JP6349202B2 - 蛍光検出装置、被検物質検出装置、及び蛍光検出方法 - Google Patents
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Description
本発明は、蛍光検出装置、被検物質検出装置、及び蛍光検出方法に関する。
生体試料中に含まれる遺伝子又はタンパク質等の被検物質を検出する方法として、標識物質としての蛍光物質を被検物質に結合させ、励起光の照射によって蛍光物質から蛍光を発光させることにより被検物質を検出する方法がある。
以上のような方法を利用した装置として、ＣＭＯＳセンサ等の受光センサ上に被検物質に結合した蛍光物質を位置付け、この蛍光物質が発光する蛍光を受光センサによって広視野に検出可能なレンズフリー蛍光顕微鏡がある（例えば、非特許文献１参照）。
以上のような方法を利用した装置として、ＣＭＯＳセンサ等の受光センサ上に被検物質に結合した蛍光物質を位置付け、この蛍光物質が発光する蛍光を受光センサによって広視野に検出可能なレンズフリー蛍光顕微鏡がある（例えば、非特許文献１参照）。
非特許文献１記載の受光センサは、複数色を識別して検出することができる。また、受光センサ上にはプリズムが配置されており、このプリズムは、受光センサに対して斜めから照射された励起光を反射させることで、受光センサに入射させ難くし、励起光が受光センサにノイズとして検出されるのを防止している。
Scientific Reports, 4: 3760, DOI:10.1038, srep03760
前記非特許文献１記載のレンズフリー蛍光顕微鏡は、励起光を受光センサに入射し難くするためにプリズムを備えている。しかし、プリズムは非常に高価であるため、レンズフリー蛍光顕微鏡の高騰化の原因となる。
本発明は、高価なプリズムを使用しなくても、安価な構成で複数色の蛍光を識別して検出することができる蛍光検出装置、被検物質検出装置、および蛍光検出方法の提供に向けたものである。
本発明は、高価なプリズムを使用しなくても、安価な構成で複数色の蛍光を識別して検出することができる蛍光検出装置、被検物質検出装置、および蛍光検出方法の提供に向けたものである。
蛍光検出装置は、複数色を識別して検出する光検出器と、光検出器上に設けられており、光検出器が感度を有する波長域に含まれる所定の波長以上の波長域に含まれる波長の光を透過させ、所定の波長未満の波長域に含まれる波長の光をカットするフィルタ部材と、光源を有するとともに、当該光源からフィルタ部材上に位置付けられた測定対象の蛍光物質に、所定の波長未満の波長域にピーク波長を有する励起光を照射する照射部と、励起光の照射により蛍光物質から発せられる蛍光のうちフィルタ部材によってカットされる光の信号を補う第１の補正部と、を備え、前記光検出器と前記フィルタ部材と前記照射部とが前記光源の光軸に沿って並べて配置されている。
被検物質検出装置は、複数色を識別して検出する光検出器と、光検出器の上方に設けられており、光検出器が感度を有する波長域に含まれる所定の波長以上の波長域に含まれる波長の光を透過させ、所定の波長未満の波長域に含まれる波長の光をカットするフィルタ部材と、光源を有するとともに、当該光源から、フィルタ部材上に位置付けられた、生体試料に含まれる被検物質と蛍光物質とを含む複合体に、所定の波長未満の波長域にピーク波長を有する励起光を照射する照射部と、励起光の照射により蛍光物質から発せられる蛍光のうちフィルタ部材によってカットされる光の信号を補う第１の補正部と、を備え、前記光検出器と前記フィルタ部材と前記照射部とが前記光源の光軸に沿って並べて配置されている。
被検物質検出装置は、複数色を識別して検出する光検出器と、光検出器の上方に設けられており、光検出器が感度を有する波長域に含まれる所定の波長以上の波長域に含まれる波長の光を透過させ、所定の波長未満の波長域に含まれる波長の光をカットするフィルタ部材と、光源を有するとともに、当該光源から、フィルタ部材上に位置付けられた、生体試料に含まれる被検物質と酵素とを含む複合体中の酵素と基質との反応により生じる蛍光物質に、所定の波長未満の波長域にピーク波長を有する励起光を照射する照射部と、励起光の照射により蛍光物質から発せられる蛍光のうちフィルタ部材によってカットされる光の信号を補う第１の補正部と、を備え、前記光検出器と前記フィルタ部材と前記照射部とが前記光源の光軸に沿って並べて配置されている。
蛍光検出方法は、複数色を識別して検出する光検出器が感度を有する波長域に含まれる所定の波長以上の波長域に含まれる波長の光を透過させ、所定の波長未満の波長域に含まれる波長の光をカットするフィルタ部材上に、測定対象の蛍光物質を位置付ける工程、光源を有するとともに当該光源の光軸に沿って前記光検出器及び前記フィルタ部材と並べて配置された照射部により、前記フィルタ部材上の前記蛍光物質に、前記所定の波長未満の波長域にピーク波長を有する励起光を照射する工程、励起光により蛍光物質から発光されフィルタ部材を透過した可視光波長の蛍光を検出する工程、及び、励起光の照射により蛍光物質から発せられる蛍光のうちフィルタ部材によってカットされる光の信号を補う工程、を含む。
本発明によれば、安価な構成で複数色の蛍光を識別して検出することができる。
実施形態に係る被検物質検出システムの構成について説明する。図１に示されるように、実施形態に係る被検物質の検出システム１０は、被検物質検出装置１１と、信号変換装置１２と、画像処理装置１３とを備えている。
被検物質検出装置１１は、照射部２１と、フィルタ部材２２と、光検出器２３とを備えている。フィルタ部材２２と光検出器２３とは、この順で上から積層されている。照射部２１は、フィルタ部材２２及び光検出器２３の上方に配置されている。フィルタ部材２２上には、被検物質及び蛍光物質を含む複合体６５が位置付けられる。フィルタ部材２２上の複合体６５のうち蛍光物質が光検出器２３によって検出されることで、間接的に被検物質が検出される。したがって、本実施形態の被検物質検出装置１１は、蛍光検出装置としても機能している。
＜照射部２１の構成＞
照射部２１は、光源３１と、コリメート光学系３２とを備えている。光源３１には、例えばＬＥＤ（Ｌｉｇｈｔ Ｅｍｉｔｔｉｎｇ Ｄｉｏｄｅ）等の半導体素子が用いられる。光源３１は、その光軸Ｙが鉛直方向に沿うように配置され、下方に向けて光を照射する。光源３１は、電球等に比べて消費電力が比較的小さいＬＥＤ等の半導体発光素子によって構成されているので、光源３１が電球である場合に比べて省電力化を図ることができる。
照射部２１は、光源３１と、コリメート光学系３２とを備えている。光源３１には、例えばＬＥＤ（Ｌｉｇｈｔ Ｅｍｉｔｔｉｎｇ Ｄｉｏｄｅ）等の半導体素子が用いられる。光源３１は、その光軸Ｙが鉛直方向に沿うように配置され、下方に向けて光を照射する。光源３１は、電球等に比べて消費電力が比較的小さいＬＥＤ等の半導体発光素子によって構成されているので、光源３１が電球である場合に比べて省電力化を図ることができる。
コリメート光学系３２は、光源３１の下方に配置されている。コリメート光学系３２は、光源３１の光軸Ｙに沿って上下に並べられた２つのレンズ３３，３４を備えている。上方に配置された第１レンズ３３は、凹レンズからなり、光源３１の光を拡散する。下方に配置された第２レンズ３４は凸レンズからなり、第１レンズ３３によって拡散された光を平行光に変換する。第２レンズ３４を透過した平行光は、光源３１の光軸Ｙに沿って下方に向けて進行する。
光源３１が発する光は、３００ｎｍ以上４５０ｎｍ未満の範囲にピーク波長を有する紫外光とされている。より具体的に、本実施形態では、光源３１が発する紫外光は、ピーク波長が４０５ｎｍとされている。光源３１が発する紫外光は、フィルタ部材２２上に位置付けられた蛍光物質を励起し、当該蛍光物質から蛍光を発光させる励起光となる。
＜フィルタ部材２２の構成＞
図２に示されるように、フィルタ部材２２は、石英ガラス等のガラス板３６の表面に膜状に形成されている。フィルタ部材２２は、可視光波長域に含まれる所定の波長未満の波長域の光をカットし、所定の波長以上の波長域の光を透過する特性を有するロングパスフィルターとされている。フィルタ部材２２は、所謂、干渉フィルタにより構成されており、基板に誘電体多層膜と金属膜とをコーティングし、光の干渉作用を利用することで所定の波長域の光をカットすることができる。この干渉フィルタは、入射角依存性があり、その表面に対して垂直に入射する光に対しては高いカット特性をもつ。フィルタ部材２２は水平に配置されているので、照射部２１から下方に向けて進行する平行光が、フィルタ部材２２に垂直に入射する。
図２に示されるように、フィルタ部材２２は、石英ガラス等のガラス板３６の表面に膜状に形成されている。フィルタ部材２２は、可視光波長域に含まれる所定の波長未満の波長域の光をカットし、所定の波長以上の波長域の光を透過する特性を有するロングパスフィルターとされている。フィルタ部材２２は、所謂、干渉フィルタにより構成されており、基板に誘電体多層膜と金属膜とをコーティングし、光の干渉作用を利用することで所定の波長域の光をカットすることができる。この干渉フィルタは、入射角依存性があり、その表面に対して垂直に入射する光に対しては高いカット特性をもつ。フィルタ部材２２は水平に配置されているので、照射部２１から下方に向けて進行する平行光が、フィルタ部材２２に垂直に入射する。
本実施形態で用いられるフィルタ部材２２は、分光光度計によって測定した透過率が図５に示されるようになる。フィルタ部材２２は、５００ｎｍ付近の所定の波長Ａ以上の波長域が光を透過可能な透過波長域となり、所定の波長Ａ未満の波長域が光をカットするカット波長域となるような性質を有している。透過波長域とカット波長域との境界となる所定の波長Ａは、例えば、光の透過率が５％となるような波長に設定される。
前述したように本実施形態では、光源３１が発する励起光が４０５ｎｍのピーク波長を有しており、このピーク波長は、フィルタ部材２２のカット波長域に含まれているので、フィルタ部材２２は、励起光の大部分をカットする。光源３１が発する励起光は、フィルタ部材２２に対して垂直に入射する平行光であるので、フィルタ部材２２は、励起光を効率よくカットすることができる。
フィルタ部材２２は、光源３１からの励起光のピーク波長である４０５ｎｍの光の透過率が約０．０４％となっている。また、励起光のピーク波長よりも長波長の４５０ｎｍの光の透過率が約０．１％となっている。したがって、フィルタ部材２２は、４０５ｎｍ、４５０ｎｍのいずれの波長の光も９９％以上をカットする特性をもつ。
一方、フィルタ部材２２は、波長５１３ｎｍの光の透過率が９５％、波長５２０ｎｍの光の透過率が９２％、波長５５０ｎｍの光の透過率が９４％であり、いずれの光に対しても９０％以上の透過率をもつ。したがって、フィルタ部材２２は、蛍光物質から発せられる蛍光の透過率が、照射部２１から照射される平行光の透過率の９０倍以上となるような光の透過性を有している。
フィルタ部材２２は、以上のような特性を有するものに限定されない。例えば、フィルタ部材２２は、透過波長域とカット波長域の境界である所定の波長が４００ｎｍ以上５００ｎｍ未満の範囲内に設定されていることがより好ましい。
＜光検出器２３の構成＞
図２に示されるように、光検出器２３は、光電変換素子を有する受光部４１と、この受光部４１上に設けられた複数のカラーフィルタ４２と、各カラーフィルタ４２上に設けられたマイクロレンズ４３とを備えている。前述のフィルタ部材２２は、マイクロレンズ４３上に設けられている。
図２に示されるように、光検出器２３は、光電変換素子を有する受光部４１と、この受光部４１上に設けられた複数のカラーフィルタ４２と、各カラーフィルタ４２上に設けられたマイクロレンズ４３とを備えている。前述のフィルタ部材２２は、マイクロレンズ４３上に設けられている。
受光部４１としては、例えばＣＭＯＳイメージセンサを用いることができる。ＣＭＯＳイメージセンサは、シリコン基板にフォトダイオード、ＭＯＳＦＥＴ、及び配線等が周知のイオン注入技術及び成膜技術等を利用して設けられたものである。ＣＭＯＳイメージセンサは、フォトダイオードと当該フォトダイオードに接続されたＭＯＳＦＥＴとからなる複数のセル（図示せず）が、格子状に配列された構成を有する。受光部４１としてＣＭＯＳイメージセンサのような固体撮像素子を用いることで、光検出器２３を構成する複数のセルの集積化を図ることができるので、その分、光検出器２３で得られる撮像画像の解像度の向上を図ることができ、ひいては、被検物質の検出感度向上を図ることができる。また、ＣＭＯＳイメージセンサは、ＰＭＴ（Ｐｈｏｔｏ Ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ Ｔｕｂｅ）等に比べて消費電力が比較的小さいので、光検出器２３としてＰＭＴ等を用いた構成に比べて省電力化を図ることができる。
複数のカラーフィルタ４２は、それぞれ赤（Ｒ）、緑（Ｇ）、及び青（Ｂ）の波長域の光を選択的に透過する。したがって、光検出器２３は、カラーフィルタ４２により複数色にわたる波長域の光、すなわち複数色の可視光を識別して検出することが可能である。言い換えると、光検出器２３は、６２０ｎｍ以上７５０ｎｍ未満の範囲にピーク波長のある赤の分光感度を有している第１光検出器と、４９５ｎｍ以上５７０ｎｍ未満の範囲にピーク波長のある緑の分光感度を有している第２光検出器と、４５０ｎｍ以上４９５ｎｍ未満の範囲にピーク波長のある青の分光感度を有している第３光検出器とを備えている。光源３１から発せられる励起光は、第３光検出器が感度を有する波長域と重複する波長域を有している。
マイクロレンズ４３は、上方から入射した光をカラーフィルタ４２を介して受光部４１のフォトダイオードに集光する。
図４には、光源３１が発する励起光の波長と、光検出器２３が感度を有する波長と、フィルタ部材２２が透過及びカットする光の波長とがそれぞれグラフで示されている。なお、この図は、横軸で示す各グラフの波長の相対的な関係について示すものであるので、各グラフの縦軸について特に示していない。各グラフの縦軸が意味するところは、励起光のグラフについては光源であるＬＥＤの出力（任意単位）であり、フィルタ部材２２の特性のグラフについては図５と同様の透過率（％）であり、（Ｒ）（Ｇ）（Ｂ）で示す光検出器２３の分光感度を示すグラフについては量子効率（％）である。
図４を参照して説明したように、フィルタ部材２２は、５００ｎｍ付近の所定の波長Ａを境界として、この波長Ａ未満のカット波長域の光をカットし、この波長Ａ以上の透過波長域の光を透過させる。したがって、フィルタ部材２２によってカットされるカット波長域は、光検出器２３が感度を有する青（Ｂ）の波長域と緑（Ｇ）の波長域とに重複している。すなわち、フィルタ部材２２は、光検出器２３が感度を有する光のうち、青と緑の光の一部をカットする。フィルタ部材２２のカット波長域は、少なくとも青（Ｂ）の波長域と重複していればよい。
一方、光源３１が発する励起光は、４０５ｎｍのピーク波長を有し、フィルタ部材２２のカット波長域に含まれているので、その大部分がフィルタ部材２２によってカットされる。したがって、光検出器２３は、励起光を検出し難く、蛍光物質から発せられる蛍光を検出し易くなっている。図４には、光源３１として、ピーク波長２７０ｎｍの深紫外光が併せて示されている。この深紫外光の波長は、フィルタ部材２２によるカット波長域に含まれているため、フィルタ部材２２によりカットされる。また、光検出器２３は、波長２７０ｎｍにおける量子効率が約０％であり、深紫外光に対する検出感度をほとんどもたない。すなわち、波長２７０ｎｍの深紫外光は光検出器２３によって検出されない。
＜信号変換装置１２の構成＞
信号変換装置１２は、光検出器２３の受光部４１から取得した信号を画像情報に変換して画像処理装置１３へ出力する。この信号変換装置１２は、例えば光電変換素子から取得したアナログ信号をデジタル信号に変換するアナログデジタル変換器を含んで構成されている。具体的に、信号変換装置１２は、信号処理部５１と、補正部５２とを有している。
信号変換装置１２は、光検出器２３の受光部４１から取得した信号を画像情報に変換して画像処理装置１３へ出力する。この信号変換装置１２は、例えば光電変換素子から取得したアナログ信号をデジタル信号に変換するアナログデジタル変換器を含んで構成されている。具体的に、信号変換装置１２は、信号処理部５１と、補正部５２とを有している。
信号処理部５１は、受光部４１から出力された信号を受け付け、ＲＧＢの三色の電気信号を補正部５２に出力する。補正部５２は、信号処理部５１から出力されたＲＧＢ信号をそれぞれ補正し、適切な出力信号を生成する機能を有している。補正部５２は、例えば、ＣＰＵと、ＲＯＭ、ＲＡＭ等のメモリとを備えたコンピュータにより構成することができる。この場合、ＣＰＵが、メモリに記憶されたコンピュータプログラムを実行することにより、所定の補正機能を実現することができる。
具体的に、補正部５２は、第１の補正部５２Ａと第２の補正部５２Ｂとの２つの補正部を備えている。前述したように、フィルタ部材２２は、光検出器２３が検出する可視光の波長域に重複するカット波長域を有している。したがって、フィルタ部材２２は、本来、光検出器２３が受光すべき波長の光をカットしてしまう。そのため、第１の補正部５２Ａは、カットされた波長域の信号を補うための補正を実行する。
具体的に、第１の補正部５２Ａは、ガンマ補正を実行する。ガンマ補正では、フィルタ部材２２によってカットされた色の出力値を増大させる補正が行われ、その結果が画像処理装置１３（図１参照）に出力される。本実施形態では、図４に示されるようにフィルタ部材２２によって、青（Ｂ）と緑（Ｇ）の波長域の一部がカットされている。したがって、第１の補正部５２Ａは、青と緑の色の出力値が増大するような補正を行う。
第２の補正部５２Ｂは、オフセット処理を実行する。フィルタ部材２２は、照射部２１によって照射される励起光の大部分をカットするが、一部が漏れ込んで光検出器２３に入射してしまうこともある。したがって、第２の補正部５２Ｂは、光検出器２３に入射した励起光に相当する信号を差し引く処理を行う。これにより、励起光の影響を取り除いた適切な出力を得ることができる。本実施形態の第２の補正部５２Ｂは、励起光の波長域により近い、青（Ｂ）と緑（Ｇ）についてオフセット処理を行う。なお、第１の補正部５２Ａによるガンマ補正は、第２の補正部５２Ｂによるオフセット処理が行われた信号に対して行われる。
図３においては、補正部５２を通過することによって補正された青（Ｂ）と緑（Ｇ）の信号が、それぞれ「Ｂ’」、「Ｇ’」で示されている。
＜画像処理装置１３の構成＞
画像処理装置１３は、信号変換装置１２から入力される情報に基づいて画像を生成し、その画像を表示部５４に表示する。表示部５４は、液晶パネル等のディスプレイにより構成することができる。
画像処理装置１３は、信号変換装置１２から入力される情報に基づいて画像を生成し、その画像を表示部５４に表示する。表示部５４は、液晶パネル等のディスプレイにより構成することができる。
画像処理装置１３は、信号変換装置１２から入力される画像情報に基づいて、光検出器２３で検出される光の光量を算出することができる。ここで、画像処理装置１３は、光検出器２３で検出可能な光の光量と蛍光物質の量との関係を示す検量データを保持している。そして、画像処理装置１３は、この検量データに基づき、蛍光物質の量を算出するとともに、算出した蛍光物質の量から検物質の量を算出する機能を有する。
画像処理装置１３は、ＣＰＵと、ＲＯＭ、ＲＡＭ等のメモリと、を備えるコンピュータを含んで構成されている。そして、ＣＰＵが、メモリに記憶されたコンピュータプログラムを実行することにより、画像処理装置１３の各種機能が実現される。
＜被検物質を含む複合体の生成＞
光検出器２３によって検出される蛍光物質及び被検物質を含む複合体は、図６に示される手順により生成することができる。まず、図６の（Ｉ）に示されるように、固相担体としての磁性粒子６１に一次抗体６２を結合させ、この一次抗体６２に被検物質である抗原６３を反応させる。磁性粒子６１としては、例えばストレプトアビジン結合蛍光磁性粒子を用いることができる。一次抗体６２としては、例えばビオチン結合一次抗体を用いることができる。
光検出器２３によって検出される蛍光物質及び被検物質を含む複合体は、図６に示される手順により生成することができる。まず、図６の（Ｉ）に示されるように、固相担体としての磁性粒子６１に一次抗体６２を結合させ、この一次抗体６２に被検物質である抗原６３を反応させる。磁性粒子６１としては、例えばストレプトアビジン結合蛍光磁性粒子を用いることができる。一次抗体６２としては、例えばビオチン結合一次抗体を用いることができる。
次いで、洗浄工程を経て、図６の（II）に示されるように、酵素標識された二次抗体６４を抗原６３に反応させ、これによって（III）に示されるように、抗体６２，６４と抗原６３とを結合させた複合体６５を生成する。
そして、洗浄工程を経て、図６の（IV）に示されるように、蛍光基質を含む液滴６６に複合体６５を封入し、この液滴６６をオイル中に分散させ、エマルションを生成する。液滴６６内では、酵素と蛍光基質とが反応し、蛍光物質が生成される。
蛍光基質としては、例えばペルオキシターゼと反応して蛍光物質であるレゾルフィンを生成するペルオキシターゼ用蛍光基質、又はアルカリフォスターゼと反応して蛍光物質であるＢＢＴ−アニオンを生成するアルカリフォスターゼ用蛍光基質等を採用することができる。なお、ペルオキシターゼ用蛍光基質から生成されるレゾルフィンは、例えば有機系色素に比べて強い蛍光を発する蛍光物質である。また、アルカリフォスターゼ用蛍光基質から生成されるＢＢＴ−アニオンは、例えば有機系色素に比べて大きなストークスシフトと広い蛍光スペクトルを持つ蛍光物質である。
以上の手順で生成された液滴６６を、図６の（Ｖ）に示されるように、光検出器２３上（実質的にはフィルタ部材２２上）に滴下し、光源３１からの励起光を照射することによって、蛍光物質が発する蛍光を光検出器２３で検出する。図６の例では、蛍光を発している液滴６６にハッチングを付している。
＜検証実験＞
本発明者は、以上に説明した被検物質の検出システム１０について、蛍光画像の出力を検証する実験を行った。実験の手法は以下の通りである。
本発明者は、以上に説明した被検物質の検出システム１０について、蛍光画像の出力を検証する実験を行った。実験の手法は以下の通りである。
まず、図７（ａ）に示されるように、光検出器２３上に設置した石英ガラス板３６にフィルタ部材２２である干渉フィルタを設けたもの（実施例）と、図７（ｂ）に示されるように干渉フィルタを設けていないもの（比較例）とを準備し、それぞれに対して蛍光物質として次の（１）及び（２）の２種類の量子ドットを滴下した。
（１）Ｑｄｏｔ６２５（蛍光波長６２５ｎｍ；インビトロジェン社製），１μＭ，０．５μＬ
（２）Ｑｄｏｔ７０５（蛍光波長７０５ｎｍ；インビトロジェン社製），１μＭ，０．５μＬ
（２）Ｑｄｏｔ７０５（蛍光波長７０５ｎｍ；インビトロジェン社製），１μＭ，０．５μＬ
実施例及び比較例のそれぞれについて、波長が４０５ｎｍの紫外光と、２７０ｎｍの深紫外光とを照射部２１によって照射した。そして、光検出器２３が検出した信号の、図７のＸ軸上における強度プロファイルを求めた（図８、図９参照）。
図８は、ピーク波長が２７０ｎｍの深紫外光を照射部が照射した場合の比較例（図８（ａ））及び実施例（図８（ｂ））における強度プロファイルを示している。いずれの例においても補正部５２による補正は行われていない。この図８から明らかなように、干渉フィルタの有無による強度プロファイルの違いはわずかである。ピーク波長が２７０ｎｍの深紫外光は、光検出器２３の受光部４１がほとんど検出感度を有しておらず、干渉フィルタの影響も少ないからである。
図９は、ピーク波長が４０５ｎｍの紫外光を照射部が照射した場合の比較例（図９（ａ））及び実施例（図９（ｂ））における強度プロファイルを示している。いずれの例においても補正部５２による補正は行われていない。
図９（ａ）に示されるように、干渉フィルタを用いていない比較例の場合、より波長が短い青の強度が緑及び赤よりも高くなっている。これは、光源３１からの励起光が光検出器２３によって検出されていることによる。これに対して、図９（ｂ）に示されるように、干渉フィルタを用いている場合には、青の強度が抑えられ、緑及び赤の強度が高くなっていることがわかる。これは、干渉フィルタによってより波長の短い光がカットされるからである。
しかし、図９（ｂ）に示される状態では未だ補正がなされていないので、各色の強度は正確ではない。一方、前述した比較例のように、ピーク波長２７０ｎｍの深紫外光を照射した場合（図８（ａ）参照）は、光検出器２３は、励起光の影響を受けることなく蛍光物質から発せられた蛍光を適切に受光し、より正確な信号を出力していると考えることができる。したがって、図８（ａ）の比較例の出力結果を基準として、補正部５２による補正結果を評価することにする。
図９（ｂ）のような強度プロファイルを示す出力信号に前述の補正部５２による補正を実行すると、図１０（ｂ）に示される強度プロファイルが取得される。図１０（ａ）には、対比を容易にするために基準となる図８（ａ）と同じ強度プロファイルが併せて示されている。図１０（ａ）（ｂ）の強度プロファイルを比較すると、補正部５２によって光検出器２３の出力信号を補正することで、比較例に近い結果が得られている。したがって、補正部５２における出力信号の補正が有効であることがわかる。
以上に説明した実施形態に係る被検物質の検出システム１０は、照射部２１により照射された励起光がフィルタ部材２２によりカットされるので、先行技術（非特許文献１参照）のような高価なプリズムを用いなくても当該励起光が光検出器２３に検出されるのを抑制することができる。したがって、複数色を識別して検出することができる被検物質の検出システム１０を安価に構成することができる。
フィルタ部材２２のカット波長域に含まれる波長の蛍光は、光検出器が感度を有する可視光波長域であってもフィルタ部材２２によりカットされるが、光検出器２３の出力信号を第１の補正部５２Ａにより補正することによって、カットされた可視光の信号が補われるので、可及的に正確な可視光の出力信号を得ることができる。
フィルタ部材２２のカット波長域は、光検出器２３が感度を有する蛍光の可視光波長域の短波長側の一部、特に青色と緑色との波長域に重複しているので、光源３１から照射される励起光のピーク波長を可及的に可視光波長域に近づけることができる。励起光の光源３１は、ピーク波長が短いもの（例えば深紫外光）ほど高価となる傾向にある。また、ＤＮＡ等の生物材料は深紫外領域に吸収領域をもつため、深紫外光を照射すると生体材料由来のノイズが生じやすくなる。そのため、可視光波長域に励起光のピーク波長を近づけることで、これらの問題を解消することができる。
上記実施形態の被検物質の検出システム１０は、光検出器２３の出力信号を補正することで、フィルタ部材２２を透過し光検出器２３によって検出された励起光を低減する第２の補正部５２Ｂを備えているので、励起光がフィルタ部材２２を通過して光検出器２３に漏れたとしても、その影響を小さくすることができる。
上記実施形態において、照射部２１は、前述したように励起光としての紫外光を発する光源３１に加えて、蛍光物質が蛍光を発しない波長域であって、フィルタ部材２２の透過波長域に含まれるピーク波長を有する光を照射する光源を別途備えていてもよい。この場合、照射部２１から発せられる光によって被検物質の明視野像を撮像することができる。すなわち、光源３１による光の照射方向を変えることなく蛍光画像に加えて明視野像をも取得することができる。
＜他の実施形態＞
以上に説明した実施形態では、酵素標識した二次抗体を被検物質としての抗原に反応させ、その酵素を蛍光基質と反応させることによって蛍光物質を生成する例について説明した。この例に代えて、フィルタ部材２２の表面に捕捉物質を固定化し、この捕捉物質に被検物質を結合させ、さらに被検物質に、量子ドットのような蛍光物質を含む結合物質を結合させてもよい。この場合、フィルタ部材２２上には、捕捉物質、被検物質、及び蛍光物質の複合体が生成され、この複合体に照射部２１による励起光を照射することによって、被検物質を検出することができる。
以上に説明した実施形態では、酵素標識した二次抗体を被検物質としての抗原に反応させ、その酵素を蛍光基質と反応させることによって蛍光物質を生成する例について説明した。この例に代えて、フィルタ部材２２の表面に捕捉物質を固定化し、この捕捉物質に被検物質を結合させ、さらに被検物質に、量子ドットのような蛍光物質を含む結合物質を結合させてもよい。この場合、フィルタ部材２２上には、捕捉物質、被検物質、及び蛍光物質の複合体が生成され、この複合体に照射部２１による励起光を照射することによって、被検物質を検出することができる。
この場合、捕捉物質の固定化は、フィルタ部材２２に結合する結合基等を介して行なうことができる。この結合基としては、例えば、チオール基、ヒドロキシル基、リン酸基、カルボキシル基、カルボニル基、アルデヒド基、スルホン酸基、アミノ基等が挙げられる。また、フィルタ部材２２上への捕捉物質の固定化は、物理吸着法又はイオン結合法等により行なわれていてもよい。フィルタ部材２２上における捕捉物質の固定量は、特に限定されるものではなく、用途及び目的に応じて設定することができる。
捕捉物質は、被検物質の種類に応じて適宜選択することができる。例えば、被検物質が核酸である場合、捕捉物質として、核酸にハイブリダイズする核酸プローブ又は核酸に対する抗体、核酸と結合するタンパク質等を用いることができる。また、被検物質がタンパク質又はペプチドである場合、捕捉物質として、タンパク質又はペプチドに対する抗体等を用いることができる。このように、被検物質保持部は、捕捉物質に対応する特定の有機物質を選択的に保持することができる。したがって、被検物質とともに他の夾雑物質が混合した試料の中から、被検物質だけを取り出すことが可能となる。
また、捕捉物質による被検物質の捕捉は、捕捉物質と被検物質とが結合する条件下で行なう。捕捉物質と被検物質とが結合する条件は、被検物質の種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、被検物質が核酸であり、捕捉物質が核酸にハイブリダイズする核酸プローブである場合、被検物質の捕捉は、ハイブリダイゼーション用緩衝液存在下に行なうことができる。また。被検物質が核酸、タンパク質又はペプチドであり、捕捉物質が核酸に対する抗体、タンパク質に対する抗体、又はペプチドに対する抗体である場合、被検物質の捕捉は、リン酸緩衝生理的食塩水、ヘペス（ＨＥＰＥＳ）緩衝液、ピペス（ＰＩＰＥＳ）緩衝液、トリス（Ｔｒｉｓ）緩衝液等の抗原抗体反応を行なうに適した溶液中で行なうことができる。更に、被検物質が、リガンドであり、捕捉物質がリガンドに対するレセプタである場合、又は被検物質がレセプタであり、捕捉物質がレセプタに対するリガンドである場合、被検物質の捕捉は、リガンドとレセプタとの結合に適した溶液中で行なうことができる。
＜変形例＞
なお、本発明は、前述した各実施形態に限定されるものではなく、特許請求の範囲に記載された範囲内の全ての態様を含む。例えば、本発明は、以下に示す変形例を含む。
なお、本発明は、前述した各実施形態に限定されるものではなく、特許請求の範囲に記載された範囲内の全ての態様を含む。例えば、本発明は、以下に示す変形例を含む。
（１）上記実施形態は、被検物質を検出するシステム及び装置についての例であるが、本発明はこれに限定されない。例えば、本発明は、単に蛍光物質からの蛍光を検出する装置であってもよい。
（２）上記実施形態では、励起光のピーク波長が４０５ｎｍである例について説明したが、本発明はこれに限定されない。本発明において、励起光のピーク波長は、３００ｎｍ以上４５０ｎｍ未満であることが好ましい。
（３）上記実施形態では、光検出器２３として、シリコン基板を用いた光電変換素子を含むＣＭＯＳイメージセンサが用いられる例について説明したが、本発明はこれに限定されない。例えば、光検出器２３としては、ＣＭＯＳイメージセンサ、ｍｉｃｒｏＰＭＴ(Ｐｈｏｔｏｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ Ｔｕｂｅ)、ＰｉＮ(Ｐｏｓｉｔｉｖｅ−ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ−Ｎｅｇａｔｉｖｅ)フォトダイオード、ＡＰＤ(Ａｖａｋａｎｃｈｅ Ｐｈｏｔｏｄｉｏｄｅ)、ＭＰＣＣ(Ｍｕｌｔｉ−Ｐｉｘｅｌ Ｐｈｏｔｏｎ Ｃｏｕｎｔｅｒ)、ＥＭＣＣＤ(Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｙｉｎｇ Ｃｈａｒｇｅ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｄｅｖｉｃｅ)、ＣＣＤ(Ｃｈａｒｇｅ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｄｅｖｉｃｅ)イメージセンサ、或いは、ＮＭＯＳ(Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｈａｎｎｅｌ Ｍｅｔａｌ Ｏｘｉｄｅ Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ)イメージセンサ等を用いることができる。また、本発明の光検出器は、複数色を識別して検出する光検出器であれば、さらに保護層を備えていてもよい。
光検出器２３としてカラーフィルタを備えないものを用いることができる。例えば、光検出器２３として、複数のシリコンを厚さ方向に積層し、色による吸収の深さの違いを利用して複数色を識別して検出する積層型のイメージセンサ、又は光電変換膜を積層した有機ＣＭＯＳイメージセンサ等を用いることもできる。
（４）上記実施形態では、光源３１が、ＬＥＤ等の半導体発光素子から構成される例について説明したが、光源３１の種類はこれに限定されるものではない。例えば、光源３１として放電ランプ（例えばＨＩＤランプ等）等から構成されるものであってもよい。
（５）上記実施形態のフィルタ部材は、干渉フィルタにより構成されているが、本発明のフィルタ部材は、可視光波長域に含まれる所定の波長未満の波長域の光をカットし、所定の波長以上の波長域の光を透過する特性を有すれば、さらに保護層を含んでもよい。
１１ ：被検物質検出装置
２１ ：照射部
２２ ：フィルタ部材
２３ ：光検出器
３１ ：光源
３２ ：コリメート光学系
３３ ：第１レンズ
３４ ：第２レンズ
５２Ａ ：第１の補正部
５２Ｂ ：第２の補正部
６２ ：抗体
６３ ：抗原
６４ ：二次抗体
６５ ：複合体
Ｙ ：光軸
２１ ：照射部
２２ ：フィルタ部材
２３ ：光検出器
３１ ：光源
３２ ：コリメート光学系
３３ ：第１レンズ
３４ ：第２レンズ
５２Ａ ：第１の補正部
５２Ｂ ：第２の補正部
６２ ：抗体
６３ ：抗原
６４ ：二次抗体
６５ ：複合体
Ｙ ：光軸
Claims (18)
- 複数色を識別して検出する光検出器と、
前記光検出器上に設けられており、前記光検出器が感度を有する波長域に含まれる所定の波長以上の波長域に含まれる波長の光を透過させ、前記所定の波長未満の波長域に含まれる波長の光をカットするフィルタ部材と、
光源を有するとともに、当該光源から前記フィルタ部材上に位置付けられた測定対象の蛍光物質に、前記所定の波長未満の波長域にピーク波長を有する励起光を照射する照射部と、
前記励起光の照射により前記蛍光物質から発せられる蛍光のうち前記フィルタ部材によってカットされる光の信号を補う第１の補正部と、を備え、
前記光検出器と前記フィルタ部材と前記照射部とが前記光源の光軸に沿って並べて配置されている蛍光検出装置。 - 画像処理装置と、
表示部と、をさらに備え、
前記画像処理装置は、前記第１の補正部により補正された信号に基づいて生成された蛍光の画像を前記表示部に表示する、請求項１に記載の蛍光検出装置。 - 前記光検出器は、第１光検出器と、前記第１光検出器のピーク波長未満の波長域にピーク波長を有する第２光検出器と、前記第２検出器のピーク波長未満の波長域にピーク波長を有する第３光検出器と、を備え、
前記所定の波長は、前記第３光検出器が感度を有する波長域に含まれる、請求項１又は２に記載の蛍光検出装置。 - 前記励起光は、前記第３光検出器が感度を有する波長域と重複する波長域を有する光である、請求項３に記載の蛍光検出装置。
- 前記第１の補正部は、前記光検出器の出力信号にガンマ補正を行う、請求項１〜４のいずれか１項に記載の蛍光検出装置。
- 前記フィルタ部材を透過し前記光検出器によって検出された励起光を低減する第２の補正部をさらに備えている、請求項１〜５のいずれか１項に記載の蛍光検出装置。
- 前記第２の補正部は、前記光検出器の出力信号にオフセット処理を行う、請求項６に記載の蛍光検出装置。
- 前記フィルタ部材が干渉フィルタであり、
前記照射部が、前記干渉フィルタに対して垂直な平行光を照射する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の蛍光検出装置。 - 前記照射部は、励起光を発する光源と、前記励起光を前記光源の光軸に沿った平行光に形成するコリメート光学系とを有している、請求項８に記載の蛍光検出装置。
- 前記照射部は、前記蛍光物質の励起波長よりも長波長の光を発する他の光源を備えている、請求項９に記載の蛍光検出装置。
- 前記干渉フィルタは、前記蛍光物質から発せられる蛍光の透過率が、前記照射部により照射される平行光の透過率の９０倍以上となるような光の透過性を有している、請求項９又は１０に記載の蛍光検出装置。
- 前記励起光は、３００ｎｍ以上４５０ｎｍ未満の範囲にピーク波長を有し、前記第３光検出器が感度を有する波長域と重複する波長域を有する光である、請求項４に記載の蛍光検出装置。
- 前記所定の波長が４００ｎｍ以上５００ｎｍ未満の範囲内にある、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の蛍光検出装置。
- 前記フィルタ部材は、前記所定の波長未満の波長域に含まれる波長の光の透過率が５％未満となるように光をカットする特性を有している、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の蛍光検出装置。
- 前記第１光検出器は、６２０ｎｍ以上７５０ｎｍ未満の範囲にピーク波長を有し、
前記第２光検出器は、４９５ｎｍ以上５７０ｎｍ未満の範囲にピーク波長を有し、
前記第３光検出器は、４５０ｎｍ以上４９５ｎｍ未満の範囲にピーク波長を有する、請求項３に記載の蛍光検出装置。 - 複数色を識別して検出する光検出器と、
前記光検出器の上方に設けられており、前記光検出器が感度を有する波長域に含まれる所定の波長以上の波長域に含まれる波長の光を透過させ、前記所定の波長未満の波長域に含まれる波長の光をカットするフィルタ部材と、
光源を有するとともに、当該光源から、前記フィルタ部材上に位置付けられた、生体試料に含まれる被検物質と蛍光物質とを含む複合体に、前記所定の波長未満の波長域にピーク波長を有する励起光を照射する照射部と、
前記励起光の照射により前記蛍光物質から発せられる蛍光のうち前記フィルタ部材によってカットされる光の信号を補う第１の補正部と、を備え、
前記光検出器と前記フィルタ部材と前記照射部とが前記光源の光軸に沿って並べて配置されている被検物質検出装置。 - 複数色を識別して検出する光検出器と、
前記光検出器の上方に設けられており、前記光検出器が感度を有する波長域に含まれる所定の波長以上の波長域に含まれる波長の光を透過させ、前記所定の波長未満の波長域に含まれる波長の光をカットするフィルタ部材と、
光源を有するとともに、当該光源から、前記フィルタ部材上に位置付けられた、生体試料に含まれる被検物質と酵素とを含む複合体中の前記酵素と基質との反応により生じる蛍光物質に、前記所定の波長未満の波長域にピーク波長を有する励起光を照射する照射部と、
前記励起光の照射により前記蛍光物質から発せられる蛍光のうち前記フィルタ部材によってカットされる光の信号を補う第１の補正部と、を備え、
前記光検出器と前記フィルタ部材と前記照射部とが前記光源の光軸に沿って並べて配置されている被検物質検出装置。 - 複数色を識別して検出する光検出器が感度を有する波長域に含まれる所定の波長以上の波長域に含まれる波長の光を透過させ、前記所定の波長未満の波長域に含まれる波長の光をカットするフィルタ部材上に、測定対象の蛍光物質を位置付ける工程、
光源を有するとともに当該光源の光軸に沿って前記光検出器及び前記フィルタ部材と並べて配置された照射部により、前記フィルタ部材上の前記蛍光物質に、前記所定の波長未満の波長域にピーク波長を有する励起光を照射する工程、
前記励起光により前記蛍光物質から発光され前記フィルタ部材を透過する蛍光を検出する工程、及び、
前記励起光の照射により前記蛍光物質から発せられる蛍光のうち前記フィルタ部材によってカットされる光の信号を補う工程、を含む、蛍光検出方法。
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