CN113956963A - 一种液滴型数字化pcr系统使用的平铺芯片及荧光探测系统 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种液滴型数字化PCR系统使用的平铺芯片及荧光探测系统，其中平铺芯片包含N个乳液接收部，其中N为不小于2的整数，与所述N个乳液接收部流体性连通的N个独立的平铺区域，与乳液接收部相对间隔设置的排出部，所述N个乳液接收部同时或者顺序接收N个不同的乳液样本，并将所述N个不同的乳液样本以单层平铺的状态分布于所述N个独立的平铺区域，所述N个独立的平铺区域中之前的介质经由所述排出部排出，通过本发明的平铺芯片设计可以高效快速地完成多个乳液样本的快速平铺转移，还可以生成高质量的阵列化平铺状态，从而使得探测过程能够低成本且高效化地被实现。

Description

一种液滴型数字化PCR系统使用的平铺芯片及荧光探测系统

技术领域

本发明涉及数字类型PCR技术领域，特别涉及一种液滴型数字化PCR系统使用的平铺芯片及荧光探测系统。

背景技术

数字聚合酶链反应(dPCR)是对传统PCR方法的改进,可用于直接定量核酸序列的原始拷贝数，该思想发展最早来源于在液滴内进行独立地扩增，进而检测扩增产物的思维，以液滴为载体进行核酸分子链的扩增思想最早可见于英国医药研究委员会，之后转让给英国研究与创新基金会的系列化专利申请中，1999年12月16日提交的专利申请号US 09/464122美国申请，其主要保护了分割液滴化思维的早期雏形方案；2002年10月03日提交的专利申请号US10/263984提出了在微液滴中增殖并筛选出特定的遗传核酸基因片段的方案等等；比较系统化明确化地提出利用荧光方案来实现定量化PCR的实现思维和实现系统，可见于2003年07月02日英国曼彻斯特大学递交的申请号为GB2003015438的英国申请，然而其为基于微通道上精细检验的荧光检测方案，受制于微通道尺寸的限制，该方案对于荧光探测系统的分辨率要求较高，同时为了保证检测的准确性最优地在微通道内液滴串行地通过所述通道，也就是不同液滴最优地不包含重叠部分逐一通过所述荧光系统，实现对于液滴的精确分类，然而这一方案存在效率特别低的技术问题，同时对于系统分辨率也有较高的要求，先进流体逻辑公司于2012-06-29日递交的申请号为US61/666490的美国专利申请，公开了一种对于液滴类型PCR获取多种不同目标核酸片段信息的方案，然而其提出的方案实际为多组并联的探测系统模块方案，其采用四个不同的发射端和四个对应的接收端来进行探测，然而这一方案对于成本要求很高，并且为了保证每个不同的系统对于被探测对象准确探测需要校正每个探测系统的焦点或焦平面导致整个系统复杂度更高。目前市面上已经出现的液滴类型数字PCR技术主要有三种，1)是通过在特定仪器中使用流动的油切断水相的PCR溶液形成液滴，然后在另外的两台仪器中完成PCR和检测；2) 是通过将PCR溶液分布到挖空的硅片上，然后在特定仪器中进行PCR以及另外一台仪器中进行检测；3)是在一种仪器上将液体通过狭窄的沟道注入腔体形成液滴，并完成PCR，然后在另一台仪器中完成检测。然而，当前的三种方法的液滴形成速度或者通量各有限制。此外，上述三种技术无一例外的依赖多台大型仪器。这不但增加了仪器的购置的成本，限制了数字PCR的广泛使用；而且增加了实验操作的复杂度；多台设备中间的转运也使得检测输出的结果可重复性并不高。

为了配合液滴类型PCR实现分辨率保证同时能够实现多种目标核酸片段的同时被探测的高效化系统，需要开发一种适应性乳液平铺芯片以及使用其完成荧光探测的荧光探测系统以保证数字化PCR系统的可靠准确与高自动化的实现。

发明内容

本申请的目的在于，针对上述现有技术中的不足提出了一种液滴类型数字化PCR系统使用的平铺芯片及利用其完成探测的荧光探测系统，以解决现有的需要在分隔的模块中实现检测而导致污染风险与结果重复性较差的问题，并利用本发明的平铺芯片实现高效化准确检测的目标，同时由于本发明的方案为阵列化的液滴平铺模块，利用荧光探测系统焦点或者焦平面始终保持不变，调整方便也不用使用特殊要求的探测系统即可实现探测，同时为了保证对于多组不同的目标核酸片段进行探测获得不同的量化结果，本发明利用k组激发光路的选择模块，实现利用所述光路选择模块能被控制从所述光路选择模块的不同部位输出k组不同激发光信号，进一步所述选择模块可以为集合了二向色镜单元、激发光端偏振单元与荧光接收端偏振单元的复合型光路选择单元，只需要单纯移动所述光路选择单元整体即可实现不同的通道之间切换，解决了多组件切换可能存在的可靠性较低的问题，同时本方案只需要移动载样台来保证不同区域位于焦点或者焦平面内，从而实现了探测结果的准确可靠。

为实现上述目的，本申请实施例采用的技术方案如下：

本申请实施例提供了一种液滴类型数字化PCR系统使用的平铺芯片，包含N个乳液接收部(其中N为不小于2的整数)，与所述N个乳液接收部流体性连通的N个独立的平铺区域，与乳液接收部相对间隔设置的排出部，所述N个乳液接收部同时或者顺序接收N 个不同的乳液样本，并将所述N个不同的乳液样本以单层平铺的状态分布于所述N个独立的平铺区域，所述N个独立的平铺区域中之前的介质经由所述排出部排出。

可选地，所述N个独立的平铺区域中每个平铺区域容纳乳液样本容积范围为：75-250 μL。

可选地，所述N个独立的平铺区域具有与所述乳液中液滴粒径相匹配的高度特征，以保证所述N个不同的乳液样本以单层平铺的状态分布于所述N个独立的平铺区域。

可选地，所述N个独立的平铺区域中每个还包含整流结构，所述整流结构为以预设间隙排列的多个圆柱。

可选地，还包含与所述N个乳液接收部同轴布置的N个流体介质注入部，其与所述乳液接收部至少流体性互不相通。

可选地，所述N个独立的平铺区域中每个还包含识别结构，所述识别结构具有在检测过程中能被识别的尺寸特征。

可选地，所述N个不同的乳液样本为完成扩增之后的乳液样本。

第二方面本发明还提供了一种利用第一方面的平铺芯片完成探测的荧光探测系统，包含光路系统，所述光路系统包含于焦点和/或焦平面固定的探测系统内，所述探测系统的接收端也固定安装；载样台，其能够承载所述平铺芯片，所述载样台具有在水平面移动的特性，使得所述平铺芯片的至少部分处于所述光路系统的焦点和/或焦平面位置，所述接收端获得所述光路系统发射端发出的激发光经所述平铺芯片中被探测的液滴荧光反射的返回光信号。

可选地，所述光路系统包含k组不同波长的激发光通道(其中k为不小于2的整数)，所述探测系统对于所述平铺芯片相同部分内的液滴执行k次激发光探测，并在所述接收端接收k次不同的荧光信号。

可选地，当所述接收端完成所述平铺芯片当前部分内液滴荧光信息接收后，所述载样台在水平面内移动，使得至少部分不同于当前部分的第二部分处于所述光路系统的焦点和 /或焦平面位置。

本申请的有益效果是：

本申请实施例提供的一种液滴类型数字化PCR系统使用的平铺芯片包含包含N个乳液接收部(其中N为不小于2的整数)，与所述N个乳液接收部流体性连通的N个独立的平铺区域，与乳液接收部相对间隔设置的排出部，所述N个乳液接收部同时或者顺序接收 N个不同的乳液样本，并将所述N个不同的乳液样本以单层平铺的状态分布于所述N个独立的平铺区域，所述N个独立的平铺区域中之前的介质经由所述排出部排出，在一个平铺芯片中设置不少于两个平铺区域能够实现对于多个样本溶液的同时处理，保证系统高效运行，另外平铺状态使得液滴能够以密集阵列化方案平铺于不同的平铺区域中如此对于后续设置大区域的场检测是非常有效的，也保证了后续检测的高效性，对于检测模块设计要求也具化保证了检测系统的最简化结果。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本申请的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本申请实施例提供的一种平铺芯片组成示意图；

图2为本申请实施例提供的一种平铺芯片整体示意图；

图3为本申请实施例提供的一种平铺芯片底部及局部放大示意图；

图4为本申请实施例提供的一种平铺台内平铺芯片接收乳液示意图；

图5为本申请实施例提供的一种平铺台内平铺芯片与盛装乳液容器配合结构示意图；

图6为本申请实施例提供的一种平铺台内平铺芯片与盛装乳液容器配合实现乳液转移功能示意图；

图7为本申请实施例提供的一种在平铺台中完成平铺操作之后平铺效果示意图；

图8为本申请实施例提供的一种利用本发明的平铺芯片实现探测的荧光探测系统工作原理示意图；

图9为本申请实施例提供的一种偏振单元与二向镜单元组成的组合单元结构示意图；

图10为本申请实施例提供的一种多通道组合形成的光路选择模块示意图；

图11为本申请实施例提供的一种5个可选择通道的光路选择模块结构示意图；

图12为本申请实施例提供的一种使用本发明的平铺芯片在探测系统中完成荧光探测的荧光探测系统结构示意图；

图13为本申请实施例提供的一种荧光探测系统的另一状态示意图。

具体实施方式

为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本申请实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。

因此，以下对在附图中提供的本申请的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本申请的范围，而是仅仅表示本申请的选定实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步定义和解释。

目前研究的液滴类型的PCR系统按照操作类型主要分为连续类型液滴定量化PCR，主要原理为驱动油性溶液和包含核酸序列的水性溶液在集成的微流道内利用油性溶液对于水性溶液的剪切作用实现水性溶液的液滴化，利用微循环泵配合微阀门实现液滴在相对封闭的系统中循环于不同的温度区，通过特定次数的循环之后，配合微阀门的打开在后端设置微通道检测部，从而实现对于扩增循环完成之后的微液滴荧光特性进行检测，现有技术公开最多的为二元判定的阴阳性结果对于液滴进行统计，之后结合泊松分布算法计算出绝对定量化的原始拷贝结果；另一类型的液滴定量化PCR为非连续类型，其基本原理为制备包含核酸序列的水性溶液与油性溶液，将两者驱动通过液滴生成芯片，通常系统做成一体化，生成液滴之后，在驱动力的作用下被转移至能够平铺液滴的芯片中，在此条件下通过对于平铺芯片进行热循环，进而实现原水性溶液内的核酸分子链循环扩增，经过预定次数的循环扩增之后对于平铺芯片内的液滴进行分类统计以获得原始溶液内的拷贝数，然而现有技术中大多数芯片为一体化集成化设计，在微尺度条件下还需要考虑加热过程中的密封，还需要考虑对于特殊的模块例如PCR扩增模块，需要进行循环的温度升高与降低，一体化结构将非常占用空间，并且对于一体化模块整体的耐受性将有特别高的要求，如此整体设计实现将非常复杂，加工难度也很高，如此设计自动型的液滴定量化设备将存在极大的困难。

为了发展一种非连续类型的液滴PCR实现利用一台对于样本能够更多通道地识别出不同的目标核酸片段，需要匹配开发一种适配于液滴类型PCR的检测系统，以满足检测调整迅速并且满足多通道多样品等等的要求。为了满足检测的需求，通常需要制备包含核酸序列的水性溶液，其来源可以为待实验的标准核算序列溶液，也可以为对于各种采集方案采集获得的样品提取获得的核酸序列，例如采用咽拭子、全血采样、鼻拭子、肛拭子等等获得待检测样品，获得待检测样品之后经过例如磁珠提取方案对于样品中的核酸序列分离提取获得，同时为了实现荧光类型的探测所述水性溶液中还包含荧光染料或荧光探针。例如荧光染料包括荧光素类染料其包含异硫氰酸荧光素(FITC)、羟基荧光素(FAM)等及其类似物；罗明类染料包含红色罗丹明(RBITC)、四甲基罗丹明(TAMRA)等及其类似物；Alexa系列染料包含AlexaFlour350、405、430等等及其类似物；Cy系列菁染料包含Cy2、Cy3等等及其类似物；蛋白类染料包含藻红蛋白(PE)、藻蓝蛋白(PC)等等及其类似物；不同的荧光素的基本特征参数可以参见如下表1所示

表1.荧光素主要参数

对于实时荧光定量PCR，量子产率为Q，由此可以获得荧光发射率为：

F＝QA＝2.302QKCL

其中，C一般为0.2μmol/L，L一般为1cm，以FAM为例，计算得到表2的结果

表2.FAM荧光素在不同激发光波长下基本特性参数

激发波长(nm)	归一化吸收系数	吸收率	发射率
				494	1.00	3.50％	3.15％
488	0.95	3.33％	3.00％
				470	0.57	2.00％	1.80％
465	0.49	1.72％	1.55％

激发波长与荧光素的匹配十分关键,发射光强比激发光小2个数量级,其他类型的荧光素不再详细进行说明，荧光探针包括化学荧光探针包括有机小分子荧光探针，纳米荧光探针；基因荧光探针等等；荧光探针种类也比较多此处不再详细列举，荧光素与荧光探针的工作原理类似响应于一种波长的激发光之后会被激发从而发射出与其波长不相同的发射光，从而实现荧光探测的效果。

图1为本发明提出的配合荧光探测系统来完成探测的平铺芯片结构示意图，结合图3 乳液接收部11为设置在平铺芯片底部的外环流道，其与平铺区域相连接，本实施例中所述乳液接收部的数量N设置为4个，当然也可以为不小于2的其他整数，从而保证一次能够对于更多的乳液样本进行处理，同时也不能设置过多的乳液接收部11，这样将导致系统设计复杂，高自动化的实现将存在更大的障碍，乳液接收部可以与平铺区域通过多个流通通道相连接，从而保证分配结构能够快速地完成乳液的平铺操作，当然所述多个流通通道也可以按照树形分叉方案设计，在这一情况中平铺区域为4个独立的区域，4个不同的样本乳液可通过4个不同的连接结构转移至4个独立的平铺区域121、122、123、124中，为了保证液滴排布更为紧凑以满足探测系统设计更为简便的效果，在每个平铺区域中设置整流结构15，所述整流结构15为以预设间隙排列的多个圆柱，当然所述整流结构15为多组设置的以保证每个平铺区域的乳液均能被可靠地单层平铺，也就是至少部分的液滴不包含重叠或者堆叠部分，所述整流结构也可以包含疏水涂层以保证不破坏所述乳液中的液滴，当然预设间隙设置最优不能使乳液中液滴产生过大的变形，同时所述整流结构也可以起到支撑作用从而保证每个平铺区域能够具有更均匀一致的高度尺寸等，进一步为了保证对于液滴尺寸能够有比较可靠的参照，另外也考虑到当荧光探测系统不能一次性覆盖整个平铺芯片的所有范围，需要对于相同的平铺芯片进行多于一次的拍摄，此时需要将多次拍摄结果进行拼接以获得完整的平铺芯片内探测结果，因此为了保障参照可靠与拍摄结果的可靠结合，每个所述平铺区域还设置有识别结构16，所述识别结构16具有在检测过程中能被识别的尺寸特征，例如其可与平铺芯片内液滴粒径具有差别化特征尺寸以保证识别结构16能被容易识别，本实施例中的识别结构16为四个柱形结构组成的一组结构，每个平铺区域中包含多组识别结构16，所有平铺区域中的每一个中整流结构15与识别结构16间隔设置，当然为了保证更高的识别效果，所述整流结构15(整流结构15的基本作用是对于进入平铺芯片不同区域内的微液滴进行整流，相当于堤坝作用，使得整个平铺过程能够更为均匀充实地平铺，当然不同组别的整流结构也可以采用交错排布的形式，图示并非限定性实施例)也可以作为识别结构，从而提供更多的参照，另外所述识别结构16也可以具有支撑作用，此处并不限定，在工作过程中乳液接收部将乳液导入平铺芯片的平铺区域中，之前平铺芯片内可包含其他介质例如空气或者封存的油等等，在平铺芯片导入乳液的过程中之前的其他介质可经由连通排出缓冲部13的排出部131排出，为了防止污染的风险，所述排出部131内包含过滤组件，当然排出部可以设置为与所述平铺区域数量相对应的4个，也可设置为一个的结构，此处不限定，为了保证平铺芯片各个部位排出介质的阻力基本相同，所述排出缓冲部包含多个连通于所述平铺区域的排出通道，为了保证探测得到结果的准确性真实性并且具有更高的可重复性，所述N个独立的平铺区域中每个平铺区域容纳样本乳液容积范围为：75-250μL，进一步所述N个独立的平铺区域具有与所述乳液中液滴粒径相匹配的高度特征，以保证所述N个不同的乳液样本以单层平铺的状态分布于所述N个独立的平铺区域，其高度尺寸特征例如可以为1、1.1、1.2、1.3等等倍的液滴平均粒径尺寸，当然特殊情况下高度尺寸特征也可以稍小于液滴平均粒径尺寸此处也并不限定。

图2为本发明的平铺芯片整体结构示意图，所述平铺芯片可以包含分层结构，可分别成型盖板和底层结构，在所述底层利用蚀刻、注塑或者激光加工等等方案成型出图1各个功能结构，之后再将两个部分粘合或者焊合，所述平铺芯片具有透明的特征或者至少顶部具有透明的特征以保证探测系统能够进行探测，可以采用塑料、玻璃等等具有透明或者半透明特征材料制备，此处并不限定，为了保证平铺芯片能够被容易地转移，所述平铺芯片还包含转移夹持结构17。

图3为本发明所提供的平铺芯片背面结构和局部放大结构示意图，在图中乳液接收部可以为11，14为与所述N个乳液接收部11同轴布置的N个流体介质注入部，其与所述乳液接收部至少流体性互不相通，注入的流体介质可以为与乳液中水性溶液和油性溶液性质均不相同的第三类型的流体，此处并不限定。

图4为本申请实施例提供的一种在平铺台结构内，带盖体结构的第一容器(也就是扩增完成之后乳液的盛放部，以下不再另行区分)与所述平铺芯片结合的示意图，平铺芯片包含穿透部可以穿透第一容器配合的盖体结构的可操作密封部，实现所述穿透部与所述第一容器的子容器单元相连通，从而在平铺台中当所述第三类型液体由所述穿透部的中心流道，进入所述第一容器的子容器单元中以驱动所述第一容器内的乳液实现转移，所述N个不同的乳液样本为完成扩增之后的乳液样本(由于在平铺步骤之前乳液样本已经完成热循环扩增，因此对于平铺芯片的材料无需严格的耐热要求，同时也能够克服利用较大尺寸的平铺芯片循环扩增所具有的热惯性大，并且配置相应的对于加热均匀性控制精度高要求的加热器具有高成本要求的缺点，采用本发明的扩增之后进行平铺方案整体可靠性更高实现难度低成本也更低)，从而实现了在完成平铺操作之后，所述平铺芯片可以直接被转移至探测系统的载样台以完成荧光检测，在一种情况下，所述第三类型液体可以为与所述第一容器内的油性溶液相同的液体，其密度可以大于所述水性溶液的密度，以实现在所述第三类型液体注入所述第一容器过程中抬升液面使得所述乳液实现转移，在另一种情况下所述油性溶液密度小于所述水性溶液密度，随着所述第三类型液体注入所述第一容器过程中，受到重力等的作用力所述乳液被转移至所述平铺芯片中，在这一过程中所述中心流道可以被设计为转移流道而与所述平铺芯片实现相连接，而所述外环流道则被设计为第三类型流体的注入流道，且所述中心流道具有向所述第一容器内延伸更多的尺寸长度特征，当然此处并不限定具体的实现方案，利用本方案的容纳室设计，可以实现4组不同样液对应的液滴转移进入平铺芯片的不同子容纳区域，从而实现系统能够快速获取多对象不同目标核酸片段检测的效果。

图5为本申请实施例提供的一种在平铺台结构内带盖体结构的第一容器与所述平铺芯片结合的示意图，其中所述带盖体的第一容器包含完成热循环扩增的溶液，由横切面示意图中可看出所述穿透部可以穿透所述第一容器配合的盖体结构的可操作密封部62，从而实现所述穿透部与所述第一容器的子容器单元61相连通，以实现在平铺台中当所述第三类型液体由所述穿透部的中心流道14，进入所述本体结构的第一容器的子容器单元61中以驱动所述本体结构的腔室内的乳液实现转移，当然此处并不限定具体的实现方案。

图6为本申请提供的一种在平铺台内实现乳液转移步骤的具体实现方案步骤示意图，步骤1)为第三类型液体注入的初始时第一容器的子容器单元61内乳液状态示意图，第三类型液体由中心流道14注入所述第一容器的子容器单元61，包含液滴的部分由于密度较小处于子容器单元61的上部，注入的第三类型液体密度可以大于所述乳液的微液滴密度，随着第三类型液体的注入在步骤2)中乳液中包含微液滴的部分被抬升，从而使得乳液接近所述外环设置的接收部，所述接收部可以具有倾斜的导流结构，从而使得乳液能够被快速且不受破坏地引导向平铺芯片10的平铺区域中，在步骤3)中随着第三类型的液体持续的注入，包含液滴的乳液基本全部被导流结构引导进入平铺芯片的平铺区域，此时可以停止注入所述第三类型的液体，以完成整个转移操作步骤，实现不同的第一容器的子容器单元61内油包水乳液在不同的平铺区域中单层平铺效果，当然所述第三类型液体可以与所述乳液的油包水中的油具有相似相溶的特性，此处也不限定。

图7为本申请所提供的一种平铺效果示意图，可以看到在本发明所提供的平铺芯片中，所述乳液能够实现单层液滴呈现阵列化平铺的效果，并且液滴之间基本不存在重叠或者堆叠的现象。

图8为利用本发明所提供的平铺芯片完成探测的荧光探测系统功能示意图，其包含激发光发射端3，按照本发明的设计方式，激发光发射系统无需特殊的改造，采用通常使用的激发光发射端即可，例如采用白光光源31，可见光420nm到750nm有连续的光谱分布，色温可选，此时白光作为一种复合光，可以通过偏振片设置从而产生不同波长的可见光(可以为赤、橙、黄、绿、蓝、靛和紫七种颜色之一)，由于系统采用复合的激发光发射端，因此本方案中的发射端光源设置为单光源，与现有技术中需要多组光源的方案相比，本方案具有更低的成本，而且利用单光源也能保证不同通道输出的光强度统一，从而使得探测结果具有更强的对比性可信性也更强，激发光发射端设置简单，只需要发光光源31和位于其后的准直透镜32即可实现激发光发射基本功能，当然为了保证激发光的可靠运行还可以在激发光发射端设置散热部等等；还包含光路选择模块4，其包含了激发光偏振单元 43，用于将所述激发光发射端3输出的复合光进行处理，使得特定波长的激发光才能通过所述激发光偏振单元43，沿光线传播方向在激发光偏振单元43的下游设置了二向色镜单元41，其基本原理是可以反射第一波长特性的光而透射第二波长特性的光，按照透射与反射特性的差异二向色镜可以被分为长通二向色镜和短通二向色镜，其中长通二向色镜可以使长波(EM)透过，而短波(EX)被反射，短通二向色镜则相反，其可以使短波(EX) 透过，而长波(EM)可以被透过，一般情况下二向色镜被布置为与入射光方向呈45°夹角的方式布置，当然此处并不严格现定于该角度的布置，可以有一定的偏差例如±5°的角度偏差，对于一般的二向色镜而言其通带的透过率大于90％，反射带的透过率小于5％，通过出光孔激发光被透射至载样台5上的平铺芯片10上，所述平铺芯片10内的处于平铺状态的微液滴由于内部包含荧光素或者荧光探针，当其与目标核酸片段结合后，会与淬灭基分离，从而使得液滴能呈现出不同的荧光特性，如之前所述荧光与激发光的波长不同，荧光的透过率可以达95％以上，在荧光穿透二向色性沿着荧光传播的下游，包含荧光接收端的偏振单元42，其可以精确地筛选出荧光光波，从而保证后续探测的准确性，光路选择模块4集合了激发光发射端的激发光偏振单元，二向色镜单元和接收端的荧光偏振单元，使得整个接收端2和发射端3不需要进行改变，接收端包含接收镜头组件21和CCD或者 CMOS组成的阵列型接收模块22，在一些特殊的场景下为了保证接收传感器的准确性，接收端的像素单元也可以采用处于盖革模式下的二极管像素单元，例如线性放大型器件APD 甚至处于雪崩状态下的雪崩光电二极管SPAD阵列，此处不限定，为了保证探测的准确性接收端固定安装其焦点和/或焦平面处于固定位置，当然在此条件下载样台5的平铺芯片 10最优地处于光学系统的焦点和/或焦平面位置处，此时接收端利用分辨率优先的设计被固定至可以获取到微液滴清晰界面处不用兼顾视场范围，从而保证不需要利用高精尖的显微镜头来实现兼容视场与分辨率的探测效果，本发明的方案只需要通过移动载样台使得更多区域可以逐次被探测从而完成范围更大的平铺芯片10内微液滴状态的探测，同时可保证探测均处于光学系统的焦点和/或焦平面位置附近，从而实现出厂之后焦平面和/焦点固定的效果，保证系统的可靠性。

图9为本申请实施例提供的一种探测模块原理实现示意图，光源发射激发光此处为白光，光源发射的激发光经过激发光偏振单元43之后被滤除成为单一波长类型的激发光，当此时激发光的波长为短波长激发光时将二向色镜41布置为长通二向色镜，此时激发光由于受到倾斜布置的二向色镜41的反射，从而改变传播方向被投射通过出光孔进入载样台上的平铺芯片10，由于平铺芯片10内为以离散液滴状态分布的包含核酸序列的乳液，在之前的扩增阶段由于荧光素或荧光探针与目标核酸片段配合而与淬灭基分离，从而当液滴中包含目标核酸片段时液滴会呈现荧光特性，为了分辨更多的目标核酸序列，所述液滴中的至少部分包含两种或者以上的荧光标引物，例如可以设置2、3、4、5等等种荧光标引物来完成不同目标核酸序列更完整的探测，由于荧光素和荧光探针的作用，荧光可以掺混而形成返回光300，在这一实施例中由于二向色镜41为长通类型，因此荧光的波长长于激发光波长，当混合光300经过二向色镜41时，混合光中的短波特性的激发光可以被大部分滤除达到95％以上的滤除，经过二向色镜镜之后只残留很少的激发光与荧光和其他干扰光形成的混合光310，再经过接收端荧光偏振单元的滤除可以获得更为纯正的荧光返回光320，从而被接收端探测以标示出平铺芯片10内当前探测部分内包含目标核酸片段的液滴。图10和图11示意了本发明所提出的光路选择模块示意图，在所述光路选择模块上设置不少于两个的选择通道，光路系统包含k组激发光路的选择模块，所述光路选择模块能被控制从所述选择模块的不同部位输出k组不同激发光信号，由图11示出了一种k＝5组不同激发光路的选择模块4，配合地也可将乳液内包含的荧光素或荧光探针种类数量设置为5，光路选择模块4的每个光路选择单元均包含激发光偏振单元43，二向色镜单元41 和荧光接收端偏振单元42，利用此类型的设计在本发明中只需要移动光路选择模块4，使得之一的光路选择单元处于探测系统的光路系统中，而不需要同时控制接收端激发端的复杂控制，同时光学系统一直处于静止状态保证了探测结果可靠结果的重复性也更高。

图12为本发明实施例提供的一种检测模块示意图，其能承载被探测的平铺芯片10的载样台5，配合开合结构载样台5可被一维地移动出或者入探测模块，所述探测模块设置为封闭的壳体结构内也实现了探测模块受其他模块影响较小的效果，也能尽可能减少交叉污染的风险，也使得整个探测过程受到外部光源的干扰更小，还包含激发光产生部3，用于产生主动的探测激发光，此处为混合的白色激发光，接收端2，接收经过被探测试样内反射激发的荧光，通过后续的处理模块处理输出原始样液的目标核酸序列的原始拷贝结果，光路选择模块4用于对激发光的输出光波长进行限定，例如该探测系统中包含5个偏振单元43，光路选择模块4包含内部倾斜布置的二向色镜41，改变激发光传播方向至载样台5，通过出光孔之后激发光被透射至容平铺芯片10上从而产生返回光信号，经过接收端荧光偏振单元42的滤除产生纯的荧光而被接收端所探测识别，通过水平移动控制部的控制所述5个偏振单元的某一对准所述激发光源与所述探测接收单元，更优地，包含核酸序列的初始水性溶液中可以包含对应的5种不同的荧光染料或荧光探针，此处不限定于对于相同样品均进行5种不同的偏振单元进行检测，也不限定于系统检测的偏振单元数量为 5个，在这种设计中，激发光产生部与接收单元固定于固定的壳体上，可以保证其检测焦点或者焦平面始终不变保证检测的准确性和可重复性更高的效果，当平铺芯片10的当前部分完成5个不同所述光路选择模块的子单元时，所述载样台在水平面内移动，使得至少部分不同于当前部分的第二部分处于所述光路系统的焦点和/或焦平面位置，如此可以解决视场范围与分辨率的矛盾问题，同时整个载样台不具有高度上差异不会引起液滴之间的融合力增强导致检测结果可重复性较差的问题，所述接收端能够通过l次接收(其中l为大于等于2的整数)，完成相同所述容纳室中所有液滴的完整结果，同时由于光路系统未做任何改变也能保证探测结果处理难度降低，当然也不限于上述步骤可以先获得某一光路选择单元内的结果之后再获取其他的光路选择单元，图13与图12为相同探测系统的不同状态示意图，此处不再赘述各个模块功能。

下表3为利用本发明的平铺芯片配合荧光探测系统实现液滴定量化方法在实际测试中获得的定量化结果，由下表结果可以得到利用本发明的系统可以实现准确且重复性高的可靠化定量结果。

表3.利用包含本发明平铺芯片与荧光探测系统的系统获得的定量化结果

需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步定义和解释。以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种液滴类型数字化PCR系统使用的平铺芯片，其特征在于，包含N个乳液接收部，其中N为不小于2的整数，与所述N个乳液接收部流体性连通的N个独立的平铺区域，与乳液接收部相对间隔设置的排出部，所述N个乳液接收部同时或者顺序接收N个不同的乳液样本，并将所述N个不同的乳液样本以单层平铺的状态分布于所述N个独立的平铺区域，所述N个独立的平铺区域中之前的介质经由所述排出部排出。

2.如权利要求1所述的液滴类型数字化PCR系统使用的平铺芯片，其特征在于，所述N个独立的平铺区域中每个平铺区域容纳乳液样本容积范围为：75-250μL。

3.如权利要求1所述的液滴类型数字化PCR系统使用的平铺芯片，其特征在于，所述N个独立的平铺区域具有与所述乳液中液滴粒径相匹配的高度特征。

4.如权利要求1所述的液滴类型数字化PCR系统使用的平铺芯片，其特征在于，所述N个独立的平铺区域中每个还包含整流结构，所述整流结构为以预设间隙排列的多个圆柱。

5.如权利要求1所述的液滴类型数字化PCR系统使用的平铺芯片，其特征在于，还包含与所述N个乳液接收部同轴布置的N个流体介质注入部，其与所述乳液接收部至少流体性互不相通。

6.如权利要求1所述的液滴类型数字化PCR系统使用的平铺芯片，其特征在于，所述N个独立的平铺区域中每个还包含识别结构，所述识别结构具有在检测过程中能被识别的尺寸特征。

7.如权利要求1所述的液滴类型数字化PCR系统使用的平铺芯片，其特征在于，所述N个不同的乳液样本为完成扩增之后的乳液样本。

8.一种利用如权利要求1所述的液滴类型数字化PCR系统使用的平铺芯片完成探测的荧光探测系统，其特征在于，包含光路系统，所述光路系统包含于焦点和/或焦平面固定的探测系统内，所述探测系统的接收端也固定安装；载样台，其能够承载所述平铺芯片，所述载样台具有在水平面移动的特性，使得所述平铺芯片的至少部分处于所述光路系统的焦点和/或焦平面位置，所述接收端获得所述光路系统发射端发出的激发光经所述平铺芯片中被探测的液滴荧光反射的返回光信号。

9.如权利要求8所述的荧光探测系统，其特征在于，所述光路系统包含k组不同波长的激发光通道，其中k为不小于2的整数，所述探测系统对于所述平铺芯片相同部分内的液滴执行k次激发光探测，并在所述接收端接收k次不同的荧光信号。

10.如权利要求8所述的荧光探测系统，其特征在于，当所述接收端完成所述平铺芯片当前部分内液滴荧光信息接收后，所述载样台在水平面内移动，使得至少部分不同于当前部分的第二部分处于所述光路系统的焦点和/或焦平面位置。

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