CN106460233A - 便携式核酸分析系统和高效微流体电活性聚合物致动器 - Google Patents

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Abstract

使用多序列扩增和同时杂交读取对一组不同核酸序列进行平行检测的装置、系统和方法。一种自动化核酸分析系统，包括在微流体连通中的样品裂解、扩增、PCR和检测模块，其设置成通过多序列扩增和同时微阵列杂交读取来对不同核酸序列进行平行检测。设置高效微粒体电活化聚合物(μEAP)致动器用于细胞分选，其包含封闭端流体腔室，其中腔室的表面是被介电弹性体的EAP层覆盖的电极。

Description

便携式核酸分析系统和高效微流体电活性聚合物致动器
本申请要求2014年11月18日提交的系列号62/081,525；2014年8月25日提交的系列号62/041,430；和2014年4月14日提交的系列号61/979,377的优先权。
本发明在合同编号HR0011-14-C-0082的国防部高级研究计划署的政府支持下完成。政府对本发明拥有某些权利。
引言
通过在易用系统中的扩增和检测对样品制备物的整合对于核酸诊断而言仍然是明显挑战[1]。FDA已经批准了多种系统作为用于近-POC应用的“中等复杂”装置[2]，包括赛沛公司(Cepheid)的GeneXpert平台、纳米球公司(Nanosphere)的Verigene平台、BD公司的(Becton,Dickinson and Company)BD Max系统、和利亚特公司(Liat)的“管中实验室(lab-in-a-tube)”一次性装置。
研究文献普遍是病原体检测技术和装置的示例；然而，没人能够开发一种多重、自动化、集成的设置成接受原始生物样品的“从样品到结果”系统[3]。早期示例使用电泳分离和激光诱导的荧光来检测从全血中扩增并提取的病原体DNA的存在[4]。Xu等[5]在扩增期间使用实时荧光读取来检测少至100个拷贝/μl。Ferguson等[6]通过在电催化缓冲液存在下电泳检测与纳米结构的电极上的PNA探针杂交的病毒RNA，而Lam等[7]检测经扩增的ssDNA与沉积在金电极上的氧化还原标记的分子探针的杂交。Ferguson[6]证实获得了等于10TCID50(组织培养感染剂量)的LOD，其比临床效价值低4个数量级。Lam[7]证实获得了1个细菌/μl的LOD，虽然在掺入的尿液样品上进行分析时使用100CFU/μl的浓度。2组使用横向流夹心试验作为其核酸检测的基础[8,9]，并且Fraunhofer Institutes ivD-平台[10]使用模块平台。
数十年来，国防部(DoD)已经认识到了对现场便携式生物分析的需求。最初，这种需求是为了鉴定生物威胁；然而，随着个性化医疗的进步，除了环境监测以外，DoD也认识到常规健康状态监测的价值以及护理点(POC)诊断的可及性。事实上，DARPA有多种旨在监测生物系统以允许快速介入的程序。然而，尽管已有数十年的投资，还没有在需要地点进行核酸加工的市售仪器。为了填补这项空缺，SRI已经开发并且我们在此公开了一种进行“从样品进入到答案输出”分析的便携式、集成、可快速重构并且自动化的生物检测系统。
发明内容
本发明提供了用于通过多序列扩增和同时杂交读取对一组不同核酸序列进行平行检测的装置、系统和方法。
在一个方面中，本发明提供了一种自动化核酸分析系统，包括在微流体连通中的样品裂解、扩增、PCR和检测模块，其设置成通过多序列扩增和同时微阵列杂交读取来对不同核酸序列进行平行检测。
在实施方式中，本发明提供系统，其中：
检测模块包含微阵列检测光学器件，其包含采用渐消波激发的微阵列扫描仪；
检测模块包含自动化杂交处理器，其设置成通过温度提供多重严谨性；和/或
PCR模块设置成在单次反应中进行逆转录和PCR。
在实施方式中，本发明提供系统，其中包括包含模块的集成微流体卡和分析仪，所述分析仪包含设置用于接受卡的容器，设置用于操作卡的操作器，和设置用于电子控制操作器的控制器，该操作器包含流体致动器、PCR热循环仪、和自动化杂交处理器以及微阵列检测光学器件。
在实施方式中，本发明提供系统，其还包括设置成含有并递送试剂至裂解、纯化、PCR和检测模块的试剂模块。
在实施方式中，本发明提供系统，其是：
便携的：小于1000in3并且小于10lbs；
快速的：分析低于120分钟；
多重的：同时分析超过50种靶序列；和/或
自动的：在样品导入和结果展示之间不需要用户介入。
在实施方式中，本发明提供系统，其中：
样品包含蛋白质分析物并且系统进一步设置成用包含核酸序列的标签来标记蛋白质分析物；
锚定的探针通过其空间位置限定序列；
使用比被分析序列的数目少的引物对数来实现扩增；
不同核酸序列是多物种/生物体的；
PCR模块包含金属(例如，铝)PCR反应腔室；
微流体连通包含经设置用于去除气泡的透气膜，其中透气膜在通道层之下，使得整个通道暴露于大气压中(在一个具体的实施方式中，该膜跨越所述卡，因为与单独的片相比其更易于被制成层，虽然其仅在通道层之下起作用)；
扩增完全包含在耗材(例如，无开口管)中；和/或
检测是基于探针组而不是引物组(易于构建新的测试)。
在实施方式中，本发明提供系统，其设置成：
在单个容器中扩增(无样品裂解)；
接受并处理下述分析物样品：血液、唾液、GI样品、尿液、伤口拭子、脊椎穿剌、鼻拭子、兽医学和农业来源；
通过试样收集工具或运输介质接受样品；
处理1-100ul的样品体积；
是模块化的(模块可互换以支持不同应用)；
能够测量(通过通道尺寸和气泡去除进行)；和/或
是单向或自封闭的(防止样品交叉污染)。
在实施方式中，本发明提供系统，包括包含模块的集成微流体卡和包含外壳(盒)的分析仪，并且在外壳内包括设置用于接受卡的容器，其中该分析仪：
接合卡以进行裂解、纯化、PCT(扩增和标记)、和检测；
通过压力(例如，样品运输)、磁场(例如，样品混合)、温度(例如，扩增、严谨性、杂交)和/或光(例如，杂交检测)与样品相互作用；和/或
通过将渐消波与样品偶联来进行检测以实时观察杂交和/或确定产生序列信息的可能碱基对错配和动力学。
在实施方式中，本发明提供了包括包含模块的集成微流体卡(筒)的系统，其中该卡设置成：
对疾病类型有特异性(例如，呼吸道疾病)；
对患者类型有特异性(例如，小儿)；
对病原体类型有特异性(例如，生物战试剂)；
对个体有特异性(例如，药物基因组学)；
含有针对患者特异性信息的独特标识；
用于一次性使用以保持无菌并最小化交叉污染；
使用辊到辊(roll-to-roll)生产步骤产生；和/或
来自聚碳酸酯底架、金属箔PCR腔室、丙烯酸组分、可呼吸膜材料、和/或聚氨酯密封。
在实施方式中，本发明提供了功能性集成微流体颗粒分选仪的系统，如荧光-活化细胞分选仪(FACS)，其设置成提供用于颗粒或细胞比对的流体力学和/或惯性聚焦并且包含设置成用于分选的微孔电活性聚合物(EAP)致动器。
EAPμ-分选仪可功能性集成或纳入iMFC系统的颗粒-浓缩/分选模块，并且设置成允许系统通过将大体积的稀释颗粒浓度浓缩(例如，以每毫升几个细胞存在于环境样品中的细菌)或从许多细胞的背景中分选出选择细胞(例如，从外周血单核细胞群中分选出活化T细胞)来增加操作区域(operation envelop)。另外，微孔电活性聚合物致动器适于在分选时的交替应用，包括细胞捕获、流体混合和泵送，并且因此可独立于对象自动核酸分析系统提供、设置和/或操作。
本发明也提供了使用公开的系统通过多重序列扩增和同时微阵列杂交读取来平行检测不同分析物核酸序列的方法。
在另一个方面中，本发明提供了设置在流体通道周围的高效微流体电活性聚合物(μEAP)致动器，其中施加于致动器的电压脉冲诱导致动器在流体通道之间产生瞬时交叉流，其将流体通道内的靶颗粒偏转到新路径上，其中该致动器包含封闭端流体腔室，其中腔室的一个或多个表面(例如，壁、底层、顶层)包含由介电弹性体的EAP层覆盖的电极。
单个uEAP致动器可与接受由致动器驱动的流体喷射的顺应腔室(即，“风箱”)配对。该构造仅需要一个工作致动器，但是其仍然生成交叉流。顺应腔室可仅是没有电子连接的致动器之一，或者其可以是不同几何形状的腔室，如我们用于多通道/阶段分选仪那样。
虽然主要用固体电极(例如，玻璃片上的氧化铟锡(ITO)电极)例示，电极也可以或另外包括流体，如相邻通道中的导电性流体。
在另一个方面中，本发明提供了多种这种设置在流体通道周围并且彼此异步的致动器，其中施加到致动器的电压脉冲诱导致动器在流体通道之间产生瞬时交叉流，其将流体通道内的靶颗粒偏转到新路径上，其中各致动器包含封闭端流体腔室，其中腔室的表面是由介电弹性体的EAP层覆盖的电极。
在另一个方面中，多种致动器是一对设置成互相180°异步的致动器。
在实施方式中：
-腔室的多个表面包含由介电弹性体的EAP层覆盖的电极；
-流体通道设置成提供用于颗粒的水平比对的流体力学聚焦和用于垂直比对的惯性聚焦的组合；
新路径导向分选输出；
流体通道包含样品输入通道以及分选和未分选的输出通道，和导向分选输出通道的新路径；
流体通道设置成用于荧光检测，其中在检测靶颗粒之后，向μEAP致动器施加电压脉冲；
-EAP层是1-50(或2-25，或5-15μm厚)；
弹性体是硅酮；
-致动器设置成在多通道装置中提供平行分选；
-致动器设置成向多个输出提供多阶段系列分选；和/或
-致动器经功能性集成到标记经活化的颗粒分选仪中。
本发明还提供了制造和使用致动器的方法，如包括施加电压脉冲以诱导致动器在流体通道之间产生瞬时交叉流的步骤，该交叉流将流体通道内的靶颗粒偏转到新路径上。
本发明具体提供了所述实施方式的所有组合，如同其各自已详尽单独列出那样。
附图的简要说明
图1：分子诊断系统的物理构造。
图2A和B：iMGC卡。
图2C：鼻拭子的输入模块。
图2D：TEC排列。
图2E：在PCR和检测处理模块周围的iMFC卡的截面。
图2F：具有检测孔、光栅和铬的玻璃基材。
图2G：玻璃基材的侧视图，显示光如何耦合到玻璃基材中。
图2H：玻璃基材的侧视图，显示光如何通过玻璃基材内的总内部反射而传播。
图2I：与微阵列相关的照相机系统和TEC的排列。
图3：将核酸结合到石英玻璃料的机制。
图4：透气膜的体积控制。
图5A和5B：控制流的阀控制机制。
图6：iMFC卡的投影图。
图7：气动系统。
图8：装置10的物理硬件的功能框图。
图9：显示μEAP FAC的通道布局的EAP微分选仪示意图。
图10：7-μm绿色荧光颗粒的条纹图。
图11：藻红蛋白标记的B细胞分选。
图12：将多重分选仪整合到双通道装置中。
图13：将多重分选仪整合到阶段式分选装置中。
具体实施方式及其实施例详述
本发明提供了便携式廉价分子诊断系统，其能够在没有人介入的情况下产生结果-仅在输入样品和读取结果中需要人介入。由于上述的各种技术，也非常迅速地产生结果。该系统包括接合称为iMFC的一次性元件的方法。该方法和系统使得易于设置iMFC以运行不同类型的测试，而不需要改变背后的硬件。最后，卡本身是模块化的，易于改变用于运行不同类型的测试。
在一个方面中，本发明提供了独立系统，其可获取样品作为输入，进行分子诊断步骤，并且显示诊断测试的结果。一般而言，该步骤包括(i)提取和纯化，例如，其中从输入样品中提取DNA样品，该输入样品可以是血液、组织、尿液、唾液或其他体液；(ii)扩增并标记，例如，其中扩增样品的特定序列；(iii)杂交；(iv)严谨洗涤以去除与靶序列结合的不需要分子和(v)在完成鉴定步骤并鉴定特定序列处读取。该系统一般包括称为集成微流体卡(iMFC)的一次性元件和非一次性基本单元。集成微流体卡可通过界面方案耦合至基本单元。可通过控制形成卡结构的部分的阀来实现iMFC中的流体流。可设计各卡来检测并鉴定特定组的生物标记物。
在实施方式中，进行样品输入和读取之间的步骤而不需要任何人介入，该系统并不分裂样品，该系统能够鉴定至少1000个靶标，该系统可在每次运行中鉴定超过50个靶标和/或在单个系统中实施所有测试步骤，和/或通过使用实时杂交，该系统能够在杂交完成之前预测结果并且能够提供与靶标浓度相关的信息。
图1显示了整个系统10。该系统包括单元基底20、单元盖30和一次性集成微流体卡(iMFC)40。卡的设计是模块，使得其可定制用于接受各种形式的样品输入，包括但不限于血滴、鼻拭子、痰液等，或定制用于进行不同测试。一般而言，测试过程由首先选择合适的卡，将样品置于卡的输入腔室中，将卡置于单元基底中，关上盖并选择合适的软件运行开始。一旦测试过程开始，不需要人介入。结果可显示在以系统的部分集成的屏幕上，或者他们可被传输置外部装置如计算机或智能手机。在测试完成之后，可处理卡并可选择不同的卡用于下一次测试。这些步骤的顺序可根据需要变化。
一次性集成微流体卡。卡一般将多种功能合并在一张卡上，如裂解、纯化、扩增、标记和检测在典型的市售系统中，用多种仪器完成这些功能。我们实现了通过集成多种用于去除气泡和准确测量的技术和特征的功能合并、渐消场成像系统的整合、各种步骤中的反应物和化学物的选择以及快速扩增和实时杂交等。将多功能合并到一张卡中能够获得CLIA豁免(CLIA waiver)。图2A显示了卡的透视图并且图2B显示了平面图。图2B也显示了区域(虚线显示)，其中卡内可出现各种功能。例如，块100可以是裂解块，块110可以是纯化块，块120可以是发生聚合酶链反应(PCR)过程处，并且块130可以是发生检测处。含有测试样品的流体以上述顺序通过卡内纳入的通道从一个块流向另一个块。通过这些通道从一个块流向另一个块的流体流受到微型阀的控制，该阀可打开或关闭，取决于在阀处施加的压力。
裂解块。样品输入也可在裂解块中发生，图2A和2B，块100。可使用各种方法来输入样品，如使用血滴和鼻拭子。在一个实施方式中，卡直接接受用于收集样品的工具。一般而言，在市售系统中，用于收集样品的工具并不直接接合测试仪器。通过允许工具直接接合测试仪器，可消除污染和用户误差来源。因为卡是模块，可改变裂解块以接受各种输入方法。参考图2A和2B，元件102可以是接受样品如血滴的输入腔室。图2C显示了模块化的优势，其中裂解块设置成接受鼻拭子250作为输入。对于使用血滴或鼻拭子的这两种情况，卡40的背后设计可能是相同的；仅仅输入模块可能不同。
除适应各种输入方法以外，裂解模块可设置成进行不同类型的裂解，如机械、化学或其他类型。参考图2A和2B，裂解模块显示为具有珠磨器104，其包含填充珠的珠腔室和在珠腔室顶部固定的小电动马达，其使珠互相碰撞。位于碰撞的珠之间的细胞裂解，使其内容物释放进入裂解缓冲溶液中-机械裂解的示例。其他模块可设置成进行其他形式的裂解，并且这些模块可具有比图2A和2B中所示的不同或更少的腔室或子模块。例如，能够进行化学裂解的模块可具有代替珠磨器的另一个腔室，其中化学物(可能储存在试剂模块中并且在合适的时间进入腔室)可与含有样品的裂解缓冲溶液混合。因此，不同类型的裂解可适应卡的相同基础设计。
为了起始裂解过程，使在试剂块140中的裂解缓冲孔142中储存的裂解缓冲溶液进入腔室108。可通过控制微阀来实现控制卡内流体流的方法。腔室108可在顶部具有透气性裂口，使得当液体接触裂口时，由于腔室和大气之间的压力差，其被空气封锁，使得腔室中的空气在其填充时流出。该裂口可由各种材料制成，如特氟隆(Teflon)。当腔室108被填充时，可打开其与输入腔室102之间的阀，使得缓冲溶液与输入样品混合。一旦裂解缓冲液和输入样品混合，打开输入腔室102和珠磨器104之间的另一个阀使混合物进入珠磨器。然后打开珠磨器顶部的电动马达持续特定时间，之后打开珠磨器104和腔室106之间的阀并且溶液现在流入腔室106中。腔室106可预填充试剂，如盐酸胍，在那里其与经裂解的溶液混合。在与试剂的混合完成后，可打开腔室106和纯化块110之间的阀以将该混合物引向纯化块。盐酸化使得样品中的DNA与纯化块中基于二氧化硅的结构结合，由此辅助纯化过程。
提供进行不同类型裂解的能力、接受各种输入方法和接受输入方法的实际工具的构造是有优势的特征，其可在装置10中协同组合。
纯化块。当打开腔室106和纯化块之间的阀时，溶液与置于纯化块中的石英玻璃料接触。玻璃料和盛放玻璃料的结构在图2A和2B中分别用112和114表示。玻璃料之间的溶液流示于图3。该图显示了在玻璃料112周围的卡的截面。该玻璃料可以是位于通道410中的形式，其可以夹在基底层400和顶盖层430之间。基底层、顶盖层形成盛放玻璃料的结构114的部分。箭头指示通道410内的流体流。在来自腔室106的含有盐酸胍的溶液中含有核酸的溶液将结合至玻璃料并在箭头的方向上流动。在其流过玻璃料之后的溶液流将可被微阀引向流入残留腔室或引向进一步加工。因此，溶液中的DNA结合玻璃料，但不结合玻璃料的溶液其他组分如蛋白质和脂质流过玻璃料并且可被引导通过通道进入残留收集腔室114。在DNA结合步骤之后，进行洗涤步骤。在乙醇储器146中含有的乙醇允许流过玻璃料以进行洗涤步骤从而洗去可能仍然与DNA结合的不需要的裂解物组分。然后允许乙醇干燥。纯化过程中的下一步是使在洗脱缓冲液孔148中储存的洗脱缓冲液在玻璃料上洗涤。该步骤使核酸与玻璃料解偶联。现在允许溶液进入PCR处理块120。在该步骤中，打开通向进一步处理步骤(PCR处理)的阀，但关闭通向残留腔室的阀。
PCR块。在纯化块之后，可优选用如下所述的系统改动来实施聚合酶链反应(PCR)。在由120表示的PCR块中，并且可在如图2A和2B中所示的多个步骤中进行PCR。在来自纯化步骤的洗脱洗涤完成之后，允许经纯化的含有核酸的溶液流入PCR主混合腔室122。在此，经纯化的溶液与冻干(冷冻干燥)的酶混合，该酶在主混合腔室结构内携带。在处理链中进一步出现的扩增步骤需要这些酶。主混合腔室可包含孔，其中可控制填充孔的溶液体积，允许精确体积溶液，并且避免或消除气泡。各处理阶段中的精确体积获得结果精确性。
在与酶的混合完成后，使溶液流入PCR引物腔室124，其中溶液与冻干引物混合。引物腔室也可以是孔，其中除了避免或消除在溶液中俘获的气泡以外，精确控制体积。在一些情况中可优选分离包括混合主混合物和引物的混合步骤，因为这允许使用常用的主混合模块并降低装置的总体成本。另外，分成2个步骤也允许迅速展开试剂盒以测试出现的问题，例如，可能用不同引物制成多张卡，其可用于检查不同靶分子的存在。引物(寡核苷酸)的冻干过程是迅速且简单的，并且可在装置10外部的实验室中进行。因此，通过分离2个混合步骤，可改变卡以测试不同物质，虽然如果优选，也可在一个步骤中进行混合过程。
在与引物的混合完成之后，溶液流向PCR腔室126。在与常规市售方法(其中PCR腔室可由非金属材料制成)不同的方法中，iMFC卡中的PCR腔室可由钝化金属制成，诸如但不限于铝。金属，尤其是铝的使用是优选的，因为其允许在铝腔室内迅速控制溶液的温度。通过使铝腔室的顶部和底部紧密接触热电冷却器(TEC)来实现这种迅速控制。通过将2个TEC放在PCR腔室之上或之下来得到PCR腔室和TEC之间的紧密接触。PCR腔室上的TEC位于TEC外壳单元200内的装置10的盖30上(图1)。TEC 210的面的形状与PCR腔室126的形状匹配使得当关闭盖时，TEC面可直接位于PCR腔室的上表面上。PCR腔室下的TEC简单地放在单元基底20内。图2D显示了PCR腔室如何夹在2个TEC 220(具有TEC面210)和230(具有TEC面240，图中不可见)之间。因此，TEC的这种排列与铝PCR腔室的使用使得能够对PCR混合物进行快速温度循环。已经通过测量发现，这种组合允许温度升高>15℃/s，精度±1℃。这种构造然后直接导致缩短样品输入和结果输出之间的时间。除了在由于使用钝化铝对溶液的快速温度控制中获得的优势以外，可实现另一个优势，即与PCR腔室使用非金属材料所需的能量相比，需要较少的能量来加热并冷却溶液。较少能量直接转换成需要较低总体能量以运行装置，能够进行任选的电池操作和场地便携性。
现在参考图2E解释了PCR腔室126的另一个方面，其显示了在PCR腔室和检测块130周围的卡的截面。为了保留溶液的浓度，在进行PCR过程时，应该避免或最小化PCR腔室内的捕获的空气。所述的顶部和底部截面PCR腔室可由钝化铝制成；因此，在此可能不使用透气膜。因此，提供来自PCR腔室的输出通道250，其导向储器255进而通过另一个通道257向大气开放。因此，在腔室126填充溶液时，推出空气并且流向大气。在填充腔室126时，可关闭通道260中的阀。在填充过程器件，可也用溶液填充通道250和储器255，其防止空气返回腔室126。同时，由于通过6psi的恒定压力驱动溶液，没有发生从通道250或储器255的回流。在填充腔室之后，开始PCR过程。在PCR过程结束时，扩增并标记所需的靶序列用于在检测块中检测。
检测块-一般说明。在PCR过程完成之后，参考图2E，可打开通道260中的阀262，并且PCR腔室126中含有扩增的组分(扩增子)的溶液可流入混合腔室275。因此，溶液与可储存在试剂块中的杂交缓冲液孔150中的杂交缓冲液混合。在其与PCR产物混合之前，测量来自杂交缓冲液的溶液。在混合腔室275中的混合过程完成之后，使溶液通过通道330流入检测腔室325。检测腔室325、混合腔室275、将溶液从腔室中输入和输出的通道都形成图2B所示的检测块130的部分。接着，在检测腔室内，可使与杂交缓冲液混合的PCR产物流到DNA微阵列上。这出现在孔317中，如图2F所示，其中盛放溶液的孔和微阵列315置于孔的底部。因此，对于这种构造，溶液位于微阵列的顶部。图2F显示了DNA微阵列315的排列并且解释了光如何偶联到微阵列中，这种光形成用于读取微阵列的光学系统的部分。DNA微阵列可含有在玻璃基材310上以网格图案排列的多个探针。各探针可含有DNA(或RNA)的一条链，并且用于检测样品溶液中与该探针中的序列互补的核苷酸序列的存在。如上所述，这些探针在玻璃基材310顶部以网格图案放置。光通过在玻璃内蚀刻的光栅305偶联到玻璃基材中。
参考图2G，沿入射光306显示光栅。入射光306可具有特定波长。由于存在光栅，入射光可以多种方向传播；一些光可如307所示向右传播，一些光可如308和309所示以特定角度传播。光可以相对于光307的其他更陡的角度传播，但在本文中忽略它们，因为在更陡角度的光强度往往更低。通过熟知的光栅公式来确定光传播的角度(对于不以直线转播的光而言)。可通过调整入射光306的波长和对光栅图案化来调整光308和309的角度。接着，为了将光偶联到玻璃基材中，使用全内反射的过程。这一概念如图2H所示。在该图中，忽略了直线传播的光307和以一定角度传播的光309。光308显示为由光栅305的尺寸显示的光束。因此，光308的光束由从光栅的左侧边缘发出的实线308L和从光栅的右侧边缘发出的虚线308R显示。使用实线和虚线来区分光束的2个边缘；没有显示其他差异。根据光束308的角度以及玻璃基材和周围环境(基本是空气)的折射率，可在标为R1的玻璃基材区1的上表面上建立全内反射。这种反射的光可到达玻璃基材的下表面并且可再次在区2(标为R2)处全内反射。因此，虽然全内反射，光可在检测孔317之后，微阵列315之下被导向。如前所述，微阵列316可位于监测孔317的底部。现在，光被导向微阵列的位置，产生称为渐消场的另一种现象以在DNA微阵列中激发光敏分子。已知光学元件中，在发生全内反射的边界处，在边界的另一侧上建立渐消场。这些渐消场是近场现象并且强度在远离边界处呈指数下降。然而，在非常靠近边界处，渐消场能够激发光敏分子并且由于检测孔317中的溶液位于边界处或边界附近，使用渐消场的检测方法变得可能。回到图2H，可以看到检测孔位于封闭层320内；该封闭层由铬制成。铬层也示于图2F，在全部四个侧面上的检测孔周围。包含铬作为设计的部分，从而降低或消除从检测孔的毗邻处发出的散射光。通过在检测孔上偶联黑色塑料片327来进一步去除错误光的可能性。也可使用除塑料以外的其他材料。
光308的光栅设计和后续角度，玻璃基材的厚度，玻璃基材的折射率，光栅和检测孔之间的距离是我们已经针对该装置优化的参数并且提供了协同功能。另外，可选择光308的角度，使得其不仅从区如R1和R2(基本从玻璃-空气边界)全内反射，也从检测孔的玻璃-溶液边界全内反射。检测孔中溶液的反射率大约为1.33，而空气的反射率约为1。可改变光栅间距、光栅材料和基材率以使用不同波长激光。在一个实施例中，633nm波长光与750微米的融合二氧化硅基材上195nm间距的150nm氮化硅光栅联用。光以10°发散偶联到基材中。选择光栅与微阵列之间的距离，使得微阵列位于对应于全内反射的整数的距离上。可根据需要调整所有上述具体参数。例如，可使用其他光波长，其然后需要与上述不同的光栅间距。
TEC可置于检测孔317上以控制溶液温度。最后，CCD相机360可置于微阵列底部，使得可在相机检测器上形成微阵列的一对一图像。相机系统拍摄微阵列上溶液的照片。照片显示了在微阵列内可能正发出荧光的区域。这种信息用于鉴定和检测过程。
本发明利用所述改善和调整的协同组合来实施检测功能。
检测块-质量控制。除了鉴定样品内的靶序列以外，可使用微阵列来确保如上所述发生步骤(裂解、纯化、酶和引物的混合等)。可在各步骤处加入标记物，并且可在微阵列内光学测试标记物的存在或缺失。因此，通过分析标记物的存在或缺失，可实现质量控制以鉴定测试是否可能没有正确运行或没有正确运行之处。
检测块-全扩增。可使用装置10来避免样品裂解以测试各种核酸序列。样品裂解通常用于市售系统；其要求样品被分割成多个样品，其中可测试各分割样品的特定序列。由于原始样品被分裂成多个样品，这种方法由等于样品分裂数量的因数降低了检测限。与使用样品分裂不同，我们进行了称为全扩增的过程，由此可鉴定细菌或病毒物种内的变异而不分裂样品。这种类型的测试变得可能，因为物种内变体的DNA的一些部分可能是小的或相似的。在已知存在某些序列的情况下，然后可设计引物来鉴定变体。
一般而言，PCR限于约20种不同引物组，这限制了一个市售系统可检测的靶标数量。我们的系统通过全扩增克服了这种限制，其中PCR引物组靶向在许多生物体间共有的DNA序列，而引物之间的区域含有在生物体之间高度可变的DNA序列。全扩增方法允许在微阵列上分化样品类型，其中高度多重化是可能的。例如，冠状病毒聚合酶基因的保守区允许用单个引物组扩增6种不同的冠状病毒血清型，而各血清型在微整列上可通过分析在引物组之间扩增的可变区来区分。
全扩增的一个优势在于，需要比进行PCR的一般市售装置更少的引物。使用超过20种引物可导致称为“引物二聚体”的现象，其中引物分子由于引物中一连串互补碱基的互相杂交，而我们的全扩增过程允许使用更少的引物，因此产生有优势的构造。
检测块-实时杂交。在另一个有优势的构造中，在装置10内实施实时杂交方法，其导致样品输入和结果输出之间的时间缩短。在典型市售方法中，允许杂交继续直至达到正在测试中的一种或多种样品的稳定浓度。相反，在装置10中，进行实时方法，其中在一种或多种样品的浓度可能在杂交开始之后快速上升期间重复估计这一种或多种样品的浓度。该技术是基于以下观察，即来自CCD相机的信号强度可能与动态曲线方程的浓度相关，同上。使用动态模型，可监测荧光信号相对于时间的增加。该信号可建模或拟合为指数形式，从中可估计时间常数。用对时间常数的估计，可估计分析物浓度。
检测块-使用多阶段温度对照。在典型的市售杂交过程中，在杂交完成之后，进行严谨性洗涤，以洗去未结合的探针。一般而言，通过改变盐浓度来进行严谨性洗涤，然而在装置10中，可通过使用TEC改变样品温度同时保持恒定的盐浓度来实现相似的效果。因此，在杂交完成并且拍摄最初的一组图片之后，可升高TEC的温度，使得可去除未结合分子中的一些。这允许一种对结果进行检查的优选的方式，因为改变溶液的温度比改变杂交缓冲液的盐浓度更容易。
体积控制。测试过程需要精确体积，这可被填充腔室中存在的气泡破坏。在一般的市售系统中，使用各种装置如蠕动泵，但这些装置的添加提高了装置的复杂性和成本。我们的装置提供了实现高精度和准度(优选10％或更低)并且低成本实施的体积控制。
图4显示了填充腔室450和填充腔室周围结构的截面。填充腔室可位于底层490的顶部。腔室的侧面显示为460。流体可沿着箭头480进入腔室。可用虚线箭头495标记填充腔室的输出。元件470可以是阀；如果其关闭，没有沿虚线箭头495出现流。透气膜440可固定在所示填充腔室的顶部。关闭阀，流体可以480的方向流入填充腔室450。透气膜可使捕获的空气排出，并且随着填充腔室的填充，全部空气被排出。由于腔室和大气之间的压力差，透气膜没有使任何空气返回；因此，关闭阀470，可在填充腔室内收集精确量的流体。填充腔室内的体积精度可由腔室尺寸的精度决定，并且可使用熟知的技术控制腔室尺寸，诸如但不限于加工和蚀刻。透气膜可由材料制成，诸如但不限于微孔聚丙烯。因此，用精确制成的腔室和透气膜的组合，可实现精确且准确的体积控制。
填充腔室和膜一起位于iMFC卡内的各种位置上。因此，例如，具有透气膜的填充腔室可用于PCR主混合物腔室122和PCR引物腔室124。在这两个具体位置上，冻干的化合物可作为团块位于腔室内；因此，这些腔室内的再水合过程可发正在体积控制的环境中。
阀控制。图5A和B显示了如何控制iMFC卡内的阀和流体流，包括流体流通道520和气流通道540以及柔性膜530。图5A显示了2个额外箭头550以显示流体可流过流体流通道520。流体可在特定压力如6psi下被泵送通过系统。如果膜530没有变形，如图5A所示，则通道520可允许流体自由流动。然而，如果向气流通道施加更高的压力如18psi，则膜可能变形，如图5B所示，这可有效阻断通过通道520的流动。因此，通过控制膜任意侧上的压力，可控制流过流体通道的流。下文描述了施加不同压力的气动系统。
iMFC层。上述的iMFC卡可以是一次性的并且可由廉价材料制成，如聚碳酸酯、丙烯酸和聚对苯二甲酸乙二酯。卡可被认为是“母板”，其中可适应不同分子，如卡可设计为具有多种不同的输入类型以适应不同输入方法。不仅卡可适应各种模块，也可修改通道构造以适应不同诊断测试或从诊断测试中添加或减去步骤。因此，可设计各卡来适应特定测试或测试组，而不需要改变背后的硬件。各卡可有一层或多层制成。卡的主要功能之一是在合适的时间上使流体从一个位置按路线通过卡中构建的气流通道和流体流通道系统到另一个位置上。其他功能包括但不限于测量流并且证明温度控制的环境。
图6显示了iMFC卡的所有层的复合“投影”图像。一般而言，卡具有一个或多个通道，如600，使得流体可在这些通道中从一个位置流向另一个位置。可通过将槽切成卡内层状材料来形成通道。另外，卡也可具有一个或多个阀，如630，以及一个或多个通道或储器，如620，其中可测量体积。一些层或层的部分可由透气膜组成。卡可含有多个端口，如610。端口可形成硬件和卡之间的界面。使用这些端口来施加驱动压力(以驱动流体)或阀压力(以驱动阀)。这些端口的位置可对卡而言保持相同，这防止对改变背后硬件的任何需要。然而，可以任何方便的方式设计卡，并且可以任何方便的方式设置卡上的功能。这一方面使得卡多能，因为其经设计用于进行各种测试而不需要改变背后的硬件。
气动系统。气动系统(图7)负责调节卡内的流。气动系统可具有可位于单元基底内的泵。这种泵将积聚器(accumulator)中的空气压缩至所需的压力，如16psi。该图也显示从积聚器到泵的反馈环，使得积聚器内的压力保持恒定。一条路径从积聚器导向调控器，其中积聚器中的较高压力被调低至较低压力，如6psi。使用这种较低压力来驱动整个系统内的流体。可在调控器的输出处包括螺线管阀，以打开流体驱动。另一条来自积聚器的通路可通过一个或多个螺线管阀来控制阀的打开或关闭。因此，积聚器的较高压力(16psi)可用于控制阀。如图中所示，各螺线管阀可控制一个或多个阀。图5A和5B显示了如何通过流体通道和气流通道的设计来控制流体流。在图7的内容中，流体通道可连接至“驱动”输出，并且气流通道可连接至“阀”输出之一。
气动系统可以是硬件的部分；因此，可能不易于改变用于向流体流或阀控制提供压力的一些路径。然而，为了实现卡设计的灵活性，在相同位置上仅需要端口；这些端口是向流体驱动通道或向气流通道提供压力以驱动阀的原因。这些端口在图6中表示为610。因此，通过要求卡在相同位置处有端口，可使用相同硬件单元，但是卡本身可设计用于不同目的。
硬件。如图1所示，所述的测试系统可构建成一次性盒，包括单元基底20和单元盖30。可在基底和盖内物理构造各种功能和能力。图8显示了硬件的功能框图。硬件可包括处理器和能源如电池。处理器可接合其他元件如TEC、电动马达、光学系统、气动系统、显示器和通信系统。关于显示系统，装置10可具有可显示信息或结果的屏幕。关于通信系统，单元10可通过任意合适的通信方法如以太网和蓝牙接合外部计算机。可使用熟知的技术来实施这些显示器和通信子系统。图8也显示，卡可在机械上接合子系统中的一些，如TEC，电动马达等。由虚线显示这些接合。
本发明的实施方式包括：
1.一种模块诊断装置、系统或方法，其检测一大组(>6，>10，>20或>50)核酸序列而无需任何人介入来进行测试过程，除了出于注射或插入样品和读取结果的目的以外。
2.本文所述的装置、系统或方法，其中将裂解、纯化、PCR和杂交步骤整合到一个系统中，并且其中在一次性卡中进行这些步骤。
3.本文所述的装置、系统或方法，其中一次性卡可含有模块，使得通过改变该模块，可构造卡用于不同测试。
4.本文所述的装置、系统或方法，其中可在来自多种来源的样品中检测分析物，包括，例如：血液、唾液、GI样品、尿液、伤口拭子、脊椎穿剌、鼻拭子、兽医学和农业来源。
5.本文所述的装置、系统或方法，其中用于收集样品的工具可直接输入卡中。
6.本文所述的装置、系统或方法，其中通过称为全扩增的过程而不是样品分裂来进行PCR过程的扩增步骤。
7.本文所述的装置、系统或方法，其中检测步骤使用微阵列。
8.本文所述的装置、系统或方法，其中微阵列包括对照，其验证测试过程的各步骤是否适当发生。
9.本文所述的装置、系统或方法，其中检测步骤使用实时杂交方法，其基于动态模型来预测样品的浓度，其中减少了读取时间。
10.本文所述的装置、系统或方法，其中在钝化金属镀覆腔室中进行PCR过程，使得可通过将金属镀覆腔室放在TEC附近或与TEC接触来迅速控制腔室内的温度，优选其中使用的金属是铝。
11.本文所述的装置、系统或方法，其中通过使用与透气膜偶联的通道或腔室来测量溶液体积，使得在填充通道或腔室时，空气被排出透气膜；因此，可最小化或去除由于在测量的体积中有空气而造成的误差。
12.本文所述的装置、系统或方法，其中气动系统通过施加不同压力驱动流体和控制阀来控制流体流。
其他实施方式及其实施例详述
公开了便携式系统，其可分析多种样品中的核酸序列内容物。该系统能够获取多种原始样品(诊断或环境)并且在独立单元中通过微阵列进行核酸提取、纯化、扩增、标记和序列分析。该系统是自动且快速的，以允许由非熟练实验室技术人员的使用者对样品进行现场分析。
在实施方式中：该系统包括(1)可重复使用的硬件平台和(2)决定待进行的试验的耗用集成微流体卡(iMFC)；
该系统小(<150，<250，或400in3)、质量轻(<3，5或10lb)、快速、并且使用直观。
可重复使用硬件控制并提供气动、压力调节、温度控制、激光控制和最后微阵列成像；
耗用的iMFC包含卡，其进行样品裂解、纯化、PCR和检测并且容纳所有需要的干试剂；和/或
iMFC还包含试剂储存元件，其分开盛放所有液体试剂，从而不破坏干试剂的完整性。
在实施方式中，该系统提供：
易于使用：对于非熟练操作者现场使用而言易于操作并且结果理解简便；设置成临床实验室改善修改(CLIA)豁免认证的；和/或提供没有使用者介入的样品输入到结果输出的能力。
配置性：iMFC是模块，能够储存主要iMFC并且连接分开的、快速产生的、较低成本的模块，其限定终端产物试验功能性；由于主要iMFC保持相同，该系统在新威胁出现时提供新试验的即时开发。
试验灵活性；样品类型(从耐寒(hardy)孢子到易于破坏的哺乳动物细胞)和/或分析物类型(DNA、RNA和蛋白质)的灵活性。
可制造性和成本：iMFC和模块组件是可使用低成本注塑或先进制造激光转化过程制造的；高速激光转化和精确层叠使得能在接近50英尺/分钟的生产速率下制造具有小至125μm的图案和小于50μm的公差的iMFC；旧注塑技术和先进激光转化技术的组合允许以低于$10/卡批量产生复杂的一次性筒。
在实施方式中，我们的系统从原始样品输入到结果输出是完全自动化的，和/或可设置成允许多重分析类型。
在实施方式中，我们的系统提供便携式生物分析平台以检测核酸，一般是DNA或RNA，如微生物，一般是细菌、病毒或真菌检测，和通过mRNA和蛋白质检测的健康监测，以及细胞选择和浓缩。在实施方式中，该系统由2个元件组成：(1)可重复使用的硬件平台和(2)决定待进行的试验的耗用集成微流体卡(iMFC)。
在实施方式中，我们的系统证明可适应多种应用：
细菌试剂检测。我们的DNA检测iMFC以与实验室流程相似的方式运行：裂解、DNA纯化、DNA扩增和标记、以及杂交。我们的各步骤的微流体技术方法在下文中着重指出。
使用二氧化硅珠和低成本一次性电动马达来完成裂解，用于对从耐寒孢子到哺乳动物细胞的样品类型的强力裂解。
我们通过使DNA结合至石英玻璃料、洗去杂质、并在聚合酶链反应(PCR)即用溶液中洗脱来纯化DNA。我们的DNA纯化模块和过程允许在约5分钟内在没有使用者介入的情况下在前6μl中洗脱高DNA浓度。相反，用于孢子裂解和DNA纯化的实验室平台方法在7个步骤上耗费30分钟并且需要实验室离心。
我们在2个定制热电冷却器(TEC)之间的铝壁腔室中进行DNA扩增。TEC和铝腔室允许TEC和PCR混合物之间的快速传热。我们已经在12分钟内证明与大肠杆菌O104:H4病原体相关的两种基因(AGG和STX2)的PCR双螺旋并且已经检测到低至10个基因组拷贝。
我们使用定制DNA微阵列和光学系统来杂交DNA。使用光栅将光偶联至玻璃板并且保持限于全内反射。使用表面上的渐消波来激发与其在微阵列表面上的互补物杂交的靶序列。使用渐消波使我们能实时观察杂交。使用定制光继电器和CCD来对微阵列表面进行成像。
我们可验证对多种潜在生物战剂的多重检测并建立我们的试验和硬件平台的接受者操作者特征(ROC)曲线。
病毒RNA检测。除我们使用单逆转录/PCR混合物以外，我们用于检测病毒RNA的技术方法与我们进行DNA检测的方法相同。对于流感病毒H3N2和H1N1，我们已经在不到30分钟内证明了单主混合物逆转录和PCR。现场便携能力可直接利用从DARPA的预测程序获得的信息并且允许对导致在家养动物群中潜在大流行的病毒群突变的早期检测。
mRNA检测。我们能使用相同的软件解决mRNA分析，更新iMFC以允许使用聚-T珠进行mRNA捕获并对微阵列进行实时成像以捕获动态数据。使用动态测量使我们能够在刚好达到平衡之前就确定各分析物的浓度，从而减少了一般驱动基因表达分析的杂交时间。我们在需要地点快速分析血液样品mRNA的能力利用了预测健康和疾病程序(PredictingHealth and Disease program)中投资的DARPA。
蛋白质检测。我们可将蛋白质-结合事件转导成核酸读取，从而使我们的相同平台具有同时测试核酸和蛋白质的能力。血浆蛋白质浓度指示健康状态或环境接触。我们已经开发了4-宿主-响应蛋白质面板，其指示离子化辐射接触；用于其他环境接触诊断的类似面板也可集成到平台中。我们使用与mRNA检测相同的珠捕获微流体模块来捕获珠上的蛋白质分析物。用针对特定蛋白质分析物的抗体代替聚-T寡核苷酸来官能化珠。用寡核苷酸标记的二抗用作传统免疫试验的报告分子。一旦夹心试验经过严谨洗涤，使用与DNA检测相同的模块来扩增、标记和杂交报告寡核苷酸。我们把这种方法称为“微球-免疫-PCR”(MSiPCR)。
细胞选择和浓缩。我们的前端模块允许使用微流体电活化(EAP)聚合物细胞分选仪进行特定细胞选择和浓缩，这与实验室规模的荧光活化细胞分选仪(FACS)类似。该模块通过浓缩大体积的稀释细胞浓缩物(一些细菌细胞/ml)或从许多细胞的背景中分选出选择细胞(从全部外周血单核细胞中仅分选出活化的T细胞)增加系统操作区域。在该模块中，我们使用流体力学和/或惯性聚焦来排列细胞，并且然后基于荧光触发使用EAP致动器来分选。我们已经证明了该技术以超过25000个细胞/秒的速度进行分选的潜力。
基线手持式分析仪
硬件平台提供了支持对微生物DNA样品进行iMFC处理所需的所有必要硬件致动。使用者通过计算机USB端口与硬件平台交互。一旦将iMFC插入硬件并且关上盖，使用者选择针对所需试验的特定处理脚本。在启动脚本之后，手持式器件在没有使用者交互下运行，直至完成。在运行期间，将图像从手持式器件转移到主PC，其中它们被分析。在运行完成之后，分析和结果将展示在屏幕上由使用者检查。
硬件设计成在小型便携式装置中进行细胞裂解、纯化、扩增和检测，优先用小于1ft3的总体积，优选小于200in3。在一个实施方式中，硬件尺寸在4.75in深x6.25in宽x5in高，总体积为148in3。
在iMFC上，通过正压控制膜阀和液体流体流。启动子系统在定制丙烯酸歧管上集中，其与手持式分析仪(HHA)中的所有启动组件连接并且使这些组件的输出沿途径到iMFC上的输入端口。这种歧管含有积聚器以将一定体积的空气保持在规定的压力下(18psi)，该压力适于iMFC上的微流体阀膜致动。使用单个螺线管来在试验加工器件的任何时间上触发通向iMFC的驱动压力。这种驱动压力端口通过压力调控器(固定至集成歧管中)沿路径运行，使得对于任何给定HHA，驱动压力可在0-10psi中调节。
表1显示了基线系统中的功能性组件及其目的以及实施。支持扩增(PCR)和检测模块的硬件在下文详细描述为基线iMFC说明的部分。第二列列出了功能性组件的目的并且最后一列列出了在硬件平台上实施的用于实现所需能力的我们的技术方法。
表1.
基线iMFC和iMFC模块
耗用的iMFC包含(1)进行样品裂解、纯化、PCR和检测并容纳所有所需干试剂的卡和(2)分开盛放试剂储存元件以不损坏干试剂完整性。因为iMFC以模块模式设计-即，在通用卡上组装应用特异性模块-可通过简单互换模块来容易并快速开发用于新应用的iMFC。这种通用性特征消除了重新设计、开发和制造新卡，最复杂组件的需要。一旦制成，相同的卡可用于广泛的应用，从而降低了成本和开发时间。
微流体卡。该卡采用正压力驱动流并且有三个功能性层组成，其含有(1)流体通道，(2)22个控制流体流的膜阀，和(3)用于从流体通道去除气泡的裂口。这些功能性层一起包含9个层叠层，其周围是2个注塑的部件。7个模块预固定的卡上，4个在上表面(裂解模块，纯化滤器，PCR主混合物腔室，和引物腔室)并且3个在下表面(PCR腔室，搅拌棒混合腔室，和检测腔室)。固定至检测腔室的是光学波导芯片，其含有DNA微阵列以感测感兴趣的靶标。
试剂块。当使用者启动程序时，手持式硬件中的可膨胀囊状物将试剂块挤压到尖锐物上以穿透箔密封，其进而释放液体试剂。使用正压力驱动流，空气进入试剂块中的各腔室并且驱动流体试剂通过输出通孔并进入卡。卡上的可压缩垫圈防止试剂块-卡界面处的流体或空气泄漏。表2列出了可储存在试剂块中用于DNA分析的液体。设计用于不同应用(mRNA或蛋白质分析)的卡将具有不同试剂。试剂块也包含废料储器，其含有吸收材料以收集流过卡的试剂。试剂块优选含有生物试验分析所需的单预包装模式的所有液体试剂。表格列出了目前用于DNA分析的试剂。缓冲液名称连同缓冲液的目的和精确化学配方。试剂块是一般目的，并且所需的试剂将根据由iMFC进行的生物试验而变化。我们的技术方法是使用相同的包装，但用不同试剂填充以支持RNA病毒检测、mRNA检测和蛋白质检测的新试验能力。
表2.
裂解。在从试剂块中释放液体之后，自动化程序中的下一步是裂解。裂解模块，其可以操控甚至孢子样品，由3个腔室组成：样品腔室，珠磨腔室(用于孢子裂解)，和结合剂腔室。在来自试剂块的裂解缓冲液流入样品腔室之后，打开电动马达使裂解缓冲液与样品混合。混合的样品然后流入珠磨腔室中，其中第二电动马达运行3分钟以搅拌玻璃珠并且通过珠磨使孢子样品裂解。裂解的样品然后进入结合剂腔室，其中盐酸胍和硫酸氢钠(结合剂)的固体混合物在样品中溶解以促进下一步骤中DNA与纯化滤器结合。
作为对该方法概念的证明，我们获得了从通过裂解模块裂解的枯草芽孢杆菌孢子样品的裂解效率。孢子代表了最难裂解的情况。对于非孢子应用，珠磨腔室可用无电动马达的腔室模块替换以简化设计并降低成本。
纯化。我们在开发用于微流体DNA纯化的技术方法中面临几大挑战。例如，我们需要开发一种复制需要7个步骤和30分钟以及离心步骤以成功裂解并纯化孢子样品的实验室过程的方法。另外，我们需要在前6μL部分中洗脱DNA。在实验室试验中，一般在较大体积(例如，20μL)中洗脱纯化的DNA，并且然后使用较小体积等分试样(1-3μL)用于PCR扩增。在这种情况中，DNA混合并且因此洗脱速率在整个20μL上平均化。微流体方法几乎不包括混合，因为大多数的流是层叠的；因此，最高浓度的洗脱DNA需要在第一部分中。
表3.我们使用我们的裂解模块进行了枯草芽孢杆菌孢子裂解的三次重复。下面以从107个孢子的起始母液的百分比显示了结果(基于活力计数)。对照是Claremount珠磨装置。我们的微流体结果与使用实验室吸头和试管的对照相当。
枯草芽孢杆菌样品编号 基于107的活力计数输入的裂解后回收(％)
1 48.4
2 31.6
3 18.6
平均 32.9
对照 39.6
在iMFC上，在裂解后，样品流过纯化模块，DNA结合至滤器，并且剩余裂解样品的内容物流向废料储器。然后来自试剂块的洗涤缓冲液流过滤器以去除残留杂质并且也收集在废料储器中。空气吹过纯化模块以干燥滤器，之后是来自试剂块的洗脱缓冲液(在第一部分中实现显著洗脱的关键方面是洗脱缓冲液pH)，其在流过时，从滤器中去除纯化的DNA制备用于PCR。表4表示在微流体卡上纯化的大肠杆菌样品的三个重复的数据并且比较了这些结果与来自标准纯化滤器的那些。在各种情况中，很明显，最高浓度来自第一部分。各部分表示约6μl的洗脱液中的DNA。
表4.我们使用我们的iMFC方案重复了大肠杆菌样品纯化的3个重复。我们开发了方案以洗脱第一部分中的大部分DNA，因为使用一般实验室平台方法，我们将没有机会收集整个洗脱并用吸头只选择一部分。结果清楚地表明，最大浓度来自前6-μl部分。
PCR扩增和标记。携带来自滤器的纯化的DNA，洗脱缓冲液填充PCR主混合物腔室，其含有冻干的主混合物。然后，再水合的主混合物流入引物腔室并且使干燥的引物再水合。我们分离引物和主混合物是为了重复使用通用PCR主混合物模块。寡核苷酸的冻干是快速的，并且这种方法使我们能够支持快速开发试剂盒来测试出现的威胁。在再水合步骤之后，样品和主混合物以及引物一起进入PCR腔室，在其中然后扩增样品DNA。
两个关键特征使我们能够完成快速PCR：(1)铝PCR模块表面和(2)新TEC组件，其可以±1℃的精度升温>15℃/s。
PCR模块夹在2个TEC组件之间。PCR主混合物盛放在由2个25-μm铝壁封闭的1-mm-高丙烯酸腔室中。PCR腔室的铝表面使得能够向TEC组件或从TEC组件向液体PCR混合物快速导热。作为比较，50-μm-厚的塑料使升温塑料降低约3倍。
SRI设计并测试定制TEC组件。我们已经转变了用于制造的RMTltd设计。定制SRI组件结合散热器、TEC、反馈传感器(热敏电阻器)、和传感器周围的氮化铝(AlN)热器。校正各热敏电阻器传感器以允许HHA补偿任何传感器制造错误公差。
作为对我们的PCR系统概念的证明，我们产生了针对与2011年德国爆发的大肠杆菌O104:H4病原体相关的聚集粘附菌毛(AGG)和志贺毒素(STX2)基因的双链PCR试验。基于在爆发刚开始之后由BGI上传的序列分析选择独特区域的引物和探针。采用使用台式设备的实验室试验来建立针对AGG和STX2靶标优化的探针选择和引物优化。一旦建立，将试验转变为SRI微流体PCR系统。由于SRI PCR系统利用针对热传导和温度均匀以及用于快速温度循环的新热敏电阻器驱动的TEC设计优化的铝PCR腔室的优点，含有用于钝化铝腔室的佐剂的定制的主混合物制剂允许在16分钟内对AGG和STX2靶标进行双链扩增。
结果提供了40个PCR循环(95℃变性步骤，62℃退火以及73℃延伸)的覆盖。各循环持续21秒进行40个循环，总共14分钟的PCR热循环。剩余时间用于最初变性和尿嘧啶-DNA糖苷酶(UNG)处理。我们的定制主混合物含有dUTP作为扩增的部分，并且UNG步骤确保在硬件平台的不同使用之间没有污染。我们在5个不同输入拷贝数(10，50，100，500，和1000)上测试了16-分钟PCR并且同时针对AGG和STX2基因对扩增因数进行定量。另外，我们使用12-分钟PCR方案测试了500拷贝输入并且观察到循环时间从21s/循环降低至15s。同样，使用2分钟UNG处理和初始变性，循环时间只有10分钟。表5显示了针对扩增子标准物的巢式PCR以对各样品中的扩增子进行定量并确定扩增因数的结果。总体上，对于模块PCR，我们的扩增范围是1.6x109至3.4x1011。另外，已经用SRI模块杂交系统检测了用模块PCR系统生成的扩增子。
表5.模块PCR样品的定量结果。结果显示，所有样品在杂交中有>3.4nM的扩增子，其高于1-nM LOD。
检测。为了检测特定靶标的存在，将扩增的样品与光学波导芯片上的微阵列杂交。为了促进杂交，首先向扩增的样品中加入来自试剂块的SSPE缓冲液。采用2个测量腔室来实现样品与SSPE缓冲液的最优比例。
SSPE和PCR混合，然后被推入检测腔室中，其在光学波导芯片上的微阵列上孵育样品。在5分钟的温度控制的杂交之后，使用我们的定制TEC组件，其他SSPE缓冲剂流入检测腔室以洗去样品并且去除未杂交的扩增子，之后升高温度以去除交叉杂交或与错误探针非特异性结合的任何扩增子。
最后，使用定制的照射、收集和成像光学块对DNA微阵列进行成像。光学块设计成单独的子组件，其包括激光照射和微阵列杂交成像所需的所有东西。可在安装到HHA中之前预排列和调整光学块。一旦进行了这种预排列，在安装时不需要进一步调整。
激光照射光学元件由线-生成激光二极管模块和转向镜组成。激光照射的靶标是微阵列芯片上的光栅。线-生成激光二极管以矩形图案发出635nm的10-mW光束以激发用于观察与微阵列的杂交的Alexa Fluor 647nm染料分子。线-生成二极管模块具有在现成包装(粘合有限公司(Coherent))中集成的聚焦和线-生成光学元件。
微阵列成像光学元件包含折叠的1:1中继镜和干涉滤器。定制设计的中继镜是快速的(f/1.5)，从而最大光收集能力。其尺寸小(直径12mm，并且长度<27mm)。中继镜设计成充分使光准直进入2个用于阻止激光激发光和散射光到达我们的单色CCD相机的干涉滤器(由介电堆叠件制成)。
CCD芯片和电子元件直接连接至微阵列成像光学元件以降低噪音并最小化信号损失。CCD能够有对微阵列成像而言充分读取微阵列分析的速度(4帧/s)和足够的信噪比，而不需要CCD冷却。
作为对光学系统概念的证明，我们将通过TEC组件和SRI铝PCR腔室生成的PCR扩增子杂交并且使用所述的光学系统读取结果。测试的方案包括点样的探针(如我们的快速DNA合成仪器所鉴定)，在37℃下机载孵育5分钟，多次在从37℃增加至60℃的温度下的严谨洗涤，和用于自动化图像捕获的光学包装。我们用单一对照(A3)分析物杂交阴性对照，来自10拷贝的所得扩增子进入PCR，并且来自50拷贝的扩增子进入PCR。通过杂交阴性对照样品和从AGG和STX2的单独引物扩增的样品已经证明了试验结果。杂交图像证明，靶探针在10和50输入模板的情况中都清晰可见，并且在A3对照情况中不存在。
耗用的iMFC的低成本大量制造。我们开发了制造过程计划来降低iMFC制造的成本用于大量生产。因为注塑的用于产生部件的简单廉价的方法，我们注塑了卡的上层和下层，以及裂解模块和试剂块。卡的其余层叠层以自动化卷制工艺制造，其中材料卷层叠在一起，激光切割，然后反绕到另一个卷上，全部都以快速管道方式在相同的设备系统上进行。采用数百万卡数量级的高生产量，成本可低至$10/卡。
DNA检测方法。我们的系统具有用全部针对扩增子的可能探针在不到10小时内进行光刻合成寡核苷酸阵列的能力，因为我们可在约2周内选择合适的探针并且将平台PCR试验转移到我们的平台中。如本文所示，我们已经成功证明这种开发扩增试验、将其转化成iMFC PCR、以及选择针对大肠杆菌O104:H4的探针的能力。
病毒RNA检测方法。RNA病毒检测使用所有与DNA检测相同的模块，带用于RNA病毒基因组的逆转录和扩增的微流体试验。我们已经使用可区分季节性和猪流感的试验证明了这种方法的概念。用于开发流感试验的方法是普遍的，并且可使用与选择试剂RNA病毒相同的方法。
为了鉴定流感，我们的第一步骤是鉴定可选择性扩增甲型流感病毒基质基因的区段以及区分H1(猪)和H3(季节性)毒株的血凝素基因的部分的引物。我们的RT-PCR方案包括在42℃下的5分钟逆转录(RT)步骤，其中反向引物退火至RNA靶标并且引发第一DNA链的合成。2-分钟逆转录酶失活和同时Taq聚合物“热启动”之后允许正向引物退火至第一DNA链并且合成第二DNA链。在这点上，进行40个循环的PCR：95℃下的10-s变性，62℃下的20-s退火，和75℃下的5-s延伸。一旦在台式设备上实现的良好扩增，我们转移到我们的模块扩增系统，其模拟我们的iMFC中的扩增。由于该系统中的快速温度升高，上述RT-PCR方案耗时不到33分钟。首先使用凝胶电泳，然后在微阵列上评价RT-PCR产物。获得了针对CA 2009猪流感毒株(H1N1)和HK 68季节性毒株H3N2(三重扩增)的基质和血凝素基因的模块扩增的凝胶电泳结果。244bp扩增子显示甲型流感病毒基质基因。H1毒株的血凝素扩增子是173个碱基度，而H3扩增子是177个碱基对。与DNA微阵列上的序列特异性探针的杂交给出了H1和H3毒株的明确分化。
在微阵列上实现灵敏和选择性检测的第一步是制备光刻合成的探针选择芯片，其含有针对我们的感兴趣靶标的覆盖整个扩增子的20-25聚体探针。我们在不到一天内合成针对感兴趣扩增子的全部可能探针的能力表明我们能凭经验测试灵敏和特异性探针。接着，我们进行对微阵列的杂交实验以选择最灵敏和特异性的探针。鉴定了对易于区分H1和H3的探针的选择；存在一些在2个扩增子之间容易分化的扩增子区。最好的探针可与胺修饰拟合用于在我们的手持式装置中使用的环氧官能化的显微载玻片或波导芯片上点样。
mRNA检测方法。外周单核细胞(PBMC)的基因表达概况是监测疾病状态、环境接触和感染的症状前阶段诊断的有用方法。能够进行mRNA表达分析的我们的iMFC使用硬件平台的稍加改变版本-额外TEC和增加的微阵列上的光照均匀性，并且可进行：
-PBMC选择和裂解：使用用于从全血中纯化PBMC的市售尺寸排阻滤器，和本文所述的细胞选择器模块。
-mRNA纯化：使用由聚-T寡核苷酸包被的微球从裂解的细胞中捕获mRNA。
-T7线性扩增和标记：使用现有PCR腔室用于T7扩增和标记以及市售试剂盒。
-快速杂交：使用对杂交的动态测量来确定分析物浓度；将基因表达杂交所需的时间从多个小时降低到数分钟。
-T7扩增利用现有的iMFC PCR模块和市售试剂盒。
mRNA纯化。对于mRNA纯化，我们使用可将mRNA杂交至聚T包被的珠，洗去污染物，并且然后从聚T珠释放mRNA的微流体纯化模块。我们使用混合器，其将约5μm微球珠保持在溶液中并且使用新TEC来熔解在洗涤步骤之后从珠捕获的mRNA。我们已经测试了装置来验证5-μm珠在风箱混合腔室和滤器之间移动良好。我们也已经证明流体可被加热至约80℃以允许聚T:mRNA双链变性。
快速杂交。为了降低杂交时间并改善重复性，我们从动态速率参数推导浓度。在靶转录本的数量与探针数相比过量的情况中，信号值对比时间应该遵循动态曲线：
Y＝C(1-e-rt),r＝koff+[A]kon
在等式中，Y是背景扣除信号；koff和kon是取决于温度、基因序列和探针移位的动态参数；[A]是溶液中靶基因的浓度；并且C是取决于包括光强度、探针密度、靶标浓度和动态参数的多种因素的斜率因数。我们的探针选择技术通过将等式与在多个浓度上的时间系列杂交信号来估计koff和kon。可储存这些估计并实时用于估计[A]。因为光强度和探针合成密度的变化影响参数C而不是指数内的变量，这种动态技术显著改善了芯片间和同芯片上的复制可重复性。
作为对概念的证明，我们已经用动态速率方法进行实验，从合成的25-碱基对寡聚体靶标开始。一个探针针对A3对照标记的寡核苷酸的动态响应。各线表示针对不同浓度A3的响应：50nM，100nM，300nM。使用非线性最小二乘拟合来估计各时间系列的参数C和r。然后，在多个浓度[A]下的实验显示了r和[A]之间的仿射关系。
我们鉴定了在r和[A]之间产生灵敏、可重复关系的条件。我们的数据显示，该关系可出现在正确的方向上，对于[A]＝(50，100，300)nM，r＝(0.0031，0.0033，和0.0058)s-1。动态曲线拟合的另一个益处是，即时平衡值C证明好于动态速率r，拟合过程在短期噪音上平衡。我们以注意到测量动态参数的能力取决于iMFC使用渐消波仅激发荧光分子，该荧光分子结合至芯片表面，即时在靶标溶液就位时也给出高信背比。
蛋白质检测方法。一种扩大iMFC平台的检测能力的方式是在微球免疫试验中包括蛋白质生物标记物，其使用用寡核苷酸标记的抗体来在存在靶抗原时产生非线性可扩增DNA靶标，并且我们已经基于SRI的证明的微球免疫-PCR试验(MSiPCR)用iMFC平台开发了免疫试验模块。生物素化的靶标特异性抗体偶联到链霉亲和素-包被的6-μm聚苯乙烯珠上用于靶抗原的初始捕获。独立的靶标特异性抗体化学偶联一个寡核苷酸用于对靶蛋白质的二次捕获事件。2个蛋白质捕获事件之间的广泛洗涤洗去了任何未结合的靶标以及游离偶联物。然后使用特异性标记的引物组和taqman探针来扩增剩余的珠部分。扩增的核酸信号随后杂交至微阵列上用于检测和读取。我们已经将台式试验转移到iMFC平台中：我们的概念验证的iMFC平台的模块系统纳入风箱混合器用于洗涤和孵育步骤，以及滤器用于在核酸扩增后捕获珠。
系统改进。可改变光学模块以在微阵列光栅中提供更均一的图案，并且使用532nm激发来改善检测信噪比。从635nm切换到532nm激发光源的过程仅仅是改变光栅间距的问题。
这种改变的光学块由激光靶标照射光学元件和微阵列成像光学元件同时组成。激光靶标照射光学元件使用小的二极管泵送固态(DPSS)激光模块，扫描聚焦光学元件，和2D扫描微型机电系统(MEMS)镜。DPSS激光模块可输出532nm的40-mW激光束用于激发Cy3染料分子。可使用聚焦光学元件将光束聚焦到MEMS镜上。2D MEMS镜可扫描矩形上的点并且使光束瞄准光栅。在从扫描镜反射之后，光束射向扫描透镜，其在光束进入微阵列芯片上的光栅之前使光束准直。
该系统在整个光栅上，并且因此在整个微阵列上扫描相同激光点。这消除了来自线-生成光学元件的照射不均匀，其在强度上的变化可多达25％。扫描透镜也使我们在光束进入微阵列芯片光栅之前使光束准直。我们用对新扫描技术方法的概念验证证明来验证。除了不同激发(532nm)和发射(570nm)波长的滤器以外，微阵列成像光学元件与本文的光学块没有变化。
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本发明的实施方式包括：
1.一种自动化核酸分析系统，包括在微流体连通中的样品裂解、扩增、PCR和检测模块，其设置成通过多序列扩增和同时微阵列杂交读取来对不同核酸序列进行平行检测。
2.之前或之后权利要求的系统，其中：检测模块包含微阵列检测光学元件，其包含采用渐消波激发和检测的微阵列扫描仪；检测模块包含自动化杂交处理器，其设置成通过温度提供多种严谨性；和/或PCR模块设置成在单次反应中进行逆转录和PCR。
3.之前或之后权利要求的系统，包括包含模块的集成微流体卡和分析仪，所述分析仪包含设置成接受卡的容器，设置成操作卡的操作器，和设置成电子控制操作器的控制器，该操作器包含流体致动器、PCR热循环仪、和自动化杂交处理器以及微阵列检测光学器件。
4.之前或之后权利要求的系统，还包括设置成含有并递送试剂至裂解、纯化、PCR和检测模块的试剂模块。
5.之前或之后权利要求的系统，其是：
便携的：小于2000、1000或500in3并且小于50、25或10lbs；
快速的：分析不到60、120、180或240分钟；
多重的：同时分析超过10、50、500种靶序列；和/或
自动的：在样品导入和结果展示之间不需要用户介入。
6.之前或之后权利要求的系统，其中：
样品包含蛋白质分析物并且系统进一步设置成用包含核酸序列的标签来标记蛋白质分析物；
锚定的探针通过其空间位置限定序列；
使用比被分析序列的数目少的引物对数来达到/实现扩增；
不同核酸序列是多物种/生物体的；
PCR模块包含金属(例如，铝)PCR反应腔室；
微流体连通包含经设置用于去除气泡的透气膜，其中透气膜在通道层之下，使得整个通道暴露于大气压中(在一个具体的实施方式中，该膜跨越所述卡，因为与单独的片相比其更易于被制成层，虽然其仅仅在通道层之下起作用)；
扩增完全包含在耗材(例如，无开口管)中；和/或
检测是基于探针组而不是引物组(易于构建新的测试)。
7.之前或之后权利要求的系统，其设置成：
在单个容器中扩增(无样品裂解)；
接受并处理血液、唾液、GI样品、尿液、伤口拭子、脊椎穿剌、鼻拭子、兽医学和农业来源的分析物样品；
通过试样收集工具或运输介质接受样品；
处理1-100ul的样品体积；
是模块化的(模块可互换以支持不同应用)；
能够测量(通过通道尺寸和气泡去除进行)；和/或
是单向或自封闭的(防止样品交叉污染)。
8.之前或之后权利要求的系统，包括包含模块的集成微流体卡和包含外壳(盒)的分析仪，并且在外壳内包括设置用于接受卡的容器，其中该分析仪：
接合卡以进行裂解、纯化、PCT(扩增和标记)、和检测；
通过压力(例如，样品运输)、磁场(例如，样品混合)、温度(例如，扩增、严谨性、杂交)和/或光(例如，杂交检测)与样品相互作用；和/或
通过将渐消波与样品偶联来进行检测以实时观察杂交和/或确定产生序列信息的可能碱基对错配和动力学。
9.之前或之后权利要求的系统，包括包含模块的集成微流体卡(筒)的系统，其中该卡设置成：
对疾病类型有特异性(例如，呼吸道疾病)；
对患者类型有特异性(例如，小儿)；
对病原体类型有特异性(例如，生物战试剂)；
对个体有特异性(例如，药物基因组学)；
含有针对患者特异性信息的独特标识；
用于一次性使用以保持无菌并最小化交叉污染；
使用辊到辊生产步骤产生；和/或
来自聚碳酸酯底架、金属箔PCR腔室、丙烯酸组分、可呼吸膜材料、和/或聚氨酯密封。
10.之前权利要求的系统，所述系统功能性集成微流体荧光-活化细胞分选仪(μFACS)，其设置成提供用于颗粒或细胞比对的流体力学和/或惯性聚焦并且包含设置成用于分选的微孔电活性聚合物(EAP)致动器。
11.一种包括使用之前权利要求的系统通过多重序列扩增和同时微阵列杂交读取来平行检测不同分析物核酸序列的方法。
其他实施方式及其实施例详述：用于新护理点、便携式和高度集成应用的高效荧光活化分选(FACS)。
高端市售FACS设备通过静电偏转在带电液滴内含有的细胞实现了10,000至40,000分选/s的分选速率[1,2]。它们可应用于广泛的应用，例如，分离用于免疫疗法的癌症靶向T细胞，富集干细胞用于组织工程改造，和分离特定细胞用于操作或进一步分析(例如，DNA测序、RNA表达和荧光原位杂交)。然而，它们的大且昂贵的设备，其需要专家级的操作者并且因此不适于护理点或便携式应用。另外，它们的整体性意味着它们不能容易地与其他仪器或过程集成。
在解决这些限制的尝试中，研究者已经开发了许多微流体FACS变种。直到最近，这些装置是缓慢的(比常规FACS慢超过1个数量级)，并且大多数难以制造或者不适于制造和实际应用。随着脉冲激光活化细胞分选(PLACS)的发展，本领域的微流体状态增加至约10000个细胞/s，并具有高纯度[3]。在PLACS中，使用通过快速膨胀和接触血浆气泡产生的流体喷射来分选细胞。虽然流体装置是简单、连接并且便携的，该系统需要高重复率的脉冲激光，其是昂贵且大的。因此，PLACS无法解决规模和费用上的挑战。
我们公开了基于EAP的流体致动的更简单方法，其是响应电刺激改变形状的聚合物。它们已经用于微流体装置以改变通道的截面几何形状，生成用于电泳分离的小注射[4]，改变通道的流体阻力并且清除堵塞[5]。我们已经开发了新的高效微流体EAP(μEAP)致动器并将其集成到微-FACS中。
电活性聚合物致动。我们的流体致动器包括封闭端流体腔室，其中一个或多个表面包含EAP。在一个实施方式中，腔室的底面是用薄(约12μm)的介电弹性体(硅酮)的EAP层覆盖的电极。概念上，硅酮向柔性电容那样作用。其在向电极施加电压时扭曲，增加腔室体积并且将流体抽入腔室中。当增加电压时，硅酮松弛并且将流体推离腔室。
易于使用已证实的小规模制造技术来制造EAP致动器。为了产生致动器，我们使电极在氧化铟锡包被的载片上形成图案，其变为基材。我们然后将一层未固化的规定在载片上结网并使其热固化。为了产生通道层，我们使用常规软光刻来模塑微流体通道。我们然后通过将通道层与硅酮包被的载片对齐并等离子体结合来完成装置。致动器与软光刻的相容性意味着它们可易于集成到微流体装置的大的现有文库中。其也能够进行快速原型制造。这种装置是廉价的，因为它们仅需要电压源用于致动，并且制造方法适于低成本制造。
在具体的示例中，我们制造了<1mm2的致动器，其证明10μs的响应时间；然而，致动器尺寸也可以是微米级的(例如，小于1、10或100μm2)并且响应时间可小于10、1、0.1μs，更短的响应时间。它们的尺寸选项使得它们特别适于手持和集成应用并用于平行操作。
这些示例性EAP致动器的快速响应速率(<20μs)也表明它们>25,000个细胞/s的分选速率。该装置是廉价的，因为它们仅需要电压源来致动并且是使用低成本微制造技术构建的。将硅酮用作聚合物使得能够通过软光刻将EAP致动器与微流体通道简单集成。这使得能快速原型制造并具有规模放大到制造量级的潜力。EAPμFACS以手持式递送与台式FACS等同的通量。
我们已经优化了EAPμFACS的性能并且将改进的装置纳入与iMFC系统集成的细胞浓缩/分选模块中。该模块通过浓缩大体积的稀释细胞浓缩物(例如，环境样品中存在的细菌，一些细菌细胞/ml)或从许多细胞的背景中分选出选择细胞(例如，从全部外周血单核细胞中分选出活化的T细胞)是系统增加操作包封。下文进一步描述了微型分选器的实施方式。
分选器设计。分选器进行3个关键功能：比对、检测和分选。我们的设计(例如，图9)纳入多重创新，包括将流体力学和惯性聚焦组合用于比对，和使用EAP致动用于快速分选。在常规细胞分选器中，使用同轴鞘流在水平和垂直上同时聚焦颗粒或细胞，该同轴鞘流捏合紧密的样品流。由于大多数微流体装置是平面的，它们仅可在一个方向上聚焦颗粒(即，水平)；多层装置也可垂直或纵向聚焦颗粒，但对于制造而言明显更为复杂。在没有垂直聚焦的情况下，颗粒可在通道的高度上分布，导致速度上的变化并且重叠。在我们的设计中，我们通过流体力学聚焦在截面区中水平比对并且通过惯性聚焦在长“颈”中垂直比对。当流体速度足够高以对颗粒生成升力时出现惯性聚焦[6]。该组合使我们能在单层装置中有效比对颗粒，这保持了我们的简单制造方法。
为了分选，我们首先使用荧光检测颗粒，其中在检测到靶标颗粒之后，向一个或多个EAP致动器施加电压脉冲。致动器产生瞬时交叉流，其将靶标颗粒偏转到新的路径上，该路径通道分选输出，如图9所示。
图9是显示μEAP FAC的通道布局的EAP微分选仪示意图。插图显示通道的主要功能。通过流体力学聚焦(左)完成水平比对，而通过惰性聚焦(中)实现垂直比对。最后，通过μEAP致动器(右)对靶标颗粒进行分选。延长接触图像显示了来自未分选和分选的颗粒的条纹。流速为8μl/分钟(107mm/s)，并且致动脉冲为400V下1ms。
使用180°异步运行的配对致动器通过使施加在流体上的力翻倍并且降低流体阻力显著改善了性能，该阻力与通道长度成比例。用两个致动器，一个“拉”而另一个“推”流体，并且流体仅沿着致动器之间的短距离移动(一般为约2mm)。相反，用单个致动器，流体移动发生在从致动器到装置输出(约30mm)。
为了测试我们的μFACS装置，我们使用检测和控制系统，其由落射荧光显微镜、电荷耦合装置(CCD)相机、光电倍增管、基于场-可编程-门控-阵列(FPGA)的数据获取系统、和电压放大器组成。
初始颗粒分离证明。为了证明μEAP分选器的分离能力，我们通过在绿色荧光信号上门选并向EAP致动器施加620-V，500-μs脉冲分选了绿色(7μm)和红色(5μm)荧光颗粒的混合物。流体流速为10μl/分钟，其产生133mm/s的平均线速度。未分选的细胞沿着其默认路径通向废料通道，而分选的细胞偏转至通过分选通道排出的路径(图10)。我们从含有能分选和不能分选的2个流体输出捕获10-μl流体体积。在分离的手动细胞仪中对体积进行成像。基于细胞仪的结果，我们估计100％的纯度和93％的产率。
致动器性能优化。按照我们对概念的最初证明，我们启动了对EAP流体致动器的设计研究以改善我们的分选通量。我们使用COMSOL Multiphysics来开发简化的致动器机电模型。我们的结果显示，大多数致动发生在装置的周边。基于这些结果，我们开发了一定范围的致动器设计并且凭经验测试它们的性能。通过增加施加的电压并改变致动器几何形状，我们能够改善EAP致动器的性能。我们成功地用25-μs，800V脉冲以30μl/分钟(400mm/s)的流速分选颗粒，这比我们最初的颗粒分离证明中使用的分选器有20倍的改善。
细胞分选证明。为了证明μEAP FACS内的细胞分离，我们用荧光标记的B细胞制备小鼠淋巴细胞样品。白细胞通过离心分离开并且然后在用藻红蛋白-偶联的B220抗体标记之前固定。将样品输入FACS。图11显示了分选的B细胞的图像。用100-μs，800-V脉冲，以11μl/分钟(147mm/s)进行分选。注意荧光裂口在中心最亮。因为标记的细胞比荧光颗粒明显更暗，我们使用488-nm二极管激光来照射检测区中的细胞，同时更暗的发光二极管(LED)灯提供了全视野照射。右侧的亮点是通过污染纤丝在壁上捕获的细胞。
多分选器集成。由于其直接制造和与软光刻的相容性，μEAP分选器能易于集成到更复杂的装置中。为了显示我们的EAP致动器的集成能力，我们开发了特征为多个独立分选器的其他装置。图12显示了双通道装置中的平行分选，其中延长时间接触显示了在平行通道中独立分选的2种颗粒，并且图13显示了双阶段系列分选到多输出中，其中延长时间接触显示由2个连续分选器分选到3个箱中的一个的2种颗粒-注：箱3是默认(未分选)箱。类似地构建更高级的多通道平行和多阶段连续分选构造。
我们的微流体荧光活化细胞分选器(μFACS)提供了分选颗粒所需的所有功能：比对颗粒、检测其荧光信号、基于荧光作出分选决定、然后适当分选。证明的能力包括：用短至20μs的多种致动器脉冲长度的颗粒分选；用多致动器和单致动器构造的分选；在多通道分选器中的独立平行分选；在多阶段分选器中的顺序分选。微电活性聚合物(μEAP)分选器的益处包括：(a)通过简单电输入快速触发分选(证明的20μsec分选)；(b)μEAP致动器与多种微制造技术相容；和(c)μEAP分选器易于集成、并行并且非常适于便携规模的装置。
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本发明的实施方式包括：
1.设置在流通道周围的高效微流体电活性聚合物(μEAP)致动器，其中施加于致动器的电压脉冲诱导致动器在流通道之间产生瞬时交叉流，其将流通道内的靶颗粒偏转到新的路劲上，其中该致动器包含封闭端流体腔室，其中腔室的表面包含由介电弹性体的EAP层覆盖的电极。
2.如权利要求1所述的多个致动器，其设置在流通道周围并且彼此异步的致动器，其中施加到致动器的电压脉冲诱导致动器在流通道之间产生瞬时交叉流，其将流通道内的靶颗粒偏移到新的路径上，其中各致动器包含封闭端流体腔室，其中腔室的表面包含由介电弹性体的EAP层覆盖的电极。
3.如权利要求1所述的一对致动器，其设置在流通道周围并且彼此异步180°的致动器，其中施加到致动器的电压脉冲诱导致动器在流通道之间产生瞬时交叉流，其将流通道内的靶颗粒偏移到新的路径上，其中各致动器包含封闭端流体腔室，其中腔室的表面包含由介电弹性体的EAP层覆盖的电极。
4.之前或之后权利要求所述的致动器，其中腔室的多个表面包含由介电弹性体的EAP层覆盖的电极。
5.之前或之后权利要求所述的致动器，其中流通道设置成提供用于颗粒的水平比对的流体力学聚焦和用于垂直比对的惯性聚焦的组合。
6.之前或之后权利要求所述的致动器，其中新路径通向分选输出。
7.之前或之后权利要求所述的致动器，其中流体通道包含样品输入通道以及分选和未分选的输出通道，和导向分选输出通道的新路径。
8.之前或之后权利要求所述的致动器，其中流体道设置成用于荧光检测，其中在检测到靶颗粒之后，向μEAP致动器施加电压脉冲。
9.之前或之后权利要求所述的致动器，其中EAP层是1-50(或2-25，或5-15μm厚)。
10.之前或之后权利要求所述的致动器，其中弹性体是硅酮。
11.之前或之后权利要求所述的致动器，其设置成在多通道装置中提供平行分选。
12.之前或之后权利要求所述的致动器，其设置成在多通道装置中提供多阶段连续分选。
13.之前或之后权利要求所述的致动器，其功能性集成到荧光活化的颗粒分选器中。
14.一种使用之前权利要求的致动器的方法，包括以下步骤：施加电压脉冲以诱导致动器在流体通道之间产生瞬时交叉流，该交叉流将流通道内的靶颗粒偏传到新路径上。
本发明包括所述具体和优选实施方式的所有组合。应理解，本文所述的实施例和实施方式仅用于说明目的，本领域技术人员应了解据此作出的各种修饰或改变，且它们包括在本申请的主旨和权益以及所附权利要求书的范围内。本文引用的所有发表物、专利和专利申请，包括其中的引用通过引用全文纳入本文以用于所有目的。

Claims (11)

1.一种自动化核酸分析系统，包括在微流体连通中的样品裂解、扩增、PCR和检测模块，其设置成通过多序列扩增和同时微阵列杂交读取来对不同核酸序列进行平行检测。
2.如前述或后述权利要求所述的系统，其中：
检测模块包含微阵列检测光学器件，其包含采用渐消波激发的微阵列扫描仪。
检测模块包含自动化杂交处理器，其设置成通过温度提供多重严谨性；和/或
PCR模块设置成在单次反应中进行逆转录和PCR。
3.如前述或后述权利要求所述的系统，包括含模块的集成微流体卡和分析仪，所述分析仪包含经设置用于接受卡的容器，经设置用于操作卡的操作器，和经设置用于电子控制操作器的控制器，该操作器包含流体致动器、PCR热循环仪、和自动化杂交处理器以及微阵列检测光学器件。
4.如前述或后述权利要求所述的系统，还包括设置成含有并递送试剂至裂解、纯化、PCR和检测模块的试剂模块。
5.如前述或后述权利要求所述的系统，其是：
便携的：小于1000in3并且小于10lbs；
快速的：分析低于120分钟；
多重的：同时分析超过50种靶序列；和/或
自动的：在样品导入和结果展示之间不需要用户介入。
6.如前述或后述权利要求所述的系统，其中：
样品包含蛋白质分析物并且系统进一步设置成用包含所述核酸序列的标签来标记蛋白质分析物；
锚定的探针通过其空间位置限定序列；
使用比被分析序列的数目少的引物对数来实现扩增；
不同核酸序列是多物种/生物体的；
PCR模块包含金属(例如，铝)PCR反应腔室；
微流体连通包含经设置用于去除气泡的透气膜，其中透气膜在通道层之下，使得整个通道暴露于大气压中(在一个具体的实施方式中，该膜跨越所述卡，因为与单独的片相比其更易于被制成层，虽然其仅仅在通道层之下起作用)；
扩增完全包含在耗材(例如，无开口管)中；和/或
检测是基于探针组而不是引物组(易于构建新的测试)。
7.如前述或后述权利要求所述的系统，其设置成：
在单个容器中扩增(无样品裂解)；
接受并处理下述的分析物样品：血液、唾液、GI样品、尿液、伤口拭子、脊椎穿剌、鼻拭子、兽医学和农业来源；
通过试样收集工具或运输介质接受样品；
处理1-100ul的样品体积；
是模块化的(模块可互换以支持不同应用)；
能够测量(通过通道尺寸和气泡去除进行)；和/或
是单向或自封闭的(防止样品交叉污染)。
8.如前述或后述权利要求所述的系统，包括包含模块的集成微流体卡和包含外壳(盒)的分析仪，并且在外壳内包括经设置用于接受卡的容器，其中该分析仪：
接合卡以进行裂解、纯化、PCT(扩增和标记)、和检测；
通过压力(例如，样品运输)、磁场(例如，样品混合)、温度(例如，扩增、严谨性、杂交)和/或光(例如，杂交检测)与样品相互作用；和/或
通过将渐消波与样品偶联来进行检测以实时观察杂交和/或确定产生序列信息的可能碱基对错配和动力学。
9.如前述或后述权利要求所述的系统，包括含模块的集成微流体卡(筒)的系统，其中该卡设置成：
对疾病类型有特异性(例如，呼吸道疾病)；
对患者类型有特异性(例如，小儿)；
对病原体类型有特异性(例如，生物战试剂)；
对个体有特异性(例如，药物基因组学)；
含有针对患者特异性信息的独特标识；
用于一次性使用以保持无菌并最小化交叉污染；
使用辊到辊生产步骤产生；和/或
来自聚碳酸酯底架、金属箔PCR腔室、丙烯酸组分、可呼吸膜材料、和/或聚氨酯密封。
10.如之前权利要求所述的系统，所述系统功能性集成微流体荧光-活化细胞分选仪(μFACS)，其设置成提供用于颗粒或细胞比对的惯性聚焦和/或流体力学并且包含设置成用于分选的微孔电活性聚合物(EAP)致动器。
11.一种方法，包括使用前述权利要求所述的系统通过多重序列扩增和同时微阵列杂交读取来平行检测不同分析物核酸序列。
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