００－７００ｎｍであるが、これに制限されることはない。使用する蛍光体の波長帯域に応じて、波長範囲４００－６００ｎｍ，４００－７００ｎｍ，６００－８５０ｎｍなどの範囲など任意に対応できる。たとえばＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ６３５，Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ６６０，Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ７００，Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ７５０の蛍光体を使用する場合は、蛍光発光波長範囲が６３０－８２０ｎｍであり、ダイクロイックミラーの指定波長域を６５０－７８０ｎｍとする。通常、指定波長域の範囲は、４００－９００ｎｍである。なお、ダイクロイックミラーの特性は、使用する蛍光体種の中で、一番短い蛍光極大波長を有する蛍光体種の蛍光極大波長付近から、一番長い蛍光極大波長を有する蛍光体種の蛍光極大波長付近までの範囲で調整すればよい。厳密に蛍光極大波長間とする必要はない。蛍光体種ごとの蛍光極大波長付近でそれぞれ異なる比率に分割できればよい。また、特定の蛍光体を受光するときの蛍光強度比が、ほかの蛍光体の蛍光強度比と異なることで、複数の蛍光体を識別することができる。

　実施例では、オリゴヌクレオチド等の生体関連分子が捕捉される基板に蛍光測定用の光を照射し、生じる蛍光を集光し、２次元検出器に結像させ、２次元検出器にて蛍光検出する。基板は実質的に透明な基板であり、分子が捕捉されうる領域が複数設けられ、それらが格子構造の格子点位置に配置されている。該基板上で必要な試薬や試料などを反応させ、全反射照明のための光励起用の光源と、照射光学系により該基板上の蛍光体を励起し、発する蛍光を蛍光集光系で集光し、その光束を指定の波長範囲において実質的に各々の波長で異なる比率で分割する分光部により分割し、結像光学系で各々検出器に結像し、複数の検出画素を備えた検出器により検出する。さらにデータ処理部では、分割された蛍光像の相対応する輝点の強度を算定し、その強度比から蛍光体種を判定する。これにより、簡便に多種の蛍光体種を識別検出することができる。

　実施例では、基板に金属構造物を形成している。この場合、構造物の光ルミネセンス，光散乱を検出することで、構造物の空間位置を検出することができ、位置の基準マーカとして活用でき、効果的である。

　格子点位置の領域（スポット，格子点の領域）の大きさは１００ｎｍ径以下にする。少なくとも、隣接する最短の格子点の間隔の１／３以下が好ましい。これにより、光学的に解像しやすくなり、識別が容易になる。格子点位置の捕捉のための領域を１０ｎｍ～３０ｎｍ程度にすれば、単一分子の捕捉に有効である。

　また、本例では、一定間隔の格子状に捕捉領域を配置する基板を使用する。格子状に配置することで、透過像と反射像内の相対応する輝点の識別が容易になる。格子状に捕捉領域を配置する基板を使わない場合にも対応する。分子をランダムに分散させて捕捉する場合など、捕捉位置が、ランダムに分散する場合は、両方の画像を比較し、パターン解析し、または基準マーカを参照して、相対応する輝点を判定すればよい、これによっても同様の効果が得られる。

　また、本例では、一定間隔の格子状に配置した捕捉領域間隔を４画素×４画素で結像している。発光点の大きさは３画素×３画素以内に結像され、強度を算定できる。つまり、各領域からの蛍光をダイクロイックミラーによる反射光像と透過光像に分け、それぞれ３×３画素以内にて結像しており、３×３×２＝１８画素以内にて個々の領域にある蛍光体種を判定することができる。分子をランダムに分散させて捕捉する場合も、個々の分子を１８画素以下にて識別することができる。これにより、高密度に捕捉した分子を高効率で検出識別することができる。発光点を４画素×４画素で強度算定してもよい。

　また、上記はＣＣＤの画素数を１発光輝点あたり４×４画素としているが、５×５画素，５×４画素，４×３，３×３画素などに調整することが可能である。これらの画素数で検出しても高密度に捕捉した分子を高効率で検出識別することができる。

　図７は本発明の第２の実施例の構成を示す。本実施例では、４種の蛍光体を用いた段階的伸長反応によるＤＮＡシーケンシングを行う。全体の構成等は図１と同等である。

　ｄＮＴＰの蛍光標識としてＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ４８８，Ｃｙ３，Ｃｙ５，Ｃｙ５.５を用いる。蛍光体は、ほかの種々の蛍光体を使用することも可能である。また、１蛍光体で標識された４種のｄＮＴＰを使うことも可能である。蛍光励起用のレーザ装置１０１ｃ（固体レーザ、５０５ｎｍ：Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ４８８，Ｃｙ３励起用）からのレーザ光をλ／４波長板１０２ｃを通して円偏光とする。蛍光励起用のレーザ装置１０１ｄ（半導体レーザ、６３５ｎｍ：Ｃｙ５，Ｃｙ５.５励起用）からのレーザ光をλ／４波長板１０２ｄを通して円偏光とする。両レーザ光をミラー１０４ｄとダイクロイックミラー１０４ｃ（５２０ｎｍ以下を反射）で重ね合わせ、ミラー５を介して全反射照明用の石英製プリズム７に図のように入射面に垂直に入射し、ＤＮＡ分子を捕捉する基板８の裏側から照射する。石英製プリズム７と基板８はマッチングオイル（無蛍光グリセリン等）を介して接触させており、レーザ光はその界面で反射することなく、基板８に導入される。基板８表面は反応液（水）で覆われており、その界面にてレーザ光は全反射し、エバネッセント照明となる。これにより、高いＳ／Ｎで蛍光測定が可能になる。

　本実施例では、フィルタユニット１５に、レーザ光除去用のノッチフィルタ２種（５０５ｎｍ，６３５－６４２ｎｍ）、検出する波長体を透過させるバンドパス干渉フィルタ（透過帯域：５１０－７００ｎｍ）を用いる以外は図１と同じものを使用する。

　実際の計測手順に従って配列決定法を説明する。モデル試料としてＭ１３－ＤＮＡ断片を使用する。末端を定法に従い、Ｍ１３－ＤＮＡ断片の末端をビオチン化する。ビオチン化ＤＮＡ溶液を図７の試料液容器２７ａに、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ４８８で標識されたケージドｄＡＴＰ，Ｃｙ３で標識されたケージドｄＣＴＰ，Ｃｙ５で標識されたケージドｄＧＴＰ，Ｃｙ５.５で標識されたケージドｄＴＴＰ溶液（ポリメラーゼ含む）を混合して容器２７ｂに保持する。なお、標識されたケージドｄＮＴＰはヌクレオチドに２－ニトロベンジル基が結合するケージド化合物であり、ポリメラーゼにより、相補鎖として取り込まれるが、相補鎖合成反応で連続的に取り込まれる活性が抑えられている。そのため、１塩基分伸長して反応がとまる。しかし、ついで、３６０ｎｍ以下の紫外線を照射すると、ケージド物質（２－ニトロベンジル基）が遊離し、ヌクレオチド本来の活性が生じ、次のｄＮＴＰの合成を起こすことができる。

　分注ユニット２５により、フローチャンバ内にテンプレートとなるビオチン化ＤＮＡを導入し、基板と反応させる。洗浄後、オリゴプライマを導入してビオチン化ＤＮＡにプライマをハイブリさせる。これにより相補鎖伸長反応を行う。まず洗浄後、標識ケージドｄＮＴＰ溶液を導入する。プライマ結合位置の次のテンプレートの塩基によって、取り込まれる塩基が決定される。レーザ光１０１ｃ（５０５ｎｍ），１０１ｄ（６３５ｎｍ）を照射し、２次元センサカメラにて、蛍光測定を行う。実施例１と同様に蛍光の有無，蛍光波長の違いにより、取り込まれた塩基が判断できる。ついで、レーザ光１００（３５５ｎｍ）を照射し、ｄＡＴＰの活性を戻す。この手順を、複数サイクル行うことで、塩基配列が決定できる。

　ＤＮＡポリメラーゼの基質として鋳型ＤＮＡに取り込まれてＤＮＡ鎖伸長反応を保護基の存在により停止することができかつ検出され得る標識を持つ４種のｄＮＴＰの誘導体であり、なんらかの手段により該ｄＮＴＰ誘導体を伸長可能な状態に戻すことのできる試薬として本例では、蛍光標識ケージドｄＮＴＰを使用するが、蛍光体とヌクレオチドをジスルフィド結合により結合するｄＮＴＰの誘導体などでも同様に実施可能である。この場合、蛍光体の存在で、伸長が停止し、Ｔｒｉｓ［２－ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ］ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ試薬などでジスルフィド結合を化学的に解離させて伸長可能な状態に戻すことが可能である。

　本実施例でも実施例１とほぼ同様の効果がある。

　蛍光体として別の組み合わせの例を示す。

　蛍光体として、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ４８８，Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ５３２，Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ５６８，Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ５９４，Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ６４７の５種を使うことで、実施例１と同様の操作、図３（Ｃ）と同じダイクロイックミラーを使用することで、蛍光強度の比率から蛍光体種を５種識別することが容易にできる。

　センサ３個を使った場合の装置を示す。適用例を示す。

　図８に集光した蛍光を分離する部分の装置構成を示す。ダイクロイックミラー３００，３０１を２個使用し、それぞれ図のように配置して蛍光を所定の比率で分割し、分割蛍光束を結像レンズ１８ｃ，１８ｄ，１８ｅで結像させ、その像を２次元センサカメラ１９ｃ，１９ｄ，１９ｅ（高感度冷却２次元ＣＣＤカメラ）で各々検出する。制御方式は実施例１と同様である。

　図９は、この場合のダイクロイックミラー３００，３０１の透過（反射）特性図である。このように、３種のカメラに対して、各波長ごとに異なる比率の組み合わせとすることで、５００ｎｍから７００ｎｍの範囲に蛍光極大波長を有する蛍光体を識別して検出することができる。本例では、実施例３での組み合わせの蛍光体を識別できる。

　なお、本例では、蛍光波長帯域が５００－７００ｎｍの場合であるが、これに制限されることはない。実施例１，２を含めて、４００－６００ｎｍの範囲，４００－７００ｎｍの範囲，６００－８５０ｎｍの範囲など任意に対応できる。例えば、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ３５０などの蛍光波長が４００－５００ｎｍになる蛍光体をつかい、ダイクロイックミラーの指定波長域を４００－７００ｎｍとすることで、より広い範囲の蛍光体を同様に使うことができる。Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ６３５，Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ６６０，Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ７００，Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ７５０の蛍光体をつかう場合は、蛍光波長帯域が６３０－８２０ｎｍであり、ダイクロイックミラーの指定波長域を６５０－７８０ｎｍとする。通常、指定波長域の範囲は、４００－９００ｎｍである。

　図１０は基板とエバネッセント照明のためのプリズムとの接合部の別の構造を示す。図１と同じく、石英製プリズム７に基板８をカップリングする。カップリング材として透明な弾性体、たとえば、ＰＤＭＳ樹脂２０１（屈折率＝１.４２、内部透過率＝０.９６６／厚み２mm材）を介して接合する。ＰＤＭＳ樹脂の屈折率はガラスに近く、また透明であるため、基板とプリズムで挟み押し付けることで光学的に接着する。測定中、基板内の測定視野の移動は、プリズム込みでＸＹステージにて行うことができる。

　図１１，図１２は、基板とエバネッセント照明のためのプリズムとの接合部の別の構造を示す。

　測定基板２００は専用のホルダ２０３に埋め込まれて保持される。この下部（反応表面側，格子構造形成側）にフローチャンバ２０４が構成される。フローチャンバ２０４はＰＤＭＳで形成し、ホルダ２０３および測定基板２００と接着され、測定基板２００の反応領域に試薬，洗浄液などをフローできるようになっている。これをＸＹステージ２０９（図１２に図示）に保持された基板保持具２０５に接触させる。フローチャンバ２０４の流路２０８と貫通孔２０６の位置をそろえて配置する。貫通孔２０６は外部のフローシステムと連結される。また、基板保持具２０５は、その中央に大きな開口部２０７を有しており、集光レンズ１４と測定基板２００とが近接でき、蛍光を高効率で集光できる。

　測定基板２００の裏面（図では上側）のホルダ２０３内の窪み２０２にマッチングオイルを保持し、プリズム７を配置する。窪み２０２にマッチングオイルに替えてＰＤＭＳ樹脂を埋めることでマッチングすることでもよい。

　プリズム７はプリズムホルダ２１０に捕捉されており、基板との着脱機能を有しており、エバネッセント照明する場合に基板と接着する。

　なお、プリズムをアクリルなどで作成し、それと基板とが一体化した状態のものを使うこともできる。

　また図の構造を、上下反転した形状でも同様に実施できる。

　反応基板の別の実施例を示す。本実施例での基板６０の構造に示す。基板６０は、反応領域６０ａを有し、その内部にＤＮＡや蛋白などを捕捉する領域６０ｉｊがピッチｄｓで複数形成されており、さらに複数の６０ｉｊの周りを光学的に不透明なマスク６０ｂで覆う構造とする。マスク材料としては、アルミニウム，クロムなどの金属，炭化シリコンなどが適用でき、蒸着などで、薄膜化する。領域６０ｉｊの個々の大きさは直径１００ｎｍ以下である。この開口をマスク６０ｂのなかに作成する方法としては、プロジェクション法での蒸着（蒸着源と基板との間に適当なマスクを配置して蒸着する），電子ビームリソグラフィー，フォトリソグラフィーによる直接描画によって作成できる。ドライエッチング，ウェットエッチングを用いても良い。

　微小開口を有する金属薄膜の基板の場合は、生体分子は開口中に捕捉する。この場合、生体分子周囲の試料液のラマン散乱光と生体分子近傍の金属構造物の光ルミネセンス・光散乱を検出することで、構造物の空間位置を検出することができ、位置の基準マーカとして活用できる。

　開口中に金属構造体を作成してもよい。実施例１と同様に位置マーカ６１，６２，６３を配置することもでき、実施例１と同様の効果が期待できる。

　本例によっても、前記実施例１等と同様の効果が得られる。また、反応領域６０ｉｊ以外はマスクされているため、不要な迷光，蛍光が低減でき、より高感度に測定することができるようになる。

　６種類の蛍光体をラベルとして使用する場合について説明する。反応に関係する機構部は前記実施例と同等であるため、主に光学測定系について説明する。

　図１４は、本発明の蛍光分析方法を使った装置の構成図である。反応部，レーザ照射機構部対物レンズなどは実施例１，図１と同様である。

　基板のドットの構成も同様に本例では、領域８ｉｊ同士の間隔ｄｘを２マイクロメータ、間隔ｄｙは２マイクロメータ、領域８ｉｊのドット径は２０ｎｍとし、ドットに単一分子状態の測定試料を捕捉する。

　標識用の蛍光体としてＱｄｏｔ５２５，Ｑｄｏｔ５６５，Ｑｄｏｔ６０５，Ｑｄｏｔ６２５，Ｑｄｏｔ６５５，Ｑｄｏｔ７０５の６種類を使用する。これらが個々に標識された抗体を用意し、反応させることで、格子上に配置されたドット部に個々の蛍光体を捕捉する。

　蛍光励起用のレーザ装置１０１ｅ（半導体レーザ、４０５ｎｍ）からのレーザ光をλ／４波長板１０２ｅを通して円偏光とする。ミラー１０４ｅ，５を介して全反射照明用の石英製プリズム７に図のように入射面に垂直に入射し、蛍光体が捕捉された基板８の裏側から照射する。

　石英製プリズム７と基板８は接着剤にて光学接着しており、レーザ光はその界面で反射することなく、基板８部に導入される。基板８表面は反応液（水）で覆われており、その界面にてレーザ光は全反射し、エバネッセント場照明となる。これにより、基板８表面に捕捉される蛍光体を高いＳ／Ｎで測定することが可能になる。なお、基板８の端面がプリズム形状に加工されている基板を使用すれば、石英製プリズム７を使う必要がなく、構成がより簡便になる。

　基板８の上部には、試薬などを含む反応液などをフローまたは保持するためのフローチャンバ９が配置されているが、フローチャンバは光軸方向に透明材で形成されており、基板表面から発する蛍光１３は、チャンバ９を通して集光レンズ（対物レンズ）１４で集められ、フィルタユニット４０６を通して、分割結像光学系に導入される。フィルタユニット４０６は、レーザ装置１０１ｅからのレーザ光を遮断するための短波長カットフィルタ（４５０ｎｍ以下の波長帯の光をカット。透過率０.０００００１以下。４８０ｎｍ以上の波長帯域の透過率９０％以上）と、検出する蛍光波長帯を設定し、透過させるバンドパス干渉フィルタ（透過帯域：５００－７００ｎｍ、透過率９０％以上）を組み合わせから構成される。短波長カットフィルタに替えて、４０５ｎｍをカットするノッチフィルタ（ブロッキング波長４５０ｎｍ＋－４ｎｍ、透過率０.０００００１以下）でもよい。

　分割結像光学系では、まず、分割のためのダイクロイックミラー４００により、波長ごとに異なる比率で透過光と反射光に分割する。分割された光束をそれぞれ、反射光はミラー４０１で反射し、結像レンズ４０７に指定の角度で導く。透過光はミラー４０２と４０３で折り曲げ、同じ結像レンズ４０７に別の指定の角度で導く。両光束は異なる角度で結像レンズに入射することで、２次元センサカメラ４０８（高感度冷却２次元ＣＣＤカメラ）に対して、それぞれの画像をずらして結像させる。補助フィルタ４０４，４０５は迷光除去のため、バンドパス干渉フィルタ（透過帯域：５００－７００ｎｍ、透過率９０％以上）を使う。場合により、補助フィルタは使わなくてもよい。２次元センサカメラ４０８の画像は２次元センサカメラコントローラ４０９を介して制御ＰＣ２１で収集し解析を行う。なお、分割透過光と分割反射光の光路の長さは、なるべく同じになるようにしているが、必ずしも同じでなくてもかまわない。図では結像倍率は、両光束で同じであるが、異なるようにしてもよい。同じ輝点の分割透過光像と分割反射光像であることが判断されれば解析可能である。

　図１５に本例で使用する蛍光体の特性とダイクロイックミラーの特性図を示す。Ｑｄｏｔ５２５，Ｑｄｏｔ５６５，Ｑｄｏｔ６０５，Ｑｄｏｔ６２５，Ｑｄｏｔ６５５，Ｑｄｏｔ７０５の６種類の蛍光スペクトル（規格化済）と、ダイクロイックミラーの透過特性を示す。

　図１６に本例での画像取得の説明模式図を示す。ダイクロイックミラー４００により反射される光の波長成分は図１６（Ａ）右に記される「分割された反射光束の蛍光スペクトル」図になり、ダイクロイックミラー４００を透過する光の波長成分は図１６（Ａ）左に記される「分割された透過光束の蛍光スペクトル」図になる。実施例１の場合と同様、各波長ごとに異なる比率で透過光束と反射光束に分割される。本例では、ダイクロイックミラーの特性は、波長に対してほぼリニアに反射・透過特性が変わる。なお、フィルタユニット４０６の透過帯域が５００－７００ｎｍのため、図の表示波長帯域を５００－７００ｎｍとしている。

　反射光と透過光を異なる角度で結像レンズ４０７に入射させることで、それぞれの蛍光像を同じ２次元センサカメラ４０８の異なる位置に結像され、デュアル・ビュー状態で蛍光像を検出することができる。基板上の格子点位置の各領域から生じる蛍光の結像状態を図１６（Ａ）上図に模式的に示す。図１６（Ｂ）には格子点に並んだ各蛍光体の捕捉領域から発する輝点の蛍光像の分割透過光強度像（左図）と分割反射光強度像（右図）の一部を図示する。図の丸枠で示された輝点像が同じ輝点からの分割透過光像と分割反射光像に相当する。蛍光体の捕捉状態によって、格子点に並んだ捕捉領域のすべてから蛍光が観察されるわけではなく、一部輝点がない箇所も存在する。

　図１６（Ｂ）の輝点の蛍光強度比算定結果の一例を図１７に示す。各蛍光体種ごとの代表的な輝点について、分割透過光強度と分割反射光強度の合計に対する分割透過光強度の比と分割反射光強度の比が示されている。それぞれの点は、図に記載の種類の蛍光体種に相当する。各蛍光体が異なる比率で検出され、それらを区別して検出することができる。本例により、１個の２次元センサカメラで６種の蛍光体を識別することが可能であり、多種類の蛍光体を同時に簡便に識別検出することができる。

　本例によれば、抗原，抗体を測定対象にした蛋白チップ，ＤＮＡチップ，抗原検査装置などにも適用できる。同時に６種類のラベルを使うことができるので、６種類の標識抗体などを準備し、同時に反応させ、反応結果を同時に測定でき、比率で識別し、各標識抗体ごとの強度を算定することができる。単一分子の測定だけでなく、定量も可能になる。なお、基板に捕捉する抗体，抗原の位置は格子状でなくても良いので、種々のチップに対応することができる。もちろん標識は６種に限らず、３種類以上，４種類以上で適用できる。

　また、本例を細胞染色，細胞チップ等に適用することもできる。例えば、細胞表面抗原に特異的に結合する抗体を準備し、それぞれ蛍光体で標識する。６種類の標識抗体を同時に反応させ、同時に蛍光測定することで、６種の抗体の分布，濃度などを測定することもできる。表面抗原だけでなく、細胞質内のマーカ，膜マーカ，ＤＮＡ，ＲＮＡなどを同時に検出することができる。

　格子点に並んだ各蛍光体の捕捉領域から発する輝点の蛍光像の分割透過光強度像と分割反射光強度像を図１６（Ｂ）とは異なる状態で結像し、解析する例について説明する。

　図１８は、画像分割検出方式の説明模式図である。基板上の格子状の捕捉領域の間隔を、ｄｘを３マイクロメータ、間隔ｄｙを２マイクロメータ、捕捉領域のドット径を２０ｎｍとし、ドットに単一分子状態の測定試料を捕捉する場合について説明する。２次元センサカメラ（高感度冷却２次元ＣＣＤカメラ）に画素サイズ６.４５×６.４５マイクロメータ，画素数，横（ｘ方向）：１３９２画素，縦（ｙ方向）：１０４０画素を使用する。集光光学系，結像光学系の総合倍率を１２.９倍とすることで、捕捉領域の間隔を、ｄｘ方向に６画素、ｄｙ方向に４画素とする。

　図１４または図１６において、分割透過光束と分割反射光束の結像レンズへの入射角度をより浅くすることで、対応する輝点の像を図１８（Ａ）のように隣接させることもできる。分割透過光像と分割反射光像をｄｘ方向にわずかにずらして結像させる。これにより、輝点の対応がより明確になるため、解析が容易になる。透過光像と反射光像が重なるため、通常は蛍光輝点の計測が困難であるが、本例では、蛍光輝点が格子状に整列しており、重ねる画像の輝点をもう一方の輝点間隔の中間部分に結像するように調整することで、測定が可能になる。本例では、基板の捕捉領域の間隔を、ｄｘ方向がｄｙ方向にくらべて長い長方格子状態にし、ｄｘ方向に透過像と反射像を格子の約半ピッチ程度ずらすことで、輝点同士の重なりが抑えられ効率よく検出識別することができる。

　本実施例では、個々の輝点を結像した蛍光像の大きさは、分割透過光像と分割反射光像それぞれ、像のボケなどの影響を含んで３（ｄｘ方向）×３（ｄｙ方向）画素以内の大きさになる。これにより、個々の輝点を３×３×２＝１８画素以内にて検出し、蛍光体種を判定することができ、高密度基板を効率よく検出解析することができる。また、個々の輝点を４×３×２＝２４画素以内にて強度算定してもよい。

　また、上記例では、ｄｙ方向のＣＣＤの画素数を１発光輝点あたり４画素としているが、５画素，３画素などに調整することが可能である。ｄｘ方向も６画素に限定されない。これらの画素数でも高密度基板を効率よく検出解析することができる。

　実施例１の方式での任意の領域８ｉｊについて、測定の一例を模式図で説明する。工程の概要は、（ｉ）伸長反応→（ii）洗浄→（iii）蛍光測定→（iv）蛍光体除去＋３′末端回復→（ｖ）洗浄を繰り返す。（iii）蛍光測定と（ｖ）洗浄時の測定の模式図を図１９に示す。経過時間は伸長反応，蛍光体除去＋３′末端回復等の部分を除外しての表示であり、相対値を示す。図１９（Ａ）は格子状に並んだ同一捕捉領域からの蛍光の透過光強度と反射光強度の時間変化を示す。図１９（Ｂ）は透過光強度と（透過光強度と反射光強度の合計値）との比率（分割比率）の時間変化である。蛍光体が捕捉されない場合、比率の算定は意味がないので、比透過光強度と反射光強度の合計値が一定以上の時について比率を算定する。比率の大きさが、各工程で捕捉されるそれぞれの蛍光体ごとに異なるので、データ処理部で、タイミング，各検出強度，分割比率，ノイズ幅などを解析することで、図のように配列が決定できる。あらかじめ格子点位置を識別することで、または測定後に輝点位置情報を持って位置を識別することで、反応輝点・分子の全箇所の配列を判定することができる。

　なお、本例と同様の方式でＤＮＡのリアルタイムシーケンスを行うことも可能である。伸長時に発光する蛍光の透過像強度と反射光強度を同時に連続的に測定できるので、上記と同様にその比率から塩基種を連続的に判定できる。

　蛍光体として別の組み合わせの例を示す。

　共鳴による励起エネルギーの移動（いわゆるＦＲＥＴ）を利用した蛍光測定にも適用できる。例えば、ドナーとして、蛍光波長５２５ｎｍのＱｄｏｔ５２５などを使い、アクセプタとしてＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ５４６，Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ５９４，Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ６３３，Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ６６０の４種の蛍光体を使うことも可能である。これら５種の蛍光体も、前記実施例と同様に、その蛍光強度比率でそれぞれ識別弁別することができる。ＦＲＥＴの場合は、実施例１などで記載した反応領域の個々のドット（領域８ｉｊなど）にＱｄｏｔ標識の試料分子を捕捉し、それに対して４種の蛍光体または、蛍光体標識特異的認識分子（抗体，ＤＮＡなど）を個々に反応させる。前記実施例に記載の装置により、蛍光強度検出、各々の検出蛍光強度比率を算定することで、蛍光体の種類を識別することができる。個々の領域の状態は、何も捕捉されていないドット，Ｑｄｏｔのみ捕捉されたドット，Ｑｄｏｔ＋Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ５４６が捕捉されたドット，Ｑｄｏｔ＋Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ５９４が捕捉されたドット，Ｑｄｏｔ＋Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ６３３が捕捉されたドット，Ｑｄｏｔ＋Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ６６０が捕捉されたドット、になる。Ｑｄｏｔが捕捉されたドットからはその蛍光が検出されるが、蛍光強度の比率が異なっており、また、励起エネルギーの移動によりＱｄｏｔからの蛍光強度が低下することにより、蛍光強度比率により、上記組み合わせの状態を識別することが可能である。

　本例では、ＦＲＥＴ現象を利用した蛍光測定系でも適用可能である。この場合、個々の領域・ドットに存在する蛍光体は１分子でなく、複数分子での計測にも対応可能である。

　ダイクロイックミラー３２，４００の透過率（反射率）特性を検出帯域において非線形に変化させた例を示す。装置構成は、図１同等、用いる蛍光体および蛍光励起用のレーザ装置１０１ｃ，１０１ｄは実施例２と同じである。

　一般に、ある座標（本実施例であれば、格子点上に配置された金属構造体の座標）の蛍光体の存在を検出するには、上記座標における２次元センサカメラの輝度が所定の閾値よりも大きい必要がある。前記実施例のように、輝点が単一蛍光体の場合は、輝度が上記閾値を超える条件に加えて、一段階消光（リアルタイムシーケンスなら一段階解離）を示すことが単一蛍光体由来輝点の選別条件となる。蛍光体が無いときの２次元センサカメラの輝度（背景輝度）は、ショットノイズや読み出しノイズ等によって空間的かつ時間的にばらつく。そのため、たまたま閾値を超えた背景輝度の輝点が蛍光体として選別されないように、上記閾値は十分大きく設定する。しかし、輝度が閾値を下回る微弱な蛍光体輝点は、見逃されてしまう。特に、蛍光強度をダイクロイックミラーで分割する場合、画素あたりの蛍光強度が小さくなるため、輝度が閾値を下回る微弱な蛍光体輝点が存在する。本発明において、例えば、透過率が極端に大きな蛍光体種は、透過側の画素で蛍光体輝点として選別されるが、反射側の画素では、輝度が閾値を下回るために蛍光体輝点と選別されない場合がある。このような場合は、透過側の輝点が選別されている画素に対応する反射側の画素の輝度を取得することで、強度比を算出することができる。ここで強度比とは、（透過側の蛍光強度）／（透過側蛍光強度＋反射側蛍光強度）×１００％で与えられるとする。ところが、例えば、強度比が５０％付近の蛍光種の場合、分割後の蛍光強度は半分になるので、微弱な蛍光体種は、どちらの画素でも蛍光体輝点として選別されない可能性がある。微弱な蛍光体種とは、例えば、蛍光体の励起波長が、励起用レーザの波長から離れて励起効率が低いものである。

　本実施例では、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ４８８とＣｙ３励起用に５０５ｎｍで発振する固体レーザを、Ｃｙ５とＣｙ５.５励起用に６３５ｎｍで発振する半導体レーザを用いている。図２０（Ａ）に励起用レーザの波長と各蛍光体の励起スペクトル、図２０（Ｂ）に蛍光スペクトルを示す。Ｃｙ３とＣｙ５.５は、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ４８８とＣｙ５に比べて、レーザ励起波長から離れている。そのため、Ｃｙ３とＣｙ５.５の励起効率が低くなり、蛍光強度はＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ４８８とＣｙ５に比べて微弱になる可能性がある。特にＣｙ３またはＣｙ５.５の強度比が５０％付近の場合、前述の通り、微弱な蛍光体輝点の中には、分割後のどちらの画素でも輝点として選別されないものが存在し得る。

　そこで本実施例では、図２１（Ａ）または（Ｂ）に示すような非線形な透過率特性を持ったダイクロイックミラー３２を設計する。非線形な透過率特性を持つとは、透過率の波長に対する変化率（図２１の透過率曲線の傾き）が異なる波長帯域を含むような特性を持つことをいう。たとえば、（Ａ）のように変化率がほぼ一定な領域を含むように階段状に透過率を変化させても良く、（Ｂ）のように変化率が異なる波長帯域を混在させて傾斜状に透過率を変化させても良い。いずれの特性も、Ｃｙ３の蛍光極大波長（５６７ｎｍ）を含む発光体帯域で透過率を０％に、Ｃｙ５.５の蛍光極大波長（６９６ｎｍ）を含む発光帯域で透過率を１００％にする点に特徴がある。これにより、Ｃｙ３やＣｙ５.５のように励起効率が低い蛍光体種を反射または励起側で優先的に検出することができる。

　尚、上記ではダイクロイックミラー３２の透過率特性のみを示したが、反射率特性は、反射率（％）＝（１００％－（透過率（％）））であり、ダイクロイックミラーによる反射光と透過光の強度の和は、ほぼもとの光強度と同じである。上記は、ダイクロイックミラーに関する限り、他の実施例においても同様である。

　本実施例では、フィルタユニット１５に、レーザ光除去用のノッチフィルタ２種（５０５ｎｍ,６３５－６４２ｎｍ）、検出する波長体を透過させるバンドパス干渉フィルタ（透過帯域：５１０－７３０ｎｍ）を用いる。

　図２２に各蛍光体からの蛍光検出の概要を示す。図２２（Ａ）は、図２０（Ｂ）に示す蛍光スペクトルを有する各蛍光体を、本実施例のフィルタユニット１５，ダイクロイックミラー３２，補助フィルタ１７ａ，１７ｂに通過させた後の、２次元センサカメラ１９ａ，１９ｂに到達する蛍光スペクトル成分である。図２２（Ｂ）は、（Ａ）に示すスペクトルの積分値から透過側および反射側の２次元センサカメラの検出蛍光強度を用いて強度比を算出した結果である。Ｃｙ３の強度比は０％に近く、Ｃｙ５.５の強度比は１００％に近いため、微弱な蛍光体分子の見逃し率を低減できる。また、４種の蛍光体とも異なる強度比になるように、ダイクロイックミラー３２の特性を設計しているため、強度比の違いによる蛍光体種識別が可能である。ここでは、４種の蛍光体の強度比を０－１００％で均等に割り振るため、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ４８８の強度比を３３％付近に、Ｃｙ５の強度比を６６％付近にした。強度比を均等に割り振るとは、４色蛍光体であれば、１００％／（（４－１）種）＝３３％／種より、どの蛍光体種の強度比もおよそ３３％以上離れることである。蛍光単分子輝点の強度比はばらつくため、強度比が極端に近い蛍光体種は識別精度が低下する。強度比を均等に割り振ることで、特定の蛍光体種の識別精度低下を抑制する効果がある。上記は、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ４８８の強度比を６６％付近に、Ｃｙ５の強度比を３３％付近にしても同様の効果がある。また、Ｃｙ３の強度比を１００％に近く、Ｃｙ５.５の強度比を０％に近く設計しても良い。以下、理想的な強度比の割り振り方法を記す。

　蛍光体ｎ種を０－１００％の強度比の間で均等に割り振る場合、対応する励起用レーザの波長と吸収極大波長の差がｎ－２ｍとｎ－２ｍ－１番目に小さい蛍光体Ｆ_iの強度比Ｒ_i（％）は、

または、

となるようにする。ここで、対応する励起用レーザとは、上記Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ４８８とＣｙ３の場合は、５０５ｎｍで発振する固体レーザであり、Ｃｙ５とＣｙ５.５の場合は、６３５ｎｍで発振する半導体レーザである。上記（数１）と（数２）の割り振り方法をＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ４８８，Ｃｙ３，Ｃｙ５，Ｃｙ５.５の例に適用する。Ｃｙ３とＣｙ５.５は、４番目と３番目にレーザから励起波長が近いので、ｎ＝４，ｋ＝０を（数１）と（数２）に代入して、～１００％または０％を割り振る。また、２番目と１番目に近いＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ４８８とＣｙ５はｎ＝４，ｋ＝１を代入して、３３％と６６％を割り振る。以上より、４種蛍光体に強度比を均等に割り振ることができる。

　上記強度比を与えるダイクロイックミラーの透過率特性Ｄ（λ）は、１からｎまでの全てのｉに対して、

を満たすように設計する。ここで、Ｆ_i（λ）は蛍光体Ｆ_iの蛍光スペクトル、ｆ_k（λ）は、蛍光体からの発光が検出器に到達するまでに透過するフィルタ等光学部品の透過率特性である。実際には、蛍光体の蛍光スペクトルは重なりを持つため、全ての蛍光体Ｆ_iに対して、（数３）をみたすＤ（λ）を設計することは困難である。そこで、本例では可能な限り強度比Ｒ_iに近くなるようにＤ（λ）を設計した。上記、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ４８８，Ｃｙ３，Ｃｙ５，Ｃｙ５.５では、フィルタユニット１５のレーザ光除去用のノッチフィルタ２種（５０５ｎｍ，６３５－６４２ｎｍ）と検出する波長体を透過させるバンドパス干渉フィルタ（透過帯域：５１０－７３０ｎｍ）の透過率特性をｆ_k（λ）に代入して、ダイクロイックミラーの透過率特性Ｄ（λ）を（数３）を満たすように近づけて求めた。

　一般的に、ＦＲＥＴ現象を利用した蛍光測定において、ＦＲＥＴ未発生時は、ドナーの発光のみが検出され、ＦＲＥＴ発生時は、ドナーおよびアクセプタの蛍光が検出される。ＦＲＥＴ発生時、ドナーの蛍光強度は低下し、その蛍光強度の低下量は、（ＦＲＥＴ未発生時のドナー蛍光強度）×（ＦＲＥＴ効率）となる。そこで、ドナーの蛍光強度の変化からＦＲＥＴ発生の有無を知ることで、アクセプタの蛍光の発生を識別することができ、蛍光強度をより正確に検出できるようになる。

　本実施例では、ドナーであるＱｄｏｔの蛍光強度がアクセプタより数倍大きく、ＦＲＥＴ効率が低い場合の強度比を利用した蛍光体識別方法を示す。ドナーとして用いるＱｄｏｔの蛍光強度が強く、ＦＲＥＴ効率が低い場合、ＦＲＥＴ発生時でもＱｄｏｔが大きな蛍光強度を有するため、アクセプタ蛍光体の蛍光はＱｄｏｔの蛍光に埋もれてしまう。Ｑｄｏｔ蛍光の影響が大きくなると、アクセプタの強度比がＱｄｏｔの強度比に支配されるため、すべてのアクセプタの強度比がＱｄｏｔ強度比に漸近する。

　例として、ドナーにＱｄｏｔ５２５を、アクセプタにＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ５４６，Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ５９４，Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ６３３，Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ６６０を用いたときのＦＲＥＴ効率と強度比の関係を図２３に示す。Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒの蛍光強度は規格化して同一にしており、Ｑｄｏｔ５２５の強度はＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒの１０倍としている。図１４に示す構成を用いて、レーザ装置１０１ｅに４０５ｎｍで発振する半導体レーザを、レーザ装置１００には何も使用していない。フィルタユニット４０６には５１０－７１０ｎｍの光を透過させるバンドパスフィルタを、ダイクロイックミラー４００には、図１５（Ｂ）の特性を示すダイクロイックミラーを用いた。図２３に示すように、Ｑｄｏｔ５２５の蛍光強度がＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒに対して１０倍大きい条件下では、ＦＲＥＴ効率が低下するに従い全てのＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒの強度比がＱｄｏｔ５２５の強度比～５％に漸近する。低ＦＲＥＴ効率領域では、強度比の違いによるＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ種の識別は困難である。

　図２４（Ａ）に本実施例の検出系の構成を示す。ドナーの蛍光強度が大きく、ＦＲＥＴ効率が低い場合でも、強度比によるアクセプタ識別を容易にすることができる。フィルタユニット４０６とダイクロイックミラー４００の間に図２４（Ｂ）に示すような透過率特性を有するダイクロイックミラー５０１を配置し、Ｑｄｏｔ５２５の蛍光成分のみを分けた。Ｑｄｏｔ由来の輝点は結像レンズ５０２で２次元センサカメラ５０３上に結像させた。フィルタユニット４０６には４８８ｎｍ以上の光を透過させるロングパスフィルタを、ダイクロイックミラー４００には、図１５（Ｂ）の特性を示すダイクロイックミラーを用いた。ダイクロイックミラー５０１でＱｄｏｔ５２５の発光成分を分離することで、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ蛍光信号へのＱｄｏｔ５２５蛍光の重なりを防ぐ効果がある。Ｑｄｏｔ５２５の蛍光強度はＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒに比べて強いため、２次元センサカメラ５０３は２次元センサカメラ４０８よりも感度が低く、安価なもので構わない。Ｑｄｏｔ５２５は、ランダムに固定しても構わないが、実施例１記載のように格子点状に固定することで、図２４（Ａ）示す検出画像の模式図のように、同一輝点Ａを簡便に見つけることができる。

　図２５（Ａ）に図２４（Ａ）の構成でＦＲＥＴ観察したときに予想されるＦＲＥＴ効率と強度比の関係を示す。ＦＲＥＴ効率０のときは、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒの蛍光強度は０のため、強度比はＱｄｏｔ５２５と同一になる。０以外のＦＲＥＴ効率では、Ａｌｅｘａ　ＦｌｕｏｒのＱｄｏｔの強度比への漸近はほとんど見られない。また図２５（Ｂ）にＦＲＥＴ効率０.５における強度比を示す。４種のＡｌｅｘａで強度比に十分な差があるため、強度比の違いによる蛍光体種識別が可能である。尚、本例では、Ｑｄｏｔ５２５と上記に示す４種のＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒを用いたが、異なる蛍光体の組み合わせでも構わない。

　また、本例では、Ｑｄｏｔ５２５の蛍光強度を単独のカメラにて独立に検出する。ダイクロイックミラー５０１の特性によっては、２次元センサカメラ４０８側にＱｄｏｔ５２５の蛍光の一部が検出される場合があるが、その場合、２次元センサカメラ５０３のデータをもとに、２次元センサカメラ４０８への漏れ量を計算し、補正することもできる。それによってより正確な強度比の違いによる蛍光体種識別が可能になる。

　本例では、実施例１２におけるダイクロイックミラー４００（図２４（Ａ））の透過率特性を実施例１１同様に検出帯域で非線形に変化させ、励起効率が低い蛍光体を透過側もしくは反射側で高蛍光強度で検出する。これにより、励起効率が低いために存在する微弱な蛍光体の見逃し率を下げる。特にＦＲＥＴ効率の低い場合、アクセプタの蛍光強度が弱まるため、本実施例による効果が高まる。

　装置構成は実施例１２と同じであるが、ＦＲＥＴ観察の蛍光体は、ドナーにＱｄｏｔ５２５、アクセプタにＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ５４６，Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ５９４，Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ６３５，Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ６６０を用いた。

　図２６（Ａ）に実施例１１の方法に従って設計したダイクロイックミラー４００の透過率特性を示す。励起効率はＱｄｏｔ５２５の蛍光波長から遠くなるに従い低くなる。すなわち、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ５４６，Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ５９４，Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ６３５，Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ６６０の順に蛍光強度が低くなると予想される。そこで、上記蛍光強度順番に従い、（数１）と（数２）から各蛍光体の理想的な強度比を算出し、（数３）を可能な限り満たすようにダイクロイックミラー４００の透過率特性を設計した。なお、図２６（Ａ）では階段状に透過率特性を変化させたが、図２１（Ｂ）のように傾斜状に透過率を変化させても良い。図２６（Ｂ）にＦＲＥＴ効率に対する強度比の変化を示した。図２６（Ｃ）はＦＲＥＴ効率０.５における強度比である。２つの図からわかるように、本実施例のダイクロイックミラーによって、励起効率が低いＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ６６０とＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ６３５をそれぞれ透過側と反射側で効率的に検出することができる。さらに、強度比２０％から９０％の間で、強度比を４種Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒにほぼ均一に割り振っている。

　上記ダイクロイックミラーは、主にＦＲＥＴ効率の低いＦＲＥＴ観察において、微弱な蛍光体輝点の見逃し率を下げ、強度比ばらつきによる蛍光体識別率低下を抑制する効果がある。

　ＦＲＥＴ観察を１台の２次元センサカメラで行う例を図２７に示す。実施例１２で記したように、ドナーであるＱｄｏｔの蛍光は、ダイクロイックミラー５０１で分けられ、アクセプタの蛍光は実施例１２と１３で示したような透過率特性を有するダイクロイックミラー４００で分離する。上記３つの光路に分けられた蛍光は結像レンズ４０７によって、２次元センサカメラ４０８に結像する。図２７中の検出画像の模式図に示すように、２次元センサカメラ４０８のチップは３分割され、左からＱｄｏｔのみの蛍光像，透過側のアクセプタ蛍光像，反射側のアクセプタ蛍光像を与える。実施例１２と１３同様に、アクセプタの同一輝点からの蛍光像に関して、透過側と反射側の蛍光強度から強度比を算出し、アクセプタ蛍光体の識別を行うことができる。本実施例は、３種類の蛍光像を１台の２次元センサカメラで検出することで、装置コストを削減する効果がある。

　尚、ミラー４０１とレンズ４０７の間に減光フィルタを設けてもよい。Ｑｄｏｔの蛍光強度が大き過ぎる場合、減光フィルタにより強度を小さくして、３種の蛍光像を適正な輝度レベルに合わせることができ、画像計測が容易になる。

　本例では、ＦＲＥＴ観察において、ドナーおよびアクセプタの蛍光を１つのダイクロイックミラーで分離し、透過側と反射側に分けられた同一の２次元センサカメラで検出する方法を示す。ＦＲＥＴ観察の試薬は、実施例１３同様、ドナーにＱｄｏｔ５２５，アクセプタにＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ５４６，Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ５９４，Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ６３５，Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ６６０を用いる。検出系は、図１または図１４に示す構成を用いる。ただし、ドナー励起用として、レーザ装置１０１ｅ，１０１ｂに４０５ｎｍで発振する半導体レーザを使用する。ダイクロイックミラー３２，４００の特性を図１５（Ｂ）に示す。

　フィルタユニット４０６，１５に図２８に示すようにＱｄｏｔ５２５とＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ５４６の蛍光極大波長の間に立ち上がりを有するロングパスフィルタ（短波長カットフィルタ）を用い、これによりＱｄｏｔ５２５の蛍光の一部をカットし、蛍光強度を下げることを特徴とする。これにより、ドナーＱｄｏｔ５２５の蛍光シグナルが支配的になるのを防ぐ。特に、低いＦＲＥＴ効率でアクセプタ強度比がドナー強度比への漸近するのを抑制することができる。ドナーのＱｄｏｔ５２５は、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒアクセプタに対して１０倍強い蛍光強度を有するとする。この場合、図２３に示すように、ＦＲＥＴ効率低下に伴い、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒの強度比がＱｄｏｔ５２５の値に急激に漸近する。一方、図２８（Ａ）に示すようにロングパスフィルタでＱｄｏｔ５２５の蛍光強度を１／１０にした場合、図２８（Ｂ）に示すように、漸近の速度を比較的緩やかにできるため、蛍光体識別精度の向上が期待できる。ドナーの蛍光強度変化は、ＦＲＥＴ発生を確認するために必要である。そのため、ドナーの蛍光強度およびＦＲＥＴ発生時の蛍光強度低下が十分に検出でき、さらに２次元センサカメラの飽和電荷量を超えないように、アクセプタの蛍光強度の０.５倍から５倍まで低下させるのが適当である。例えば、ドナーの蛍光強度がアクセプタの１０倍であれば、ドナーの蛍光強度を１／２から１／２０にするようにロングパスフィルタを設計すればよい。ロングパスフィルタの特性は、図２８（Ａ）のほか、図２９（Ａ）に示すように、ドナーであるＱｄｏｔ５２５の蛍光波長帯域で一定の透過率であっても良い。この場合、Ｑｄｏｔ５２５の波長シフトに伴う透過蛍光強度の変化を抑制する効果がある。また図２９（Ｂ）のように緩やかな傾斜でも構わない。この場合、（Ａ）同様の効果のほかに、フィルタの製造が容易になる効果がある。尚、ロングパスフィルタの他に、ノッチフィルタ，バンドパスフィルタを用いても良い。ダイクロイックミラー３２，４００の特性は、図１５（Ｂ）のほかに、実施例１１で記述した方法で設計した非線形的に透過率（反射率）が変化するものでも構わない。

　また、図３０に示すように、ダイクロイックミラー３２，４００の特性として、ドナー（Ｑｄｏｔ５２５）の蛍光体帯域の透過率をほぼ０％（反射率ほぼ１００％）とし、最短波長のアクセプタ蛍光体（Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ５４６）の極大波長から最長波長のアクセプタ蛍光体（Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ６６０）の極大波長までをほぼ線形的に透過率を増加させてもよい。このとき、Ｑｄｏｔ５２５の蛍光成分は、殆ど全て反射側の像として検出されるため、強度比は殆ど０となる。Ｑｄｏｔ５２５の強度比を殆ど０とすることで、４種Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒの強度比を０から１００％の間でほぼ均等に割り振れるので、アクセプタ蛍光体種の識別精度向上が期待できる。尚、図３０に示したダイクロイックミラー３２，４００の透過率は、線形的に変化させるほかに、実施例１１で示したように非線形的に変化させても良い。

　また、ＦＲＥＴ観察の試薬として、上記の他種々の組み合わせ、たとえば、ドナーにＱｄｏｔ５６５、アクセプタにＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ６３５，Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ６６０，Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ７００，Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ７５０が使用できる。図３１（Ａ）はこれらの試薬の蛍光スペクトルであり、図３１（Ｂ）は本試薬の場合のロングパスフィルタ（バンドパスフィルタ）の透過率特性、図３１（Ｃ）は本試薬の場合のダイクロイックミラーの透過率特性である。本例の場合も、上記と同様に、Ｑｄｏｔ５６５の強度比が殆ど０になり、４種Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ蛍光体の強度比を０から１００％の間でほぼ均等に割り振れるので、アクセプタ蛍光体種の識別精度向上が期待できる。

５，１０４ｂ，１０４ｅ，４０１，４０２，４０３　ミラー
７　プリズム
８，６０　基板
８ａ，６０ａ　反応領域
８ｉｊ，６０ｉｊ　ＤＮＡが捕捉される領域
９，２０４　フローチャンバ
１０　廃液チューブ
１１　廃液容器
１２　試薬導入口
１３　蛍光
１４　集光レンズ（対物レンズ）
１５，４０６　フィルタユニット
１６　透過光観察用鏡筒
１７ａ，１７ｂ，１７ｃ，１７ｄ，１７ｅ，４０４，４０５　補助フィルタ
１８ａ，１８ｂ，１８ｃ，１８ｄ，１８ｅ，４０７，５０２　結像レンズ
１９ａ，１９ｂ，１９ｃ，１９ｄ，１９ｅ，４０８，５０３　２次元センサカメラ
２０ａ，２０ｂ，４０９　２次元センサカメラコントローラ
２１　制御ＰＣ
２２，２４　モニタ
２３　ＴＶカメラ
２５　分注ユニット
２６　分注ノズル
２７　試薬保管ユニット
２７ａ　試料液容器
２７ｂ，２７ｃ，２７ｄ，２７ｅ　ｄＮＴＰ誘導体溶液容器
２７ｆ　洗浄液容器
２８　チップボックス
２９　自動ピントあわせ装置
３０，３１，６１，６２，６３　位置きめマーカ
３２，１０３，１０４ａ，３００，３０１，４００，５０１　ダイクロイックミラー
６０ｂ　マスク
１００，１０１ａ，１０１ｂ，１０１ｃ，１０１ｄ，１０１ｅ　レーザ装置
１０２ａ，１０２ｂ，１０２ｃ，１０２ｄ，１０２ｅ　λ／４波長板
２００　測定基板
２０１　ＰＤＭＳ樹脂
２０２　窪み
２０３　ホルダ
２０５　基板保持具
２０６　貫通孔
２０７　開口部
２０８　流路
２０９　ＸＹステージ
２１０　プリズムホルダ
ｄｘ，ｄｙ　領域８ｉｊの間隔の寸法

Claims

　オリゴヌクレオチド等の生体関連分子が捕捉される基板に蛍光測定用の光を照射し、生じる蛍光を集光し、２次元検出器に結像させ、２次元検出器にて蛍光検出する装置であって、
　分子が捕捉されうる領域が複数設けられ、それらが格子構造の格子点位置に配置される基板と、
　光励起用の光源と、
　照射光学系と蛍光集光系と、集光した光を指定の波長範囲において実質的に各々の波長で異なる比率で分割する分離部と、
　分割された光を検出器に結像する結像光学系と、
　分割され結像された光を各々検出するための複数の検出画素を備えた検出器と、
　検出された光強度の比から蛍光体種を判定するデータ処理部を具備する蛍光検出装置。
　オリゴヌクレオチド等の生体関連分子が捕捉される基板に蛍光測定用の光を照射し、生じる蛍光を集光し、２次元検出器に結像させ、２次元検出器にて蛍光検出する装置であって、
　分子が捕捉されうる領域が複数設けられ、それらが格子構造の格子点位置に配置される基板と、
　光励起用の光源と、
　照射光学系と蛍光集光系と、
　複数の蛍光体からの蛍光強度を各々指定の波長帯ごとに異なる比率に分割する分離部と、
　異なる比率で分割された光をそれぞれ検出する画素を有する検出器
を有する蛍光検出装置。
　オリゴヌクレオチド等の生体関連分子が捕捉される基板に蛍光測定用の光を照射し、生じる蛍光を集光し、２次元検出器に結像させ、２次元検出器にて蛍光検出する装置であって、
　分子が捕捉されうる領域が複数設けられた基板、または分子が捕捉された基板と、
　光励起用の光源と、
　照射光学系と蛍光集光系と、
　複数の蛍光体からの蛍光強度を各々指定の波長帯ごとに異なる比率に分割する分離部と、
　異なる比率で分割された光をそれぞれ検出する画素を有する検出器を有する蛍光検出装置。
　オリゴヌクレオチド等の生体関連分子が捕捉される基板に蛍光測定用の光を照射し、生じる蛍光を集光し、２次元検出器に結像させ、２次元検出器にて蛍光検出する装置であって、
　分子が捕捉されうる基板、または、分子が捕捉された基板と、
　光励起用の光源と、
　照射光学系と蛍光集光系と、
　集光した光を指定の波長範囲において実質的に各々の波長で異なる比率で分割する分離部と、
　異なる比率で分割された光をそれぞれ検出する画素を有する検出器を有する蛍光検出装置。
　請求項１から４のいずれか記載の蛍光分析装置において、
　基板上に複数の蛍光体が存在し、蛍光体は各々異なる蛍光を発し、その強度を複数の検出画素を有する１個または２個の検出器で検出し、第１の蛍光体からの蛍光強度比率が、ほかの蛍光体からの蛍光強度比と異なることを特徴とする蛍光検出装置。
　請求項１または２記載の蛍光分析装置において、該格子構造の格子点位置に微小な金属構造物を設けたことを特徴とする蛍光分析装置。
　請求項１または２記載の蛍光分析装置において、
　該格子構造の格子点位置に微小開口を有し、光学的に不透明な材質の薄膜で構成された基板を使用することを特徴とする蛍光分析装置。
　オリゴヌクレオチド等の生体関連分子が捕捉される基板に蛍光測定用の光を照射し、生じる蛍光を集光し、２次元検出器に結像させ、２次元検出器にて蛍光検出する装置であって、
　分子が捕捉されうる領域が複数設けられた基板、または分子が捕捉された基板と、
　光励起用の光源と、
　照射光学系と蛍光集光系と、
　集光した光を指定の波長範囲において、波長ごとに実質的に異なる比率で検出する複数の検出画素を有するＮ（≧１）個の検出器を具備し、
　Ｎ個の検出強度の比率からＫ（＞Ｎ）種の蛍光体を識別するデータ処理部を有することを特徴とする蛍光検出装置。
　オリゴヌクレオチド等の生体関連分子が捕捉される基板に蛍光測定用の光を照射し、生じる蛍光を集光し、２次元検出器に結像させ、２次元検出器にて蛍光検出する装置であって、
　分子が捕捉されうる領域が複数設けられた基板、または分子が捕捉された基板と、
　光励起用の光源と、
　照射光学系と蛍光集光系と、
　４種以上の複数の蛍光体からの蛍光強度を、各々の蛍光極大波長帯ごとに異なる比率に分割する分離部と、
　異なる比率で分割された光をそれぞれ検出する画素を有する検出器
を有する蛍光検出装置。
　オリゴヌクレオチド等の生体関連分子が捕捉される基板に蛍光測定用の光を照射し、生じる蛍光を集光し、２次元検出器に結像させ、２次元検出器にて蛍光検出する装置であって、
　分子が捕捉されうる領域が複数設けられた基板、または分子が捕捉された基板と、
　光励起用の光源と、
　照射光学系と蛍光集光系と、
　４種以上の複数の蛍光体からの蛍光強度を、各々の蛍光極大波長帯ごとに異なる比率に分割する分離部と、
　異なる比率で分割された光をそれぞれ検出する画素を有する単一の検出器
を有する蛍光検出装置。
　請求項１から４のいずれかに記載の蛍光分析装置であって、
　基板が実質的に透明な基板であり、照射光学系が全反射照明であることを特徴とする蛍光分析装置。
　請求項８から１０のいずれかに記載の蛍光検出装置であって、
　基板が実質的に透明な基板であり、照射光学系が全反射照明であることを特徴とする蛍光検出装置。
　請求項１から４および８から１０のいずれか記載の蛍光分析装置において、
　前記分離部は、励起光の波長と前記蛍光体の吸収極大波長の差が１番大きい蛍光体種と２番目に大きい蛍光体種の蛍光極大波長において、透過率をほぼ０％とほぼ１００％またはほぼ１００％とほぼ０％とする特性を有することを特徴とする蛍光検出装置。
　請求項１から４および８から１０のいずれかの記載の蛍光分析装置において、
　前記蛍光は、複数の蛍光体から発せられ、前記複数の蛍光体の１つは励起光源によって励起されるドナー、その他の蛍光体は前記ドナーからのエネルギー移動によって励起されるアクセプタ蛍光体であることを特徴とする蛍光検出装置。
　請求項１４記載の蛍光分析装置において、
　前記ドナーの蛍光を、前記アクセプタの蛍光と実質的に異なる光路に分離する第２の２色性ミラーをさらに有し、前記アクセプタの蛍光は、前記分離部により、異なる各々の蛍光極大波長帯ごとに異なる比率に分割されることを特徴とする蛍光検出装置。
　オリゴヌクレオチド等の生体関連分子が捕捉された基板に蛍光測定用の光を照射し、生じる蛍光を集光し、蛍光検出する装置であって、
　集光した光を指定の波長範囲において実質的に各々の波長で異なる比率で分割する分離部と、
　分割された光を各々検出するための検出器と、
　検出された光強度の比から蛍光体種を判定するデータ処理部を具備する蛍光検出装置。
　オリゴヌクレオチド等の生体関連分子が捕捉された基板に蛍光測定用の光を照射し、生じる蛍光を集光し、２次元検出器に結像させ、２次元検出器にて蛍光検出する装置であって、
　分子が捕捉される個々の領域からの蛍光、または捕捉した個々の蛍光分子からの蛍光を、指定の波長範囲において実質的に各々の波長で異なる比率で分割し、
　分割した光を、各々、輝点あたり２５画素数以内の大きさで検出し、
　検出された光強度の比から蛍光体種を判定することを特徴とする蛍光検出装置。
　オリゴヌクレオチド等の生体関連分子が捕捉された基板に蛍光測定用の光を照射し、生じる蛍光を集光し、２次元検出器に結像させ、２次元検出器にて蛍光検出する装置であって、
　分子が捕捉される個々の領域からの蛍光、または捕捉した個々の蛍光分子からの蛍光を、指定の波長範囲において実質的に各々の波長で異なる比率で分割し、
　分割した光を、各々、輝点あたり９画素数以内の大きさに結像して検出し、
　検出された光強度の比から蛍光体種を判定することを特徴とする蛍光検出装置。
　オリゴヌクレオチド等の生体関連分子が捕捉された基板に蛍光測定用の光を照射し、生じる蛍光を集光し、２次元検出器に結像させ、２次元検出器にて蛍光検出する装置であって、
　分子が捕捉される個々の領域からの蛍光、または捕捉した個々の蛍光分子からの蛍光を、３２画素数以下で検出し、蛍光体種を判定することを特徴とする蛍光検出装置。
　オリゴヌクレオチド等の生体関連分子が捕捉された基板に蛍光測定用の光を照射し、生じる蛍光を集光し、２次元検出器に結像させ、２次元検出器にて蛍光検出する装置であって、
　分子が捕捉される個々の領域からの蛍光、または捕捉した個々の蛍光分子からの蛍光を、１８画素数以下で検出し、蛍光体種を判定することを特徴とする蛍光検出装置。